JP2000224984A - 新規な２級アルコール脱水素酵素、この酵素の製造方法、およびアルコール、アルデヒド、ケトンの製造方法 - Google Patents
新規な２級アルコール脱水素酵素、この酵素の製造方法、およびアルコール、アルデヒド、ケトンの製造方法Info
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- JP2000224984A JP2000224984A JP11027280A JP2728099A JP2000224984A JP 2000224984 A JP2000224984 A JP 2000224984A JP 11027280 A JP11027280 A JP 11027280A JP 2728099 A JP2728099 A JP 2728099A JP 2000224984 A JP2000224984 A JP 2000224984A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 アルコール、特に (R)-3-ヒドロキシ酪酸エ
ステルの製造に有用な新規な２級アルコール脱水素酵
素、該酵素の製造方法、およびその利用を提供すること
を課題とする。 【解決手段】 キャンディダ属により生産される、高活
性で高い立体選択性を有する新規２級アルコール脱水素
酵素を同定した。該酵素を用いることにより、ケトン化
合物からのアルコールの製造、および、アルコールから
のアルデヒド、ケトンの製造が可能となった。該酵素は
特に、(R)-3-ヒドロキシ酪酸エステルの生産等の、ラセ
ミ体アルコールもしくはケトン化合物からの光学活性ア
ルコールの製造に有用であることが判明した。
ステルの製造に有用な新規な２級アルコール脱水素酵
素、該酵素の製造方法、およびその利用を提供すること
を課題とする。 【解決手段】 キャンディダ属により生産される、高活
性で高い立体選択性を有する新規２級アルコール脱水素
酵素を同定した。該酵素を用いることにより、ケトン化
合物からのアルコールの製造、および、アルコールから
のアルデヒド、ケトンの製造が可能となった。該酵素は
特に、(R)-3-ヒドロキシ酪酸エステルの生産等の、ラセ
ミ体アルコールもしくはケトン化合物からの光学活性ア
ルコールの製造に有用であることが判明した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、光学活性3−ヒド
ロキシ酪酸エステルの製造に有用な新規な２級アルコー
ル脱水素酵素、該酵素をコードするDNA、該酵素の製造
方法、および該酵素の利用に関する。
ロキシ酪酸エステルの製造に有用な新規な２級アルコー
ル脱水素酵素、該酵素をコードするDNA、該酵素の製造
方法、および該酵素の利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、光学活性3-ヒドロキシ酪酸エステ
ルの製造方法としては、パン酵母など微生物菌体を用い
た不斉還元法（Helv. Chim. Acta 66, 495 (1983)）な
どが知られている。
ルの製造方法としては、パン酵母など微生物菌体を用い
た不斉還元法（Helv. Chim. Acta 66, 495 (1983)）な
どが知られている。
【０００３】光学活性な 3-ヒドロキシ酪酸エステルを
生成する酵素としては、還元型ニコチンアミド・アデニ
ン・ジヌクレオチドリン酸（以下、NADPHと省略する）
依存的にアセト酢酸エステルを還元し、(S) または (R)
-3-ヒドロキシ酪酸エステルを生成する還元酵素と、酸
化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以
下、NAD+と省略する）もしくは酸化型ニコチンアミド・
アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以下、NADP+と省略
する）依存的に 3-ヒドロキシ酪酸エステルを立体選択
的に脱水素する、ならびに、還元型ニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチド（以下、NADHと省略する）もし
くはNADPH依存的にアセト酢酸エステルを還元する活性
を併せ持つ脱水素酵素が報告されている。
生成する酵素としては、還元型ニコチンアミド・アデニ
ン・ジヌクレオチドリン酸（以下、NADPHと省略する）
依存的にアセト酢酸エステルを還元し、(S) または (R)
-3-ヒドロキシ酪酸エステルを生成する還元酵素と、酸
化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以
下、NAD+と省略する）もしくは酸化型ニコチンアミド・
アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以下、NADP+と省略
する）依存的に 3-ヒドロキシ酪酸エステルを立体選択
的に脱水素する、ならびに、還元型ニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチド（以下、NADHと省略する）もし
くはNADPH依存的にアセト酢酸エステルを還元する活性
を併せ持つ脱水素酵素が報告されている。
【０００４】還元酵素としては、キャンディダ・マグノ
リアエ (Candida magnoliae) 由来の還元酵素Ｓ１（WO/
9835025, 99% ee以上のＲ体を生成) 、クロストリジウ
ム・チロブチリカム (Clostridium tyrobutyricum DSM
1460) 由来アセトアセチル−CoA還元酵素 (Arch. Micro
biol. 163, 310-312 (1995)、99% ee以上のＳ体を生
成)、パン酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 由来１−
クロロ−２−ヘキサノン還元酵素 (J. Org. Chem. 63,
4996-5000 (1998), 99% ee以上のＳ体を生成) などが知
られている。
リアエ (Candida magnoliae) 由来の還元酵素Ｓ１（WO/
9835025, 99% ee以上のＲ体を生成) 、クロストリジウ
ム・チロブチリカム (Clostridium tyrobutyricum DSM
1460) 由来アセトアセチル−CoA還元酵素 (Arch. Micro
biol. 163, 310-312 (1995)、99% ee以上のＳ体を生
成)、パン酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 由来１−
クロロ−２−ヘキサノン還元酵素 (J. Org. Chem. 63,
4996-5000 (1998), 99% ee以上のＳ体を生成) などが知
られている。
【０００５】脱水素酵素としては、キャンディダ・パラ
プシロシス (Candida parapsilosisDSM 70125) 由来カ
ルボニル還元酵素 (Enzyme Microb. Technol. (1993),
15(11), 950-8, 98.5% eeのＳ体を生成) 、シュードモ
ナス・エスピー (Pseudomonassp. PED)由来アルコール
脱水素酵素 (J. Org. Chem. 57, 1526-1532 (1992),Ｒ
体を生成) 、ロドコッカス・エリスロポリス (Rhodococ
cus erythropolis DSM743) 由来カルボニル還元酵素
(J. Biotechnol. 33, 283-292 (1994), Ｓ体を生成) 、
サーモアナエロバクター・エタノリカス (Thermoanaero
bacter ethanolicus ATCC 31550) 由来２級アルコール
脱水素酵素 (Bioorg. Med. Chem. Lett.2, 619-622 (19
92), 96% eeのＳ体を生成) などが知られている。
プシロシス (Candida parapsilosisDSM 70125) 由来カ
ルボニル還元酵素 (Enzyme Microb. Technol. (1993),
15(11), 950-8, 98.5% eeのＳ体を生成) 、シュードモ
ナス・エスピー (Pseudomonassp. PED)由来アルコール
脱水素酵素 (J. Org. Chem. 57, 1526-1532 (1992),Ｒ
体を生成) 、ロドコッカス・エリスロポリス (Rhodococ
cus erythropolis DSM743) 由来カルボニル還元酵素
(J. Biotechnol. 33, 283-292 (1994), Ｓ体を生成) 、
サーモアナエロバクター・エタノリカス (Thermoanaero
bacter ethanolicus ATCC 31550) 由来２級アルコール
脱水素酵素 (Bioorg. Med. Chem. Lett.2, 619-622 (19
92), 96% eeのＳ体を生成) などが知られている。
【０００６】しかしながら、これらの微生物や酵素を用
いた光学活性 3-ヒドロキシ酪酸エステルの製造は、光
学純度、活性、蓄積濃度などにおいて満足のいくもので
はなかった。光学活性 3-ヒドロキシ酪酸エステルは、
医薬品の合成用中間体等として有用な化合物である。こ
の化合物を光学的に高い純度で効率よく製造することこ
とができれば、医薬品などの合成にきわめて有用であ
る。
いた光学活性 3-ヒドロキシ酪酸エステルの製造は、光
学純度、活性、蓄積濃度などにおいて満足のいくもので
はなかった。光学活性 3-ヒドロキシ酪酸エステルは、
医薬品の合成用中間体等として有用な化合物である。こ
の化合物を光学的に高い純度で効率よく製造することこ
とができれば、医薬品などの合成にきわめて有用であ
る。
【０００７】また、NADPH依存性の還元酵素では、菌体
内含量が低く、化学的にも不安定なNADPHが必要である
こと、還元反応の補酵素であるNADPHを再生させるため
