JP2000214070A - シ―スフロ―セルとそれを用いた血液分析装置 - Google Patents
シ―スフロ―セルとそれを用いた血液分析装置Info
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Abstract
量を増大し、多項目血液分析装置の処理能力の向上をは
かる。 【解決手段】 シースフローセルは、流入口2から流出
口3へシース液を導く案内孔4を有するセル1を備え、
前記セルは流入口2から流出口3に向かって連続する整
流部11と加速部12とオリフィス部13とを一体に接
続してなり、整流部11は円筒状の貫通孔を、加速部1
2は流出口3に向かって径が徐々に小さくなる円錐状の
貫通孔を、オリフィス部13は角筒状の貫通孔をそれぞ
れ備え、互いに滑らかに連通して前記案内孔を形成し、
前記セル内には流入口2から加速部12へ向かって整流
部11の貫通孔と同軸に延びる円筒状の試料液供給ノズ
ルが設けられ、オリフィス部13の貫通孔は一辺の長さ
が0.1〜0.4mmの断面を有し、整流部11の貫通
孔の長さがその内径の4倍以上である。
Description
ルとそれを用いた血液分析装置に関し、とくにシースフ
ロー方式に適用されるシースフローセルとそれを用いた
多項目血液分析装置に関する。
装置として、シースフロー方式と呼ばれる方式を用いた
フローサイトメータがよく知られている。この方式で
は、ノズルから吐出された試料液(粒子の浮遊液)の周
囲にシース液を流すことにより、シースフローセル内で
試料液を細く絞ることができる。そこで光学的測定を行
うことにより、試料液中の粒子の計測や分析を行うこと
ができる。なお、「シースフロー」とは、オリフィスを
層流状態で流れるシース液の中央部で粒子の浮遊液をほ
ぼ粒子の外径まで絞り、粒子を精度良く一列に整列させ
て通過させる流れを言う。血液等の試料を染色液や溶血
剤や反応試薬などで調製した試料液を用いて、種々の細
胞を分析することが行われている。
に伴い処理能力を上げることが望まれているが、シース
フローセルでの測定、洗浄に時間がかかるという問題が
ある。そこで、フローサイトメータの処理能力を向上さ
せるものとして、特開平2−176562、特表平9−
508704号公報に記載された装置がある。これは、
ノズルを多重構造とし試料液を供給する入口を複数設
け、試料液を別々の流路からシースフローセルに導くよ
うにして、切り換え時の試料液洗浄を不要としたもので
ある。
うな多重構造のノズルは、その構造の複雑さから製作、
調整が難しく、高価になるという問題がある。そして、
ノズル洗浄を各ノズル使用後にまとめて行うだけではそ
れほど処理能力が高くなるとまでは言えない。このよう
な事情を考慮してこの発明では、本来の単純な構造のシ
ースフローセルの流体特性について、特にシースフロー
セルの形態に対するシース液の流速と試料液流量との関
係について詳細に検討を行い、その結果から試料液流量
を少なくとも倍増させることが可能であることを見出し
た。そこで、この発明は、試料液流量の増大可能なシー
スフローセルとそれを用いて処理能力を向上させた血液
分析装置を提供するものである。
流出口へシース液を導く案内孔を有するセルを備え、前
記セルは流入口から流出口に向かって連続する整流部と
加速部とオリフィス部とを一体に接続してなり、整流部
は円筒状の貫通孔を、加速部は流出口に向かって径が徐
々に小さくなる円錐状の貫通孔を、オリフィス部は角筒
状の貫通孔をそれぞれ備え、互いに滑らかに連通して前
記案内孔を形成し、前記セル内には流入口から加速部へ
向かって整流部の貫通孔と同軸に延びる円筒状の試料液
供給ノズルが設けられ、オリフィス部の貫通孔は一辺の
長さが0.1〜0.4mmの断面を有し、整流部の貫通
孔の長さがその内径の4倍以上であるシースフローセル
を提供するものである。
と、シースフローセルの流入口へシース液を、ノズルへ
血液含有試料液をそれぞれ供給する第1および第2供給
部と、オリフィス部に光を照射する光源と、オリフィス
