JP2000217580A - アラビノフラノシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 （１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフ
ラノース残基に特異的に作用し、直鎖（１→５）−α−
Ｌ−アラビナンに対する加水分解活性を有するアラビノ
フラノシダーゼ、および糖転移活性を有するアラビノフ
ラノシダーゼ、当該アラビノフラノシダーゼをコードす
る遺伝子、当該アラビノフラノシダーゼ生産菌株、およ
び当該アラビノフラノシダーゼの製造法。 【効果】 アラビナン等を効率良く分解することがで
き、その高い基質特異性から研究用試薬としても利用で
きる。また、アラビノオリゴ糖等の製造に利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、（１→５）結合し
たα−Ｌ−アラビノフラノース残基に特異的に作用し、
直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンに対する加水分解
活性を有するアラビノフラノシダーゼ、および糖転移活
性を有するアラビノフラノシダーゼ、当該アラビノフラ
ノシダーゼをコードする遺伝子、当該アラビノフラノシ
ダーゼ生産菌株、および当該アラビノフラノシダーゼの
製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−アラビノースは天然に存在する五単
糖であり、適度な甘みを有する。自然界ではフラノース
の形で、アラビノキシランやアラビナン、アラビノガラ
クタンとして存在している。アラビノースを主な構成糖
とするアラビナンは、ある種の種子、果実、野菜、樹皮
あるいは木材などから抽出され、構造解析がなされてい
る。基本的にはα−Ｌ−アラビノフラノース残基が（１
→５）結合した主鎖のところどころに、Ｏ−３位あるい
はＯ−２位でα−Ｌ−アラビノフラノース残基が結合し
た構造を持つことが示されている。

【０００３】近年、世利らにより、単糖Ｌ−アラビノー
スが小腸スクラーゼを阻害すること、また経口投与によ
り砂糖負荷後の血糖上昇、インスリン上昇を抑制するこ
とが明らかにされた（世利他、メタボリズム、４５巻、
p．１３６８（１９９６）；Ｋ．Ｓｅｒｉ ｅｔ．ａ
ｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，４５，p．１３６８（１
９９６））。さらに、讃井らにより、Ｌ−アラビノース
はスクロースとともに摂取した場合、スクロースの消化
吸収を抑制し、そのエネルギー利用を低減することが示
され（讃井他、日本栄養食料学会誌、５０巻、ｐ．１３
３（１９９７））、その生理活性とともに製造法に関し
て注目が高まっている。

【０００４】アラビノース含有多糖を分解する酵素がア
ラビナナーゼであり、現在までその作用様式からエンド
型とエキソ型の二系統が知られている。エンド型のアラ
ビナナーゼはエンド−（１→５）−α−Ｌ−アラビナナ
ーゼ（EC.3.2.1.99）と呼ばれており、エキソ型はアラ
ビノフラノシダーゼ（EC.3.2.1.55）と呼ばれている。

【０００５】アラビノフラノシダーゼはこれまで様々な
起源のものが報告されている。現在のところ、以下の２
種類に大きく分類されている（Ｇ．Ｂｅｌｄｍａｎら、
アドバンシス・イン・マクロモレキュラー・カーボハイ
ドレート・リサーチ、１巻、ｐ．１（１９９７））。 （１）α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＡ （２）α−Ｌ−アラビノフラノジターゼＢ

【０００６】この分類は、ビートアラビナンなどのアラ
ビノース含有多糖への作用の有無によるものである。し
かしながら、アラビノース含有多糖の構造が未だ不明瞭
であり、そのためアラビノフラノシダーゼの分類につい
てもはっきりしていないのが現状である。アラビノース
含有多糖に作用するアラビノフラノシダーゼにおいて、
今まで発見されている酵素の多くは、ビートアラビナン
から（１→２）または（１→３）結合したα−Ｌ−アラ
ビノース残基を優先的に加水分解し、その結果直鎖（１
→５）−α−Ｌ−アラビナンを生じて溶液中から沈殿す
る（ＭｃＣｌｅａｒｙ，Ｂ．Ｖ．、エンザイムズ・イン
・バイオマス・コンバージョン、Ｐ．４２２（１９８
４）；ＭｃＣｌｅａｒｙ，Ｂ．Ｖ．，Ｅｎｚｙｍｅｓ
Ｉｎ Ｂｉｏｍａｓｓ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ，ｐ．４
２２（１９８４））。アラビナンの主鎖である直鎖（１
→５）−α−Ｌ−アラビナンはほとんど分解されないた
め、これら公知の酵素でビートアラビナンを高収率で単
糖まで分解することは困難であった。

【０００７】ワイン・果汁ジュースなどでしばしば発生
する濁りは、この直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナン
を主成分とするものである（Ｍ．Ｐ．Ｂｅｌｌｅｖｉｌ
ｌｅら、ファイトケミストリー、３３巻、Ｐ．２２７
（１９９３）；Ｍ．Ｐ．Ｂｅｌｌｅｖｉｌｌｅ ｅｔ．
ａｌ．、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３、Ｐ．２
２７（１９９３））。上述した理由により、公知のアラ
ビノフラノシダーゼによってこれら濁りの発生を防止す
ることや濁りを除去することは困難であった。

【０００８】様々なグリコシダーゼがその特異性を利用
して多糖やオリゴ糖などの構造解析に広く利用されてい
る。アラビノース含有多糖などの構造研究には基質特異
性の高い酵素が必須であるが、これまで基質特異性が明
確になっているアラビノフラノシダーゼは数少ない。我
々は幾つかのアラビノフラノシダーゼの基質特異性につ
いて、３種類のメチル−α−Ｌ−アラビノフラノビオシ
ド位置異性体（１→２、１→３、１→５）等を用いて詳
細に調べた。これまで（１→２）あるいは（１→３）結
合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基を優先して切断
する酵素の存在はいくつか確認したが、（１→５）結合
したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に特異的な酵素は
得られていない。

