JP2000219699A - 遅発育性抗酸菌ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】結核等の病原性抗酸菌の新たな診断予防、ワク
チン及び治療剤を提供する。 【解決手段】１又は複数個のアミノ酸が置換、付加又は
欠失していてもよい配列番号１（２０５個のアミノ酸）
で表される病原性抗酸菌に対する免疫原性を有するポリ
ペプチド；該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮ
Ａを含むベクターまたは形質転換体、および該ポリペプ
チドの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遅発育性抗酸菌
（マイコバクテリウム）の産生するポリペプチドおよび
その誘導体、該ポリペプチドをコードするＤＮＡに関す
る。

【０００２】

【従来の技術及びその課題】ヒト結核菌（Mycobacteriu
m tuberculosis)、らい菌（Mycobacterium leprae）な
どの病原性抗酸菌（マイコバクテリウム）は非常に増殖
の緩慢な菌で、人類の３分の１に感染しているといわれ
る。遅発育性は、細胞内寄生を可能にし、また薬剤に対
する抵抗性を付与する。

【０００３】本発明者は、病原性抗酸菌の遅発育メカニ
ズムを解明し、結核等の病原性抗酸菌の新たな診断予
防、ワクチン及び治療剤を提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
鑑み鋭意検討した結果、ＢＣＧ東京株からの配列番号１
で表されるポリペプチド（以下、ＭＤＰ１(Mycobacteri
umDNA BindingProtein 1)と略す）を分離し、該ポリペプ
チドが遅発育性の原因であることを見出した。

【０００５】すなわち、本発明は以下の項１〜項４を提
供するものである。 項１． １又は複数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失
していてもよい配列番号１（２０５個のアミノ酸）で表
される病原性抗酸菌に対する免疫原性を有するポリペプ
チド。 項２． 項１に記載のポリペプチドをコードしてなるＤ
ＮＡ。 項３． 項２に記載のＤＮＡを含むベクターまたは該ベ
クターを含む形質転換体。 項４． 項３に記載の形質転換体を培養することを特徴
とする項１に記載のポリペプチドの製造法。

【０００６】該ポリペプチド、特にリン酸化されたＭＤ
Ｐ１は、結核の診断およびワクチンの製造に有用であ
る。該ポリペプチドは、糖鎖により修飾されていてもよ
い。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明のポリペプチドは、例えば
ＢＣＧ東京株から得ることができるが、該株に限定され
ず、他のＢＣＧ株、或いは結核菌、らい菌等のマイコバ
クテリウム属の菌から得られる蛋白質であっても本発明
に包含される。

【０００８】本発明の２０５個のアミノ酸からなるポリ
ペプチドは、病原性抗酸菌に対する免疫原性を有する限
り１又は複数個、好ましくは１〜数個のアミノ酸が特定
の位置又はランダムに置換、付加又は欠失していても良
い。また、本発明のポリペプチドはリン酸化されたもの
であるのが好ましい。なお、病原性抗酸菌に対する免疫
原性を有するとは、該ポリペプチドを必要に応じて他の
タンパク質などと組み合わせて哺乳動物に投与したとき
に病原性抗酸菌に対する抗体産生を誘導する能力を有す
ることを意味する。

【０００９】前記アミノ酸をコードするＤＮＡは、該Ｄ
ＮＡがコードするポリペプチドが病原性抗酸菌に対する
免疫原性を有する限り１又は複数個、好ましくは１〜数
個の核酸塩基が特定の位置又はランダムに置換、付加又
は欠失していても良い。本発明のＤＮＡには、配列番号
２のＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイ
ズするＤＮＡを包含する。

【００１０】特定のアミノ酸を置換、付加又は欠失する
方法としては、ポイントミューテーション法、ＰＣＲを
利用したdeletion/insertion法などの従来公知の方法が
広く用いられる。

【００１１】本明細書において、「ストリンジェントな
条件」とは、通常ハイブリダイズ法で用いられる条件を
意味し、このような条件は、当業者であれば容易に理解
できる。

【００１２】本発明のポリペプチドは、例えば、該ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだベクターを細
胞に導入して形質転換体とし、該形質転換体を培地中で
培養することを特徴とする前記項１で表されるポリペプ
チドの製造法により製造される。

【００１３】上記のポリペプチドをコードするＤＮＡを
組み込んだベクターで形質転換される細胞としては、特
に限定されず、従来公知の形質転換用の細胞が広く用い
られるが、例えば大腸菌、ＢＣＧ菌等の細菌類、酵母な
どの真核微生物、マウス、ラット、ハムスター、ヒト、
等の各種哺乳動物の培養細胞が挙げられ、好ましくは細
菌又は酵母が例示される。

【００１４】大腸菌等へのベクターの導入も、公知の方
法に従い行うことができる。

【００１５】本発明のポリペプチドの製造に用いられる
ベクターとしては、本発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡの翻訳に必要なプロモーター等を備えている限り
特に限定されないが、例えば、pBluescript、pGEX等が
挙げられる。

【００１６】本発明は、該ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを組み込んだベクターが前記細胞に組み込まれた形
質転換体にも関する。

【００１７】該形質転換体が培養される培地は、形質転
換される細胞の種類にもよるが、例えば大腸菌などの微
生物の場合には、炭素源（グルコース等）、窒素源（硫
酸アンモニウムなど）、無機物（リン酸ナトリウム、硫
酸鉄、硫酸マンガンなど）を含む培地が挙げられる。温
度、ｐＨ、時間などの培養条件は、各種細胞の通常の培
養条件がそのまま用いられる。

【００１８】本発明のポリペプチドを結核または抗酸菌
の診断に用いる場合、本発明のポリペプチドまたはポリ
ペプチド中に含まれる数個から数十個のペプチドを抗原
として用い、該抗原を、抗体を含む生物試料（血清な
ど）とをin vitroで接触させ、次いで、得られた抗原抗
体複合体を検出することにより結核または抗酸菌の診断
を行うことができる。ＭＤＰ１のワクチンへの応用 さまざまな難病の防御抗原（マラリア等の原虫感染症、
肺炎球菌、クラミジア等の細菌感染症、ＨＩＶやインフ
ルエンザ等のウイルス感染症など）が同定され、動物実
験レベルでは感染防御効果を得ているが、ヒトに応用す
る場合、安全で有効なアジュバントが開発されていない
ため、十分な感染防御効果が得られず、ワクチンとして
使用するに至っていない。

【００１９】本発明者は、配列番号１のアミノ酸配列を
有するＭＤＰ１は、ＤＮＡと結合させることで免疫原性
が増強され、抗体価が上がることを証明した。上記の防
御抗原をＭＤＰ１内に組み込み、融合タンパク質として
ＤＮＡとともに使用することで、感染性のない安全で有
効なワクチンを製造できる。また、アジュバント活性が
十分でない場合には、融合タンパク質を形質転換の宿主
細胞としてのＢＣＧ菌内で発現させ、それをワクチンと
して活用できる。ＢＣＧはアジュバント活性最大の生ワ
クチンであり、効果が持続し、また安全なワクチンとし
て現在も使用されている。

【００２０】ＭＤＰ１のワクチンとしての使用の態様と
しては、 １．ＭＤＰ１内に異種抗原を発現させた融合蛋白質をＤ
ＮＡとともにワクチンとして使用する； ２．上記融合タンパク質を，ＤＮＡ、既存アジュバント
とともにワクチンとして使用する； ３．上記融合タンパク質をＢＣＧ菌内で発現させ、生ワ
クチンとして使用する；などが例示される。