部から出射される光を受光する受光部と、受光部から得
られる光学的情報に基づいて試料液に含まれる血液成分
を抽出して計数する分析部を備えた血液分析装置を提供
するものである。
から流出口を有し、その間に連続する整流部と加速部と
オリフィス部とを備え、各部に形成された貫通孔を連通
して流入口から流出口への案内孔が形成される。
射してその前方散乱光および側方散乱光を得るため、断
面が正方形又は長方形の透明な角筒で構成される。これ
は、オリフィス部に光を照射させるとき、側壁の屈折や
散乱によるそのエネルギー損失を最小限にするためであ
る。また、壁面が曲面や凹凸面を有すると、そのレンズ
効果により光が拡散や散乱を生じ、オリフィス部を透過
(又は散乱)する光から正しい光学情報が得られなくな
るからである。
を通過させることができオリフィス部の貫通孔を通過す
る液体に侵されない物理的および化学的耐性を有するも
のであれば、特に限定されない。例えば、無機ガラス,
塩化ビニル樹脂,アクリル樹脂などがあげられる。但
し、樹脂の場合には流れる液に気泡が生じることがある
ので、無機ガラスを用いることが好ましい。セルの整流
部および加速部も同様の材料で形成できる。
めに可能な限り滑らかにする必要がある。従来のシース
フローセルのセルは切削加工により製作されているが、
オリフィス部と加速部とからなる部材を切削によって加
工すると、その境界部に角部が生じてしまう。このこと
は加速部と整流部とからなる部材を切削加工する際も同
様である。さらに加速部とオリフィス部とからなる部材
に対して、整流部を接着する場合や、整流部と加速部と
からなる部材を接着する場合でも接続部の内壁に数百ミ
クロン程度の段差がどうしても生じてしまう。従ってシ
ース液の流速を上げてゆくと試料の流れが乱れて、粒子
の測定ができなくなる。この乱れはセルの内壁の角部お
よび段差によって生じるものである。そこで流速を上げ
ても試料の流れが乱れないように、セルの整流部と加速
部とオリフィス部とを同じ材料で構成し、相互に熱や薬
品などによって溶着させる方法を用いることにより接続
部の段差および角部をなくすことができる。特に接続部
の内壁は滑らかな曲面を有し、その曲率半径はオリフィ
ス部の貫通孔の一辺の長さ以上であることが好ましい。
吐出されオリフィス部においてシース液により細く絞ら
れて流入口から排出される。従って、オリフィス部への
試料液の時間当たりの流量を増大させるためには、オリ
フィス部における試料液の流速がシース液の中心流速に
ほぼ一致するので、シース液を層流状態に維持しながら
その流速を増大させればよいことが理解される。このセ
ルにおいて流入口から流出口へ導かれるシース液には、
水や食塩水など用いられる。
リフィス部とが一体に形成され、その案内孔の内壁が段
差および角部がないように滑らかに形成されているセル
において、 (1)整流部の貫通孔の長さをその内径に対して4倍以
上にすればよい。それによって、シール液の流速を層流
の状態で高速化でき試料液の時間当たりの流量を3〜1
0μL/秒に増大させることができる。 (2)その場合、オリフィス部の貫通孔は一辺の長さが
0.1〜0.4mmの正方形状の断面を有することが好
ましい。 (3)また、オリフィス部を流れるシース液の平均流速
は6〜12m/secであることが好ましい。 上記(1)〜(3)について、その理由を以下の性能試
験に基づいて説明する。
セルの一例を示す断面図であり、図2は図1のX−X矢
視拡大断面図である。この発明のセル1は、流入口2か
ら流出口3へシース液を導く案内孔4を備え、流入口2
から流出口3に向かって連続する整流部11(長さL
1)と、加速部12(長さL2)と、オリフィス部13
(長さL3)とからなる。
の円筒状の貫通孔を有し、加速部12は流出口3に向か
って径が徐々に小さくなる円錐状の貫通孔を有し、オリ
フィス部13は長さL3にわたって図2に示す断面の貫
通孔を有し、それぞれの貫通孔が連通して案内孔4を形
成する。
粒子測定用の光Yを照射してオリフィス部を通過する粒
子の前方散乱光Y1 および側方散乱光Y2 を精度よく得