に解糖系やNADPH再生用の酵素が必要であることなどか
ら、工業的な生産には不利である。
内含量が低く、化学的にも不安定なNADPHが必要である
こと、還元反応の補酵素であるNADPHを再生させるため
に解糖系やNADPH再生用の酵素が必要であることなどか
ら、工業的な生産には不利である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、アルコー
ル、特に (R)-3-ヒドロキシ酪酸エステルの酵素的な製
造に有用な新規な２級アルコール脱水素酵素と、その製
造方法、ならびに用途の提供を課題とする。
ル、特に (R)-3-ヒドロキシ酪酸エステルの酵素的な製
造に有用な新規な２級アルコール脱水素酵素と、その製
造方法、ならびに用途の提供を課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、光学活性
3-ヒドロキシ酪酸エステルの工業的な製造に有利な、N
ADH依存性のアセト酢酸エステル還元活性とNAD+依存性
の(R)-3-ヒドロキシ酪酸エステル脱水素酵素活性を併せ
持ち、さらに、該酵素単独でNADHもしくはNAD+の再生を
安価に行えるイソプロパノールなどの脱水素酵素活性や
アセトン還元活性を併せ持つ酵素を探索した結果、キャ
ンディダ属微生物において、3-ヒドロキシ酪酸エステル
の (R) 体を選択的に酸化する２級アルコール脱水素酵
素を見い出した。該酵素の精製を行った結果、新規な酵
素であることを見い出し、本発明に至った。
3-ヒドロキシ酪酸エステルの工業的な製造に有利な、N
ADH依存性のアセト酢酸エステル還元活性とNAD+依存性
の(R)-3-ヒドロキシ酪酸エステル脱水素酵素活性を併せ
持ち、さらに、該酵素単独でNADHもしくはNAD+の再生を
安価に行えるイソプロパノールなどの脱水素酵素活性や
アセトン還元活性を併せ持つ酵素を探索した結果、キャ
ンディダ属微生物において、3-ヒドロキシ酪酸エステル
の (R) 体を選択的に酸化する２級アルコール脱水素酵
素を見い出した。該酵素の精製を行った結果、新規な酵
素であることを見い出し、本発明に至った。
【００１０】すなわち本発明は、以下の２級アルコール
脱水素酵素、この酵素の製造方法、およびこの酵素を利
用したアルコール、アルデヒド、ケトンの製造方法等に
関する。 〔１〕次の（１）から（３）に示す理化学的性質を有す
る酵素。 （１）作用 β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを電子受容
体として、(R)-3-ヒドロキシ酪酸エステルを酸化し、ア
セト酢酸エステルを生成する （２）基質特異性 3-ヒドロキシ酪酸エステルのＲ体に対して高い活性を有
するが、3-ヒドロキシ酪酸エステルのＳ体に対しては実
質的に活性を有しない （３）活性化因子 硫酸イオンにより活性化される 〔２〕キャンディダ（Candida）属に属する微生物から
得ることができる〔１〕に記載の酵素。 〔３〕キャンディダ・カテヌレータ（Candida catenula
ta）から得ることができる〔２〕に記載の酵素。 〔４〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の酵素をコード
するDNA。 〔５〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の酵素を産生す
る微生物を培養し、その培養物から前記酵素を取得する
ことを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の
酵素の製造方法。 〔６〕微生物がキャンディダ（Candida）属に属する微
生物である〔５〕の製造方法。 〔７〕微生物がキャンディダ・カテヌレータ（Candida
catenulata）である〔６〕の製造方法。 〔８〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の酵素、また
は、該酵素を産生する微生物、もしくはその処理物を、
ケトンに作用させ、アルコールを製造することを特徴と
する、アルコールの製造方法。
脱水素酵素、この酵素の製造方法、およびこの酵素を利
用したアルコール、アルデヒド、ケトンの製造方法等に
関する。 〔１〕次の（１）から（３）に示す理化学的性質を有す
る酵素。 （１）作用 β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを電子受容
体として、(R)-3-ヒドロキシ酪酸エステルを酸化し、ア
セト酢酸エステルを生成する （２）基質特異性 3-ヒドロキシ酪酸エステルのＲ体に対して高い活性を有
するが、3-ヒドロキシ酪酸エステルのＳ体に対しては実
質的に活性を有しない （３）活性化因子 硫酸イオンにより活性化される 〔２〕キャンディダ（Candida）属に属する微生物から
得ることができる〔１〕に記載の酵素。 〔３〕キャンディダ・カテヌレータ（Candida catenula
ta）から得ることができる〔２〕に記載の酵素。 〔４〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の酵素をコード
するDNA。 〔５〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の酵素を産生す
る微生物を培養し、その培養物から前記酵素を取得する
ことを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の
酵素の製造方法。 〔６〕微生物がキャンディダ（Candida）属に属する微
生物である〔５〕の製造方法。 〔７〕微生物がキャンディダ・カテヌレータ（Candida
catenulata）である〔６〕の製造方法。 〔８〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の酵素、また
は、該酵素を産生する微生物、もしくはその処理物を、
ケトンに作用させ、アルコールを製造することを特徴と
する、アルコールの製造方法。
〔９〕ケトンがアセト酢酸エステルであり、アルコール
が (R)−3−ヒドロキシ酪酸エステルである、〔８〕の
製造方法。 〔１０〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の酵素、また
は、該酵素を産生する微生物、もしくはその処理物を、
アルコールに作用させ、対応するケトンもしくはアルデ
ヒドを製造することを特徴とする、ケトンまたはアルデ
ヒドの製造方法。 〔１１〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の酵素、また
は該酵素を産生する微生物、もしくはその処理物をラセ
ミ体アルコールに作用させ、一方のエナンチオーマーを
酸化することにより、光学活性アルコールを製造するこ
とを特徴とする、光学活性アルコールの製造方法。 〔１２〕〔１１〕に記載のラセミ体アルコールが、3-ヒ
ドロキシ酪酸エステルであり、光学活性アルコールが
(S)−3−ヒドロキシ酪酸エステルである〔１１〕の製造
方法。
が (R)−3−ヒドロキシ酪酸エステルである、〔８〕の
製造方法。 〔１０〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の酵素、また
は、該酵素を産生する微生物、もしくはその処理物を、
アルコールに作用させ、対応するケトンもしくはアルデ
ヒドを製造することを特徴とする、ケトンまたはアルデ
ヒドの製造方法。 〔１１〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の酵素、また
は該酵素を産生する微生物、もしくはその処理物をラセ
ミ体アルコールに作用させ、一方のエナンチオーマーを
酸化することにより、光学活性アルコールを製造するこ
とを特徴とする、光学活性アルコールの製造方法。 〔１２〕〔１１〕に記載のラセミ体アルコールが、3-ヒ
ドロキシ酪酸エステルであり、光学活性アルコールが
(S)−3−ヒドロキシ酪酸エステルである〔１１〕の製造
方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明において、(R)-3-ヒドロキ
シ酪酸エステルを酸化してアセト酢酸エステルを生成す
る活性は、以下のようにして測定することができる。す
なわち、 (R)-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルを基質
とし、NAD+の存在下で酵素を作用させてNADHの増加にと
もなう340nmの吸光度の上昇を測定することにより、酵
素活性を確認することができる。
シ酪酸エステルを酸化してアセト酢酸エステルを生成す
る活性は、以下のようにして測定することができる。す
なわち、 (R)-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルを基質
とし、NAD+の存在下で酵素を作用させてNADHの増加にと
もなう340nmの吸光度の上昇を測定することにより、酵
素活性を確認することができる。
【００１２】本発明において、3-ヒドロキシ酪酸エステ
ルのＳ体に対しては実質的に活性を示さないとは、3-ヒ
ドロキシ酪酸エステルのＲ体に対する酵素活性を１００
としたとき、Ｓ体に対する酵素活性が５以下、好ましく
は1以下である場合を言う。
ルのＳ体に対しては実質的に活性を示さないとは、3-ヒ
ドロキシ酪酸エステルのＲ体に対する酵素活性を１００
としたとき、Ｓ体に対する酵素活性が５以下、好ましく
は1以下である場合を言う。
【００１３】本発明による酵素の脱水素酵素活性ならび
に還元酵素活性は、硫酸イオンにより著しく活性化され
る。硫酸イオンによる活性化作用は、例えば実施例（参
考例１）に記載の方法により測定することができる。す
なわち先に述べた酵素活性を確認するための反応系にお
いて、硫酸イオンの有無による酵素活性の変化を観察す
ればよい。硫酸イオンは、(NH4)2SO4やNa2SO4を0.2-1.
