JP2000221136A - 経時変化追跡方法および装置 - Google Patents

経時変化追跡方法および装置

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JP2000221136A
JP2000221136A JP5749299A JP5749299A JP2000221136A JP 2000221136 A JP2000221136 A JP 2000221136A JP 5749299 A JP5749299 A JP 5749299A JP 5749299 A JP5749299 A JP 5749299A JP 2000221136 A JP2000221136 A JP 2000221136A
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flow
infrared
atr
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Toshiyuki Nagoshi
利之 名越
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection

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  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Optical Measuring Cells (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】化学変化の進行過程を追跡するための手段とし
て、それに伴う構造変化をより直接的に反映する検知手
段をもって経時的測定する方法を提供する。 【解決手段】ストップドフロー装置と赤外分光光度計を
組み合わせた測定システムを構成する。赤外分光光度計
による赤外吸収測定には、ATR法を採用する。ストッ
プドフロー−赤外ATR測定のために、複数の試料導入
ポート、ミキサー、セル恒温機構を備えたATRフロー
スルーセルを構成し、上記のシステムに組み込む。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、溶液中の試料分子
の化学変化・構造変化の過程を経時的に追跡する技術に
関するものである。
【0002】
【従来の技術】研究の対象となる試料を含む溶液に適当
な反応試薬を添加して反応させ、それによって生ずる化
学構造の変化、立体構造の変化などを経時的に追跡する
測定が、反応のプロセスを解析する手段として行われて
いる。
【0003】この反応の速度が、概略ミリ秒乃至サブミ
リ秒のオーダーである場合には、ストップドフロー測定
と呼ばれるテクニックが用いられている。これは、試
料、反応試薬などを別々の溶液で用意しておき、それら
をそれぞれ一定流量で送液し、直前で混合して測定手段
に設けたフロースルーセルに供給し、その混合液の供給
を急激に停止し、それに同期してそれ以後の測定信号の
変化を経時的に記録するというものである。
【0004】測定手段には紫外・可視吸収、蛍光強度、
円二色性などが汎用されている。ところがこれらの測定
手段は、基本的に試料物質・分子の電子状態を反映する
ものであり、試料物質・分子に対して普遍性はあるもの
の、構造に対する特異性が小さい、即ち、構造変化が生
じていることを検知することはできるが、それがどのよ
うなものかを知るには情報が少ないという弱点がある。
どのような構造変化が生じているかを見ようとすると、
分子構造を直接に反映する測定手段を採用することが有
利あり、そのような手段としてもっとも手軽な測定手段
としては赤外吸収がある。
【0005】ところがこのような測定系に用いられる通
常の溶媒は、それ自身が赤外吸収を示すことが一般的で
あり、赤外に吸収を示さないような溶媒は極めて限られ
ており、そのような溶媒に限定して構成される反応系は
ほとんど皆無に等しい。逆によく用いられる溶媒、特に
水は、非常に強い赤外吸収を示ために、ストップドフロ
ー法に組み合わせたフロースルーセルでは赤外光がほと
んど完全に吸収されてしまって全く透過せず、測定不可
能である。測定赤外光がそれなりに透過して、赤外吸収
測定が可能となるようにするためには、セル厚を薄く
し、光路長を適切に短くするという手があるが、信頼で
きる赤外吸収測定に必要な光透過率を確保するために
は、光路長は数十ミクロン以下にすることが不可欠であ
るが、このようなセル厚のフロースルーセルでは、混合
試料溶液をストップドフロー測定が可能な流量で流すこ
とが出来ず、今度はストップドフロー測定ができなくな
る。このような事情から、ストップドフロー赤外吸収と
いう測定系の構成は実現困難なものと考えられていた。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】ストップドフローと赤
外吸収を組み合わせた、構造変化の解析に好適なシステ
ムが事実上実現されないのは、反応系を構成するために
通常使われる溶媒のほとんどが、赤外に強い吸収を示す
ために、ストップドフローに用いられるようなフロース
ルーセルでは光が透過せず、測定にならないことによ
る。
【0007】本発明は、ストップドフロー法に適当な赤
外測定法を組み合わせ、赤外吸収が強くて、通常のフロ
ースルーセルでは光が透過しなくて測定不能の系でも、
赤外吸収に相当する信号を得られるようにして、ストッ
プドフロー赤外吸収測定を可能とし、反応に伴う構造変