るために、断面が正方形の透明な角筒で構成される。
すると共に、外径1mm,内径0.2mmのノズル6を
先端が整流部11と加速部12との境界に達するように
セル1の流入口2から挿入し、整流部11と同軸になる
ように固定具5に固定した。そして、固定具5の孔5a
からシース液をセル1に供給し、同時にノズル6に試料
液として希釈したインクを供給して、整流部11の長さ
L1とオリフィス部13におけるシース液の平均流速V
aとを変化させたときのシース液の流れの状態(層流か
乱流か)を定量的に観察した。ここでは、試料液の供給
量Qsを従来の約2倍の4μL/secに設定してい
る。
めに、図3に示すようにオリフィス部13に光を照射す
る光源7と、照明した試料(インク)流を撮像するビデ
オカメラ8を設け、試料流の振れ幅(流れに直交する方
向の振幅)を測定した。また、セル1には整流部11の
内径D1が5mm一定で、オリフィス部13の内部正方
形断面の一辺M(図2)が0.2mmと0.3mmのも
のを用いている。
幅の測定結果をそれぞれ図4と図5に示す。図4,図5
において曲線(イ),(ロ),(ハ),(ニ)はそれぞれシー
ス液のオリフィス部13における平均流速Vaが6,
8,10,12m/secの場合を示す。これらの結果
からオリフィス部13におけるシース液の流れを層流
(試料流の振幅が零)にするための条件をまとめると表
1のようになる。
ィス部13の中心を流れる試料流の直径を、P(kg/
cm2)はシース液に供給される圧力を表わす。
する条件は、Va=6m/secとすると、 M=0.2mmのときL1≧20mm、つまりL1≧4
×D1 M=0.3mmのときL1≧30mm、つまりL1≧6
×D1 であり、Va=10m/secとすると、 M=0.2mmのときL1≧40mm、つまりL1≧8
×D1 M=0.3のときL1≧50mm、つまりL1≧10×
D1 である。試料流の浮遊粒子の径に対応させてDsをさら
に小さくするためにVaを増大させる場合には、それに
伴ってL1を長くすればよい。
る場合には、試料流の径Dsは血球の平均粒径に近いこ
とが要求されるので、例えば、表1に示すようにDs=
15μmに設定すると、M=0.2mmのときL1≧5
0mm(10×D1),M=0.3mmのときL1≧5
0mm(10×D1)であればよい。
と、例えばM=0.1mmの場合にはL1<20mmに
おいてもシース液の層流が得られ、M=0.4mmの場
合でもL1が60〜70mm程度であれば層流が得られ
ることが判る。但し、Mが小さくなる程、シース液の供
給圧力Pを大きくする必要がある。
sを4μL/sec一定に設定したが、Qsをさらに増
減させて、例えば10μL/secや3μL/secに
設定してもシース流の流れの状態(層流条件)には何ら
影響を与えず、Dsのみが増減するだけであることが確
認された。
ば、整流部の貫通孔の長さをその内径に対して4倍以上
にすることにより、オリフィス部を流れるシース液の平
均流速を6〜12m/secに高速化しても層流が得ら
れ、試料液の時間当たりの流量を3〜10μL/秒つま
り従来の1.5〜5倍程度まで増大させることができ、
フローサイトメータの処理能率を向上させることが可能
となる。また、この場合、オリフィス部の貫通孔は一辺
の長さが0.1〜0.4mmの正方形状断面を有すれば
よいことがわかる。
せたシースフローセルを用いるこの発明の血液分析装置
において、シースフローセルの流入口へシース液を供給
する第1供給部は、例えば、シース液を収容するシース
液チャンバーと、一定圧力をシース液チャンバーに印加
する圧力装置(例えば、圧縮器と圧力調整器)と、バル
ブを介してシース液チャンバーとフローセルの流入口と
を接続する供給路を備える。なお、シース液チャンバー
に印加される圧力によりオリフィス部におけるシース液
の流速が決定される。
有試料液を供給する第2供給部は、例えば、採血された
血液を定量採取して希釈するサンプリングバルブと、血
液試料液に対して希釈する処理や染色又は溶血する処理