2、好ましくは約0.6M添加することによって供給するこ
とができる。
に還元酵素活性は、硫酸イオンにより著しく活性化され
る。硫酸イオンによる活性化作用は、例えば実施例（参
考例１）に記載の方法により測定することができる。す
なわち先に述べた酵素活性を確認するための反応系にお
いて、硫酸イオンの有無による酵素活性の変化を観察す
ればよい。硫酸イオンは、(NH4)2SO4やNa2SO4を0.2-1.
2、好ましくは約0.6M添加することによって供給するこ
とができる。
【００１４】上記理化学的性質を持つ本発明による２級
アルコール脱水素酵素は、本酵素を産生する微生物細胞
の培養物から得ることができる。本発明による酵素の産
生菌は、たとえばキャンディダ属に属する真菌に見出す
ことができる。本酵素を産生するキャンディダ属に属す
る真菌としては、たとえばキャンディダ・カテヌレータ
（Candida catenulata）IFO 0744株が挙げられる。この
菌株から調製された本発明の酵素は、上記(1)〜(3)の性
質に加え、以下のような理化学的性質、および酵素学的
性質を有する。
アルコール脱水素酵素は、本酵素を産生する微生物細胞
の培養物から得ることができる。本発明による酵素の産
生菌は、たとえばキャンディダ属に属する真菌に見出す
ことができる。本酵素を産生するキャンディダ属に属す
る真菌としては、たとえばキャンディダ・カテヌレータ
（Candida catenulata）IFO 0744株が挙げられる。この
菌株から調製された本発明の酵素は、上記(1)〜(3)の性
質に加え、以下のような理化学的性質、および酵素学的
性質を有する。
【００１５】（４）作用至適pH：脱水素反応の至適pHが
8.5付近であり、還元反応の至適pHは6.0〜6.5である。 （５）分子量：ゲル濾過により82,000。 （６）阻害：アジ化ナトリウムにより阻害される。 またこの菌株より得ることができる本発明による２級ア
ルコール脱水素酵素は、エタノールに対しても脱水素酵
素活性を示す。エタノールに対する作用は、(R)-3-ヒド
ロキシ酪酸エチルエステルにかえてエタノールを基質と
して与えることによって先の方法と同様にして確認する
ことができる。
8.5付近であり、還元反応の至適pHは6.0〜6.5である。 （５）分子量：ゲル濾過により82,000。 （６）阻害：アジ化ナトリウムにより阻害される。 またこの菌株より得ることができる本発明による２級ア
ルコール脱水素酵素は、エタノールに対しても脱水素酵
素活性を示す。エタノールに対する作用は、(R)-3-ヒド
ロキシ酪酸エチルエステルにかえてエタノールを基質と
して与えることによって先の方法と同様にして確認する
ことができる。
【００１６】本発明による２級アルコール脱水素酵素生
産能を有する微生物には、２級アルコール脱水素酵素生
産能を有するキャンディダ属に属するすべての菌株、突
然変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成され
たキャンディダ属由来の２級アルコール脱水素酵素生産
能を有する遺伝子組換え微生物等が含まれる。それらの
うち特に好ましい菌株として、キャンディダ・カテヌレ
ータIFO 0744、IFO 0745、DSM 70136などが挙げられ
る。
産能を有する微生物には、２級アルコール脱水素酵素生
産能を有するキャンディダ属に属するすべての菌株、突
然変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成され
たキャンディダ属由来の２級アルコール脱水素酵素生産
能を有する遺伝子組換え微生物等が含まれる。それらの
うち特に好ましい菌株として、キャンディダ・カテヌレ
ータIFO 0744、IFO 0745、DSM 70136などが挙げられ
る。
【００１７】本発明の酵素は、これらの微生物の抽出物
から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による
沈澱や硫安などによる塩析など）や陽イオン交換、陰イ
オン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キ
レート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマ
トグラフィーなどを適当に組み合わせることにより精製
することができる。たとえば、酵母菌体を破砕後、プロ
タミン硫酸処理、ブチル−トヨパール疎水クロマトグラ
フィー、MonoQを用いた陰イオン交換クロマトグラフィ
ー、TSKG3000SWゲルろ過などを行うことによりポリアク
リルアミドゲル電気泳動的にほぼ単一バンドにまで精製
することができる。
から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による
沈澱や硫安などによる塩析など）や陽イオン交換、陰イ
オン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キ
レート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマ
トグラフィーなどを適当に組み合わせることにより精製
することができる。たとえば、酵母菌体を破砕後、プロ
タミン硫酸処理、ブチル−トヨパール疎水クロマトグラ
フィー、MonoQを用いた陰イオン交換クロマトグラフィ
ー、TSKG3000SWゲルろ過などを行うことによりポリアク
リルアミドゲル電気泳動的にほぼ単一バンドにまで精製
することができる。
【００１８】また本発明は、本発明の２級アルコール脱
水素酵素をコードするDNAに関する。本発明の酵素をコ
ードするDNAは、本酵素を精製し、アミノ酸配列を解析
後、アミノ酸配列を元にプローブや、プライマーを合成
し、コロニーハイブリダイゼーションやポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）を利用して得ることができる。
水素酵素をコードするDNAに関する。本発明の酵素をコ
ードするDNAは、本酵素を精製し、アミノ酸配列を解析
後、アミノ酸配列を元にプローブや、プライマーを合成
し、コロニーハイブリダイゼーションやポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）を利用して得ることができる。
【００１９】たとえば、精製酵素のＮ末端アミノ酸配列
とリジルエンドペプチダーゼなどにより消化したペプチ
ド断片をアミノ酸シーケンサーにより解析して得られる
内部配列を元に、プライマーを合成し、該プライマーを
用いたPCRにより本酵素をコードする遺伝子の一部を
得、得られた遺伝子をプローブとして、該酵素を産生す
る微生物より調製したゲノムDNAライブラリーまたはcDN
Aライブラリーをコロニーハイブリダイゼーションやプ
ラークハイブリダイゼーション等でスクリーニングする
ことにより本酵素をコードするDNAの全領域を得ること
ができる。または、PCRにより得られたDNA断片の塩基配
列を基に、RACE法（Rapid Amplificationof cDNA End、
「PCR実験マニュアル」、p25-33、HBJ出版局）や逆PCR
法（Genetics, 120, 621-623 (1988)）などにより本酵
素をコードするDNAの全領域を得ることができる
とリジルエンドペプチダーゼなどにより消化したペプチ
ド断片をアミノ酸シーケンサーにより解析して得られる
内部配列を元に、プライマーを合成し、該プライマーを
用いたPCRにより本酵素をコードする遺伝子の一部を
得、得られた遺伝子をプローブとして、該酵素を産生す
る微生物より調製したゲノムDNAライブラリーまたはcDN
Aライブラリーをコロニーハイブリダイゼーションやプ
ラークハイブリダイゼーション等でスクリーニングする
ことにより本酵素をコードするDNAの全領域を得ること
ができる。または、PCRにより得られたDNA断片の塩基配
列を基に、RACE法（Rapid Amplificationof cDNA End、
「PCR実験マニュアル」、p25-33、HBJ出版局）や逆PCR
法（Genetics, 120, 621-623 (1988)）などにより本酵
素をコードするDNAの全領域を得ることができる
【００２０】本発明の２級アルコール脱水素酵素をコー
ドする遺伝子は、以下に記述するレプリカを用いた活性
染色法によっても容易に調製することができる。キャン
ディダ属に属し、２級アルコール脱水素酵素生産能を有
する微生物を培養し、Zymolyase, Novozyme 234などに
よりスフェロプラストとし、通常の方法（例えばJ.Bio
l.Chem.268.26212-26219(1993),Meth.Cell.Biol.29,39-
44(1975)）により染色体DNAを調製する。精製した染色
体DNAを適当な制限酵素（HindIII,EcoRI,BamHI,Sau3AI
など）により完全もしくは部分消化し、2-8kb程度のDNA
断片を大腸菌の発現ベクター、例えば、pUC18（宝酒造
製）、pKK223-3（ファルマシア製）、pET誘導体（宝酒
造製）、pMAL-p2（NEB製）などに導入し、得られた組換
えプラスミドで大腸菌（エシェリヒア・コリ JM109株な
ど）を形質転換し、得られた形質転換体をプラスミドに
応じた抗生物質（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子を持つ
