JP2000224986A - 可溶性グアニル酸シクラーゼに特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡便且つ高感度な一酸化窒素（ＮＯ）の検出
方法及びＮＯ検出用試薬、該検出方法及び検出用試薬に
使用することができる抗可溶性グアニル酸シクラーゼ
（ｓＧＣ）モノクローナル抗体、並びに該モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマの提供。 【解決手段】 ｓＧＣを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体、更には、ｓＧＣを特異的に認識し、且つＮＯが
ｓＧＣ中のヘムと結合することによるｓＧＣのコンフォ
ーメーショナルチェンジ（立体構造変化）、即ち、ＮＯ
が結合したｓＧＣ（ＮＯ結合型ｓＧＣ）をも認識し得る
該抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体の製
造方法、該モノクローナル抗体を用いるＮＯの検出方
法、並びに該モノクローナル抗体を含んでなるＮＯ検出
用試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の利用分野】本発明は、可溶性グアニル酸シクラ
ーゼ（以下、ｓＧＣと略記する。）に特異的に反応し得
る抗ｓＧＣモノクローナル抗体、及び、ｓＧＣに特異的
に反応し、且つ一酸化窒素（ＮＯ）がｓＧＣ中のヘムと
結合することによるｓＧＣのコンフォーメーショナルチ
ェンジ（立体構造変化）、即ち、ＮＯが結合したｓＧＣ
（ＮＯ結合型ｓＧＣ）をも認識し得る抗ｓＧＣモノクロ
ーナル抗体、及び該モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ、並びに該モノクローナル抗体を用いるＮＯ
の検出方法及びＮＯ検出用試薬に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】グアニル酸シクラーゼ（ＧＣ）は、生体
内でセカンドメッセンジャーとして働くサイクリックグ
アノシン−３’，５’−一リン酸（ｃＧＭＰ）をグアノ
シン−５’−三リン酸（ＧＴＰ）から産生する酵素であ
り、動物の神経、肺、血管平滑筋等に分布している。Ｇ
Ｃには、細胞質内に存在している可溶性ＧＣ（ｓＧＣ）
と、細胞膜に存在している膜結合型ＧＣ（ｍＧＣ）の２
種類が知られている。このうち、ｓＧＣは、α及びβの
二つのサブユニットをもつヘムタンパク質であり〔Yosh
inori Kamisaki, et al., J. Biol. Chem. 261, 7236-7
241(1986)〕、細胞内のＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）によっ
て産生されるＮＯにより、その活性が100倍以上に活性
化されること〔James R. Stone, et al., Biochemistry
33, 5636-5640(1994)、Louis J. Ignarro, et al., J.
Biol. Chem. 261, 4997-5002(1986)及びGarthwaite
J., Trends Neurosci. 14, 60-67(1991)〕等が知られて
おり、生体内でつくられるＮＯの唯一のレセプター酵素
として重要な位置を占める。また、近年、ｓＧＣは血管
壁の平滑筋の弛緩及び、小脳の長期抑圧（ＬＴＤ）等に
関与していることが報告されている〔Shibuki K and Ok
ada D., Nature 349, 326-328(1991)〕が、生体内で短
命なＮＯの産生とｓＧＣの細胞内での位置関係、例えば
神経細胞やグリア細胞に於けるｓＧＣと神経細胞型ＮＯ
Ｓ（ｎＮＯＳ）の局在場所、或いはこれら細胞に於ける
ＮＯのｓＧＣへの効果等については十分解明されていな
い。更にウシ肺からのｓＧＣ精製時に、アクチンがｓＧ
Ｃの存在する画分に検出されるという報告もなされてお
り〔Peter H, et al., Eur. J. Biochem. 190, 273-278
(1990)〕、細胞内情報伝達に重要な役割を果たす細胞骨
格系アクチンとｓＧＣとの関係が注目されているが、細
胞内でのアクチンとｓＧＣとの相互関係や生理学的意義
等については未だ解明されていない。

【０００３】しかしながら、従来、ｓＧＣを特異的に認
識し得る抗体は得られておらず、況や、ｓＧＣを特異的
に認識し、且つＮＯによるｓＧＣのコンフォーメーショ
ナルチェンジ（立体構造変化）、即ち、ＮＯが結合した
ｓＧＣ（ＮＯ結合型ｓＧＣ）をも認識し得る抗体は得ら
れておらず、上記した如きｓＧＣの局在場所、或いはｓ
ＧＣとＮＯとの関係やこれらの生理的機能及び病理的な
意義等を明らかにする手段がなかった。

【０００４】一方、近年、生体の細胞内や単細胞生物の
細菌体内等にＮＯを合成する酵素があり、生物は積極的
にＮＯをつくり利用していることが明らかにされてお
り、ＮＯは生体に対して種々の生理作用、例えば、血管
系に於ける血管拡張作用、神経系に於けるシナプスの可
塑性に関係する情報伝達物質としての作用、生体防御系
（免疫系）に於ける病原菌や腫瘍細胞への攻撃作用等に
関係していることが判明している。