【０００９】近年、グリコシダーゼの糖転位反応により
様々なオリゴ糖や配糖体が合成され、食品分野を中心に
幅広く利用されている。しかしながら、アラビノフラノ
シダーゼによる糖転位反応についてはほとんど報告がな
く、アラビノオリゴ糖やアラビノース配糖体の応用例も
知られていない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、（１→５）
結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に高い特異性
を有して直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを効率良
く分解することができ、またその高い基質特異性から研
究用試薬としても利用価値の高いアラビノフラノシダー
ゼ、および糖転移活性を有し各種アラビノオリゴ糖やア
ラビノース含有配糖体の製造に利用できるアラビノフラ
ノシダーゼを提供するものである。また、当該アラビノ
フラノシダーゼをコードする遺伝子を提供するものであ
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規な性
質を有するアラビノフラノシダーゼ、特に直鎖（１→
５）−α−Ｌ−アラビナンを効率的に分解できる酵素、
および糖転移活性を有する酵素の生産が可能な微生物を
見い出すべく鋭意研究を行った結果、ストレプトマイセ
ス属に属する放線菌に由来するアラビノフラノシダーゼ
が（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基
に高い特異性を有して直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビ
ナンを効率的に分解できることを見い出し、また本菌に
由来する別の酵素が糖転移活性を有することを見い出
し、この菌株の培養液から目的とする酵素を取り出して
その性質を解明し、発明を完成するに至った。

【００１２】すなわち、本発明は、直鎖（１→５）−α
−Ｌ−アラビナンを効率的に分解できるアラビノフラノ
シダーゼ、当該アラビノフラノシダーゼを生産する菌お
よび当該アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子を
提供するものである。

【００１３】また、本発明は、糖転移活性を有するアラ
ビノフラノシダーゼ、当該アラビノフラノシダーゼを生
産する菌株および当該アラビノフラノシダーゼをコード
する遺伝子を提供するものである。

【００１４】更に、本発明は、これらの遺伝子を有する
菌株を培地中に接種し、培養してアラビノフラノシダー
ゼを菌体内または培地中に蓄積せしめ、これを採取する
ことを特徴とする、アラビノフラノシダーゼの製造法を
提供するものである。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明のアラビノフラノシダーゼ
を生産する菌としては、発明者らによって新たに分離さ
れ、ＧＳ−９０１と名付けられた株があるが、当該菌株
は以下に示すような菌学的性質を有する。

【００１６】１Ａ．形態的性質 栄養菌糸は、合成寒天培地および天然培地において良く
発達し、不規則に分岐する。胞子は、イースト・麦芽寒
天培地、オートミール寒天培地、スターチ・無機塩寒天
培地などで良好に形成される。顕微鏡観察によると、胞
子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で、胞子はらせん状に
形成される。胞子は通常３個以上の連鎖が認められ、培
養の後期には長い鎖状を呈する。胞子の表面はとげ状
で、形状は円筒形である。

【００１７】１Ｂ．培地上での生育状態 各種培地で３０℃、１４日間培養したときの肉眼的観察
結果を表１に示す。

【００１８】

【表１】

【００１９】１Ｃ．生理的性質 （１）生育至適温度 ２５〜３７℃である。４０℃でもわずかに生育する。 （２）生化学的性質 （ａ）ゼラチンの液化 陽性 （ｂ）デンプンの加水分解 陽性 （ｃ）メラニン様色素生成 陽性 （ｄ）硝酸塩の還元 陽性 （ｅ）食塩に対する耐性 ７％まで耐性がある （３）炭素源の利用性 ＧＳ−９０１株の炭素源の利用性を表２に示した。な
お、培地はプリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ＩＳＰ
９）を使用し、２８℃、１４日間培養後に判定した。

【００２０】

【表２】

【００２１】（注）＋＋：顕著に利用、＋：利用する、
−：利用しない

【００２２】（４）細胞壁のジアミノピメリン酸（ＤＡ
Ｐ）のタイプ, ＬＬ−ＤＡＰ

【００２３】以上の性質から、本菌株が放線菌に属する
ことは明らかであって、「放線菌の同定実験法」（日本
放線菌研究会編、1985年）等を参照して分類学的位置を
検討した結果、Streptomyces sp.と同定した。

【００２４】この放線菌は下記のとおり命名し、通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る。Streptomyces sp.GS-901（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ
−１６９１６）

【００２５】次に上記微生物を培養して、培養物から新
規アラビノフラノシダーゼを採取する方法について説明
する。使用可能な培地としては、通常の微生物の培養に
用いられる培地で本発明の菌株が生育可能であれば特に
制限はないが、例えば、有機炭素源および窒素源として
はグルコース、澱粉、デキストリン、ビートアラビナ
ン、ペプトン、酵母エキスなどが適しており、無機塩類
としてはリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグ
ネシウム、食塩などの添加が有効である。その他、必要
に応じて菌の生育、酵素の生産に必要な各種有機物、無
機物を適宣添加することができる。

【００２６】上記培地での培養方法は、振盪培養または
発酵槽等を用いての、通気撹拌培養が適している。培養
温度は、生育できる範囲内なら特に限定されないが、30
℃付近が望ましい。