プラスミドではアンピシリンを50mg/L）を含むLB培地
（Bacto-Tryptone10g, Bacto-Yeast extract 5g, 塩化
ナトリウム 10g, Bacto-Agar 15g/L）などのプレート上
で培養し、適当な誘導物質（例えば、lac, trp, trcプ
ロモーターではIPTG）などの添加や温度上昇などにより
酵素遺伝子を発現させる。得られた形質転換株のコロニ
ーをプレートから濾紙などに写し取り（これをレプリカ
という）、このレプリカ上でリゾチームやクロロホルム
などにより菌を溶菌させ（例えば、10mg/mL リゾチーム
中で室温30分程度放置する）、イソプロパノールなどの
基質と、NAD+、フェナジンメトサルフェート（PMS）、
ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）を含む反応液（例
えば、100mM イソプロパノール、1.3mM NAD+、0.128mM
PMS、0.48mM NBTを含む反応液）にレプリカを浸し、反
応させることにより、キャンディダ属由来の２級アルコ
ール脱水素酵素生産能がプラスミドにより付与された形
質転換株のみが紫色に呈色する。
ドする遺伝子は、以下に記述するレプリカを用いた活性
染色法によっても容易に調製することができる。キャン
ディダ属に属し、２級アルコール脱水素酵素生産能を有
する微生物を培養し、Zymolyase, Novozyme 234などに
よりスフェロプラストとし、通常の方法（例えばJ.Bio
l.Chem.268.26212-26219(1993),Meth.Cell.Biol.29,39-
44(1975)）により染色体DNAを調製する。精製した染色
体DNAを適当な制限酵素（HindIII,EcoRI,BamHI,Sau3AI
など）により完全もしくは部分消化し、2-8kb程度のDNA
断片を大腸菌の発現ベクター、例えば、pUC18（宝酒造
製）、pKK223-3（ファルマシア製）、pET誘導体（宝酒
造製）、pMAL-p2（NEB製）などに導入し、得られた組換
えプラスミドで大腸菌（エシェリヒア・コリ JM109株な
ど）を形質転換し、得られた形質転換体をプラスミドに
応じた抗生物質（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子を持つ
プラスミドではアンピシリンを50mg/L）を含むLB培地
（Bacto-Tryptone10g, Bacto-Yeast extract 5g, 塩化
ナトリウム 10g, Bacto-Agar 15g/L）などのプレート上
で培養し、適当な誘導物質（例えば、lac, trp, trcプ
ロモーターではIPTG）などの添加や温度上昇などにより
酵素遺伝子を発現させる。得られた形質転換株のコロニ
ーをプレートから濾紙などに写し取り（これをレプリカ
という）、このレプリカ上でリゾチームやクロロホルム
などにより菌を溶菌させ（例えば、10mg/mL リゾチーム
中で室温30分程度放置する）、イソプロパノールなどの
基質と、NAD+、フェナジンメトサルフェート（PMS）、
ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）を含む反応液（例
えば、100mM イソプロパノール、1.3mM NAD+、0.128mM
PMS、0.48mM NBTを含む反応液）にレプリカを浸し、反
応させることにより、キャンディダ属由来の２級アルコ
ール脱水素酵素生産能がプラスミドにより付与された形
質転換株のみが紫色に呈色する。
【００２１】この形質転換株よりプラスミドを調製し、
挿入されたDNA断片を部分的に欠失させたプラスミドを
制限酵素消化やエンドヌクレアーゼにより調製し、欠失
プラスミドで形質転換された大腸菌が２級アルコール脱
水素酵素生産能を有するかどうかをレプリカ法により調
べることにより、２級アルコール脱水素酵素遺伝子をコ
ードするDNAの領域を特定することができる。特定され
たDNA領域の塩基配列を解析し、開始コドン、終止コド
ン、翻訳産物の分子量などからオープンリーディングフ
レームを特定することにより、キャンディダ属の生産す
る２級アルコール脱水素酵素遺伝子をクローニングする
ことができる。キャンディダ属の生産する２級アルコー
ル脱水素酵素遺伝子が大腸菌内で機能的に発現すること
は、従来報告されているキャンディダ属由来の脱水素酵
素遺伝子（DNA Databank of Japan (DDBJ)に1999年２月
１日現在、２０件登録）においてイントロンが含まれて
いないことなどから、十分に期待できる。
挿入されたDNA断片を部分的に欠失させたプラスミドを
制限酵素消化やエンドヌクレアーゼにより調製し、欠失
プラスミドで形質転換された大腸菌が２級アルコール脱
水素酵素生産能を有するかどうかをレプリカ法により調
べることにより、２級アルコール脱水素酵素遺伝子をコ
ードするDNAの領域を特定することができる。特定され
たDNA領域の塩基配列を解析し、開始コドン、終止コド
ン、翻訳産物の分子量などからオープンリーディングフ
レームを特定することにより、キャンディダ属の生産す
る２級アルコール脱水素酵素遺伝子をクローニングする
ことができる。キャンディダ属の生産する２級アルコー
ル脱水素酵素遺伝子が大腸菌内で機能的に発現すること
は、従来報告されているキャンディダ属由来の脱水素酵
素遺伝子（DNA Databank of Japan (DDBJ)に1999年２月
１日現在、２０件登録）においてイントロンが含まれて
いないことなどから、十分に期待できる。
【００２２】また、発現制御に関わる領域が大腸菌内で
機能しなかった場合でも、大腸菌における発現ベクタ
ー、例えば、pUC18, pKK223-3, pET, pMAL-p2などを用
い、プロモーターの下流に順方向にオープンリーディン
グフレームを連結すれば、キャンディダ・パラプシロシ
ス由来の２級アルコール脱水素酵素が大腸菌内でtacプ
ロモーターによって発現されたことが報告されて（特開
平07-231785）いるのと同様に、キャンディダ属由来の
２級アルコール脱水素酵素を直接もしくは融合タンパク
質として発現可能である。なお、宿主として利用する大
腸菌JM109株やHB101株やpUC18やpKK223-3などのプラス
ミドにより形質転換された大腸菌は、イソプロパノール
脱水素酵素活性を有せず、レプリカを用いた活性染色法
では紫色に染色されない。また、キャンディダ属の２級
アルコール脱水素酵素遺伝子が大腸菌において大腸菌の
機能するプロモーターの下流に正しく配置されていても
機能的に発現できない可能性（遺伝子中にイントロンを
含む場合など）も考えられるが、このような場合には、
染色体DNAをランダムに大腸菌のプラスミドに挿入せ
ず、キャンディダ属よりメッセンジャーRNA（以下、mRN
Aと略す）を調製し、mRNAから逆転写酵素などを利用し
てｃDNAを調製し、ｃDNAを大腸菌や酵母の発現ベクター
に導入することにより機能的に発現させることができ
る。このとき、酵母の宿主ベクター系としては、サッカ
ロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）な
どを利用できる。なお、酵母においてレプリカを用いた
活性染色法を行う際には、大腸菌における溶菌酵素リゾ
チームの代わりにザイモリアーゼ（Zymnolyase）を用い
る必要があるが、それ以外は大腸菌の方法をそのまま利
用できる。
機能しなかった場合でも、大腸菌における発現ベクタ
ー、例えば、pUC18, pKK223-3, pET, pMAL-p2などを用
い、プロモーターの下流に順方向にオープンリーディン
グフレームを連結すれば、キャンディダ・パラプシロシ
ス由来の２級アルコール脱水素酵素が大腸菌内でtacプ
ロモーターによって発現されたことが報告されて（特開
平07-231785）いるのと同様に、キャンディダ属由来の
２級アルコール脱水素酵素を直接もしくは融合タンパク
質として発現可能である。なお、宿主として利用する大
腸菌JM109株やHB101株やpUC18やpKK223-3などのプラス
ミドにより形質転換された大腸菌は、イソプロパノール
脱水素酵素活性を有せず、レプリカを用いた活性染色法
では紫色に染色されない。また、キャンディダ属の２級
アルコール脱水素酵素遺伝子が大腸菌において大腸菌の
機能するプロモーターの下流に正しく配置されていても
機能的に発現できない可能性（遺伝子中にイントロンを
含む場合など）も考えられるが、このような場合には、
染色体DNAをランダムに大腸菌のプラスミドに挿入せ
ず、キャンディダ属よりメッセンジャーRNA（以下、mRN
Aと略す）を調製し、mRNAから逆転写酵素などを利用し
てｃDNAを調製し、ｃDNAを大腸菌や酵母の発現ベクター
に導入することにより機能的に発現させることができ
る。このとき、酵母の宿主ベクター系としては、サッカ
ロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）な
どを利用できる。なお、酵母においてレプリカを用いた
活性染色法を行う際には、大腸菌における溶菌酵素リゾ
チームの代わりにザイモリアーゼ（Zymnolyase）を用い
る必要があるが、それ以外は大腸菌の方法をそのまま利
用できる。
【００２３】得られたDNAは、適当な発現ベクターに組