【０００５】生体内でつくられる（内因性の）ＮＯの上
記した如き種々のはたらきを明らかにするためには、細
胞、組織、器官等に於けるＮＯの濃度と分布に関するデ
ータが必要であるが、内因性のＮＯの濃度は極めて低
く、寿命も短いので内因性ＮＯの分析は技術的に非常に
困難である。生体内のＮＯを分析する方法としては、例
えばＮＯとオゾンの反応による化学発光を測定する化学
発光法、ＮＯと、オキシヘモグロビン又はミオグロビン
との反応に伴う吸光度変化を測定する吸光光度法、ＮＯ
を電気的に酸化したときに生じる電流変化を測定する電
極法、ＮＯを試薬（スピントラップ試薬）により捕捉し
て電子スピン共鳴法により測定するスピントラップ（Ｅ
ＰＲ）法、ＮＯがｓＧＣを活性化したときに生成される
ｃＧＭＰ量を測定する方法等が知られている。しかしな
がら、これら方法のうち、化学発光法は、生体試料から
ＮＯを気体として取り出す操作が必要であるという問題
点等を有している。また、吸光光度法は、ＮＯ以外にも
オキシヘモグロビン及びミオグロビンと反応する物質が
存在するので特異性が低く、高精度の測定は困難である
という問題点等、電極法は、非常に鋭敏なため再現性・
安定性に問題があるという点等、ＥＰＲ法は、スピント
ラップ試薬に毒性があるという問題点等、夫々種々の問
題点を有しており、現在も、生体試料の分析に適した分
析法に関する模索が続けられている状況である。

【０００６】更に、ＮＯは、大気汚染物質のＮＯ_x（窒
素酸化物）の一つとして、近年注目されている物質でも
あり、大気中のＮＯの分析方法としては、ガスクロマト
グラフ法、質量分析法、化学発光法、可視吸光光度法、
赤外吸光光度法、蛍光光度法、電極法、電子スピン共鳴
法等が知られている。しかしながら、これらの方法は、
特殊な装置や条件を要するという問題点や、操作が煩雑
であり、測定感度の点から、ＮＯを精度よく分析し得な
いという問題点等を有している。

【０００７】

【発明が解決すべき課題】本発明は、上記した如き状況
に鑑みなされたもので、簡便且つ高感度なＮＯの検出方
法及びＮＯ検出用試薬、該検出方法・検出用試薬に使用
することができる抗ｓＧＣモノクローナル抗体、並びに
該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの提供
をその課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】（１）本発明は、ｓＧＣ
を特異的に認識するモノクローナル抗体の発明である。

【０００９】（２）また、本発明は、ｓＧＣを特異的に
認識し、且つＮＯ結合型ｓＧＣを認識するモノクローナ
ル抗体の発明である。

【００１０】（３）更に、本発明は、上記（１）又は
（２）に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマの発明である。

【００１１】（４）更にまた、本発明は、上記（３）に
記載のハイブリドーマを培養することを特徴とする上記
（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体の製造方
法の発明である。

【００１２】（５）また、本発明は、上記（２）に記載
のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするＮＯの
検出方法の発明である。

【００１３】（６）更に、本発明は、上記（２）に記載
のモノクローナル抗体を含んでなるＮＯ検出用試薬の発
明である。

【００１４】即ち、本発明者らは、従来得られていなか
ったｓＧＣを特異的に認識するモノクローナル抗体、更
には、ｓＧＣを特異的に認識し、且つＮＯがｓＧＣ中の
ヘムと結合することによるｓＧＣのコンフォーメーショ
ナルチェンジ（立体構造変化）、即ち、ＮＯが結合した
ｓＧＣ（ＮＯ結合型ｓＧＣ）をも認識し得る抗ｓＧＣモ
ノクローナル抗体を作製することに成功し、該モノクロ
ーナル抗体を用いれば、従来のＮＯ検出方法に於ける上
記した如き問題を解決し得、簡便、高感度に且つ精度良
くＮＯを検出し得ることを見出し、本発明を完成するに
至った。

【００１５】本発明のモノクローナル抗体は、ｓＧＣを
特異的に認識するものであるが、該モノクローナル抗体
の中にはｓＧＣを特異的に認識し、且つＮＯがｓＧＣ中
のヘムと結合することによるｓＧＣのコンフォーメーシ
ョナルチェンジ（立体構造変化）、即ち、ＮＯが結合し
たｓＧＣ（ＮＯ結合型ｓＧＣ）をも認識し得るもの、更
には当該性質を有し、且つｓＧＣよりもＮＯ結合型ｓＧ
Ｃを強く認識し得るものも含まれる。これらのモノクロ
ーナル抗体は、例えばｓＧＣのα又はβサブユニットの
一領域を認識するか、ｓＧＣのα及びβ両サブユニット
を認識するか、或いはα及びβ両サブユニットに共通な
（又は極めて近似した）領域を認識する。また、該モノ
クローナル抗体には、ペプシン等で部分分解して得られ
るＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグ
メントを還元処理していられるＦａｂ’フラグメント、
パパイン等で部分分解して得られるＦａｂフラグメント
等も包含される。

【００１６】本発明のモノクローナル抗体を得る方法と
しては、例えばｓＧＣを免疫原として免疫した動物の免
疫感作された細胞と、例えば骨髄腫細胞等の永久的に増
殖する性質を有する細胞とを、ケラーとミルシュタイン
により開発された自体公知の細胞融合技術により融合さ
せてハイブリドーマを作製し、上記した如き性質を有す
る抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリ
ドーマを培地中で培養するか、動物の腹腔内に投与して
腹水中に抗体を産生させて、該培養物又は腹水より目的
のモノクローナル抗体を採取する方法、例えば遺伝子組
換え技術等を応用した自体公知の方法〔Eur. J. Immuno
l., 6, 511(1976)〕等により上記した如き性質を有する
抗体を産生する細胞を培養することにより目的のモノク
ローナル抗体を採取する方法等が挙げられる。