【００２１】

【発明の効果】本発明によれば、マイコバクテリウム、
大腸菌などの細菌に対し遅発育性を示す新規ポリペプチ
ドを単離し、その構造を明らかにした。

【００２２】該ポリペプチドは、遺伝子工学の方法によ
り容易に大量生産でき、結核、らい等の診断用の抗原、
ワクチン開発等に応用可能である。

【００２３】本発明のポリペプチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ
またはリボソームに結合して増殖を遅延させるものであ
り、感染症ないし癌の治療にも使用できる。

【００２４】

【実施例】以下、本発明を具体的な実施態様を用いてよ
り詳細に説明する。 製造例１ (1) バクテリア株、プラスミド、培養液 ＢＣＧ東京株、M.tuberculosis H37Rv及びM. smegmatis
ATCC606は、ソートン培地または１０％ＡＤＣ濃縮物及
び０．０５％ツイーン８０を添加したミドルブルック７
Ｈ９ブロス（ディフコ ラボラトリーズ、デトロイト、
米国）中、３７℃で増殖させた。M. leprae 53タイ株
は、マツオカ・マサノリ博士から得た。M.smegmatis
は、プラスミドｐＳＯ２４６及びその誘導体の宿主とし
て使用した。

【００２５】組換えM. smegmatisクローンは、１０％Ｏ
ＡＤＣ濃縮物（ディフコ ラボラトリーズ）、０．５％
グリセロール、ペニシリン４００単位／ｍｌ、シクロヘ
キシミド１００μｇ／ｍｌ７Ｈ１０アガー）を添加した
ミドルブルック７Ｈ１０アガー（ディフコ ラボラトリ
ーズ）上で培養することにより選択した。大腸菌株XL1-
Blueは、プラスミドpBluescript SK(+) (pBS SK+)（ス
トラタジーン・クローニング・システム、カリフォルニ
ア、米国）またはｐＧＥＸ４Ｔ−３（ファルマシア・バ
イオテック、東京、日本）及びその誘導体の宿主として
使用した。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥは、
ｐＥＴ２２ｂ（＋）(Novagen Madison米国）、λＭＳＯ
Ｅｌｏｘ（アマシャム）及びその誘導体の宿主として使
用した。すべての大腸菌株は、ＬＢブロスで増殖させ
た。 (2) ＢＣＧからのＭＤＰ１の精製 酸可溶性蛋白質を既述(Jhon et al., 1967)のいくつか
の改変方法で沈殿させた。バクテリアは、５０ｍｌＴＭ
ＮＳＨ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ＝７．５、１０
ｍＭＭｇＣｌ₂、６０ｍＭＮＨ₄Ｃｌ、及び６ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール）に再懸濁し、超音波により破砕し
た。３００００ｇで２時間遠心分離して得たペレット
を、０．２５Ｎ ＨＣｌに４℃で終夜攪拌することによ
り再懸濁し、２００００ｇで２０分間遠心分離した。上
澄に０．１倍量の１００％（ｗ／ｖ）ＴＣＡを激しく攪
拌しながら加えた。４℃で４時間静置して形成した沈殿
を遠心分離により回収し、アセトン（２０ｍｌ）に０．
０１ｍｌの濃塩酸を加えた酸性アセトンで１回洗浄し、
アセトンで２回洗浄し、真空デシケーターで乾燥した。
乾燥された沈殿を０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）に再懸濁した。次に、酸可溶性蛋白質を０．
２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中のグラニ
ジン塩酸塩ＧｄｎＣｌの直線グラジエントによりファー
ストフローカラム（ベッドボリューム５ｍｌ；ファルマ
シア）Hitrap CM Sepharose上を用い室温でクロマトグ
ラフィーにかけて分画した。グラジエントは、１５ｍｌ
の０及び５％ＧｄｎＣｌ溶液を充填したグラジエント装
置で行った。１ｍｌ／ｍｉｎの流速に維持し、１ｍｌの
各フラクションを集めた。精製されたＭＤＰ１を含むフ
ラクションを５％ＧｄｎＣｌを含む０．２Ｍリン酸緩衝
液に対して透析し、濃縮した。最後に、Hiload Seperde
x 200 pgカラム（ファルマシア）上でのゲル濾過により
さらに精製した。蛋白質の純度は２２０ｎｍの吸光度の
測定又はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析でモニターした。 (3) アミノ酸配列の決定 アミノ酸分析用の標品を、ＰＶＤＦ膜（ミリポア、マサ
チューセッツ、米国）からの蛋白質バンドを切り出すこ
とにより得た。１２．５％ポリアクリルアミドゲル中の
蛋白質は、０．０５％ＳＤＳを含む３−［シクロヘキシ
ルアミノ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ；シグ
マ、セントルイスミズーリ）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１
１）を用いてＰＶＤＦ膜上で電気泳動的にブロットし
た。ＣＢＢによる染色後、蛋白質のスポットをアプライ
ドバイオシステム４７７Ａガスフェーズシークエンサー
（アプライドバイオシステムズ）での自動エドマン分解
によるアミノ末端配列の決定に供した。 (4) 遺伝子クローニング、ＤＮＡ配列決定及びコンピュ
ーター分析 ＢＣＧのゲノムＤＮＡをＤＮＡの主要部分が１〜５ｋｂ
ｐになるまで注射針を繰り返し通すことにより断片化
し、アマーシャム(Amersham)のｃＤＮＡラピッド・アダ
プター・ライゲーション・モジュールを用いてＥｃｏＲ
Ｉアダプターにライゲートし、λＭＯＳＥｌｏｘのＥｃ
ｏＲＩ部位に挿入した。コロニー・ハイブリダイゼーシ
ョンを既述のように（マツオら、１９８８）、Ｎ末端ア
ミノ酸配列と相同な２セットの［α−³²Ｐ］標識化オリ
ゴヌクレオチドプローブを用いて行った。プローブ１、
２の配列は、５’−ＡＴＧＡＡＣＡＡＧＧＣ（Ｃ又は
Ｇ）ＧＡＧＣＴ（Ｃ又はＧ）ＡＴＣＧＡＣＧＴ（Met-1
〜Val-9に相当）及び５’−ＧＡＣＧＴ（Ｃ又はＧ）
（Ｔ又はＣ）Ｔ（Ｃ又はＧ）ＡＣ（Ｃ又はＧ）ＣＡＧＡ
ＡＧ（Ｔ又はＣ）Ｔ（Ｃ又はＧ）ＧＧ（Asp-8〜Gly-15
に相当）であった。ＭＤＰ１遺伝子を含む挿入されたＤ
ＮＡフラグメントは、タック・ダイ・プライマー・サイ
クル・シークエンシング・キット及び３７３Ａシステム
（アプライド・バイオシステムズ）を用いて配列決定し
た。配列相同性のサーチは、ファスタプログラム(fasta
program；ピアソン及びリップマン、１９８８)を用い
たＤＤＢＪ（静岡）データベースを通して行った。 (5) 大腸菌におけるＧＳＴとの融合蛋白質としてのＭＤ
Ｐ１の発現 プライマーは、ＭＤＰ１遺伝子の増幅のために合成し
た。プライマーＡのＤＮＡ配列は、5'GGggatccGGGAGGGT
TGGGATGAACAAAGCAG（センス鎖）であり、プライマーＢ
のＤＮＡ配列は5'GGGggatccAGCACGTGGGTGTTGTCGTTG（ア
ンチセンス鎖）であった。小文字は、加えた制限酵素部
位を示す。プライマーＡ及びＢにより増幅された生成物
は、HindIII及びBamHIで消化され、ｐＧＥＸ４Ｔ−３の
同じ部位に挿入された。最終構築物はｐＧＥＸＭＤＰ１
と名付けられた。大腸菌はこのプラスミドにより形質転
換された。ＧＳＴ−ＭＤＰ１の発現は、製造元（ファル
マシア）の説明書に従い行った。 (6) ゲル遅延試験 １００ｎｇのｐＢＳＫＳ＋、HindIIIで消化されたｐＢ
ＳＫＳ＋、または２４０ｎｇのＭＳ２ファージＲＮＡ
を、５％グリセロールを含むＰＢＳ６μｌ中に種々の量
のＭＤＰ１（最終濃度；20，10，5，2.5，1.25，0，μ
Ｍ）と混合した。サンプルを３７℃で１０分間プレイン
キュベートし、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中、
ＴＡＥ緩衝液を用いた電気泳動により分析し、エチジウ
ムブロミド（ＥｔＢｒ）で染色した。核酸を紫外線下に
可視化した。 (7) 免疫電子顕微鏡試験 免疫電子顕微鏡試験を既知のようにして行った（Ferrei
ra等、１９９２）。 (8) ＢＣＧフラクションの調製 ソートン培地中３７℃で培養したＢＣＧをＴＭＮＳＨ緩
衝液中で超音波により破砕した。破砕物を１０００ｇで
４℃、５分間の遠心分離を２回行い、壊れていない細胞
を除去した。次いで、細胞壁、細胞膜、リボソーム、細
胞質画分既知の方法により調製した（大原ら、１９９
７）。分泌タンパク質は既述のように調製した（松本
ら、１９９６ｂ）。 (9) ＢＣＧの50Sリボソームサブユニット由来のリボソ
ーム及びＭＤＰ１の精製 ＢＣＧ由来のリボソームの調製及びリボソームサブユニ
ットの分離は、既に記載されている（山田ら、１９７
２）。リボソーム蛋白質は、既知のように（ヒンデンナ
ッハら、１９７１）、０．１ＭＭｇＣｌ₂の存在下に６
６％酢酸を用いて５０Ｓサブユニットから抽出した。次
いで、抽出物を５％酢酸に対して透析し、凍結乾燥し
た。抽出された蛋白質は、Ｃ₄カラムを用い日立Ｌ−６
０００ＨＰＬＣシステムを用いた逆相−ＨＰＬＣにより
分離した。２ｍｇの５０Ｓ総蛋白質を、０．１％ＴＦＡ
中の３０〜７０％のアセトニトリルの直線グラジエント
を用い、９０分間０．６ｍｌ／ｍｉｎの流速でクロマト
グラフを行った。溶離液は、２２０ｎｍの吸光度の測定
又はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析でモニターした。 (10)免疫手法 ＭＤＰ１に対する抗血清を、フロイント不完全アジュバ
ント中の２０μｇの精製ＭＤＰ１を雌性ＢＡＬＢ／ｃマ
ウスに２回腹腔内免役して得た。ウエスタンブロット分
析を既知のように行った（松本ら、１９９６ｂ）。 (11)ＭＤＰ１によるインビトロでのＤＮＡ合成の阻害。