【００２７】上述のようにして培養した後、培養物中か
ら、目的物質であるアラビノフラノシダーゼを採取およ
び精製するには、一般的な酵素の採取および精製方法に
準じて行うことができる。すなわち、ろ過あるいは遠心
分離等の方法により、まず培養液から菌体等の固形分を
除去し、粗酵素液を得る。このようにして得られる粗酵
素液はそのまま使用することもできるが、この粗酵素液
を通常の酵素精製法、すなわち硫安塩析、アセトン、ア
ルコール等による有機溶媒沈殿、限外ろ過、イオン交換
樹脂、ゲルろ過法などの手法を、単独あるいは組み合わ
せて用いることで、より純度の高いアラビノフラノシダ
ーゼを得ることができる。

【００２８】アラビノフラノシダーゼの活性は、次に示
す方法により測定する。すなわち、２ｍＭ ｐ−ニトロ
フェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド０．２５ml、マ
クイルバイン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ７．
０）０．２mlに、酵素液０．０５mlを加え、４０℃で１
０分間反応させる。０．５％炭酸ナトリウム０．５mlを
加えることにより反応を停止し、４０８nmの吸光度を測
定する。酵素活性の表示は、上記条件において、１分間
あたり１μmolのパラニトロフェノールを遊離させる酵
素量を１単位とした。

【００２９】次に本発明で得られるアラビノフラノシダ
ーゼの理化学的性質を示す。なお、便宜上、以下の記述
においては、糖転移活性を有するアラビノフラノシダー
ゼをアラビノフラノシダーゼ１、（１→５）結合したα
−Ｌ−アラビノフラノース残基に特異的に作用して直鎖
（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを加水分解するアラビ
ノフラノシダーゼをアラビノフラノシダーゼ２と称す
る。

【００３０】（１）分子量 アラビノフラノシダーゼ１：約８０キロダルトン（ＳＤ
Ｓ電気泳動による）アラビノフラノシダーゼ２：約３７
キロダルトン（ＳＤＳ電気泳動による） （２）等電点 アラビノフラノシダーゼ１：ｐＨ６．６付近（等電点電
気泳動法による）アラビノフラノシダーゼ２：ｐＨ７．
５付近（等電点電気泳動法による） （３）作用ｐＨおよびｐＨ安定性 ４０℃におけるアラビノフラノシダーゼ１の作用ｐＨは
ｐＨ５．５近傍に至適がある。３０℃、２時間放置した
際のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性はｐＨ５．５
〜８．５の範囲で安定である。４０℃におけるアラビノ
フラノシダーゼ２の作用ｐＨはｐＨ７近傍に至適があ
る。３０℃、２時間放置した際のアラビノフラノシダー
ゼ作用の安定性はｐＨ５．０〜９．０の範囲で安定であ
る。 （４）至適温度および安定性 ｐＨ５．５、１０分反応時のアラビノフラノシダーゼ１
の作用温度は５５℃近傍に至適がある。ｐＨ７、２時間
放置後のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性は４０℃
までである。ｐＨ７．０、１０分反応時のアラビノフラ
ノシダーゼ２の作用温度は５０℃近傍に至適がある。ｐ
Ｈ７、２時間放置後のアラビノフラノシダーゼ作用の安
定性は４０℃までである。

【００３１】本発明のアラビノフラノシダーゼ１は、配
列番号１に示すアミノ酸配列を有するか、またはそのア
ミノ酸配列の１若くは数個のアミノ酸が欠失、置換若く
は付加されたアミノ酸配列を有するものである。また、
本発明のアラビノフラノシダーゼ２は、配列番号２に示
すアミノ酸配列を有するか、またはそのアミノ酸配列の
１若くは数個のアミノ酸が欠失、置換若くは付加された
アミノ酸配列を有するものである。かかる欠失、置換ま
たは付加の程度は、前記アラビノフラノシダーゼ活性を
有する限り制限されない。なお、配列番号１においてＮ
末端側のＭｅｔから２９番目のＡｌａまで、および配列
番号２においてＮ末端側のＭｅｔから４３番目のＡｌａ
まではリーダー配列を示す。

【００３２】本発明のアラビノフラノシダーゼ１をコー
ドする遺伝子は、たとえば配列番号１に示す塩基配列を
有するか、またはその塩基配列の１若くは数個の塩基が
欠失、置換若くは付加された塩基配列を有するものであ
り、アラビノフラノシダーゼ２をコードする遺伝子は、
たとえば配列番号２に示す塩基配列を有するかまたはそ
の塩基配列の１若くは数個の塩基が欠失、置換若くは付
加された塩基配列を有するものである。該アラビノフラ
ノシダーゼ遺伝子のクローニングは、たとえば以下の方
法にしたがって行うことができる。

【００３３】すなわち、例えばストレプトマイセスのゲ
ノムＤＮＡを用いてゲノムＤＮＡライブラリーを作製す
る。ここで用いるストレプトマイセスとしては、ストレ
プトマイセスｓｐ．ＧＳ−９０１またはその変異株が望
ましい。次に、精製した該アラビノフラノシダーゼのＮ
末端アミノ酸配列から推定される遺伝子を用いてコロニ
ーハイブリダイゼーションを行い、強くハイブリダイズ
するクローンを得る。得られたクローンより既知のアラ
ビノフラノシダーゼとは異なる性質、すなわち本発明の
アラビノフラノシダーゼを発現しているクローンを選択
する。

【００３４】得られたクローンの例としてプラスミド
（図１）が挙げられる。

【００３５】本発明のアラビノフラノシダーゼは、例え
ば配列番号１および２に示す塩基配列を有するか、また
はその塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換も
しくは負荷された塩基配列を有する菌株を培地中に接種
し、培養してアラビノフラノシダーゼを菌体内または培
地中に蓄積せしめ、これを採取することによっても製造
できる。