【００１７】上記のモノクローナル抗体を得る方法に於
いて、免疫原として用いられるｓＧＣとしては、例えば
ヒト，ウシ，ラット等の哺乳類等の肺，脳等の組織等か
ら自体公知の方法〔Stone J. R., et al., Biochemistr
y, 33, 5636-5640(1994)、Tomita T., et al., J. Bioc
hem., 122, 531-536(1997)等〕等により分離精製したも
の、遺伝子組換え技術を利用して得られたもの及びそれ
らの一部のアミノ酸配列を有するペプチド、又は市販品
等が挙げられる。また、ｓＧＣのαサブユニット又は／
及びβサブユニットの抗原決定基（エピトープ）配列を
合成し、これをアルブミンなどの適当なキャリアー蛋白
質に架橋させて得られたものも包含される。また、ｓＧ
Ｃを免疫感作する際には、ｓＧＣを、例えばトリス緩衝
液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、
グッド緩衝液等の通常この分野で用いられている緩衝液
中に懸濁したものを用いてもよいし、また、適当なアジ
ュバントを用いてエマルジョン化したものを用いてもよ
い。ｓＧＣの使用量としては、懸濁液中の濃度として通
常50μg／ml〜1000μg／ml、好ましくは200μg／ml〜70
0μg／mlである。

【００１８】ｓＧＣを免疫感作させる哺乳動物として
は、例えばマウス，ラット，ウマ，ヤギ，ウサギ，ウ
シ，ヒツジ，モルモット等が挙げられるが、好ましくは
マウス、より好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウスが用いられ
る。また、ｓＧＣを免疫感作する際には、被免疫動物の
抗原への応答性を高めるために用いられるアジュバント
としては、例えばフロイントの完全アジュバント、フロ
イントの不完全アジュバント、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒ
ｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日
咳ワクチン（Bordetella pertussis vaccine）、ムラミ
ルジペプチド、アルミニウムアジュバント等のアジュバ
ント、又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。

【００１９】免疫方法としては、常法に従い行えばよい
が、例えばｓＧＣ懸濁液又はアジュバント含有ｓＧＣ懸
濁液50μl〜500μl、好ましくは100μl〜300μlを感作
動物の腹腔内、皮下、筋肉内又は静脈内に注射し、初回
免疫から約４〜30日毎に１〜４回追加免疫を行う。追加
免疫の約５〜６日後に採血し、血中の抗体価を調べた
後、更に約１〜４週間後に最終免疫を行う。最終免疫よ
り約２〜５日後、該免疫動物から脾細胞等を分離し、抗
体産生細胞を得る。尚、ｓＧＣをアジュバントを用いず
に使用する場合には、ｓＧＣ量を多く用いればよい。

【００２０】上記モノクローナル抗体を得る方法に於い
て用いられる骨髄腫細胞としては、例えばマウス，ラッ
ト，ヒトに由来するもの等が使用でき、例えばマウスミ
エローマＰ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−
Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／０−Ａｇ
１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８／６５３等が好ましく挙げら
れる。尚、該骨髄腫細胞は、抗体産生細胞と同種動物、
中でも同系統の動物に由来するものが好ましい。

【００２１】上記モノクローナル抗体を得る方法に於い
て、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリ
ドーマを作製する方法としては、ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる
方法、電気融合装置を用いる方法等が挙げられる。例え
ばＰＥＧ法の場合、通常この分野で用いられている適当
な培地中又は例えばトリス緩衝液，リン酸緩衝液，ベロ
ナール緩衝液，ホウ酸緩衝液，グッド緩衝液等の通常こ
の分野で用いられている緩衝液中に、約10〜80％のＰＥ
Ｇ（平均分子量1000〜6000）を含有させ、これに脾細胞
と骨髄腫細胞とを１〜10：１、好ましくは２〜８：１の
割合で混合・懸濁し、30〜40℃、pH７〜８で、１〜３分
間程度反応させる。反応終了後、ＰＥＧ溶液を除去して
培地に再懸濁し、セルウェルプレート中に播種して培養
する。

【００２２】上記モノクローナル抗体を得る方法に於い
て、目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択するに
は、常法に従いこれを行えばよく、例えば以下の如くし
て行う。即ち、先ず、融合していない細胞が死滅し、融
合細胞のみが増殖し得る、例えばヒポキサンチン−アミ
ノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地等の選択培地を用
いてハイブリドーマの選択を行う。選択は、通常細胞融
合処理の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは半量を
選択培地と交換することによって開始し、更に２、３日
毎に同様の培地交換を繰り返しながら培養し、コロニー
が生育しているか否かにより行う。次に、生育している
ハイブリドーマが目的の抗体を産生しているか否かを調
べるには、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法、ラ
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、ウエスタンブロット
分析法、プラーク法、スポット法、凝集反応法、オクタ
ロニー法等の通常この分野で抗体の検出に用いられる種
々の方法により行えばよい〔Harlow E and Lane D (198
8), Antibodies: A Laboratory manual. Cold Spring H
arbor Laboratory, New York.等〕。即ち、ｓＧＣを特
異的に認識する抗体をスクリーニングする場合、例え
ば、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）後、ポリビニリデンジフ
ルオリド（PVDF）膜に転写する等して固相に固定化させ
たｓＧＣに培養上清等を加えて反応させ、更に例えば酵
素、蛍光物質、ラジオアイソトープ等で標識した例えば
抗免疫グロブリン抗体等の二次抗体を反応させて測定す
ること等により、目的の抗体を産生しているか否かを調
べることができる。また、ｓＧＣを特異的に認識し、且
つＮＯ結合型ｓＧＣをも認識する抗体をスクリーニング
する場合、要すれば、例えば上記の如き方法等によりｓ
ＧＣを特異的に認識する抗体を産生していることを確認
した後、例えば固相に固定化させた培養上清中の抗体
に、ｓＧＣと例えばＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ
−ペニシルアミン（SNAP）等のＮＯ発生剤とを反応させ
て生じたＮＯ結合型ｓＧＣを反応させ、これと抗体との
結合をアフィニティー センサー等で解析すること等に
より、目的の抗体を産生しているか否かを調べることが
できる。尚、ｓＧＣを特異的に認識し、且つＮＯ結合型
ｓＧＣをも認識するものであって、ｓＧＣよりもＮＯ結
合型ｓＧＣを強く認識する抗体をスクリーニングする場
合には、要すれば、例えば上記の如き方法等によりｓＧ
Ｃを特異的に認識する抗体を産生していることを確認し
た後、例えば上記した如きアフィニティー センサー等
で、ｓＧＣと抗体との結合とＮＯ結合型ｓＧＣと抗体と
の結合を比較・解析する等して目的の抗体を産生してい
るか否かを調べればよい。