【００２６】インビトロでのＤＮＡ合成を既述のように
（サムブルックら、１９８９）クレノウフラグメント
（タカラ）を用いて行った。一本鎖ＤＮＡをｆ１ファー
ジの感染によりｐＢＳＫＳ＋を有する大腸菌ＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅから調製した。反応前に、一本鎖ＤＮＡ（１μ
ｇ）及び５ｐｍｏｌのＭ１３ファージの１２４４プライ
マー（日本ジーン）を８５℃で１０分間インキュベート
し、２２℃までゆっくり冷却してアニーリングした。Ｄ
ＮＡ合成の延長反応は、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．
５）、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１２４
４プライマーのアニールされたＤＮＡ鋳型０．６μｇ、
０．９ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５０μ
Ｃｉの［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ、８ユニットのクレノウフ
ラグメント、１０ｍＭのＤＴＴ中、ＭＤＰ１又はＢＳＡ
の存在下又は不存在下に行った。最終容量は３０μｌで
あった。延長反応は、８分間２２℃で行った。反応は
０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を３０μｌ加えて停止
させた。次いで、サンプルを６８℃でインキュベート
し、クレノウフラグメントを不活性化した。各サンプル
５μｌをグラスファイバーフィルター（Ｔｏｙｏ濾紙）
上にスポットした。濾紙は２０ｍＭピロリン酸ナトリウ
ムを含む５％ＴＣＡで３回洗浄した。濾紙を乾燥後、各
サンプル中のＴＣＡ不溶性［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰをシン
チレーションカウンターにより測定した。 (12)インビトロ転写分析 既述方法（ペダーソンら、１９９４）を改変してインビ
トロ転写分析を行った。各種の量（20，10，5，2.5，1.
25及び0μＭ）のＰＢＳ中の精製ＭＤＰ１及びＢＳＡを
０．１１ｐｍｏｌ（２００ｎｇ）のｐＢＳＫＳ＋と反応
容量を２０μｌに調整して混合した。３７℃で１０分間
インキュベート後、等容量の以下の溶液を加えた：０．
０２％（ｗ／ｖ）ＤＥＰＣ；８０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）；１６ｍＭのＭｇＣｌ₂；４ｍＭのスペ
ルミジン；１０ｍＭのＤＴＴ；１．８ｍＭのＡＴＰ，Ｃ
ＴＰ，ＧＴＰ及びＵＴＰ；１．８４Ｕ／ｍｌのＲＮａｓ
ｅ阻害剤；１．４２Ｕ／ｍｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
（タカラ）及び０．３６ｍＣｉ／ｍｌの［α−³²Ｐ］Ｕ
ＴＰ。インビトロ転写は、３７℃で３０分間行った。次
いで、５μｌのサンプルをグラスファイバーフィルター
上にスポットした。濾紙は２０ｍＭピロリン酸ナトリウ
ムを含む５％ＴＣＡで３回洗浄した。グラスファイバー
フィルターを乾燥後、各サンプル中のＴＣＡ不溶性［α
−³²Ｐ］ＵＴＰをシンチレーションカウンティングによ
り測定した。 (13)インビトロ翻訳分析 インビトロ翻訳分析を、大腸菌Ｓ３０共役転写及び翻訳
システム（プロメガ）を用いて行った。各量（最終濃
度；20，10，5，2.5，1.25及び0μＭ）のＭＤＰ１又は
卵白リゾチーム、７μｌのＳ３０抽出物、５０ｎＣｉ［
³⁵Ｓ］−メチオニン、メチオニンを含まない１０μｌの
プレミックス（プロメガ）、４μｇ（３．３３ｐｍｏ
ｌ）のＭＳ２ＲＮＡ（ベーリンガーマンハイム、東京、
日本）を混合した。最終反応容量は３４μｌであった。
翻訳は３７℃で１時間行った。放射標識メチオニンの取
り込みを評価するために、製造元の説明書に従い、５μ
ｌのサンプルを取り、２４５μｌの１ＭＮａＯＨに溶解
し、最終２０％のＴＣＡで沈殿させた。ＴＣＡ処理され
たサンプルは、グラスファイバーフィルター上にトラッ
プ後、５％ＴＣＡで３回洗浄した。膜を乾燥し、放射能
を測定した。 (14)ＭＤＰ１のリン酸化の検出 １μｇの精製ＭＤＰ１をバクテリアのアルカリホスファ
ターゼ（ＢＡＰ）を用い、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ９．０）及び１ｍＭＭｇＣｌ₂を含む溶液中、６５℃
で１時間処理した。製造元の使用説明書に記載されたよ
うに、ＢＡＰで処理された或いは処理されていないＭＤ
Ｐ１の蛋白イムノブロットホスホスレオニン、ホスホセ
リン、ホスホチロシンに対する抗体（トランスダクショ
ン・ラボラトリーズ、ケンタッキー、米国）を用いてウ
ェスタンブロット法を行った。 (15)速育性細菌におけるＭＤＰ１の発現 Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ中でのＭＤＰ１（ＢＣＧ）の発
現のために、センス鎖用のプライマーＣを合成した。該
オリゴヌクレオチド配列は、5'GGGaagcttTTTGAGGGTGCGT
GCGCGTACであった。プライマーＢ及びＣにより増幅した
ＭＤＰ１構造遺伝子及びその上流領域をコードする遺伝
子をHindIII及びBaMHIの両方で消化し、ｐＢＳＫＳ＋の
同じ部位（ｐＢＭＤＰ１と名付けられた）に挿入され
た。ｐＢＭＤＰ１はHindIII及びBamHIで消化され、ＭＤ
Ｐ１遺伝子を含む１ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをｐＳ
Ｏ２４６（松本ら、１９９６ａ）の同じ部位に挿入し
た。それは、ｐＳＯＭＤＰ１と名付けられた。Ｍ．ｓｍ
ｅｇｍａｔｉｓを既述のように（松本ら、１９９６ｂ）
エレクトロポレーションによりｐＳＯＭＤＰ１でトラン
スフォームした。大腸菌中で非融合形態のＭＤＰ１を発
現するために、以下のプライマーを新たに合成した。セ
ンス鎖用のプライマーＤは、CcatatgAACAAAGCAGAGCTCAT
TGACであり、プライマーＥは、CaagcttCTATTTGCGACCCCG
CCGAGCGGであった。ＭＤＰ１の構造遺伝子を含む増幅さ
れたＤＮＡは、NdeIとHindIIIの両方で切断され、ｐＥ
Ｔ２２ｂ（＋）の同じ部位に挿入された。このプラスミ
ドはｐＥＴ２２ＭＤＰ１と名付けられた。大腸菌株ＢＬ
２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを、ｐＥＴ２２ＭＤＰ１でト
ランスフォームした。トランスフォームされた細胞は、
５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、３４μｇ／ｍｌのク
ロラムフェニコールを含み、並びに、０．５ｍＭのＩＰ
ＴＧを含むか又は含まないＬＢアガー上で増殖させた。結果 (1) ＤＮＡ結合能を有する最も豊富な蛋白質の分析 ＢＣＧ中のＤＮＡ結合蛋白を同定するために、細胞ライ
ゼートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＰＶＤＦ膜上にブロッ
トした。該膜は次いで［α−³²Ｐ］標識pBluescript KS
+(pBSKS+)と反応させ、蛋白−ＤＮＡ相互作用をオート
ラジオグラフで視覚化した。図１Ａに示されるように、
強い反応が２８ｋＤａで観察された。この２８ｋＤａＤ
ＮＡ結合蛋白を、ＭＤＰ１と名付けた。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析は、ＭＤＰ１が最も豊富にある蛋白質であること
を示した（図１Ｄのレーン１の矢印により示される）。
本発明者は、上記のようにＭＤＰ１の精製を行った。最
初に、ＭＤＰ１の豊富なサンプルは、ＢＣＧライゼート
を０．２５Ｎ−ＨＣｌ（図１Ｄのレーン２）で処理し、
次いでイオン交換カラムで精製して調製された。図１Ｂ
は、クロマトグラフのプロフィールを示し、主要ピーク
フラクションの蛋白質は図１Ｄのレーン３に視覚化され
た。このフラクションの蛋白質は、ゲル濾過カラムを通
してさらに精製され（図１Ｃ）高度に精製されたＭＤＰ
１が得られた（レーン４、図１Ｄ）。最終工程におい
て、ＭＤＰ１は、１９５ｋＤａ蛋白として溶出された
（図１Ｄ）。これは、ＭＤＰ１が多量体を形成している
ことを示すものである。ＭＤＰ１の最終収率は１００ｇ
のＢＣＧの新鮮湿重量から約５ｍｇであった。