などを行うための反応チャンバーと、反応チャンバーで
処理された試料液を定量してノズルへ供給する定量シリ
ンジなどにより構成される。この場合、前述の試料液供
給量Qs(μl/sec)はこの定量シリンジの駆動速
度によって適宜選択することができる。
に光を照射する光源には、レーザダイオード,Arレー
ザ,又はHe−Neレーザなどを用いることができる。
なお、レーザ光源の光軸は、オリフィス部が角筒状断面
を有するので、図2のようにオリフィス部の1つの側壁
に直交することが好ましい。また、光源とシースフロー
セルとの間にレンズ系を挿入してビーム径を調整する場
合には、そのビーム径はオリフィス部の試料流の径にほ
ぼ等しくすることが好ましい。それによって試料流が効
率よく照明される。
がオリフィス部を流れる試料流中の粒子に当たって前方
散乱光,側方散乱光,側方蛍光などを生じる。従って、
光強度が強い前方散乱光を受光する受光部としてはフォ
トダイオードを使用し、光強度が微弱な側方散乱光や側
方蛍光を受光する受光部としてはフォトマルチプライア
チューブを使用することが好ましい。
得られる光学的情報に基づいて試料液に含まれる血液成
分を抽出して計数するが、抽出される血液成分として
は、例えば、白血球,有核赤血球,白血球内の好塩基球
とリンパ球と単球と好中球と好酸球,成熟赤血球,網赤
血球および血小板などがあげられる。
を格納し、所定のプログラムに基づいてその情報を分画
・計数処理し、処理結果を出力するなどの機能を備える
ことが必要であるので、例えば、マイクロコンピュータ
やパーソナルコンピュータなどにより構成することが好
ましい。
る。なお、各図面の共通の要素には共通の番号および記
号を付記している。
示す形状のセル1を使用し、各部の寸法は D1=5mm L1=50mm M=0.2mm であり、セル1は石英ガラスでそれぞれ形成した整流部
11と加速部12とオリフィス部13を融着することに
より一体的に形成されている。そして、図3に示すよう
にセル1がノズル6と共に固定具5に固定され、シース
フローセルが構成される。
発明の血液分析装置の光学系を示す斜視図である。同図
においてレーザダイオード21から出射されたビームは
コリメートレンズ22を介してシースフローセル23の
オリフィス部を照射する。オリフィス部を通過する血球
から発せられる前方散乱光は、集光レンズ24とピンホ
ール板25とを介してフォトダイオード26に入射す
る。
せられる側方散乱光と側方蛍光については、側方散乱光
は集光レンズ27とダイクロイックミラー28とを介し
てフォトマルチプライアチューブ(以下、フォトマルと
いう)29に入射し、側方蛍光は集光レンズ27とダイ
クロイックミラー28とフィルタ29とピンホール板3
0を介してフォトマル31に入射する。
散乱光信号と、フォトマル29から出力される側方散乱
光信号と、フォトマル31から出力される側方蛍光信号
とは、それぞれアンプ32,33,34により増幅さ
れ、解析部35に入力される。
示す系統図である。同図において、先ず洗浄工程におい
ては、バルブ41,50が開かれ、シース液を収容した
シース液チャンバー42からシース液が圧力装置43か
ら印加される圧力Pによって送出され、バルブ41と定
量シリンジ44とノズル6とを介して廃液チャンバー4
5へ排出されると共に、バルブ50とセル1とを介して
廃液チャンバー45に排出され、所定時間後にバルブ4
1,50が閉じられる。これによって、定量シリンジ4
4,ノズル6,セル1およびその経路がシース液により
洗浄される。
47が開かれ、血液含有試料液を試薬で反応させて収容
する反応チャンバー48から試料液が吸引装置49の負
圧により吸引され、バルブ46とノズル6間の経路が試
料液で満たされると、バルブ46,47が閉じられる。
次に、バルブ50が開かれると、シース液がシース液チ
ャンバー42から圧力装置43の圧力によりセル1へ送
出され、廃液チャンバー45に排出される。この時、圧
力装置43からシース液に印加される圧力Pは1.8k
g/cm2 であり、シースフローセル23のオリフィス