【００２３】このようにして選択された目的の抗体を産
生する細胞を、更に限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セ
ルソーターを用いた方法等により選別することで、安定
して高力価の抗体を産生する、単一のクローンを得るこ
とができる。

【００２４】このようにして得られたハイブリドーマを
用いて目的のモノクローナル抗体を取得するには、例え
ば上記した如き動物の腹水から取得する方法、細胞培養
により取得する方法等により行えばよい。例えば腹水か
ら取得する場合には、例えば、予めプリスタン（２，
６，10，14−テトラメチルペンタデカン）を投与したＢ
ＡＬＢ／ｃマウス等の動物の腹腔内へハイブリドーマを
移植（通常10⁵個以上、好ましくは10⁷〜10⁸個）し、１
〜６週間後に貯留した腹水を採取すればよい。

【００２５】上記の如くして得られたモノクローナル抗
体は、例えば硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分
画法、アフィニティーカラムクロマトグラフィー法、陰
イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法等この分
野で使用される精製法により容易に精製することができ
る。

【００２６】尚、得られたモノクローナル抗体のクラ
ス、サブクラスの決定は、市販のクラス・サブクラス判
定用キット等を用いて容易に行うことができる。

【００２７】本発明の抗ｓＧＣモノクローナル抗体は、
ｓＧＣを特異的に認識するので、例えば、生体内や細胞
内・組織内等でのｓＧＣの局在場所、或いはｓＧＣと他
の生体内（細胞内・組織内）成分との相互関係やこれら
の生理学的意義等を自体公知の免疫学的測定法等を用い
て解明する際に有用に使用される。また、本発明のｓＧ
Ｃを特異的に認識する抗体であって、且つＮＯ結合型ｓ
ＧＣをも認識する抗ｓＧＣモノクローナル抗体は、例え
ば、生体内や細胞内・組織内等でのＮＯとｓＧＣとの相
互関係、或いはＮＯのｓＧＣへの効果やこれらの生理的
機能及び病理的意義等を自体公知の免疫学的測定法等を
用いて解明する際に有用に使用される。

【００２８】このような目的に使用される自体公知の免
疫学的測定法としては、試料中のｓＧＣと、本発明の抗
ｓＧＣモノクローナル抗体とを反応させ、形成される免
疫複合体を測定・検出し得る免疫学的測定法であれば特
に限定されず、直接法と間接法の何れを用いてもよく、
また、免疫複合体の検出に標識物質として放射性同位元
素を用いるラジオイムノアッセイ、酵素を用いるエンザ
イムイムノアッセイ、蛍光物質を用いる蛍光イムノアッ
セイの何れを用いてもよい。

【００２９】本発明の抗ｓＧＣモノクローナル抗体を用
いて上記した如き免疫学的測定法を実施する場合には、
例えば以下の如く行えばよい。即ち、直接法の場合、固
定された細胞又は組織片に、酵素又は蛍光物質等の標識
物質で標識された本発明の抗体を作用させｓＧＣ（又は
ＮＯ結合型ｓＧＣ）と該標識抗体との免疫複合体（ｓＧ
Ｃ−標識抗体）を形成させる。次いで、該細胞又は組織
片を洗浄して余分に存在する遊離（未反応）の標識抗体
を除去する。この後、蛍光顕微鏡又は顕微鏡等により該
細胞又は組織片中の免疫複合体に由来する蛍光又は発色
を観察すればよい。また、間接法の場合、固定された細
胞又は組織片に、一次抗体として本発明の抗体を作用さ
せ、ｓＧＣ（又はＮＯ結合型ｓＧＣ）と該抗体との免疫
複合体１（ｓＧＣ−抗体）を形成させる。次いで、該細
胞又は組織片を洗浄して余分に存在する遊離の該抗体を
除去する。その後、更に、該細胞又は組織片に、二次抗
体として酵素又は蛍光物質等の標識物質で標識された該
抗体に対する抗体（抗免疫グロブリン抗体等）を作用さ
せ、ｓＧＣ（又はＮＯ結合型ｓＧＣ）と本発明の抗体と
標識された該抗体に対する抗体との免疫複合体２（ｓＧ
Ｃ−抗体−標識抗体）を形成させる。次いで、該細胞又
は組織片を洗浄して余分に存在する遊離（未反応）の標
識抗体を除去する。この後、蛍光顕微鏡又は顕微鏡等に
より該細胞又は組織片中の免疫複合体２に由来する蛍光
又は発色を観察すればよい。尚、本発明の抗体を用いて
上記の如き方法を行うことにより、細胞又は組織片に於
けるｓＧＣ（又はＮＯ結合型ｓＧＣ）の存在する部分の
みが発色又は蛍光を発するので、その発色又は蛍光を指
標としてｓＧＣ（又はＮＯ結合型ｓＧＣ）の局在等を分
析し得る。

【００３０】更に、本発明の抗ｓＧＣモノクローナル抗
体のうち、ｓＧＣを特異的に認識し、且つＮＯ結合型ｓ
ＧＣをも認識する抗ｓＧＣモノクローナル抗体（以下、
抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体と略記する。）を用いれば、例えば
生体、細胞等の生体試料中、或いは大気中等に存在する
ＮＯを簡便に且つ高感度に精度良く検出することができ
る。