【００３６】本発明のアラビノフラノシダーゼ１につい
て、メチル−α−（１→２）−Ｌ−アラビノフラノビオ
シドに対して作用させたときの反応生成物のＨＰＬＣチ
ャートを図２に示した。なお、ＨＰＬＣの分析条件は以
下の通りであった。すなわちカラム：昭和電工（株）製
Ｓｕｇｅｒ ＫＳ−８０１、溶離液：水、温度：８０
℃、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計である。

【００３７】アラビノフラノシダーゼ１の作用により、
加水分解産物であるＬ−アラビノースとメチル−α−Ｌ
−アラビノフラノシド以外に、矢印で示した新たなピー
クが生じた。本物質を分取し構造研究を行ったところ、
構成糖としてＬ−アラビノースのみからなる三糖である
ことが確認され、本酵素は糖転移活性を有していること
が明らかとなった。

【００３８】本発明のアラビノフラノシダーゼ２につい
て、ビートアラビナン及び直鎖（１→５）−α−Ｌ−ア
ラビナンに対する分解の経時変化を図３（ａ）に、化学
合成した３種類のメチル−α−Ｌ−アラビノフラノビオ
シド位置異性体（１→２、１→３、１→５）に対する分
解の経時変化を図３（ｂ）に示した。

【００３９】アラビノフラノシダーゼ２はビートアラビ
ナンにほとんど作用せずに、直鎖（１→５）−α−Ｌ−
アラビナンによく作用することが示されている。また、
本酵素はメチル−α−（１→２）−Ｌ−アラビノフラノ
ビオシドやメチル−α−（１→３）−Ｌ−アラビノフラ
ノビオシドにほとんど作用せずに、メチル−α−（１→
５）−Ｌ−アラビノフラノビオシドに良く作用すること
が示されている。これらのことから、アラビノフラノシ
ダーゼ２は（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノ
ース残基に特異的に作用する新規なアラビノフラノシダ
ーゼであることが確認された。

【００４０】

【実施例】本発明を実施例により詳細に説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【００４１】実施例１ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＳ−９０１株につ
いて、以下の培地を調製し培養を行った。すなわち、ビ
ートアラビナン１．０％、リン酸水素２アンモニウム
０．３％、リン酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネ
シウム０．０５％、酵母エキス０．３％である。上記培
地２０mlを含む１００ml容三角フラスコに１白金耳接種
し、３０℃、２１０rpmで３日間振とう培養し、種培養
液とした。ついで、同培地１００mlを含む５００ml容三
角フラスコに種培養液２mlを植菌し、３０℃、２１０rp
mで４日間振とう培養を行った。培養終了時のアラビノ
フラノシダーゼ活性はおよそ０．０３unit／mlであっ
た。

【００４２】実施例２ 実施例１で得た上清液を硫安塩析により濃縮し、イオン
交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー
により電気泳動的に単一タンパクにまで精製した。精製
したアラビノフラノシダーゼ１の比活性は約１０unit／
mg、アラビノフラノシダーゼ２の比活性は約３unit／mg
であった。これらのアラビノフラノシダーゼは前記の基
質特異性及び酵素学的性質を有していた。

【００４３】実施例３ クローニング 精製したアラビノフラノシダーゼ１、２のＮ末端、並び
にＶ８−プロテアーゼで限定分解した内部ペプチドのＮ
末端アミノ酸配列を基に合成したプライマーを用い、斉
藤・三浦法（バイオキミカ・バイオフィス・アクタ、７
２巻、p.６１９（１９６３）；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，p.６１９（１９６３））に
より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により
ＤＮＡを増幅した。その結果、精製酵素のＮ末端及び内
部アミノ酸配列をコードしている領域を含む増幅断片が
得られた。 次に、この断片をプローブとしてジェノミ
ックサザンハイブリダイゼーションを行った。その結
果、アラビノフラノシダーゼ１はＢａｍＨ１およびＢｇ
ｌIIでゲノムＤＮＡを共切断したときに、またアラビノ
フラノシダーゼ２ではＳａｌ Iで切断したときに単一な
バンドが得られた。

【００４４】以上の結果を基にアラビノフラノシダーゼ
１、２遺伝子のクローニングを試みた。まず、Ｔｒｉｇ
ｌｉａらの方法（ヌクレイック・アシッド・リサーチ、
１６巻、p.８１８６（１９８８）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，p.８１８６（１９８
８））に従いインバースＰＣＲを行ったところアラビノ
フラノシダーゼ１では約３．５ｋｂｐの、アラビノフラ
ノシダーゼ２では約２．３ｋｂｐのＤＮＡ増幅断片が得
られた。これらのシークエンスを確認し、それぞれの全
長を含むＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。

【００４５】

【発明の効果】本発明のアラビノフラノシダーゼ１は、
糖転移活性を有するため、各種アラビノース含有配糖体
やアラビノオリゴ糖の調製に有用である。また、本発明
のアラビノフラノシダーゼ２は、直鎖（１→５）−α−
Ｌ−アラビナンによく作用するため、アラビナンの酵素
分解や単糖Ｌ−アラビノースの製造などに有効である。
さらに、その高い基質特異性から、アラビノース含有多
糖の構造研究などのための試薬としても有用である。