部13(図1参照)におけるシース液の平均流速は10
m/secである(表1参照)。
43からの圧力Pは定量シリンジ44を介してノズル6
の先端へも伝達され、ノズル6の先端においてノズル外
部のシース液の圧力とノズル内部の試料液の圧力とが平
衡する。従って、この状態で定量シリンジ44のピスト
ン44bがモータ44aにより駆動されると、バルブ4
6とノズル6間に存在する試料液はノズル6からオリフ
ィス部13へ容易に吐出され、シース液によって細く絞
られてオリフィス部13を通過し、シース液と共に廃液
チャンバー45へ排出される。
液の流量が4μL/secになる速度で駆動される。オ
リフィス部13で絞られる試料液の流れの直径は表1よ
り17μmとなる。この値は対象とする血球の平均径
(約10μm)から見て適当なものである。そして、定
量シリンジ44のピストン44bの駆動が終了すると、
測定工程を終了する。
4bが引き戻され、定量シリンジ44は初期状態に復帰
するが、この間にはバルブ41,50は開かれたままで
あるので、前述の洗浄工程が行われ、次の測定工程に備
えられることになる。
53に収容された他の試料液についてもバルブ54,5
5,56を開閉して前述と同様の工程を順次実行するこ
とにより測定を行うことができる。なお、バルブ57は
廃液チャンバー45から廃液を排出するバルブであり、
必要に応じて開閉される。
ロック図である。図8において、61は各種の数値や領
域などの条件を予め設定するためのデータの入力部であ
り、例えば、キーボードやマウスにより構成される。
る設定条件格納部、63はフォトダイオード26とフォ
トマル29,31の出力信号から得られる光学情報を格
納するデータ格納部である。64はデータ格納部63に
格納された光学情報、つまり前方散乱光強度(Fs
c),側方散乱光強度(Ssc),側方蛍光強度(Sf
l)の内いずれか2つのパラメータを用いて2次元分布
図を作成する分布図作成部、65は分布図作成部64で
作成された分布図から座標や領域を抽出する抽出部であ
る。
図において各粒子の分画領域を決定する分画領域決定
部、67は分画領域内の粒子数の計数を行う演算部であ
る。そして、演算部67の演算結果は分布図作成部64
で作成された分布図と共に表示部68に表示される。6
9は図7に示すバルブ41,46,47,50,54,
55,56,57およびモータ44aを駆動する流体系
駆動部である。また、分析部35はパーソナルコンピュ
ータで構成される。
血球測定モード」,「白血球、好塩基球測定モード」、
「白血球4分類測定モード」、「網赤血球測定モード」
の4種類の測定モードを測定するか否かが設定される。
設定に対応して、図示しない血液定量部にて定量された
血液と、希釈液、染色液、溶血剤などの試薬とが、反応
チャンバー48,51,52,53の内の対応するチャ
ンバーに収容されて所定の処理が施される。このように
調製された血液試料は、シースフローセル1にて順次測
定される。
μlがストマトライザーNR溶血剤(シスメックス
(株)製)882μlとともに反応チャンバー48に運
ばれる。そしてストマトライザーNR染色液(シスメッ
クス(株)製)18μlが添加される。この状態で約7
秒間反応させることで、赤血球が溶血させられ、白血球
・有核赤血球が染色される。この処理がされた試料は定
量シリンジ44によって、ノズル6から吐出され、光学
的に測定して得られた情報のうち、側方蛍光(Sfl)
と前方散乱光(Fsc)とを二次元分布にした例が図9
である。有核赤血球が赤血球および白血球から分画され
て測定される
液18μlがストマトライザーFB(II)(シスメック
ス(株)製)882μlとともに反応チャンバー51に
運ばれる。この状態で約14秒間反応させることで、赤
血球が溶血させられ、好塩基球以外の白血球が裸核化・
収縮される。この処理がされた試料は定量シリンジ44
によって、ノズル6から吐出され、光学的に測定して得
られた情報のうち、側方散乱光(Ssc)と前方散乱光
(Fsc)とを二次元分布図にした例が図10である。