【００３１】本発明のＮＯの検出方法は、本発明の抗Ｎ
Ｏ−ｓＧＣ抗体を用いるものであり、試料とｓＧＣとを
反応させてＮＯ結合型ｓＧＣを生じさせ、次いで該ＮＯ
結合型ｓＧＣと該抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体とを反応させ、形
成される免疫複合体を測定・検出し得る免疫学的測定法
であれば特に限定されず、直接法と間接法の何れを用い
てもよく、また、免疫複合体の検出に標識物質として放
射性同位元素を用いるラジオイムノアッセイ、酵素を用
いるエンザイムイムノアッセイ、蛍光物質を用いる蛍光
イムノアッセイ等の通常この分野で用いられる測定法は
全て使用可能である。このような免疫学的測定法として
は、例えば以下の如きものが挙げられる。即ち、直接法
の場合、ｓＧＣを固相に固定化し、該固定化ｓＧＣと試
料とを反応させてＮＯ結合型ｓＧＣを生じさせ、生じた
ＮＯ結合型ｓＧＣと、標識物質により標識された本発明
の抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体とを反応させて、ＮＯ結合型ｓＧ
Ｃと該標識抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体との免疫複合体を形成さ
せ、次いで、固相に結合した該免疫複合体を洗浄後、該
免疫複合体中の標識物質に基づいて試料中のＮＯの値を
測定する。また、間接法の場合、ｓＧＣを固相に固定化
し、該固定化ｓＧＣと試料とを反応させてＮＯ結合型ｓ
ＧＣを生じさせ、生じたＮＯ結合型ｓＧＣに、一次抗体
として本発明の抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体を反応させてＮＯ結
合型ｓＧＣと該抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体との免疫複合体１を
形成させた後、固相に結合した該免疫複合体１を洗浄
し、次いで、該免疫複合体１に、二次抗体として標識物
質で標識された抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体に対する抗体（抗免
疫グロブリン抗体等）を反応させてＮＯ結合型ｓＧＣと
抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体と標識抗体との免疫複合体２を形成
させた後、固相に結合した該免疫複合体２を洗浄後、該
免疫複合体２中の標識物質に基づいて試料中のＮＯの値
を測定する。

【００３２】上記方法に於いて用いられるｓＧＣは、前
述した如き免疫原として用いられるｓＧＣと同様のもの
であればよい。尚、上記ＮＯの検出方法に於いては、Ｎ
Ｏと結合し得るｓＧＣが使用される。

【００３３】本発明で用いられる固相としては、通常こ
の分野で用いられるものであればよく、例えば試験管、
チューブ、マイクロタイタープレート、ビーズ、ラテッ
クス等が挙げられ、これらは、天然、半合成又は合成の
素材を常法により成型することにより得られるもの等が
含まれる。これらの素材としては、例えばガラス、金
属、セラミック、シリコンラバー、或いはポリスチレ
ン，ポリ塩化ビニル，ポリプロピレン，アクリル樹脂，
ポリメチルメタクリレート等の合成高分子等が挙げられ
る。

【００３４】上記した如き固相に、ｓＧＣを固定化させ
るには、自体公知の固定化方法、例えば共有結合により
固定化する方法或いは物理的に吸着させて固定化する方
法（特公平5-41946号公報等）等の固定化方法を利用す
ればよい。尚、このようにして得られたｓＧＣが固定化
された固相は、通常この分野で行われているブロッキン
グ処理を行うことが望ましい。また、該固相は、例えば
乾燥処理、凍結処理、凍結乾燥処理等を施した状態、或
いは通常この分野で用いられている、例えばトリス緩衝
液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、
グッド緩衝液等の適当な緩衝液に懸濁させた懸濁液等の
溶液状態等、多種多様の形態で保存し得る。尚、該懸濁
液中には、例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラ
チン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、界面活性
剤、糖類等を含有させておいてもよい。

【００３５】本発明で用いられる二次抗体としては、本
発明の抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体に対する抗体であればよく、
例えば抗マウスＩｇＧ抗体等の抗免疫グロブリン抗体等
が挙げられる。また、該二次抗体は、市販品を用いて
も、或いは通常この分野で用いられる常法により調製さ
れたものを用いてもよい。

【００３６】本発明で用いられる標識物質としては、例
えばラジオイムノアッセイに於いて用いられる^99mＴ
ｃ、¹³¹Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹⁴Ｃ、³Ｈ等の放射性同位元素、例
えばエンザイムイムノアッセイに於いて用いられるアル
カリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、パーオキ
シダーゼ、マイクロパーオキシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ
酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ等の酵素類、例えば蛍光
イムノアッセイに於いて用いられるフルオレセイン、ダ
ンシル、フルオレスカミン、クマリン、ナフチルアミ
ン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、
ローダミン、ローダミンＸイソチオシアネート、スルフ
ォローダミン101、ルシファーイエロー、アクリジン、
アクリジンイソチオシアネート、リボフラビン或いはこ
れらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン、イ
ソルミノール、ルミノール、ビス（２，４，６−トリフ
ロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフ
ェノール、ナフトール、アントラセン或いはこれらの誘
導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば４−アミノ
２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシ
ル、３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリ
ジン−１−オキシル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−
（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シク
ロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリオキシル等
のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル
化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。

【００３７】上記した如き標識物質を用いて本発明の抗
ＮＯ−ｓＧＣ抗体又は二次抗体を標識するには、通常こ
の分野で用いられる常法、例えば自体公知のエンザイム
イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ又は蛍光イムノ
アッセイ等に於いて一般に行われている自体公知の標識
方法〔例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監
修、第１版、中山書店、１９７１；図説 蛍光抗体、川
生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、１９８
３；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、室井潔編、第
２版、医学書院、１９８２等〕や、アビジン（又はスト
レプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法等を
利用すればよい。