込み、宿主細胞へ形質転換することによって、該DNAが
コードする本発明の２級アルコール脱水素酵素の高発現
株を得ることができる。このような高発現株は、本発明
の酵素の製造や、以下に述べる２級アルコールやケトン
等の製造に用いることができる。
込み、宿主細胞へ形質転換することによって、該DNAが
コードする本発明の２級アルコール脱水素酵素の高発現
株を得ることができる。このような高発現株は、本発明
の酵素の製造や、以下に述べる２級アルコールやケトン
等の製造に用いることができる。
【００２４】本発明の酵素は、２級アルコール酸化（脱
水素）活性を有する。従って、２級アルコールを基質と
して本発明の酵素に作用させ、反応産物であるケトンも
しくはアルデヒドを製造することができる。本発明にお
いて基質とすることができる２級アルコールには、以下
のような化合物が含まれる。
水素）活性を有する。従って、２級アルコールを基質と
して本発明の酵素に作用させ、反応産物であるケトンも
しくはアルデヒドを製造することができる。本発明にお
いて基質とすることができる２級アルコールには、以下
のような化合物が含まれる。
【００２５】本発明において、２級アルコールとは、以
下のような一般式で示される化合物を意味する。 Ｒ１−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ２ Ｒ１：ハロゲンまたは芳香族による置換を含む、Ｃ１−
Ｃ６の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基、 Ｒ２：Ｈもしくは、ハロゲンによる置換を含むＣ１−Ｃ
２のアルキル基、またはＲ３−ＣＨ（Ｒ４）−ＣＯＯＲ
５ Ｒ３：ハロゲンまたは芳香族による置換を含む、Ｃ１−
Ｃ５の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基、 Ｒ４：Ｈ、ハロゲンもしくはハロゲン置換を含むＣ１−
Ｃ２のアルキル基、 Ｒ５：Ｃ１−Ｃ４の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基。
下のような一般式で示される化合物を意味する。 Ｒ１−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ２ Ｒ１：ハロゲンまたは芳香族による置換を含む、Ｃ１−
Ｃ６の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基、 Ｒ２：Ｈもしくは、ハロゲンによる置換を含むＣ１−Ｃ
２のアルキル基、またはＲ３−ＣＨ（Ｒ４）−ＣＯＯＲ
５ Ｒ３：ハロゲンまたは芳香族による置換を含む、Ｃ１−
Ｃ５の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基、 Ｒ４：Ｈ、ハロゲンもしくはハロゲン置換を含むＣ１−
Ｃ２のアルキル基、 Ｒ５：Ｃ１−Ｃ４の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基。
【００２６】以上の基質化合物の中でも特に重要なもの
が(R)-3-ヒドロキシ酪酸エステルである。本発明におけ
る(R)-3-ヒドロキシ酪酸エステルには、エチルエステル
等の化合物が含まれる。本発明による２級アルコール脱
水素酵素は、酸化的条件下でNAD+依存的に(R)-3-ヒドロ
キシ酪酸エステルを酸化し、アセト酢酸エステルを生成
する。
が(R)-3-ヒドロキシ酪酸エステルである。本発明におけ
る(R)-3-ヒドロキシ酪酸エステルには、エチルエステル
等の化合物が含まれる。本発明による２級アルコール脱
水素酵素は、酸化的条件下でNAD+依存的に(R)-3-ヒドロ
キシ酪酸エステルを酸化し、アセト酢酸エステルを生成
する。
【００２７】本発明による脱水素酵素反応を行わせるに
は、酸化的条件下で本発明による２級アルコール脱水素
酵素を、NAD+存在下で基質と接触させる。酸化的脱水素
反応の場合、基質である２級アルコールを濃度１〜１０
００mM、NAD+を０．０１〜１０mMで使用することができ
る。反応温度は反応が進行する温度であれば特に限定さ
れないが、好ましくは１０〜４０℃、反応pHは7〜9、好
ましくは約8.5である。酸化的な条件とは、上記pH範囲
を与えることによって達成することができる。
は、酸化的条件下で本発明による２級アルコール脱水素
酵素を、NAD+存在下で基質と接触させる。酸化的脱水素
反応の場合、基質である２級アルコールを濃度１〜１０
００mM、NAD+を０．０１〜１０mMで使用することができ
る。反応温度は反応が進行する温度であれば特に限定さ
れないが、好ましくは１０〜４０℃、反応pHは7〜9、好
ましくは約8.5である。酸化的な条件とは、上記pH範囲
を与えることによって達成することができる。
【００２８】また、本発明の酵素は、ケトンに対する還
元活性を有する。すなわち、還元的条件下においては酸
化反応の逆反応を触媒することができる。従って、ケト
ンを基質として本発明の酵素に作用させ、反応産物であ
るアルコールを製造することができる。たとえばアセト
酢酸エステルを基質とし、NADH依存的にこれを還元して
(R)-3-ヒドロキシ酪酸エステルを与える。還元的２級ア
ルコール生成反応の場合、本発明の反応条件として、基
質であるケトンやアルデヒドを濃度１〜１０００mM、NA
DHを０．０１〜１０mMで使用することができる。これら
の基質や補酵素は、反応媒体中で必ずしも完全に溶解し
なくてもよい。反応温度は反応が進行する温度であれば
限定されないが、好ましくは１０〜４０℃、反応pHは5
〜7、好ましくは6.0-6.5である。還元的な条件とは、上
記pH範囲を与えることによって達成することができる。
元活性を有する。すなわち、還元的条件下においては酸
化反応の逆反応を触媒することができる。従って、ケト
ンを基質として本発明の酵素に作用させ、反応産物であ
るアルコールを製造することができる。たとえばアセト
酢酸エステルを基質とし、NADH依存的にこれを還元して
(R)-3-ヒドロキシ酪酸エステルを与える。還元的２級ア
ルコール生成反応の場合、本発明の反応条件として、基
質であるケトンやアルデヒドを濃度１〜１０００mM、NA
DHを０．０１〜１０mMで使用することができる。これら
の基質や補酵素は、反応媒体中で必ずしも完全に溶解し
なくてもよい。反応温度は反応が進行する温度であれば
限定されないが、好ましくは１０〜４０℃、反応pHは5
〜7、好ましくは6.0-6.5である。還元的な条件とは、上
記pH範囲を与えることによって達成することができる。
【００２９】本発明による還元的２級アルコール生成反
応において、適用することができるケトンとしては、以
下のような化合物を示すことができる。 Ｒ１−ＣＯ−Ｒ２ Ｒ１：ハロゲンまたは芳香族による置換を含む、Ｃ１−
Ｃ６の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基、 Ｒ２：Ｈもしくは、ハロゲンによる置換を含むＣ１−Ｃ
２のアルキル基、またはＲ３−ＣＯ−ＣＨＲ４−ＣＯＯ
Ｒ５ Ｒ３：ハロゲンまたは芳香族による置換を含む、Ｃ１−
Ｃ５の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基、 Ｒ４：Ｈ、ハロゲンもしくはハロゲン置換を含むＣ１−
Ｃ２のアルキル基、 Ｒ５：Ｃ１−Ｃ４の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基。
応において、適用することができるケトンとしては、以
下のような化合物を示すことができる。 Ｒ１−ＣＯ−Ｒ２ Ｒ１：ハロゲンまたは芳香族による置換を含む、Ｃ１−
Ｃ６の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基、 Ｒ２：Ｈもしくは、ハロゲンによる置換を含むＣ１−Ｃ
２のアルキル基、またはＲ３−ＣＯ−ＣＨＲ４−ＣＯＯ
Ｒ５ Ｒ３：ハロゲンまたは芳香族による置換を含む、Ｃ１−
Ｃ５の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基、 Ｒ４：Ｈ、ハロゲンもしくはハロゲン置換を含むＣ１−
Ｃ２のアルキル基、 Ｒ５：Ｃ１−Ｃ４の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基。
【００３０】また、本発明の２級アルコール脱水素酵素
は高い立体選択性を有する。この選択性を利用して、例
えばアセト酢酸エステルからの(R)-3-ヒドロキシ酪酸エ
ステルなどの光学活性アルコールの生産に利用すること
ができる。また、ラセミ体 3-ヒドロキシ酪酸エステル
の (R) 体を立体選択的に酸化することを通じて(S)-3-
ヒドロキシ酪酸エステルの製造に利用することができ
る。より具体的には、3-ヒドロキシ酪酸エステルの (S)
体と(R)体とが混在するラセミ体に、本発明による２級
アルコール脱水素酵素をNAD+共存下で作用させるのであ
る。立体選択性に優れる本発明による２級アルコール脱
水素酵素は、(R)体に対して特異的に作用し、これを酸
化してアセト酢酸エステルとするが、(S)体の3-ヒドロ
キシ酪酸エステルには作用しないので、やがて(S)体の
割合が大きくなってくる。こうして蓄積する(S)体を分
離すれば、最終的にラセミ体から(S)体の3-ヒドロキシ
酪酸エステルを回収することができる。より高純度な状
態で3-ヒドロキシ酪酸エステルを回収するために、酵素