【００２７】精製されたＭＤＰ１のアミノ酸配列のＮ末
端は、アミノ酸シークエンサーによりMNKAELIDVLYQKLG-
Dと同定された。ＭＤＰ１をコードする遺伝子をクロー
ン化するために、コロニーハイブリダイゼーションをＮ
末端アミノ酸配列（実施例参照）に相当する２つの［α
−³²Ｐ］標識されたセットのオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いて行った。２つのプローブでハイブリダイズさ
れたＤＮＡフラグメントを得、配列決定した。図２Ａ
は、核酸配列及び推定アミノ酸配列を示す。ＤＮＡフラ
グメントは、２６５位にＡＴＧで始まり８８２位のＴＡ
Ｇ終止コドンで終わるオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）を含む。ＭＤＰ１のＮ末端アミノ酸配列（図
２Ａにおいて枠で囲まれた部分）はこのＯＲＦと完全に
一致することが見出された。予期されたように、ＭＤＰ
１は、極度に塩基性（等電点（ＰＩ）が１２．４）であ
り、アラニン、アルギニン、リシン、プロリン及びスレ
オニンを多量に含む。可能性のあるシャイン−ダルガル
ノ（ＳＤ）配列は、開始コドン（図２Ａの下線部）の上
流７ヌクレオチドの位置に観察された。バクテリアにお
いて、いくつかの染色体結合蛋白に観察されたＤＮＡ結
合モチーフは、４６位〜６５位みられた（図２Ａの太い
下線）。この領域は、ＭＤＰ１のＤＮＡ結合部位と予測
される。