【００３８】尚、このようにして得られた標識抗ＮＯ−
ｓＧＣ抗体又は標識二次抗体は、例えば乾燥処理、凍結
処理、凍結乾燥処理等を施した状態、或いは通常この分
野で用いられている、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝
液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等
の適当な緩衝液に懸濁させた懸濁液等の溶液状態等、多
種多様の形態で保存し得る。尚、該懸濁液中には、例え
ばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、ポリエチ
レングリコール等の安定化剤、界面活性剤、糖類等を含
有させておいてもよい。

【００３９】上記方法に於いて、免疫複合体又は免疫複
合体２中の標識物質に基づいて試料中のＮＯの量を測定
するには、該免疫複合体２中の標識物質量を、例えば予
めＮＯ濃度既知の標準品等を試料として上記方法と同様
にして求めた、ＮＯ濃度と標識物質量測定値との関係を
示す検量線に当てはめることにより、試料中のＮＯの量
を算出すればよい。尚、このようなＮＯ標準品として
は、例えばＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシ
ルアミン（SNAP）や３−（２−ヒドロキシ−１−メチル
−２−ニトロソヒドラジノ）−Ｎ−メチル−１−プロパ
ンアミン（NOC-7）等のＮＯ発生剤を含有するものが挙
げられる。また、上記方法に於いて、標識物質量測定値
から、ＮＯを含まない試料を用いて上記と同様にして求
めた値を盲検として差し引けば、より精度よく試料中の
ＮＯを検出することができる。

【００４０】標識物質により標識された本発明の抗ＮＯ
−ｓＧＣ抗体を反応させて形成した免疫複合体中の標識
物質量、或いは二次抗体として標識物質で標識された抗
ＮＯ−ｓＧＣ抗体に対する抗体（抗免疫グロブリン抗体
等）を反応させて形成した免疫複合体２中の標識物質量
を測定する方法は、用いる標識物質が有している性質に
応じて、夫々所定の方法に従い実施すればよい。例え
ば、標識物質が酵素の場合にはエンザイムイムノアッセ
イで用いられている常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋
白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫
・辻章夫・石川榮治編集、51〜63頁、共立出版（株）、
1987年９月10日発行」糖に記載された方法に準じて測定
・検出を行えばよく、標識物質が放射性物質の場合には
ラジオイムノアッセイで用いられている常法、例えば放
射性物質の出す放射線の種類及び強さに応じて液浸型Ｇ
Ｍカウンター、液体シンチレーションカウンター、井戸
型シンチレーションカウンター、ＨＰＬＣ用カウンター
等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行えばよい
（例えば医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１
版、中山書店、1971等参照。）。また、標識物質が蛍光
性物質の場合には蛍光光度計等の測定機器を用いる蛍光
イムノアッセイで用いられる常法、例えば「図説 蛍光
抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、
1983」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、
標識物質が発光性物質の場合にはフォトカウンター等の
測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白
質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・
辻章夫・石川榮治編集、252〜263頁、共立出版（株）、
1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて行え
ばよい。更に、標識物質が紫外部に吸収を有する物質の
場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって
測定を行えばよく、標識物質がスピンの性質を有する場
合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素
免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川
常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、264〜271頁、
共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載された
方法に準じて夫々測定を行えばよい。

【００４１】本発明のＮＯ検出用試薬は、例えば大気，
水，土壌，食品，例えば血液等の各種生体由来試料等中
のＮＯを免疫学的測定法により測定・検出するために使
用されるもので、本発明の抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体とｓＧＣ
とを使用する以外は、上記した如き通常この分野で使用
される試薬類を、この分野で通常使用される濃度範囲で
含有するように調製されたものでよく、抗ＮＯ−ｓＧＣ
抗体とｓＧＣの好ましい態様や使用濃度等は、上で述べ
た通りである。尚、上記本発明の試薬には、必要に応じ
て、ＮＯ標準品等が組み合わされていてもよい。

【００４２】本発明の検出用試薬を用いて、試料中のＮ
Ｏを測定・検出するためには、例えば以下の如く行えば
よい。即ち、直接法の場合、固相に固定化されたｓＧＣ
と試料を４〜40℃で数分間反応させてＮＯ結合型ｓＧＣ
を生じさせる。次いで、生じたＮＯ結合型ｓＧＣと、標
識物質により標識された本発明の抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体と
を４〜40℃で数分〜数時間反応させてＮＯ結合型ｓＧＣ
と該標識抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体との免疫複合体（ＮＯ結合
型ｓＧＣ／抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体）を形成させた後、洗浄
して遊離（未反応）の標識抗体を除去する。この後、常
法に従い、標識物質に応じた適当な方法で、固相に結合
した免疫複合体中の標識物質量を測定する。（要すれ
ば、該標識物質量測定値から、ＮＯを含まない試料を用
いて上記と同様にして求めた値を盲検として差し引き、
標識物質量測定値ｂを求める。）得られた標識物質量測
定値（ｂ）を、例えば予めＮＯ濃度既知の標準等を試料
として上記と同様にして求めた、ＮＯ濃度と標識物質量
測定値との関係を示す検量線に当てはめることにより、
試料中のＮＯの値を求めることができる。また、間接法
の場合、固相に固定化されたｓＧＣと試料を４〜40℃で
数分間反応させてＮＯ結合型ｓＧＣを生じさせる。次い
で、生じたＮＯ結合型ｓＧＣに、一次抗体として本発明
の抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体を４〜40℃で数分〜数時間反応さ
せてＮＯ結合型ｓＧＣと該抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体との免疫
複合体１（ＮＯ結合型ｓＧＣ／抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体）を
形成させた後、洗浄して遊離（未反応）の抗体を除去す
る。次いで、該免疫複合体１に、二次抗体として酵素又
は蛍光物質等の標識物質で標識された抗ＮＯ−ｓＧＣ抗
体に対する抗体（抗免疫グロブリン抗体等）を４〜40℃
で数分〜数時間反応させてＮＯ結合型ｓＧＣと抗ＮＯ−
ｓＧＣ抗体と標識抗体との免疫複合体２（ＮＯ結合型ｓ
ＧＣ／抗ＮＯ−ｓＧＣ抗体／標識抗体）を形成させた
後、洗浄して遊離（未反応）の標識抗体を除去する。こ
の後、常法に従い、標識物質に応じた適当な方法で、固
相に結合した免疫複合体２中の標識物質量を測定する。
（要すれば、該標識物質量測定値から、ＮＯを含まない
試料を用いて上記と同様にして求めた値を盲検として差
し引き、標識物質量測定値ｂを求める。）得られた標識
物質量測定値（ｂ）を、例えば予めＮＯ濃度既知の標準
等を試料として上記と同様にして求めた、ＮＯ濃度と標
識物質量測定値との関係を示す検量線に当てはめること
により、試料中のＮＯの値を求めることができる。