化の経時的な追跡をおこない、その解析を可能とするシ
ステムを提供することにある。
【0008】
【課題を解決するための手段】前記の課題を解決するた
めに、本発明では、赤外測定にATR法(減衰全反射
法)を採用し、透過光強度測定によらない赤外吸収信号
を取得するようにする。
【0009】静的な状態の測定では知られているよう
に、赤外ATR法では、測定光はプリズムの界面の内側
で全反射するよう光学系が構成されるが、プリズムの外
側にも波長分程度滲みだし、そこに存在する物質による
吸収をうけて減衰する。この減衰分を透過光の減衰のよ
うに見なして吸光度を計算すると、概ね波長レベルの光
路長を持つ測定セルを用いたときに相当する試料の吸光
度を得ることができる。一方、プリズム面から波長程度
以上離れた部位は、全反射光強度に影響を及ぼさないの
で、混合試料溶液を供給するときの溶液が流れる部分を
ここに確保すれば、ストップドフローを行うのに十分な
透過断面積、即ち溶液を適当な流量で送液するのに必要
なセル断面積を確保することが可能となる。
【0010】さらに、ストップドフロー測定を効果的に
行うためには、測光部位であるセル室の直前で効率よく
試料溶液が混合されること、混合した後セル室に至るま
での時間経過をできるだけ短くすること、溶液溜から流
路を経てセル室までの間を効果的に恒温に保つことが必
要となる。これらの最後の項目は、構造変化をもたらす
反応の速度は、温度に依存するため、再現性のよい測定
を行うためには、反応を一定温度下で行わせる必要があ
るためである。
【0011】このようなストップドフロー−赤外ATR
法測定の必要事項を満たすために、フロースルーセルを
ATRプリズム、スペーサ、セルボディで構成し、試料
溶液を効率よく混合し、測定部に到達させる流路とミキ
サーを内蔵させた新しい専用のATRフロースルーセル
を構成する。またこのセルには、恒温水などを循環させ
る流路を備えたり、ペルチェ素子を用いた加温/冷却デ
バイスを取り付けるなどして一定温度にコントロールで
きる機能を付与する。
【0012】
【発明の実施の形態】本発明の実施例を図1に示すシス
テムの概略を例にとり、かつそれを蛋白質の変成過程の
解析に応用する場合を例にとって説明する。
【0013】システムはストップドフロー測定用に最適
に構成された赤外ATR用フロースルーセル2を組み込
んだ赤外分光光度計1、ストップドフロー装置3、及び
データ処理装置9を組み合わせて構成される。この赤外
ATR用フロースルーセル2については後述する。
【0014】対象とする蛋白質を含む緩衝溶液と、変成
を引き起こす尿素やグアニジンなどの変成剤溶液をそれ
ぞれ別の溶液に調製し、ストップドフロー装置の試料溜
に納める。試料溜は通常シリンジで構成されることが多
い。ストップドフロー装置は、これらの試料溶液を一定
の流量でATRフロースルーセルに送り出し、それらは
セル内に設けられたミキサーで混合し、セル室に供給さ
れ、そこでその赤外吸収が赤外ATR法によって測定さ
れる。
【0015】試料の蛋白質の側からみると、ミキサーで
変成剤と混合すると、その瞬間から変成が始まり、その
2次構造の変化が始まる。セル室はミキサーの直後に設
置されていて、溶液を流している状態では、ミキサーか
らこのセル室に到達するまでの極短い時間を経過した時
点での構造に相当する赤外吸収信号が検知されているこ
とになる。赤外吸収を検知する波数としては、この場
合、変成に伴う2次構造の変化に着目し、それを反映す
るアミド基の1650cm−1付近を選択する。
【0016】次にストップドフロー装置による送液を停
止する。これに同期して赤外吸収信号の取得を開始す
る。あるいは赤外吸収信号の取得を開始すると同時に、
送液を停止してもよい。こうすると、変成に伴う2次構
造の変化の時間経過がアミド基の赤外吸収の時間変化と
して捉えられる。
【0017】ストップドフロー−赤外ATR法のシステ
ムを実現するために、キーとなるのは、ATRフロース
ルーセルである。そのための構成例を図2に示す。また
その各部の詳細を図3に示す。ATRフロースルーセル
はATRプリズム11、スペーサ12、セル基板13で
構成される。ATRプリズムには、ストップドフロー測
定に用いる溶媒に不溶で、赤外透過性で、比較的高い屈
折率を有するゲルマニウムやセレン化亜鉛などが用いら
れる。このATRプリズムとセル基板で、測定溶液試料
を容れる空間を持たせたスペーサを挟んでセルを構成す
る。この空間はセルセル室19を構成するもので、その
サイズは赤外測定のための入射光のサイズとストップド
フローの溶液の流量とを勘案して決定されることにな
る。
【0018】セル基板には、ストップドフロー装置から
送液される試料を受け入れる試料導入ポート21、それ
らを混合するミキサー18、不要となった試料溶液を排
出する試料排出ポート22を備えている。試料導入ポー
トの数は、用いる溶液の数とする。図2における試料導
入ポート21からミキサー18を経てセル室に至り、そ
こから試料排出ポート22に至る流路は概念であり、実
施形態としては図3のセル基板上面図33、セル基板正
面図34に示すように、セル基板の下面にストップドフ
ロー装置からの送液配管を取り付ける試料導入ポート2
1を設け、セル基板を上下に貫通する細孔でセル基板の
上面までの流路とし、そこからセル基板上面に細い溝を
掘ってミキサー18までの試料溶液流路35とし、この
流路を180゜以下で交わるようにしてミキサー18を
形成し、そこから概ね交わりの2等分線の方向に溝を設
けてセル室19までの流路とするようにした。
【0019】
【発明の効果】各種反応の過程を、分子の構造を直接反