【００２８】ＭＤＰ１に相同ないくつかの蛋白質及びア
ミノ酸配列のアラインメントを示すコンピューター検索
が、図２Ｂに示される。２つのＯＲＦでコードされる高
い相同が、M.tuberculosis及びM.leprae由来のゲノムの
コスミドライブラリーのＤＮＡ配列において観察され
た。ＭＤＰ１は、M.tuberculosisと９５％の相同性を有
し、M.lepraeと８３％の相同性を有する。コンピュータ
ー分析は、ＭＤＰ１のＮ末端領域がバクテリア由来のＨ
Ｕに対し部分的な相同性を有し、Ｃ末端領域は真核細胞
のヒストンＨ１クラスと部分的な相同性を有することを
示した。代表例として、ＭＤＰ１と大腸菌のＨＵ２及び
ヒトのヒストンＨ１の比較を図２Ｂに示す。最初の９０
アミノ酸の最良のアラインメントは、ＭＤＰ１とＨＵ２
の間で４１％（Ｋａｎｏら、１９８７）、ＭＤＰ１とヒ
トヒストンＨ１の間で２５％（Ａｌｂｉｇら、１９９
１）であった。 (2) ＭＤＰ１による核酸コンフォーメーションの認識 ＭＤＰ１のＤＮＡ結合能は、以下のように確認された。
ＭＤＰ１はSchistosoma japonicum グルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（ＧＳＴ−ＭＤＰ１）との
融合蛋白質として発現された。大腸菌発現ＧＳＴ−ＭＤ
Ｐ１の全蛋白質は、膜に転写された。膜は［α−³²Ｐ］
標識ｐＢＳＫＳ＋と反応し、そのオートラジオグラフが
図３Ａに示される。付加的なバンドがレーン４とレーン
５に観察され（図３Ａ上の矢印で示される）、抗ＭＤＰ
１抗体（データは示さない）により認識された（データ
は示されていない）。これは、該遺伝子によりコードさ
れる産物のＤＮＡ結合能を確認する。分解産物が観察さ
れ、この融合蛋白が大腸菌中で安定でないことを示す。
ＭＤＰ１の核酸結合活性をより詳細に分析するために、
ゲル遅延アッセイを次に行った。各種濃度の精製ＭＤＰ
１を環状プラスミド、直鎖プラスミド、又はＲＮＡとと
もにインキュベーション後、複合体をアガロースゲル電
気泳動で分析した（図３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄ）。ヌクレオ
チドがＭＤＰ１の濃度に依存してスロット中で遅延する
ので、該データは、ＭＤＰ１がＤＮＡ及びＲＮＡの両方
に結合することを示した。ＭＤＰ１のニックを有するＤ
ＮＡ（図３Ｂ）、直鎖形態のＤＮＡ（図３Ｃ）及びＲＮ
Ａ（図３Ｄ）に対する結合能は、ほぼ同一であった。一
方、他のものよりもスーパーコイルＤＮＡのゲルへの移
動に対する優先的な阻害は、１０〜５μＭＭＤＰ１にお
いて観察された（図３Ｂ、３Ｃ）。これらは、ＭＤＰ１
が核酸のコンフォーメーションを認識することを示す。 (3) 細胞中のＭＤＰ１の局在化 ＭＤＰ１の局在化を知るために、最初は、免疫電子顕微
鏡試験をＢＣＧを標的として行った。結果は、ＭＤＰ１
同族体が細胞壁、細胞膜、リボソーム領域、染色体ＤＮ
Ａ領域に局在化することを示した（図４Ａ，パネル
ａ）。第２に、ＢＣＧ由来の各細胞下画分が調製され
た。これらのサンプルは、膜上に転写され、抗ＭＤＰ１
抗体と反応された（図４Ｂ、パネルｂ）。強い反応が細
胞壁、細胞膜、リボソーム画分の２８ｋＤａ蛋白で観察
されたが、分泌蛋白及び細胞質蛋白では観察されなかっ
た。同時に、蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にゲル染色に
より視覚化され、推定ＭＤＰ１バンドが図４Ｂのパネル
ａにおいて矢印で示される。これらの生化学的観察は、
ＢＣＧに関する免疫電子顕微鏡試験の結果と一致する。
興味あることに、抗ＭＤＰ１抗体のいくつかは免疫電子
顕微鏡分析において直接にリボソーム粒子と反応してい
るらしく、それらはリボソーム画分と強力に反応する
（図４Ｂ、パネルｂ）。これらは、ＭＤＰ１がリボソー
ムに結合する可能性を示す。この点を明らかにするため
に、リボソーム粒子（３０Ｓ及び５０Ｓサブユニット）
をシュクロース密度勾配遠心により分離した。３０Ｓ又
は５０Ｓサブユニットに由来する蛋白質が、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ後、転移した膜上で抗ＭＤＰ１抗体と反応され
た。該反応は、図４Ｂのパネルｂに示されるように、３
０Ｓサブユニットではなく５０Ｓサブユニットの２８ｋ
Ｄａ及び２７ｋＤａ蛋白質において観察された。この結
果を確認するために、５０Ｓサブユニットの蛋白質をＲ
Ｐ−ＨＰＬＣ（図４Ｃ、パネルａ）により分離された。
各画分の蛋白は、ＣＢＢにより染色されたＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより視覚化され（図４Ｃ、パネルｂ）、或いはこ
れらは、膜上にブロッティングした後、抗ＭＤＰ１抗体
と反応させた。結果は、２８ｋＤａ及び２７ｋＤａ蛋白
質は各々約４７％（図４Ｃのパネルａの画分２７）およ
び４０％（画分１８、１９）アセトニトリルの濃度で溶
出した。アミノ酸シークエンサーによるＮ末端アミノ酸
の配列決定は、２８ｋＤａの蛋白質がＭＤＰ１であるこ
とを示す。この結果は、５０Ｓリボソームサブユニット
はＭＤＰ１を含むことを示す。しかしながら、２７ｋＤ
ａのＮ末端アミノ酸は配列決定されていない。従って、
２７ｋＤａの蛋白質がＮ末端での修飾アミノ酸なのか、
異なる遺伝子をコードする遺伝子の同族体なのかは明ら
かでない。 (4) ＭＤＰ１のインビトロにおける複製、転写及び翻訳
の阻害 インビトロにおけるマクロ分子合成をＭＤＰ１の分子プ
ロセスを解明するために研究した。第１に、ＤＮＡポリ
メラーゼＩの機能に関するＭＤＰ１の効果を、ＤＮＡ合
成の伸長を見るために調べた（図５Ａ）ＤＮＡ合成は、
ＭＤＰ１により用量依存的に抑制された。１．２５μＭ
のＭＤＰ１で９７％までの阻害が観察された。

【００２９】第２に、本発明者は、Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼの転写に対するＭＤＰ１の効果を評価した（図５
Ｂ）。転写は、２．５μＭのＭＤＰ１でほぼ完全に阻害
された。

【００３０】第３に、翻訳に関するＭＤＰ１の効果をイ
ンビトロで調べた。インビトロでの翻訳分析は、大腸菌
Ｓ３０抽出物を用いて行った（図５Ｃ）。３０分のイン
キュベーション後、蛋白合成をＭＳ２ファージＲＮＡの
鋳型なしでさえ観察された。これは、大腸菌Ｓ３０抽出
物の内因性天然ｍＲＮＡのためであるかもしれない。Ｍ
ＤＰ１による蛋白合成の阻害は、ＭＤＰ１の濃度に依存
して観察された。１０μＭにおいて、ＭＤＰ１は翻訳を
ほぼ完全に阻害した。 (5) ＭＤＰ１によるバクテリアの増殖遅延 上記の結果から、ＭＤＰ１はＤＮＡ、ＲＮＡ及びリボソ
ームに対する結合に依存してマクロ分子生合成の阻害に
より増殖遅延を起こかもしれない。本発明者は、この仮
説を速やかに増殖するバクテリア中においてＭＤＰ１を
発現させることにより調べた。ＭＤＰ１の非キメラ形態
を発現するために、ｐＳＯＭＤＰ１及びｐＥＴＭＤＰ１
を構築した（実施例参照）。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ及
び大腸菌を、各プラスミドを用いてトランスフォーム
し、プレート上で集めた。図６に示すように、両方のバ
クテリアの増殖速度はＭＤＰ１の発現により劇的に減少
し、ＭＤＰ１はバクテリアの増殖速度を減少することを
示す。 (6) ＭＤＰ１蛋白のスレオニンリン酸化 リン酸化及び脱リン酸化は、真核細胞における細胞増殖
を制御する主要なメカニズムの１つである。本発明者は
ＭＤＰ１がリン酸化蛋白かそうでないかを調べた。精製
されたＭＤＰ１は、ホスホセリン、ホスホチロシン又は
ホスホスレオニンに対するモノクローナル抗体と反応さ
せた。抗ホスホスレオニン抗体のみがＭＤＰ１と反応
し、予期したようにこの反応は、反応前にバクテリアの
アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）でＭＤＰ１を処理す
ることにより消失した（データは示さない）。これら
は、ＭＤＰ１がスレオニンリン酸化蛋白質であることを
示す。 (7) 迅速及び遅延増殖マイコバクテリウム間の対数及び
定常増殖期におけるＭＤＰ１の発現の比較 様々なマイコバクテリウム種のＭＤＰ１の発現をＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（図７Ａ）及びウエスタンブロット分析（図
７Ｂ）により調べた。抗体は、ＢＣＧの２８ｋＤａの蛋
白質（図７Ｂのレーン１及び２）、M.tuberculosisの３
０ｋＤａの蛋白質（レーン３及び４）、M.lepraeの２６
ｋＤａの蛋白質（レーン５）、M.smegmatisの３１ｋＤ
ａの蛋白質（レーン６および７）と強く反応したが、大
腸菌の蛋白質とは全く反応しなかった。対数及び定常増
殖期におけるＢＣＧ及びM.tuberculosis由来のライゼー
トの豊富な蛋白バンドは、抗ＭＤＰ１血清反応バンドと
同一である。M.lepraeは、バクテリア中で最も増殖が遅
く、インビトロでの培養が未だ成功していない。ヌード
マウスのフットパッドで増殖するM.lepraeは、図７に示
すように多量のＭＤＰ１を発現する。一方、M.smegmati
sにおいて、抗ＭＤＰ１血清を認識する蛋白は定常期に
おいてのみ高度に発現される。本発明者は、これらＭＤ
Ｐ１同族体がＤＮＡに結合する能力を有することをサウ
スウエスタンブロット分析により確認した（データは示
さない）。これらの結果は、ＭＤＰ１が広範囲のマイコ
バクテリウムにおいて保存されているが、ＭＤＰ１の発
現量は遅い増殖菌と速い増殖菌で異なっている。遅い増
殖菌は増殖期と無関係に多量のＭＤＰ１を発現するが、
速い増殖菌は定常状態で主に発現され、対数増殖期では
発現されない。 実施例１ ６〜１０週齢の４種のマウス（C3H/He、C57BL/6、A/J、
BALB/c）にＭＤＰ１をフレウントのインコンプリートア
ジュバントとともに５μｇずつ２回（２回目は３週後）
免疫し（１回目は皮下、２回目は腹腔内）、４週後に採
血して血清を１００倍に希釈し（希釈液：1%BSA in PB
S)、一次抗体としてウェスタンブロットに用いた。抗原
は、ＢＣＧのライゼートを用いた。ＭＤＰ１に対する抗
体の産生が認められたマウスはBALB/cのみであった。