【００４６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> GODO Shusei co,Ltd. <120> Arabinofuranosidase <130> P00361101 <160> 2 <210> 1 <211> 2478 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(2478) <400> 1 atg tca cgc atc cgc tgg aga tac ggc aca gcc gcc acc gcc ctc ctg 48 Met Ser Arg Ile Arg Trp Arg Tyr Gly Thr Ala Ala Thr Ala Leu Leu 1 5 10 15 gtc gcg gcc ggc ctc gtc ccc acc gcc acc gcg cac gcc gag gac gtc 96 Val Ala Ala Gly Leu Val Pro Thr Ala Thr Ala His Ala Glu Asp Val 20 25 30 acc gac tac tcg atc acc gtc gac ccg gcc gcc aag ggc gcc gcc atc 144 Thr Asp Tyr Ser Ile Thr Val Asp Pro Ala Ala Lys Gly Ala Ala Ile 35 40 45 gac gac acg atg tac ggc gtc ttc ttc gag gac atc aac cgg gcc gcg 192 Asp Asp Thr Met Tyr Gly Val Phe Phe Glu Asp Ile Asn Arg Ala Ala 50 55 60 gac ggc ggt ctg tac gcc gag ctc gtg cag aac cgg tcc ttc gag tac 240 Asp Gly Gly Leu Tyr Ala Glu Leu Val Gln Asn Arg Ser Phe Glu Tyr 65 70 75 80 tcc acg gac gac aac cgg tcc tac acg ccc ctc acc tcc tgg atc gtc 288 Ser Thr Asp Asp Asn Arg Ser Tyr Thr Pro Leu Thr Ser Trp Ile Val 85 90 95 gac ggc acc ggc gag gtc gtg aac gac gcc ggc cga ctg aac gag cgc 336 Asp Gly Thr Gly Glu Val Val Asn Asp Ala Gly Arg Leu Asn Glu Arg 100 105 110 aac cgc aac tac ctc tcc ctg ggc gcc ggt tcg tcc gtc acg aac gcc 384 Asn Arg Asn Tyr Leu Ser Leu Gly Ala Gly Ser Ser Val Thr Asn Ala 115 120 125 ggc tac aac acc ggc atc cgg gtc gag cag ggc aag cgg tac gac ttc 432 Gly Tyr Asn Thr Gly Ile Arg Val Glu Gln Gly Lys Arg Tyr Asp Phe 130 135 140 tcg gtg tgg gcc cgc gcc ggc agc gcc agc acg ctc acc gtc gcc ctg 480 Ser Val Trp Ala Arg Ala Gly Ser Ala Ser Thr Leu Thr Val Ala Leu 145 150 155 160 aag gac gcc gcc ggc acg ctg gcg acc gcc cgc cag gtg gcc gtc gag 528 Lys Asp Ala Ala Gly Thr Leu Ala Thr Ala Arg Gln Val Ala Val Glu 165 170 175 ggc ggc tgg gcc aag tac agg gcc acg ttc acc gcg acc cgc acc agc 576 Gly Gly Trp Ala Lys Tyr Arg Ala Thr Phe Thr Ala Thr Arg Thr Ser 180 185 190 aac cgc ggc cgc ctc gcc gtc gcc gcc aac gac gcg gcg gcc ctc gac 624 Asn Arg Gly Arg Leu Ala Val Ala Ala Asn Asp Ala Ala Ala Leu Asp 195 200 205 atg gtg tcg ctg ttc ccg cgc gac acc tac cgg aac cag cag aac ggc 672 Met Val Ser Leu Phe Pro Arg Asp Thr Tyr Arg Asn Gln Gln Asn Gly 210 215 220 ctg cgc aag gac ctc gcc gag aag atc gcg gcc ttg cac ccg ggc ttc 720 Leu Arg Lys Asp Leu Ala Glu Lys Ile Ala Ala Leu His Pro Gly Phe 225 230 235 240 gtg cgc ttc ccg ggc ggc tgc ctg gtc aac acc ggc tcc atg gag gac 768 Val Arg Phe Pro Gly Gly Cys Leu Val Asn Thr Gly Ser Met Glu Asp 245 250 255 tac agc gcg gcc tct ggc tgg cag cgc aag cgc tcc tac cag tgg aag 816 Tyr Ser Ala Ala Ser Gly Trp Gln Arg Lys Arg Ser Tyr Gln Trp Lys 260 265 270 gac acc gtc ggc ccg gtc gag gag cgc gcc acc aac gcc aac ttc tgg 864 Asp Thr Val Gly Pro Val Glu Glu Arg Ala Thr Asn Ala Asn Phe Trp 275 280 285 ggt tac aac cag agt tac ggc ctc ggc tac tac gag tac ttc cgc ttc 912 Gly Tyr Asn Gln Ser Tyr Gly Leu Gly Tyr Tyr Glu Tyr Phe Arg Phe 290 295 300 tcc gag gac atc ggc gcc atg ccg ctg ccc gtc gtc ccg gcc ctg gtg 960 Ser Glu Asp Ile Gly Ala Met Pro Leu Pro Val Val Pro Ala Leu Val 305 310 315 320 acg gga tgc ggc cag aac aag gcc gtc gac gac gag gcg ctg ctc aag 1008 Thr Gly Cys Gly Gln Asn Lys Ala Val Asp Asp Glu Ala Leu Leu Lys 325 330 335 agg cac atc cag gac act ctc gac ctg atc gag ttc gcg aac ggc ccg 1056 Arg His Ile Gln Asp Thr Leu Asp Leu Ile Glu Phe Ala Asn Gly Pro 340 345 350 gcg acc tcg aag tgg ggc aag gtc cgt gcc gag atg ggc cat ccg cgg 1104 Ala Thr Ser Lys Trp Gly Lys Val Arg Ala Glu Met Gly His Pro Arg 355 360 365 ccc ttc cgc ctc acg cac ctc gag gtc ggc aac gag gag aac ctc ccc 1152 Pro Phe Arg Leu Thr His Leu Glu Val Gly Asn Glu Glu Asn Leu Pro 370 375 380 gac gag ttc ttc gac cgc ttc aag cag ttc cgt gcc gcc atc gag gcc 1200 Asp Glu Phe Phe Asp Arg Phe Lys Gln Phe Arg Ala Ala Ile Glu Ala 385 390 395 400 gag tat ccg gac atc acg gtc