反応によって(R)体の3-ヒドロキシ酪酸エステルから生
成するアセト酢酸エステルを更に酵素的に酸化すること
もできる。
は高い立体選択性を有する。この選択性を利用して、例
えばアセト酢酸エステルからの(R)-3-ヒドロキシ酪酸エ
ステルなどの光学活性アルコールの生産に利用すること
ができる。また、ラセミ体 3-ヒドロキシ酪酸エステル
の (R) 体を立体選択的に酸化することを通じて(S)-3-
ヒドロキシ酪酸エステルの製造に利用することができ
る。より具体的には、3-ヒドロキシ酪酸エステルの (S)
体と(R)体とが混在するラセミ体に、本発明による２級
アルコール脱水素酵素をNAD+共存下で作用させるのであ
る。立体選択性に優れる本発明による２級アルコール脱
水素酵素は、(R)体に対して特異的に作用し、これを酸
化してアセト酢酸エステルとするが、(S)体の3-ヒドロ
キシ酪酸エステルには作用しないので、やがて(S)体の
割合が大きくなってくる。こうして蓄積する(S)体を分
離すれば、最終的にラセミ体から(S)体の3-ヒドロキシ
酪酸エステルを回収することができる。より高純度な状
態で3-ヒドロキシ酪酸エステルを回収するために、酵素
反応によって(R)体の3-ヒドロキシ酪酸エステルから生
成するアセト酢酸エステルを更に酵素的に酸化すること
もできる。
【００３１】酸化的脱水素反応、還元的２級アルコール
生成反応、あるいはこれらの酵素作用を利用した立体異
性体の分別のための酵素反応などにおいて、反応系を構
成する基質や出発材料は、様々な形態で接触させること
ができる。たとえば、酵素、基質、ならびに補酵素との
接触は、３者を同一溶液中に混合することによって達成
される。もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、たとえ
ば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホル
ム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒
体との２相系により行うことができる。更に本発明の反
応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うこ
とも可能である。いずれの形態においても、反応系を構
成するこれらの基質や補酵素は反応媒体中で完全に溶解
しなくてもよい。また、基質は反応開始時に一括して添
加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高く
なりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加す
ることもできる。反応は５分から１００時間程度行えば
よい。生成物の単離は抽出、濃縮、イオン交換、電気透
析、晶析等の公知の方法を利用して行うことができる。
生成反応、あるいはこれらの酵素作用を利用した立体異
性体の分別のための酵素反応などにおいて、反応系を構
成する基質や出発材料は、様々な形態で接触させること
ができる。たとえば、酵素、基質、ならびに補酵素との
接触は、３者を同一溶液中に混合することによって達成
される。もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、たとえ
ば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホル
ム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒
体との２相系により行うことができる。更に本発明の反
応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うこ
とも可能である。いずれの形態においても、反応系を構
成するこれらの基質や補酵素は反応媒体中で完全に溶解
しなくてもよい。また、基質は反応開始時に一括して添
加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高く
なりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加す
ることもできる。反応は５分から１００時間程度行えば
よい。生成物の単離は抽出、濃縮、イオン交換、電気透
析、晶析等の公知の方法を利用して行うことができる。
【００３２】本発明による還元的２級アルコール生成酵
素反応では、NADHの消費に伴って反応環境が次第に酸化
的となる。還元的な状態を維持するために、上記反応系
にNADHの再生系を組み合わせることができる。還元反応
に付随してNADHから生成するNAD+の、NADHへの再生は、
微生物の持つNAD+還元能（解糖系など）を用いて行うこ
とができる。これらNAD+還元能は、反応系にグルコース
やエタノール、イソプロパノールを添加することにより
増強することが可能である。また、本酵素のエタノール
やイソプロパノール脱水素活性を利用し、反応系にエタ
ノールやイソプロパノールを添加することにより本酵素
単独でNADHの再生を行うことも可能である。さらに、NA
D+からNADHを生成する能力を有する微生物やその処理
物、酵素を反応系に添加することによっても行うことが
できる。たとえば、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素
酵素、リンゴ酸脱水素酵素を含む微生物、その処理物、
ならびに精製酵素を用いてNADHの再生を行うことができ
る。
素反応では、NADHの消費に伴って反応環境が次第に酸化
的となる。還元的な状態を維持するために、上記反応系
にNADHの再生系を組み合わせることができる。還元反応
に付随してNADHから生成するNAD+の、NADHへの再生は、
微生物の持つNAD+還元能（解糖系など）を用いて行うこ
とができる。これらNAD+還元能は、反応系にグルコース
やエタノール、イソプロパノールを添加することにより
増強することが可能である。また、本酵素のエタノール
やイソプロパノール脱水素活性を利用し、反応系にエタ
ノールやイソプロパノールを添加することにより本酵素
単独でNADHの再生を行うことも可能である。さらに、NA
D+からNADHを生成する能力を有する微生物やその処理
物、酵素を反応系に添加することによっても行うことが
できる。たとえば、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素
酵素、リンゴ酸脱水素酵素を含む微生物、その処理物、
ならびに精製酵素を用いてNADHの再生を行うことができ
る。
【００３３】NADH再生のために反応系に添加される化合
物、たとえば、グルコース脱水素酵素を利用する場合の
グルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、ア
ルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしく
はイソプロパノールなどは、基質ケトンに対してモル比
で１−２０、好ましくは１−５倍過剰に添加することが
できる。NADH再生用の酵素は、たとえば、グルコース脱
水素酵素やギ酸脱水素酵素などは、本発明の２級アルコ
ール脱水素酵素に比較して酵素活性で０．１−１００
倍、好ましくは０．５−２０倍程度添加することができ
る。
物、たとえば、グルコース脱水素酵素を利用する場合の
グルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、ア
ルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしく
はイソプロパノールなどは、基質ケトンに対してモル比
で１−２０、好ましくは１−５倍過剰に添加することが
できる。NADH再生用の酵素は、たとえば、グルコース脱
水素酵素やギ酸脱水素酵素などは、本発明の２級アルコ
ール脱水素酵素に比較して酵素活性で０．１−１００
倍、好ましくは０．５−２０倍程度添加することができ
る。
【００３４】他方、酸化的脱水素反応に付随してNAD+か
ら生成するNADHの、NAD+への再生は、微生物の有するNA
DH酸化活性 (NADH脱水素酵素、NADHオキシダーゼなどの
電子伝達系) を利用して行うことができる。また、本酵
素の持つアセトン還元活性を利用し、反応系にアセトン
を添加することにより本酵素単独でNAD+の再生を行うこ
とも可能である。更に、NADHのNAD+への酸化活性を有す
る微生物菌体、その破砕物、酵素 (ジアホラーゼなど)
を反応系に添加することによっても行うことができる。
ら生成するNADHの、NAD+への再生は、微生物の有するNA
DH酸化活性 (NADH脱水素酵素、NADHオキシダーゼなどの
電子伝達系) を利用して行うことができる。また、本酵
素の持つアセトン還元活性を利用し、反応系にアセトン
を添加することにより本酵素単独でNAD+の再生を行うこ
とも可能である。更に、NADHのNAD+への酸化活性を有す
る微生物菌体、その破砕物、酵素 (ジアホラーゼなど)
を反応系に添加することによっても行うことができる。
【００３５】これら各種合成反応に利用する本発明の酵
素は、精製酵素に限定されず、粗精製酵素、本酵素を含
む微生物菌体、その処理物も含まれる。また、本酵素を
含む微生物は、キャンディダ属に限定されない。なお本
発明における処理物とは、菌体、精製酵素、あるいは粗