【００３１】次に、ＢＣＧ菌を投与した３種のマウス
（C3H/He、C57BL/6、A/J；１回目血中、２回目腹腔内；
ＢＣＧ１０６ＣＦＵ）の血清を同様に反応させた結果、
いずれのマウスにおいてもＭＤＰ１に対する抗体産生が
確認された。また、抗体はＢＣＧ抗原のうちＭＤＰ１に
最も強く反応した。

【００３２】この実験結果から、菌体で免疫すると、Ｍ
ＤＰ１に対する抗体が強く誘導されることが明らかにな
った。 実施例２：患者血清との反応 ハンセン氏病患者３名、結核患者４名及び健常人血清を
１００倍に希釈した。精製したＭＤＰ１をメンブレンに
転写し、希釈抗体と反応させた。その結果、すべての抗
酸菌症患者の血清中に、ＭＤＰ１を認識する抗体の存在
が明らかになった。一方、健常人のサンプルには該抗体
の存在は認められなかった。同じウェスタンブロットの
系で、分泌蛋白質（８５コンプレックスを含む）に対し
て反応させると、ハンセン氏病患者の血清には反応する
が、結核患者の血清とは反応しなかった。この結果は、
ＭＤＰ１はＡｇ８５よりも抗酸菌症において抗原性が高
いことを示している。 実験１ ＢＣＧ東京株を、ソートン培地で培養後、０．４５μｍ
(Millipore)のフィルターに通し、菌体と分泌蛋白質を
分離した。菌体はＳＤＳ−サンプルバッファーに溶解
し、超音波で破砕し、１００℃で５分間煮沸した。分泌
蛋白質は、培養濾過物に終濃度８０％になるように硫酸
アンモニウムを加えてタンパク質を析出させ、それをＰ
ＢＳ（ｐＨ７．２）に透析した。得られた分泌タンパク
質にＳＤＳ−サンプルバッファーを加え、１００℃で５
分間煮沸した。それぞれのサンプルを遠心し、その上清
（タンパク質量２０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２
１．５％）にて電気泳動した後、タンパク質を電気的に
ポリビニリデンジフルオライド膜(ＰＶＤＦ膜；Millipo
re)上に転写した。ＰＶＤＦ膜を３％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓ中で３０分間浸し、ブロッキングを行った。抗体の調
製は、ＢＣＧ東京株１０ ⁷ＣＦＵをＣ３Ｈ／Ｈｅ静脈に
投与し、１ヶ月後同量の菌体を腹腔内に投与し、その１
ヶ月後に血清を採取し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１００倍
希釈した。調製した抗体を、ＢＳＡでブロッキングした
ＰＶＤＦ膜と４℃で終夜反応させ、0.05%のNonidet P40
を含むＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで１０００倍に希釈し
たペルオキシダーゼ標識した抗マウス抗体と反応させ、
上記洗浄液で洗浄後、２５ｍｇの3,3-ジアミノベンジジ
ン・テトラヒドロクロライドを２０ｍＭＴｒｉｓ(pH7.
5)１００ｍｌ中に溶解し、２９μｌのＨ₂Ｏ₂を加えた溶
液にＰＶＤＦ膜を浸し、抗体検出を行った。結果を図８
に示す。図８に示されるように、菌体タンパク質ではＭ
ＤＰ１に相当する分子量のタンパク質および４５〜４７
ｋＤａのタンパク質に対する抗体が検出された。一方、
分泌タンパク質に対する抗体は、この条件では検出され
なかったことから、ＭＤＰ１は最も強い抗原性を有する
といわれているＡｇ８５を上回る抗原性を有していると
考えられた。 実験２ ＢＣＧ東京株（１０⁷ＣＦＵ）を、Ａ／ｊ、ＢＡＬＢ／
ｃ、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ、Ｃ５７ＢＬ／６に腹腔内投与し、１
ヶ月後血清を採取し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１００倍希
釈した。精製ＭＤＰ１を１μｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ後、ＰＶＤＦ膜上に転写し、希釈血清と上記と同様
の方法で反応させ、ＭＤＰ１に対する抗体の検出を行っ
た。その結果、４種全てのマウスの血清中に抗ＭＤＰ１
抗体が産生されていることが分かった。 実験３ ＢＣＧ菌（１０⁸ＣＦＵ）を、マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ：
ｓｌｃ）に尾静脈より投与し、ＭＤＰ１（５μｇ）／Ｒ
ＡＳ（リビアジュバントシステム）、ＤＮＡ(M. tuberc
ulosis DNA 0.5μｇ）／ＲＡＳ、ＭＤＰ１（５μｇ）＋
ＤＮＡ（０．５μｇ）／ＲＡＳをマウス（Ｃ３Ｈ／Ｈ
ｅ：ｓｌｃ）に皮下投与し、３週間後に同用量を腹腔内
投与した後、４週間後に血清を採取し、採取した血清を
ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１００倍希釈した。精製ＭＤＰ１
を１μｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜上
に転写し、希釈血清と反応させた。その結果（図９）、
ＢＣＧ及びＭＤＰ１＋ＤＮＡで免疫したマウスにのみ抗
体が産生されており、ＭＤＰ１単独、ＤＮＡ単独では抗
体産生が認められず、ＭＤＰ１はＤＮＡと結合させるこ
とで免疫原性が増強され、抗体価が上がることが確認さ
れた。 実験４ ＭＤＰ１、ヒストンＨ１、Ｈ２、Ｈ３（ベーリンガーマ
ンハイム、牛由来）をそれぞれ５μｇずつ、単独または
結核菌由来ＤＮＡ（０．５μｇ）と混合して、リビアジ
ュバント(RIBI immunochen Research, Inc. Hamilton,
MT)を用い、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス（初回免疫時、７週
齢）に免疫した。サンプルは、ＰＢＳで希釈し、１匹の
マウスに１００μｌとなるように調整した。免疫方法
は、初回免疫を皮下投与で、３週間後の追加免疫を腹腔
内投与により行った。追加免疫の１週間後のマウスより
採血を行い、遠心分離により血清成分を得た。それぞれ
に抗原に対する抗体の検出は、ＥＬＩＳＡ法により行っ
た。即ち、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートＨ（住友ベーク
ライト株式会社）に、それぞれの抗原を２μｇ／ｍｌに
なるように０．０５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で
溶解し、１００μｌずつ各ウェルに分注し、室温で２時
間放置し、抗原を個層化した。ブロッキングは、ＢＢＳ
（ｐＨ８．０；ホウ酸１０．３３ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ７．
８３ｇ／Ｌ）でウェルを１回洗浄後、３％ＢＳＡを含む
ＢＢＳを３００μｌずつウェルに分注し、室温で２時間
放置し、ＢＢＳで１回洗浄することで行った。それぞれ
の血清サンプルは、５０〜１０２４００倍まで、１％Ｂ
ＳＡを含むＢＢＳ溶液で希釈し、それぞれのウェルに１
００μｌずつ加え、３０分間３７℃で反応させた。反応
プレートをＨＢＢＳ（ｐＨ８．０；ホウ酸１０．３３ｇ
／Ｌ、ＮａＣｌ２９．２２ｇ／Ｌ）を調製し、各ウェル
を３００μｌずつ７回洗浄した。その後、ペルオキシダ
ーゼ抗マウス抗体を、１％ＢＳＡを含むＢＢＳ溶液で２
０００倍に希釈し、１００μｌずつ各ウェルに分注し、
３０分間３７℃で培養した。その後、上記洗浄液で同様
の洗浄を行い、オルト−フェニレンジアミン二塩酸塩を
0.4mg/mlとなるように、８０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝
液に加え、その溶液１０ｍｌにつきＨ₂Ｏ₂を４μｌ加え
た検出液を用い、発色を行った。３−５分間反応後、１
Ｎの硫酸を等量加えて反応を停止し、４９２ｎｍの吸光
度で測定した。その結果、図１０〜１３に示されるよう
に、ＭＤＰ１とＤＮＡを混合して免疫し、得られたサン
プルのみ吸光度の上昇が観察され、同じＤＮＡ結合タン
パク質であるヒストンＨ１、Ｈ２、Ｈ３のいずれの場合
にも吸光度の上昇は観察されなかった。このことから抗
原性に関してはＭＤＰ１特異的であることが明らかにな
った。 実験５ 精製したＭＤＰ１を１μｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡＧＥ
後、ＰＶＤＦ膜上に転写し、らい患者（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ
３）、結核患者（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４）の血清希釈
液と上記と同様にして反応させ、ＭＤＰ１に対する抗体
の検出を行った。その結果（図１４）、試験した全ての
患者血清中にＭＤＰ１に対する抗体が検出された。この
結果から、ＭＤＰ１は結核、らい患者等の診断薬として
の応用が考えられる。ＭＤＰ１の診断薬への応用 ＭＤＰ１は抗酸菌に特異的なタンパク質であり、強い抗
原性を有していることが上記実験より確認できた。特に
実験１の結果より現在抗原性が最も強く、診断薬として
検討されている抗酸菌特異的な抗原Ag85complexよりも
強い抗原性を有することが明らかになった。従って、Ｍ
ＤＰ１に対する抗体を同定することで、結核による感染
の有無を診断できる（実験５）。また、抗酸菌の種が異
なればＭＤＰ１の配列も異なることから、種特異的な抗
原またはペプチドを用いることで感染菌の同定の可能性
もある。従って、結核菌を含む各種抗酸菌のＭＤＰ１お
よびそのＭＤＰ１中に含まれるペプチドは、診断薬の抗
原として利用できる。