gtc tcc aac tcc ggc ccc gac gac gcc 1248 Glu Tyr Pro Asp Ile Thr Val Val Ser Asn Ser Gly Pro Asp Asp Ala 405 410 415 ggc acc acc ttc gac acc gcc tgg aag ctc aac cgc gag gcg aac gtc 1296 Gly Thr Thr Phe Asp Thr Ala Trp Lys Leu Asn Arg Glu Ala Asn Val 420 425 430 gag atg gtc gac gag cac tac tac aac agc ccc aac tgg ttc ctc cag 1344 Glu Met Val Asp Glu His Tyr Tyr Asn Ser Pro Asn Trp Phe Leu Gln 435 440 445 aac aac gac cga tac gac tcc tac gac cgg ggc ggc ccg aag gtc ttc 1392 Asn Asn Asp Arg Tyr Asp Ser Tyr Asp Arg Gly Gly Pro Lys Val Phe 450 455 460 ctc ggc gag tac gcc tcc cag ggc aac gcc tgg aag aac ggc ctc tcc 1440 Leu Gly Glu Tyr Ala Ser Gln Gly Asn Ala Trp Lys Asn Gly Leu Ser 465 470 475 480 gaa gcc gcg ttc atg acc ggc ctg gag cgc aac gcg gac gtc gtc aag 1488 Glu Ala Ala Phe Met Thr Gly Leu Glu Arg Asn Ala Asp Val Val Lys 485 490 495 ctg gcc tcg tac gcc ccg ctt ctc gcc aac gag gac tac gtc cag tgg 1536 Leu Ala Ser Tyr Ala Pro Leu Leu Ala Asn Glu Asp Tyr Val Gln Trp 500 505 510 cgt ccg gac ctg gtc tgg ttc aac aac cgc gcc tcc tgg aac tcg gcg 1584 Arg Pro Asp Leu Val Trp Phe Asn Asn Arg Ala Ser Trp Asn Ser Ala 515 520 525 aac tac gag gtc cag aaa ctg ttc atg aac aac gtc ggc gac cgg gtc 1632 Asn Tyr Glu Val Gln Lys Leu Phe Met Asn Asn Val Gly Asp Arg Val 530 535 540 gtc ccc tcg aag gcc acc acc acg ccg gac gtc agc ggc ccg atc acc 1680 Val Pro Ser Lys Ala Thr Thr Thr Pro Asp Val Ser Gly Pro Ile Thr 545 550 555 560 ggt gcc gtc ggc ctc tcg acc tgg gcg acc ggc acc gcg tac gac gac 1728 Gly Ala Val Gly Leu Ser Thr Trp Ala Thr Gly Thr Ala Tyr Asp Asp 565 570 575 gtg aag gtc acc gcg gcg gac ggg gcc acg ctg ctg agc gac gac ttc 1776 Val Lys Val Thr Ala Ala Asp Gly Ala Thr Leu Leu Ser Asp Asp Phe 580 585 590 tcc ggt gac gcc tcg aag tgg acg cac acc ggc gcc ggc agc tgg agc 1824 Ser Gly Asp Ala Ser Lys Trp Thr His Thr Gly Ala Gly Ser Trp Ser 595 600 605 gtc cag gac ggc cag tac gtc cag acg gac gcg gcg gcg gag aac acc 1872 Val Gln Asp Gly Gln Tyr Val Gln Thr Asp Ala Ala Ala Glu Asn Thr 610 615 620 atg gtc cag gcc ggc gac ccg tcc tgg cac gac tac gac ctg cat gtg 1920 Met Val Gln Ala Gly Asp Pro Ser Trp His Asp Tyr Asp Leu His Val 625 630 635 640 aag gcc acc aag aag tcc ggc aag gag ggc ttc ctc gtc gcc ttc ggc 1968 Lys Ala Thr Lys Lys Ser Gly Lys Glu Gly Phe Leu Val Ala Phe Gly 645 650 655 gtc aag gac acc ggc aac tac tac tgg tgg aac ctg ggc ggc tgg aac 2016 Val Lys Asp Thr Gly Asn Tyr Tyr Trp Trp Asn Leu Gly Gly Trp Asn 660 665 670 aac acc cag tcc gcc gtc gag cag gcc gtg gac ggc ggc aag ggc acg 2064 Asn Thr Gln Ser Ala Val Glu Gln Ala Val Asp Gly Gly Lys Gly Thr 675 680 685 ctg ctc acc aag gcc ggc tcg atc gag acg ggc cgc gcc tac gac atc 2112 Leu Leu Thr Lys Ala Gly Ser Ile Glu Thr Gly Arg Ala Tyr Asp Ile 690 695 700 gac gtc aag gtg cgc ggc cgc cag gtc acc ctg tac ctc gac ggc cag 2160 Asp Val Lys Val Arg Gly Arg Gln Val Thr Leu Tyr Leu Asp Gly Gln 705 710 715 720 gag tgg ggc ggc ttc acg gac gac aag ccg gcc gag ccg ttc cgt cag 2208 Glu Trp Gly Gly Phe Thr Asp Asp Lys Pro Ala Glu Pro Phe Arg Gln 725 730 735 gtc gtc acc aag gac gcc cgg acc ggt gac ctg atc gtc aag gtc gtc 2256 Val Val Thr Lys Asp Ala Arg Thr Gly Asp Leu Ile Val Lys Val Val 740 745 750 aac gcc cag ccg gcc gag gcc cgc acc gcg atc gac ctg ggc ggc gcc 2304 Asn Ala Gln Pro Ala Glu Ala Arg Thr Ala Ile Asp Leu Gly Gly Ala 755 760 765 agg gtc gcc tcc acg gcc cgg gtc acc acc ctc gcc gcc gac cag gac 2352 Arg Val Ala Ser Thr Ala Arg Val Thr Thr Leu Ala Ala Asp Gln Asp 770 775 780 gcg gtg aac acc gag acg gac gca ccg gtc acc ccg gcg acg tcc acc 2400 Ala Val Asn Thr Glu Thr Asp Ala Pro Val Thr Pro Ala Thr Ser Thr 785 790 795 800 ttc tcg ggg gtc acg gac agg ttc acg tac acc ttc ccg gcg aac tcc 2448 Phe Ser Gly Val Thr Asp Arg Phe Thr Tyr Thr Phe Pro Ala Asn Ser 805 810 815 gtg acg ttc ctg cgg ctc aag cag agg tag 2478 Val Thr Phe Leu Arg Leu Lys Gln Arg 820 825