好塩基球とその他の白血球(リンパ球+単球+好中球+
好酸球)が分画されて測定される。
8μlがストマトライザー4DL(シスメックス(株)
製)882μlとともに反応チャンバー52に運ばれ
る。そしてストマトライザー4DS(シスメックス
(株)製)18μlが添加される。この状態で約22秒
間反応させることで、赤血球が溶血させられ、白血球が
染色される。この処理がされた試料は定量シリンジ44
によって、ノズル6から吐出され、光学的に測定して得
られた情報のうち、側方散乱光(Ssc)と側方蛍光
(Sfl)とを二次元分布図にした例が図11である。
白血球がリンパ球、単球、好中球+好塩基球、好酸球と
に分画されて測定される。
μlがレットサーチ(II)希釈液(シスメックス(株)
製)895.5μlとともに反応チャンバー53に運ば
れる。そしてレットサーチ(II)染色液(シスメックス
(株)製)18μlが添加される。この状態で31秒間
反応させることで、網赤血球等が染色される。この処理
がされた試料は定量シリンジ44によって、ノズル6か
ら吐出され、光学的に測定して得られた情報のうち、側
方蛍光(Sfl)と前方散乱光(Fsc)とを二次元分
布図にした例が図12である。網赤血球が成熟赤血球と
血小板とから分画されて測定される。
1で試料が約5秒間測定され、その後約3秒間でノズル
洗浄、シースフローセル洗浄、流路切換などの動作が行
われ次のモードの測定ができる状態となる。すなわち1
測定モードあたり約8秒という高速で、白血球分類や有
核赤血球測定などの特殊な検査が可能となる。
高速のシース流に対して層流が得られる形状にすること
により試料液の時間当たりの供給量を増大させることが
できるので、このシースフローセルを用いることによっ
て多項目血液分析装置の時間的な処理能力を向上させる
ことができる。
を示す説明図である。
試料流の振幅を示すグラフである。
試料流の振幅を示すグラフである。
る。
る。
ク図である。
Claims (7)
- 【請求項1】 流入口から流出口へシース液を導く案内
孔を有するセルを備え、前記セルは流入口から流出口に
向かって連続する整流部と加速部とオリフィス部とを一
体に接続してなり、整流部は円筒状の貫通孔を、加速部
は流出口に向かって径が徐々に小さくなる円錐状の貫通
孔を、オリフィス部は角筒状の貫通孔をそれぞれ備え、
互いに滑らかに連通して前記案内孔を形成し、前記セル
内には流入口から加速部へ向かって整流部の貫通孔と同
軸に延びる円筒状の試料液供給ノズルが設けられ、オリ
フィス部の貫通孔は一辺の長さが0.1〜0.4mmの
断面を有し、整流部の貫通孔の長さがその内径の4倍以
上であるシースフローセル。 - 【請求項2】 整流部と加速部とオリフィス部とが溶着
により一体化された請求項1記載のシースフローセル。 - 【請求項3】 整流部と加速部との接続部および加速部
とオリフィス部との接続部は、内壁が曲率を有して接続
され、その曲率半径がオリフィス部の貫通孔の一辺の長
さ以上である請求項1記載のシースフローセル。 - 【請求項4】 請求項1記載のシースフローセルと、シ
ースフローセルの流入口へシース液を、ノズルへ血液含
有試料液をそれぞれ供給する第1および第2供給部と、
オリフィス部に光を照射する光源と、オリフィス部から
出射される光を受光する受光部と、受光部から得られる
光学的情報に基づいて試料液に含まれる血液成分を抽出
して計数する分析部を備えた血液分析装置。 - 【請求項5】 第1供給部はシースフローセルのオリフ
ィス部を流れるシース液の平均流速が6〜12m/se
cになるようにシース液を供給する請求項4記載の血液
分析装置。 - 【請求項6】 第2供給部は血液含有試料液を3〜10
μL/秒でノズルへ供給する請求項4記載の血液分析装
置。 - 【請求項7】 分析部は光学的情報に基づいて白血球分
類測定と有核赤血球測定と網赤血球測定とを選択的に測
定することができる請求項4記載の血液分析装置。
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