【００４３】以下に実施例、参考例及び実験例を挙げ、
本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらによ
り何等限定されるものではない。

【００４４】

【実施例】実施例１ 抗ｓＧＣモノクローナル抗体の作
製 （１）ｓＧＣ抗原の調製 Stone J. R., et al., Biochemistry, 33, 5636-5640(1
994)に記載の方法を改変したTomita T., et al., J. Bi
ochem., 122, 531-536(1997)に記載の方法に従ってｓＧ
Ｃを精製した。尚、理論的にｓＧＣは等molのヘムを含
んでいるはずであるが、以下の調製過程に於いては、必
ずしも等molのヘムを含んでいない場合もあるので、Ｎ
Ｏ発生剤としてニトロプルシッドナトリウムを終濃度0.
1mMとなるように添加して［³Ｈ］cyclic GMP immunoass
ay system（TRK500：アマーシャム社製）を用いてｃＧ
ＭＰ量を測定し、添加前よりもｃＧＭＰ産生量が100倍
以上になるｓＧＣ活性画分を、目的のｓＧＣ活性を含む
フラクションとした。即ち、約４kgのウシ肺を生理食塩
水で洗浄し、気管支を取り除いた後細かく切断した。次
いでこれに等量のホモジナイズ緩衝液（NaCl 50mM、ジ
チオスレイトール ５mM、エチレンジアミン四酢酸 １m
M、ベンズアミジン １mM、ロイペプチン １μg／ml及び
ペプスタチンＡ １μg／mlを含有する25mM トリエタノ
ールアミン−塩酸緩衝液、pH7.4）を加え、フードプロ
セッサーを用いてホモジナイズした。得られた懸濁液
を、10000×gで４℃20分間遠心分離処理し、その上清を
更に100000×gで20分間遠心分離処理した。得られた上
清を予めホモジナイズ緩衝液で平衡化したDEAE-Fast Fl
ow カラム（1000ml：ファルマシア社製）に供し（0.05M
→1.05M NaCl直線濃度勾配）、目的のｓＧＣ活性を含む
フラクションを採取した。得られたフラクションに硫酸
アンモニウムを最終濃度23％飽和状態になるように加
え、生じた沈殿物を15000×gで20分間遠心分離処理して
除去した。次いで、上清に硫酸アンモニウムを最終濃度
41％飽和状態になるように加え、15000×gで20分間遠心
分離処理して沈殿物を採取した。得られた沈殿物を緩衝
液Ａ（ジチオスレイトール ５mM、ベンズアミジン １m
M、ロイペプチン １μg／ml及びペプスタチンＡ １μg
／mlを含有する25mM トリエタノールアミン−塩酸緩衝
液、pH7.4）で懸濁し、該緩衝液Ａで一晩透析処理し
た。得られた透析物に４mMになるようにMnCl２を加えた
後、15000×gで20分間遠心分離処理し、その上清を、４
mM MnCl２を含む緩衝液Ａで予め平衡化したGTP-アガロ
ースカラム（100ml：シグマ社製）に供し（０→６mM Ａ
ＴＰ直線濃度勾配）、目的のｓＧＣ活性を含むフラクシ
ョンを採取した。得られたフラクションを濃縮後、緩衝
液Ａで一晩透析処理した。得られた透析物を、緩衝液Ａ
で予め平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（30ml：
生化学工業（株）製）に供し（０→200mM リン酸緩衝液
直線濃度勾配）、ｓＧＣ活性を含むフラクションを採取
した。得られたフラクションを濃縮した後、更にジチオ
スレイトール ５mMを含有する25mM トリエタノールアミ
ン−塩酸緩衝液（pH7.4）で予め平衡化したSuperdex 20
0pgゲル濾過カラム（ファルマシア社製）に供し、ｓＧ
Ｃ活性を含むフラクションを採取した。得られたフラク
ションを濃縮した後、最終濃度20％になるようにグリセ
ロールを加え、ｓＧＣ最終標品とした。尚、Ignarro L.
J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 2870
-2873(1982)に記載の方法に従ってｓＧＣの比活性を測
定した結果、当該ｓＧＣは、Mg^{2 +}存在下での比活性が7
5.0nmol／min／mgであり、−80℃で保存した場合、活性
は３週間安定であった。また、得られた精製ｓＧＣを、
Laemmli U. K., Nature, 227, 680-685(1970)に記載の
方法に従いドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行ったところ
（サンプル量2.25μgタンパク質、7.5％ポリアクリルア
ミドゲル）、当該ｓＧＣは、αサブユニット（Mr＝7400
0）とβサブユニット（Mr＝69000）の２つのサブユニッ
トからなるヘテロダイマーであることが確認された。そ
の結果を図１に示す。