精製酵素などを様々な方法で固定化処理したものを総称
して示す用語である。以下、実施例により本発明をさら
に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるもので
はない。
素は、精製酵素に限定されず、粗精製酵素、本酵素を含
む微生物菌体、その処理物も含まれる。また、本酵素を
含む微生物は、キャンディダ属に限定されない。なお本
発明における処理物とは、菌体、精製酵素、あるいは粗
精製酵素などを様々な方法で固定化処理したものを総称
して示す用語である。以下、実施例により本発明をさら
に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるもので
はない。
【００３６】
【実施例】［参考例１］ (R)-3-ヒドロキシ酪酸エチル
エステル脱水素酵素活性の測定 本発明において、(R)-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステル
脱水素酵素活性の測定は、50 mMトリス−塩酸緩衝液（p
H 8.5）、2.5 mM NAD+、20 mM (R)-3-ヒドロキシ酪酸エ
チルエステル、0.6 M硫安及び酵素を合む反応液中30℃
で反応させ、NADHの増加にともなう340nmの吸光度の増
加を測定することにより行った。１Uは、1分間に１μmo
lのNADHの増加を触媒する酵素量とした。また、タンパ
ク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキッ
トを用いた色素結合法により行った。
エステル脱水素酵素活性の測定 本発明において、(R)-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステル
脱水素酵素活性の測定は、50 mMトリス−塩酸緩衝液（p
H 8.5）、2.5 mM NAD+、20 mM (R)-3-ヒドロキシ酪酸エ
チルエステル、0.6 M硫安及び酵素を合む反応液中30℃
で反応させ、NADHの増加にともなう340nmの吸光度の増
加を測定することにより行った。１Uは、1分間に１μmo
lのNADHの増加を触媒する酵素量とした。また、タンパ
ク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキッ
トを用いた色素結合法により行った。
【００３７】［実施例１］ ２級アルコール脱水素酵素
の精製 キャンディダ・カテヌレータIFO 0744株をYM培地（グル
コース24g，酵母エキス3g，麦芽エキス3g，バクトペプ
トン5g/L、 pH 6.0）で培養し、遠心分離により菌体を
調製した。得られた湿菌体を100 mMリン酸カリウム緩衝
液 (pH 8.0), 0.02% 2-メルカプトエタノール, 2 mMフ
ェニルメタンスルホニルフルオリドで懸濁し、ビードビ
ーター（Biospec社製) により破砕後、遠心分離機によ
り菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞
抽出液にプロタミン硫酸を添加後、遠心分離により上清
を得た。その上清に、硫安を添加して30％飽和にし、30
％硫安飽和標準緩衝液 (10 mMリン酸カリウム緩衝液 (p
H 8.0) , 0.01% 2-メルカプトエタノール) で平衡化し
たブチル−トヨパールカラムを用い、30％硫安飽和〜0
％までの濃度勾配溶出を行い、活性画分を回収した。
の精製 キャンディダ・カテヌレータIFO 0744株をYM培地（グル
コース24g，酵母エキス3g，麦芽エキス3g，バクトペプ
トン5g/L、 pH 6.0）で培養し、遠心分離により菌体を
調製した。得られた湿菌体を100 mMリン酸カリウム緩衝
液 (pH 8.0), 0.02% 2-メルカプトエタノール, 2 mMフ
ェニルメタンスルホニルフルオリドで懸濁し、ビードビ
ーター（Biospec社製) により破砕後、遠心分離機によ
り菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞
抽出液にプロタミン硫酸を添加後、遠心分離により上清
を得た。その上清に、硫安を添加して30％飽和にし、30
％硫安飽和標準緩衝液 (10 mMリン酸カリウム緩衝液 (p
H 8.0) , 0.01% 2-メルカプトエタノール) で平衡化し
たブチル−トヨパールカラムを用い、30％硫安飽和〜0
％までの濃度勾配溶出を行い、活性画分を回収した。
【００３８】得られた活性画分を限外濾過により濃縮、
脱塩後、MonoQを用いたイオン交換クロマトグラフィー
を行った。0〜1M 塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行
い、活性画分を回収した。活性画分を濃縮後、TSKゲルG
3000SWを用いたゲルろ過により精製した。精製工程の要
約を表１に示した。精製酵素の比活性は、22.5 U/mg-タ
ンパク質であった。
脱塩後、MonoQを用いたイオン交換クロマトグラフィー
を行った。0〜1M 塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行
い、活性画分を回収した。活性画分を濃縮後、TSKゲルG
3000SWを用いたゲルろ過により精製した。精製工程の要
約を表１に示した。精製酵素の比活性は、22.5 U/mg-タ
ンパク質であった。
【００３９】
【表１】
【００４０】［実施例２］ ２級アルコール脱水素酵素
の分子量測定 実施例１で得られた酵素の分子量をTSKゲルG3000SWXLの
ゲルろ過カラムを用いて分子量を測定したところ約82,0
00であった。
の分子量測定 実施例１で得られた酵素の分子量をTSKゲルG3000SWXLの
ゲルろ過カラムを用いて分子量を測定したところ約82,0
00であった。
【００４１】［実施例３］ ２級アルコール脱水素酵素
の至適pH リン酸カリウム緩衝液、トリス塩酸緩衝液を用いてpHを
変化させて、実施例１で得られた酵素のイソプロパノー
ル脱水素酵素活性、アセトン還元活性を調べた。イソプ
ロパノール脱水素酵素活性の測定は、参考例１に示した
活性測定方法のうち、基質である２０mM(R)-3-ヒドロキ
シ酪酸エチルを１００mMイソプロパノールに代えて測定
した。アセトン還元活性は、１００mMリン酸カルシウム
緩衝液pH6.5、０．２mMのNADH、０．６M硫酸ナトリウム
および酵素を含む反応液を３０℃で反応させ、NADHの減
少に伴う３４０nmにおける吸光度の低下を測定すること
により定量した。結果は最大活性を100とした相対活性
で表し、図１に示した。脱水素反応の至適pHは8.5であ
り、還元反応の至適pHは6.0〜6.5であった。
の至適pH リン酸カリウム緩衝液、トリス塩酸緩衝液を用いてpHを
変化させて、実施例１で得られた酵素のイソプロパノー
ル脱水素酵素活性、アセトン還元活性を調べた。イソプ
ロパノール脱水素酵素活性の測定は、参考例１に示した
活性測定方法のうち、基質である２０mM(R)-3-ヒドロキ
シ酪酸エチルを１００mMイソプロパノールに代えて測定
した。アセトン還元活性は、１００mMリン酸カルシウム
緩衝液pH6.5、０．２mMのNADH、０．６M硫酸ナトリウム
および酵素を含む反応液を３０℃で反応させ、NADHの減
少に伴う３４０nmにおける吸光度の低下を測定すること
により定量した。結果は最大活性を100とした相対活性
で表し、図１に示した。脱水素反応の至適pHは8.5であ
り、還元反応の至適pHは6.0〜6.5であった。
【００４２】［実施例４］ ２級アルコール脱水素酵素
の活性化因子 実施例１で得られた酵素を(R)-3-ヒドロキシ酪酸エチル
エステルを基質とした参考例１に記載の標準反応条件の
うち、無機イオンの種類を変えて活性を測定した。その
結果、表２に示したように、硫酸アンモニウム、硫酸ナ
トリウムなど硫酸イオンにより活性化されることが明ら
かとなった。
の活性化因子 実施例１で得られた酵素を(R)-3-ヒドロキシ酪酸エチル
エステルを基質とした参考例１に記載の標準反応条件の
うち、無機イオンの種類を変えて活性を測定した。その
結果、表２に示したように、硫酸アンモニウム、硫酸ナ
トリウムなど硫酸イオンにより活性化されることが明ら
かとなった。
【００４３】
【表２】
【００４４】［実施例５］ ２級アルコール脱水素酵素
の活性化因子濃度の影響 実施例１で得られた酵素を、硫酸アンモニウムもしくは
硫酸ナトリウムの濃度を変えて活性を測定した。その結
果、図２に示したように、硫酸アンモニウムにおいては
0.6 Mで最大活性を示した。硫酸ナトリウムに於いて
は、測定した0.6 Mまで活性は増加し続けた。
の活性化因子濃度の影響 実施例１で得られた酵素を、硫酸アンモニウムもしくは
硫酸ナトリウムの濃度を変えて活性を測定した。その結
果、図２に示したように、硫酸アンモニウムにおいては
0.6 Mで最大活性を示した。硫酸ナトリウムに於いて
は、測定した0.6 Mまで活性は増加し続けた。
【００４５】［実施例６］ ２級アルコール脱水素酵素
の基質特異性 実施例１で得られた酵素の基質特異性を調べるため以下
のような実験を行った。なお脱水素反応（酸化反応）
は、基質濃度をエタノールとプロパンノールは１００m
M、(R)あるいは(S)-3-ヒドロキシ酪酸エチルは２０mMと
する他は、先の活性測定方法にしたがって測定した。活
性はイソプロパノールに対する活性を100とした相対活