【００３３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ostuka Pharmaceutical Co., Ltd. <120> MDP1 gene <130> 3588JP <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 205 <212> PRT <213> BCG strain <400> 1 Met Asn Lys Ala Glu Leu Ile Asp Val Leu Thr Gln Lys Leu Gly Ser 1 5 10 15 Asp Arg Arg Gln Ala Thr Ala Ala Val Glu Asn Val Val Asp Thr Ile 20 25 30 Val Arg Ala Val His Lys Gly Asp Ser Val Thr Ile Thr Gly Phe Gly 35 40 45 Val Phe Glu Gln Arg Arg Arg Ala Ala Arg Val Ala Arg Asn Pro Arg 50 55 60 Thr Gly Glu Thr Val Lys Val Lys Pro Thr Ser Val Pro Ala Phe Arg 65 70 75 80 Pro Gly Ala Gln Phe Lys Ala Val Val Ser Gly Ala Gln Arg Leu Pro 85 90 95 Ala Glu Gly Pro Ala Val Lys Arg Gly Val Gly Ala Ser Ala Ala Lys 100 105 110 Lys Val Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Thr Lys Ala Ala Lys 115 120 125 Lys Ala Ala Thr Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala Thr Lys Ala Pro 130 135 140 Ala Lys Lys Ala Val Lys Ala Thr Lys Ser Pro Ala Lys Lys Val Thr 145 150 155 160 Lys Ala Val Lys Lys Thr Ala Val Lys Ala Ser Val Arg Lys Ala Ala 165 170 175 Thr Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala Ala Lys Arg Pro Ala Thr Lys 180 185 190 Ala Pro Ala Lys Lys Ala Thr Ala Arg Arg Gly Arg Lys 195 200 205 <210> 2 <211> 1026 <212> DNA <213> BCG strain <400> 2 ctttgagggt gcgtgcgcgt actggaaacc gcgcactcta cccgccccct gaggcgtaga 60 accgggcgaa atttcagcgt gacccgccgg cagaacctga gccattttgg ggccgcgcca 120 ccggtcaagg gcggcaaccg gattgcgaaa aaccggtcgt tggctcagtg aaattgcgcg 180 tggctcttgg aaatcagccg ggtaagggtt taccgtgtcc actagtcggt tccaaacgag 240 gaccactggt ttcggagggt tgggatgaac aaagcagagc tcattgacgt gctcacacag 300 aaattgggct cggaccgtcg gcaggcgacc gccgccgtcg agaatgtcgt tgacacgatt 360 gtgcgtgcgg tacacaaagg cgacagcgtc accattaccg ggttcggtgt gttcgaacag 420 cgtcgccgcg cggctcgagt ggcccgcaat ccgcgtaccg gcgagacagt aaaggtgaag 480 ccgacgtcgg tgccggcgtt ccgcccgggc gcgcaattca aagcggttgt gtctggcgcg 540 cagcgtctcc cggcagaagg acccgctgtt aagcgtggtg tgggggccag tgcagccaag 600 aaggtagcga agaaggcacc tgccaagaag gcgacaaagg ccgccaagaa ggcggcgacc 660 aaggcgcccg ccaagaaagc ggcgaccaag gcgcccgcca agaaagctgt caaggccacg 720 aagtcacccg ccaagaaggt gaccaaggcg gtgaagaaga ccgcggtcaa ggcatcggtg 780 cgtaaggcgg cgaccaaggc gccggcaaag aaggcagcgg ccaagcggcc ggctaccaag 840 gctcccgcca agaaggcaac cgctcggcgg ggtcgcaaat aggtcaagac acacggatac 900 cctttgcacg gtggcaatgt gacgaagggt atccgtgtgt taggcccgca cgttggcggc 960 cagcgcaccg ccgatgtggt cggctgtcac aagcctgccg gctgacaacg acaacaccca 1020 cgtgct 1026 <210> 3 <211> 1026 <212> DNA <213> BCG strain <400> 3 ctttgagggt gcgtgcgcgt actggaaacc gcgcactcta cccgccccct gaggcgtaga 60 accgggcgaa atttcagcgt gacccgccgg cagaacctga gccattttgg ggccgcgcca 120 ccggtcaagg gcggcaaccg gattgcgaaa aaccggtcgt tggctcagtg aaattgcgcg 180 tggctcttgg aaatcagccg ggtaagggtt taccgtgtcc actagtcggt tccaaacgag 240 gaccactggt ttcggagggt tggg atg aac aaa gca gag ctc att gac gtg 291 Met Asn Lys Ala Glu Leu Ile Asp Val 1 5 ctc aca cag aaa ttg ggc tcg gac cgt cgg cag gcg acc gcc gcc gtc 339 Leu Thr Gln Lys Leu Gly Ser Asp Arg Arg Gln Ala Thr Ala Ala Val 10 15 20 25 gag aat gtc gtt gac acg att gtg cgt gcg gta cac aaa ggc gac agc 387 Glu Asn Val Val Asp Thr Ile Val Arg Ala Val His Lys Gly Asp Ser 30 35 40 gtc acc att acc ggg ttc ggt gtg ttc gaa cag cgt cgc cgc gcg gct 435 Val Thr Ile Thr Gly Phe Gly Val Phe Glu Gln Arg Arg Arg Ala Ala 45 50 55 cga gtg gcc cgc aat ccg cgt acc ggc gag aca gta aag gtg aag ccg 483 Arg Val Ala Arg Asn Pro Arg Thr Gly Glu Thr Val Lys Val Lys Pro 60 65 70 acg tcg gtg ccg gcg ttc cgc ccg ggc gcg caa ttc aaa gcg gtt gtg 531 Thr Ser Val Pro Ala Phe Arg Pro Gly Ala Gln Phe Lys Ala Val Val 75 80 85 tct ggc gcg cag cgt ctc ccg gca gaa gga ccc gct gtt aag cgt ggt 579 Ser Gly Ala Gln Arg Leu Pro Ala Glu Gly Pro Ala Val Lys Arg Gly 90 95 100 105 gtg ggg gcc agt gca gcc aag aag gta gcg aag aag gca cct gcc aag 627 Val Gly Ala Ser Ala Ala Lys Lys Val Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys 110 115 120 aag gcg aca aag gcc gcc aag aag gcg gcg acc aag gcg ccc gcc aag 675 Lys Ala Thr Lys Ala Ala Lys Lys Ala Ala Thr Lys Ala Pro Ala Lys 125 130 135 aaa gcg gcg acc aag gcg ccc gcc aag aaa gct gtc aag gcc acg aag 723 Lys Ala Ala Thr Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Val Lys Ala Thr Lys 140 145 150 tca ccc gcc aag aag gtg acc aag gcg gtg aag aag acc gcg gtc aag 771 Ser Pro Ala Lys Lys Val Thr Lys Ala Val Lys Lys Thr Ala Val Lys 155 160 165 gca tcg gtg cgt aag gcg gcg acc aag gcg ccg gca aag aag gca gcg 819 Ala Ser Val Arg Lys Ala Ala Thr Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala 170 175 180 185 gcc aag cgg ccg gct acc aag gct ccc gcc aag aag gca acc gct cgg 867 Ala Lys Arg Pro Ala Thr Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Thr Ala Arg 190 195 200 cgg ggt cgc aaa taggtcaaga cacacggata ccctttgcac ggtggcaatg 919 Arg Gly Arg Lys 205 tgacgaaggg tatccgtgtg ttaggcccgc acgttggcgg ccagcgcacc gccgatgtgg 979 tcggctgtca caagcctgcc ggctgacaac gacaacaccc acgtgct 1026 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <400> 4 ggggatccgg gagggttggg atgaacaaag cag 33 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <400> 5 gggggatcca gcacgtgggt gttgtcgttg 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <400> 6 gggaagcttt ttgagggtgc gtgcgcgtac 30 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <400> 7 ccatatgaac aaagcagagc tcattgac 28 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <400> 8 caagcttcta tttgcgaccc cgccgagcgg 30