【００４７】 <210> 2 <211> 987 <212> DNA <213> Streptomyces sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(987) <400> 2 atg tgt acc cga gag gca gtc cgt atg agc cgc gaa cac gac ctg ccc 48 Met Cys Thr Arg Glu Ala Val Arg Met Ser Arg Glu His Asp Leu Pro 1 5 10 15 gaa atc ccc agc cgc aga ctg ctg ttg aag ggt gcc gcg gcc gcc ggc 96 Glu Ile Pro Ser Arg Arg Leu Leu Leu Lys Gly Ala Ala Ala Ala Gly 20 25 30 gcc ctc acg gcc gtc ccc ggc gtc gcc cat gcc gcc ccc agg ccg gcg 144 Ala Leu Thr Ala Val Pro Gly Val Ala His Ala Ala Pro Arg Pro Ala 35 40 45 ccc tac gag aac ccc ctc gtc cgg cag cgc gcc gac ccc cac atc cac 192 Pro Tyr Glu Asn Pro Leu Val Arg Gln Arg Ala Asp Pro His Ile His 50 55 60 cgc cac acg gac ggc cgt tac tac ttc acg gcc acc gct ccc gag tac 240 Arg His Thr Asp Gly Arg Tyr Tyr Phe Thr Ala Thr Ala Pro Glu Tyr 65 70 75 80 gac cgg atc gtc ctg cgc cgc tcc cgc acc ctg ggc ggc ctg tcc acg 288 Asp Arg Ile Val Leu Arg Arg Ser Arg Thr Leu Gly Gly Leu Ser Thr 85 90 95 gcg gcc gag tcg gtc atc tgg cgg gcc cac ccc acc ggc gac atg gcc 336 Ala Ala Glu Ser Val Ile Trp Arg Ala His Pro Thr Gly Asp Met Ala 100 105 110 gcc cac atc tgg gcg ccg gag ctg cac cgc atc ggc ggc aag tgg tac 384 Ala His Ile Trp Ala Pro Glu Leu His Arg Ile Gly Gly Lys Trp Tyr 115 120 125 gtc tac ttc gcc gcc gcg ccc gcc gaa gac gtg tgg cgc atc cgt atc 432 Val Tyr Phe Ala Ala Ala Pro Ala Glu Asp Val Trp Arg Ile Arg Ile 130 135 140 tgg gtc ctg gag aac tcc cac ccc gac ccg ttc aag ggc acc tgg gag 480 Trp Val Leu Glu Asn Ser His Pro Asp Pro Phe Lys Gly Thr Trp Glu 145 150 155 160 gag aag ggg cag gtc agg acg gcc tgg gag acc ttc tcc ctc gac gcc 528 Glu Lys Gly Gln Val Arg Thr Ala Trp Glu Thr Phe Ser Leu Asp Ala 165 170 175 acc acc ttc acc cac cgg ggc gcc cgc tac ctc tgc tgg gcg cag cac 576 Thr Thr Phe Thr His Arg Gly Ala Arg Tyr Leu Cys Trp Ala Gln His 180 185 190 gag ccc ggg gcg gac aac aac acc ggc ctg ttc ctg tcc gag atg gcg 624 Glu Pro Gly Ala Asp Asn Asn Thr Gly Leu Phe Leu Ser Glu Met Ala 195 200 205 aac ccc tgg acg ctg acg gga cct cag atc cgg ctg tcc aca ccg gag 672 Asn Pro Trp Thr Leu Thr Gly Pro Gln Ile Arg Leu Ser Thr Pro Glu 210 215 220 tac gac tgg gag tgc gtc ggc tac aag gtc aac gag ggc ccc tac gcc 720 Tyr Asp Trp Glu Cys Val Gly Tyr Lys Val Asn Glu Gly Pro Tyr Ala 225 230 235 240 ctc aag cgc aac ggc cgc atc ttc ctc act tac tcg gcc tcc gcc acc 768 Leu Lys Arg Asn Gly Arg Ile Phe Leu Thr Tyr Ser Ala Ser Ala Thr 245 250 255 gac cac cac tat tgc gtc ggc atg ttc acc gcc gac gcc ggc ggc aac 816 Asp His His Tyr Cys Val Gly Met Phe Thr Ala Asp Ala Gly Gly Asn 260 265 270 ctc atg gac ccg ggc aac tgg tcc aag tcc ccg atc ccg gtc ttc acc 864 Leu Met Asp Pro Gly Asn Trp Ser Lys Ser Pro Ile Pro Val Phe Thr 275 280 285 ggc aac gag acc acg aag cag tac ggc ccc ggc cac aac tgc ttc acc 912 Gly Asn Glu Thr Thr Lys Gln Tyr Gly Pro Gly His Asn Cys Phe Thr 290 295 300 gtc gcc gag gac ggc cgc agc gac gtg ctc gtc tac cac gcc cgt cag 960 Val Ala Glu Asp Gly Arg Ser Asp Val Leu Val Tyr His Ala Arg Gln 305 310 315 320 tac aag gag atc gtc ggc gac ccc tga 987 Tyr Lys Glu Ile Val Gly Asp Pro 325