性で表した。還元反応では、実施例１で得られた酵素を
用い、100mMリン酸カリウム緩衝液 (pH 6.5)、0.6 M硫
安、0.2 mM NADH及び酵素を含む1mLの反応液中で反応を
行い、NADHの減少に基づく340 nmの吸収の低下を測定し
た。還元反応における基質濃度は、アセトンは１００m
M、アセト酢酸エチルと４−クロロアセト酢酸エチルは
２０mMとした。活性は、アセトンに対する活性を100と
した相対活性で表した。得られた結果を表３に示す。そ
の結果、本酵素は高い立体選択性を有しており、酸化反
応においては、エタノールや(R)-3-ヒドロキシ酪酸エチ
ルに対しては高い活性を有するが、(S)-3-ヒドロキシ酪
酸エチルに対してはほとんど活性を有さないことが判明
した。
の基質特異性 実施例１で得られた酵素の基質特異性を調べるため以下
のような実験を行った。なお脱水素反応（酸化反応）
は、基質濃度をエタノールとプロパンノールは１００m
M、(R)あるいは(S)-3-ヒドロキシ酪酸エチルは２０mMと
する他は、先の活性測定方法にしたがって測定した。活
性はイソプロパノールに対する活性を100とした相対活
性で表した。還元反応では、実施例１で得られた酵素を
用い、100mMリン酸カリウム緩衝液 (pH 6.5)、0.6 M硫
安、0.2 mM NADH及び酵素を含む1mLの反応液中で反応を
行い、NADHの減少に基づく340 nmの吸収の低下を測定し
た。還元反応における基質濃度は、アセトンは１００m
M、アセト酢酸エチルと４−クロロアセト酢酸エチルは
２０mMとした。活性は、アセトンに対する活性を100と
した相対活性で表した。得られた結果を表３に示す。そ
の結果、本酵素は高い立体選択性を有しており、酸化反
応においては、エタノールや(R)-3-ヒドロキシ酪酸エチ
ルに対しては高い活性を有するが、(S)-3-ヒドロキシ酪
酸エチルに対してはほとんど活性を有さないことが判明
した。
【００４６】
【表３】
【００４７】［実施例７］ ２級アルコール脱水素酵素
のアジ化ナトリウムによる阻害 (R)-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルを基質とした参考
例１に記載の反応液にアジ化ナトリウムを20 mM添加し
た条件で活性を測定した結果、アジ化ナトリウムを含ま
ない条件の8.3%しか活性を示さなかった。
のアジ化ナトリウムによる阻害 (R)-3-ヒドロキシ酪酸エチルエステルを基質とした参考
例１に記載の反応液にアジ化ナトリウムを20 mM添加し
た条件で活性を測定した結果、アジ化ナトリウムを含ま
ない条件の8.3%しか活性を示さなかった。
【００４８】
【発明の効果】本発明によって、高い立体選択性を有す
る２級アルコール脱水素酵素が提供された。本酵素を利
用することにより、光学純度の高い (R) もしくは (S)
-3-ヒドロキシ酪酸エステルの効率的な生産方法が提供
された。産業上の有用性の高い3-ヒドロキシ酪酸エステ
ルを、酵素的な製造方法によって、立体異性体として高
い純度で提供することができるので、本発明の経済的な
効果は高い。
る２級アルコール脱水素酵素が提供された。本酵素を利
用することにより、光学純度の高い (R) もしくは (S)
-3-ヒドロキシ酪酸エステルの効率的な生産方法が提供
された。産業上の有用性の高い3-ヒドロキシ酪酸エステ
ルを、酵素的な製造方法によって、立体異性体として高
い純度で提供することができるので、本発明の経済的な
効果は高い。
【図１】実施例１で得られた酵素のイソプロパノール脱
水素活性、アセトン還元活性のpH依存性を示す図であ
る。
水素活性、アセトン還元活性のpH依存性を示す図であ
る。
【図２】実施例１で得られた酵素の硫酸イオンによる活
性化効果を示す図である。
性化効果を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD04 FF03E FF04E FF06E FF12E LL05 4B064 AD64 CA06 CA21 CB12 CB13 CC12 CD27 CE04 CE06 CE07 DA16 4B065 AA73X BA22 BC13 BC26 BD15 BD16 BD17 BD18 CA28
Claims (12)
- 【請求項１】 次の（１）から（３）に示す理化学的性
質を有する酵素。 （１）作用 β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを電子受容
体として、(R)-3-ヒドロキシ酪酸エステルを酸化し、ア
セト酢酸エステルを生成する （２）基質特異性 3-ヒドロキシ酪酸エステルのＲ体に対して高い活性を有
するが、3-ヒドロキシ酪酸エステルのＳ体に対しては実
質的に活性を有しない （３）活性化因子 硫酸イオンにより活性化される - 【請求項２】 キャンディダ（Candida）属に属する微
生物から得ることができる請求項１に記載の酵素。 - 【請求項３】 キャンディダ・カテヌレータ（Candida
catenulata）から得ることができる請求項２に記載の酵
素。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の酵素を
コードするDNA。 - 【請求項５】 請求項１〜３のいずれかに記載の酵素を
産生する微生物を培養し、その培養物から前記酵素を取
得することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記
載の酵素の製造方法。 - 【請求項６】 微生物がキャンディダ（Candida）属に
属する微生物である請求項５の製造方法。 - 【請求項７】 微生物がキャンディダ・カテヌレータ
（Candida catenulata）である請求項６の製造方法。 - 【請求項８】 請求項１〜３のいずれかに記載の酵素、
または、該酵素を産生する微生物、もしくはその処理物
を、ケトンに作用させ、アルコールを製造することを特
徴とする、アルコールの製造方法。 - 【請求項９】 ケトンがアセト酢酸エステルであり、ア
ルコールが (R)−3−ヒドロキシ酪酸エステルである、
請求項８の製造方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜３のいずれかに記載の酵
素、または、該酵素を産生する微生物、もしくはその処
理物を、アルコールに作用させ、対応するケトンもしく
はアルデヒドを製造することを特徴とする、ケトンまた
はアルデヒドの製造方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜３のいずれかに記載の酵
素、または該酵素を産生する微生物、もしくはその処理
物をラセミ体アルコールに作用させ、一方のエナンチオ
ーマーを酸化することにより、光学活性アルコールを製
造することを特徴とする、光学活性アルコールの製造方
法。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載のラセミ体アルコー
ルが、3-ヒドロキシ酪酸エステルであり、光学活性アル
コールが(S)−3−ヒドロキシ酪酸エステルである請求項
１１の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11027280A JP2000224984A (ja) | 1999-02-04 | 1999-02-04 | 新規な２級アルコール脱水素酵素、この酵素の製造方法、およびアルコール、アルデヒド、ケトンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11027280A JP2000224984A (ja) | 1999-02-04 | 1999-02-04 | 新規な２級アルコール脱水素酵素、この酵素の製造方法、およびアルコール、アルデヒド、ケトンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000224984A true JP2000224984A (ja) | 2000-08-15 |
Family
ID=12216673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11027280A Pending JP2000224984A (ja) | 1999-02-04 | 1999-02-04 | 新規な２級アルコール脱水素酵素、この酵素の製造方法、およびアルコール、アルデヒド、ケトンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000224984A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019140958A (ja) * | 2018-02-20 | 2019-08-29 | 大阪瓦斯株式会社 | アセト酢酸の製造方法 |
-
1999
- 1999-02-04 JP JP11027280A patent/JP2000224984A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019140958A (ja) * | 2018-02-20 | 2019-08-29 | 大阪瓦斯株式会社 | アセト酢酸の製造方法 |
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