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａは蛋白−ＤＮＡ相互作用をオートラジオ
グラフを示す。図１Ｂは、クロマトグラフのプロフィー
ルを示す。図１Ｃはゲル濾過カラムの結果を示す。図１
ＤはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。

【図２】図２Ａは、核酸配列及び推定アミノ酸配列を示
す。図２Ｂは、ＭＤＰ１に相同ないくつかの蛋白質及び
アミノ酸配列のアラインメントを示すコンピューター検
索結果を示す。

【図３】図３Ａは、オートラジオグラフ結果を示す。図
３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｄは、アガロースゲル電気泳動の
分析結果を示す。

【図４】図４Ａは免疫電子顕微鏡試験結果を示す。図４
Ｂはサンプルと抗ＭＤＰ１抗体との反応結果を示す。図
４ＣはＲＰ−ＨＰＬＣの結果（パネルａ）、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによる視覚化（パネルｂ）を示す。

【図５】図５Ａは、ＤＮＡポリメラーゼＩの機能に関す
るＭＤＰ１の効果を示す。図５Ｂは、Ｔ７ＲＮＡポリメ
ラーゼの転写に対するＭＤＰ１の効果を示す。図５Ｃ
は、翻訳に関するＭＤＰ１の効果を示す。

【図６】Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ及び大腸菌を、各プラ
スミドを用いてトランスフォームし、プレート上で集め
た結果を示す。

【図７】図７ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。図７Ｂ
はウエスタンブロット分析結果を示す。

【図８】抗体検出結果を示す。

【図９】精製ＭＤＰ１と希釈血清の反応結果を示す。

【図１０】抗ＭＤＰ１血清を用いた結果を示す。

【図１１】抗ヒストンＨ１血清を用いた結果を示す。

【図１２】抗ヒストンＨ２血清を用いた結果を示す。

【図１３】抗ヒストンＨ３血清を用いた結果を示す。

【図１４】ＭＤＰ１に対する抗体の検出結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松本 壮吉 長崎県西彼杵郡長与町吉無田郷1163−52 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA13 BA31 CA03 CA09 DA05 DA06 EA04 GA11 GA14 GA19 HA14 4B064 AG01 AG31 BH09 CA02 CA10 CA19 CC24 CE03 CE07 CE11 DA01 DA15 4B065 AA26X AA36X AA36Y AA91X AB01 BA02 BA03 BD04 BD15 CA24 CA44 CA45 CA46 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA11 DA75 DA86 EA29 EA31 EA52 FA72 FA74 GA05 GA06 GA10 GA15 GA22 GA23 GA25

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】１又は複数個のアミノ酸が置換、付加又は
   欠失していてもよい配列番号１（２０５個のアミノ酸）
   で表される病原性抗酸菌に対する免疫原性を有するポリ
   ペプチド。
2. 【請求項２】請求項１に記載のポリペプチドをコードし
   てなるＤＮＡ。
3. 【請求項３】請求項２に記載のＤＮＡを含むベクターま
   たは該ベクターを含む形質転換体。
4. 【請求項４】請求項３に記載の形質転換体を培養するこ
   とを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドの製造
   法。