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素遺伝子を保有するプラスミド、ｐ
ＣＲ−２．１の構造を示す図である。プラスミドの分子
量は約６．３ｋｂである。図中、ＡＦａｓｅ１と記した
矢印部分が本発明の酵素遺伝子であり、矢印は遺伝子の
転写方向を示している。また、図中の引出し線は本プラ
スミド中の代表的な制限酵素サイトを示す。

【図２】本発明のアラビノフラノシダーゼ１について、
メチル−α−（１→２）−Ｌ−アラビノフラノビオシド
に対して作用させたときの反応生成物のＨＰＬＣチャー
トである。

【図３】本発明のアラビノフラノシダーゼ２について、
（ａ）はビートアラビナン及び直鎖（１→５）−α−Ｌ
−アラビナンに対する分解の経時変化を、（ｂ）は３種
類のメチル−α−Ｌ−アラビノフラノビオシド位置異性
体（１→２、１→３、１→５）に対する分解の経時変化
を示した図である。それぞれ、縦軸は分解率、横軸は反
応時間を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 BA12 CA02 DA05 EA04 GA11 HA01 HA14 4B050 CC03 DD02 LL01 LL02 4B065 AA50Y AB01 AC14 BA02 CA31 CA41 CA44

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンに
   対する加水分解活性を有するアラビノフラノシダーゼ。
2. 【請求項２】 （１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフ
   ラノース残基に特異的に作用するものである請求項１記
   載のアラビノフラノシダーゼ。
3. 【請求項３】 次の酵素学的性質を有するものである請
   求項１または２記載のアラビノフラノシダーゼ。 （１）分子量 約３７キロダルトン（ＳＤＳ電気泳動法による） （２）等電点 ｐＨ７．５付近（等電点電気泳動法による） （３）作用ｐＨおよびｐＨ安定性 ４０℃におけるアラビノフラノシダーゼ作用ｐＨはｐＨ
   ７．０近傍に至適がある。３０℃、２時間放置した際の
   アラビノフラノシダーゼ作用の安定性はｐＨ５．０〜
   ９．０の範囲で安定である。 （４）至適温度および安定性 ｐＨ７．０、１０分反応時のアラビノフラノシダーゼ作
   用温度は５０℃近傍に至適がある。ｐＨ７．０、２時間
   放置後のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性は４０℃
   までである。
4. 【請求項４】 糖転位活性を有するアラビノフラノシダ
   ーゼ
5. 【請求項５】 次の酵素学的性質を有するものである請
   求項４記載のアラビノフラノシダーゼ （１）分子量 約８０キロダルトン（ＳＤＳ電気泳動法による） （２）等電点 ｐＨ６．６付近（等電点電気泳動法による） （３）作用ｐＨおよびｐＨ安定性 ４０℃におけるアラビノフラノシダーゼ作用ｐＨはｐＨ
   ５．５近傍に至適がある。３０℃、２時間放置した際の
   アラビノフラノシダーゼ作用の安定性はｐＨ５．５〜
   ８．５の範囲で安定である。 （４）至適温度および安定性 ｐＨ５．５、１０分反応時のアラビノフラノシダーゼ作
   用温度は５５℃近傍に至適がある。ｐＨ７．０、２時間
   放置後のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性は４０℃
   までである。
6. 【請求項６】 配列番号１に示すアミノ酸配列を有する
   か、またはそのアミノ酸配列の１若くは数個のアミノ酸
   が欠失、置換若くは付加されたアミノ酸配列を有するも
   のである請求項４又は５記載のアラビノフラノシダー
   ゼ。
7. 【請求項７】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有する
   か、またはそのアミノ酸配列の１若くは数個のアミノ酸
   が欠失、置換若くは付加されたアミノ酸配列を有するも
   のである請求項１〜３のいずれか１項記載のアラビノフ
   ラノシダーゼ。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項記載の性質
   を有するアラビノフラノシダーゼを生産するストレプト
   ミセス・エスピーＧＳ−９０１株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
   ｃｅｓ ｓｐ．ＧＳ−９０１）
9. 【請求項９】 ストレプトミセス・エスピーＧＳ−９０
   １株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＳ−９０
   １）またはその変異株由来のものである請求項１〜７の
   いずれか１項記載のアラビノフラノシダーゼ。
10. 【請求項１０】 請求項１〜７のいずれか１項記載のア
    ラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子。
11. 【請求項１１】 配列番号１に示す塩基配列を有する
    か、またはその塩基配列の１若くは数個の塩基が欠失、
    置換若くは付加された塩基配列を有するものである請求
    項１０記載の遺伝子。
12. 【請求項１２】 配列番号２に示す塩基配列を有する
    か、またはその塩基配列の１若くは数個の塩基が欠失、
    置換若くは付加された塩基配列を有するものである請求
    項１０記載の遺伝子。
13. 【請求項１３】 ストレプトミセス・エスピーＧＳ−９
    ０１株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＳ−９０
    １）またはその変異株由来のものである請求項１１また
    は１２記載の遺伝子。
14. 【請求項１４】 請求項１０〜１３のいずれか１項に記
    載の遺伝子を有する菌株を培地中に接種し、培養してア
    ラビノフラノシダーゼを菌体内または培地中に生成蓄積
    せしめ、培養物から該酵素を採取することを特徴とす
    る、請求項１〜７のいずれか１項記載のアラビノフラノ
    シダーゼの製造方法。