映する赤外吸収でストップドフロー測定出来るようにな
った。即ち、これまでストップドフロー装置に組み合わ
せて用いられてきた紫外・可視吸収は、対象化学種の電
子状態の変化に伴う吸光度の変化を観測するもので、化
学種が変化したという証拠は得られるが、それがどんな
化学変化、構造変化か直接的に示唆するものではない。
ストップドフロー−蛍光測定も、蛋白質の変成の追跡に
用いられた実績はあるが、蛋白質内の蛍光性アミノ酸残
基、即ちトリプトファン、フェニルアラニン、チロシン
の近傍の状態の変化を観測するもので、やはり、どのよ
うに変化したかを示すものではない。円二色性(CD)
測定が組み合わされた場合も、対象化学種の電子状態の
立体的非対称性の変化を観測するもので、構造、特に化
学結合の変化が直接示されるものではない。これに対し
て赤外吸収は、化学結合そのものを反映するので、その
生成、消滅、変化を直接観測することができ、推定によ
らない構造の変化を追跡できるようになった。
【0020】また蛋白質の変成過程の追跡に、ストップ
ドフロー−円二色性(CD)測定を応用した場合、ある
種の蛋白質では変成に伴って凝集析出して濁りが生じる
ため、光散乱の影響を受けやすいCD測定では、測定が
妨害されるという問題が生じていた。赤外ATR法で
は、このような散乱の影響を本質的に受けないため、正
確かつ信頼性の高い測定が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図1】ストップドフロー装置とATR装置を組み込ん
だ赤外分光光度計を組み合わせたシステムの概念図であ
る。
【図2】ストップドフロー測定のために構成した赤外A
TR用フロースルーセルの模式図である。
【図3】ストップドフロー測定のために構成した赤外A
TR用フロースルーセルの実施例の分解図である。
【符号の説明】
1 赤外分光光度計 2 ATRフロー
スルーセル 3 ストップドフロー装置 4 送液流路及び
温度調節部 5 廃液溜 6 ストップドフ
ロー装置I/F 7 温度コントローラ 8 赤外分光光度
計I/F 11 ATRプリズム 12 スペーサ 13 セル基板 14 測定入射光 15 測定全反射光 16 試料溶液導
入流路 17 試料排出流路 18 ミキサー 19 セル室 20 セル恒温デ
バイス 21 試料導入ポート 22 試料排出ポ
ート 31 スペーサ上面図 32 スペーサ正
面図 33 セル基板上面図 34 セル基板正
面図 35 セル基板正面図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Fターム(参考) 2G054 AA06 AB10 BB10 BB13 CB02 CD03 CE01 EA04 EA05 EB10 FA08 FA18 FA36 GA01 GB01 JA01 2G057 AA01 AB02 AB09 AC01 BA05 DA03 DB05 DC01 DC07 EA06 2G059 AA01 BB04 DD05 DD12 DD13 DD17 EE01 EE02 EE12 FF03 HH01 JJ12 KK01 MM01

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 変化を測定しようとする試料を含む
    溶液に、1乃至それ以上の溶液を一定比率で混合しなが
    ら赤外分光光度計のフロースルーセルに供給し、このフ
    ロースルーセル内の混合試料の赤外吸収信号乃至赤外反
    射信号を検出するようにし、混合溶液の供給を停止する
    ことに同期して信号の経時変化を測定することにより、
    混合溶液の混合によって生起する化学変化、構造変化な
    どの過程を追跡する方法。
  2. 【請求項2】 請求項1に関わる経時変化を追跡する方
    法で、試料の赤外吸収信号乃至赤外反射信号をATR法
    で検出する方法。
  3. 【請求項3】 請求項1に関わる赤外分光光度計のフロ
    ースルーセルで、2以上の試料溶液導入ポートと、そこ
    から導入された溶液が混合して測定セルに到達するミキ
    サーと、セル部にゲルマニウム、セレン化亜鉛などのよ
    うな高屈折率で赤外線透過性の材質で構成したプリズム
    を設け、このプリズムの接液面で測定赤外光を全反射さ
    せるように構成した赤外ATR法測定装置。
  4. 【請求項4】 請求項3に関わる赤外分光光度計のAT
    Rフロースルーセルで、試料溶液導入ポート以降の溶液
    の流路、ミキサー、混合溶液をセル部へ導く流路、セル
    から溶液を排出するための流路などを、セル基板に溝を
    掘ることにより構成したATRフロースルーセル。
  5. 【請求項5】 請求項3に関わる赤外分光光度計のAT
    Rフロースルーセルで、セル部を恒温に保つ機構を持た
    せた恒温ATRフロースルーセル。
  6. 【請求項6】 請求項5に関わる赤外分光光度計の恒温
    ATRフロースルーセルで、セル基板に恒温水を循環す
    る流路を別途設け、そこに恒温水などを循環させること
    によりセル部を恒温に保つようにしたATRフロースル
    ーセル。
  7. 【請求項7】 請求項5に関わる赤外分光光度計の恒温
    ATRフロースルーセルで、セル基板にペルチェ素子を
    用いた温度制御機構を付属させ、セル部を恒温に保つよ
    うにしたATRフロースルーセル。
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