【００４５】（２）免疫及び免疫脾細胞の採取 Kawashima I., et al., Mol. Immun., 29, 625-632(199
2)に記載の方法を一部改変した方法によって下記の如く
行った。上記（１）で得られた精製ｓＧＣを500μg／ml
になるように生理食塩水に懸濁し、該懸濁液２mlをRibi
アジュバント凍結乾燥品（ＭＰＬ＋ＴＤＭエマルジョ
ン，R-700；500μg：Ribi Immuno. Chem. Res. Inc.
製）に添加し充分に混和した後、該混和物200μlを７週
齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射した。20日後
及び40日後に同様の操作を行い追加免疫した後、最終免
疫の３日後に、脾臓を摘出して脾細胞を得た。

【００４６】（３）細胞融合及びハイブリドーマの選択 上記（２）で得られた脾細胞とマウス骨髄腫細胞P3X63-
Ag8/653とをポリエチレングリコール4000（メルク社
製）を用いて細胞融合させた。常法〔ケラー（Koehler
G.）ら, Nature, 256, 495-497(1975)〕に従い、得られ
たハイブリドーマを、DMEM／15％FCS／HAT培地〔牛胎児
血清（FCS：BIO Whittaker社製）を15％含有するダルベ
ッコ変法イーグル培地（DMEM：Flow社製）990mlにHAT培
地（Boehringer Mannheim Biochemica社製）10mlを加え
たもの〕を用いて選択的に増殖させた。

【００４７】（４）抗体産生細胞のスクリーニング及び
クローニング 目的の抗体産生細胞のスクリーニングは、上記（１）で
得られた精製ｓＧＣを用いたウエスタンブロット分析法
により下記の如く行った。ポリビニリデンジフルオリド
（PVDF）膜（MILLIPORE Immobilon社製）を、上記
（１）に於いて精製ｓＧＣをＳＤＳ−ＰＡＧＥした際の
ポリアクリルアミドゲルと同じ大きさに切り、100％メ
タノールに20秒間浸漬した後、該PVDF膜を、転写用緩衝
液〔トリス10.9g及びグリシン13.0gを90mlのメタノール
に溶解したもの（pH8.3）〕に電極用濾紙と共に30分間
浸漬した。次いで、該ポリアクリルアミドゲルとPVDF膜
とを接触させ、その上下を電極用濾紙３枚ずつで挟み、
トランスブロッターを用いてゲルからPVDF膜へｓＧＣを
転写した。転写後、該PVDF膜を５％スキムミルクを含有
するリン酸緩衝液に浸漬し、室温で30分間静置してブロ
ッキング処理を行った後、ハイブリドーマの培養上清を
該PVDF膜に滴下し（１つのハイブリドーマに対して、夫
々タンパク質として２，１，0.5，0.25，0.1，0.05μg
／mlを含有する希釈系列を作製した）、25℃で１時間加
温した。次いで、TBST〔0.5M トリス−塩酸緩衝液（pH
7.5）50ml、NaCl 8.0g、ツイーン20 0.5gを混合・溶解
し、純水で1000mlにしたもの〕で充分に洗浄した後、該
PVDF膜に、２次抗体としてアルカリ性ホスファターゼ標
識抗マウスＩｇＧ抗体（バイオラッド社製）を滴下し、
25℃で30分間加温後、TBSTで洗浄した。このPVDF膜に、
NBT基質（ニトロブルーテトラゾリウム：プロメガ社
製）33μl及びBCIP基質（５−ブロモ−４−クロロ−３
−ヨードドリル−ホスフェイト：プロメガ社製）16.5μ
lを含む発色用溶液〔0.1M NaCl及び５mM MgCl２含有0.1
M トリス−塩酸緩衝液（pH9.5）〕５mlに浸漬し、発色
させた。抗体を含む培養上清中のタンパク質量0.1μg／
ml以上の希釈系列で発色したものをｓＧＣを特異的に認
識する抗体を産生している細胞と判断した。

【００４８】続いて、限界希釈法によりクローニングを
行い、３種類の目的の抗体産生クローンを得た。これら
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を、夫々Ｈｙ
ｄ３２２１株、Ｈｙｄ１０２１４株及びＨｙｄ２８１３
１株と命名した。

【００４９】これらハイブリドーマのうち、Ｈｙｄ３２
２１株は、平成１１年１月２６日からＦＥＲＭ Ｐ−１
７１６７号として、工業技術院生命工学技術研究所に寄
託されている。

【００５０】（５）モノクローナル抗体の精製 上記（４）で得られたハイブリドーマＨｙｄ３２２１株
を無血清培地SFM-101〔日水製薬（株）製〕で大量培養
後、培養上清を12000×gで10分間遠心分離処理し、得ら
れた上清に最終濃度が60％飽和状態になるように硫酸ア
ンモニウムを加え、塩析処理を行った。塩析後、沈殿物
を遠心分離処理より採集した後、該沈殿物を20mM リン
酸緩衝液（PBS:pH7.4）で透析処理した。また、上記
（４）で得られたハイブリドーマＨｙｄ２８１３１株は
無血清培地で培養できなかったため、予めプリスタン
（２，６，10,14−テトラメチルペンタデカン）0.5mlを
一週間毎に２回腹腔内注射しておいた６週齢の雄ＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスの腹腔内に注射し（1.0×10⁷cells／m
l）、約30日後に腹水を採取した。得られた腹水は、抗
体精製用プロテインＡカラムキット（Ampure PA Kit：
アマーシャム社製）を用いる常法により精製した。得ら
れたモノクローナル抗体を、更に100mM トリス−塩酸緩
衝液（pH7.4）で一晩低温で透析処理し、精製モノクロ
ーナル抗体とした。

【００５１】尚、ハイブリドーマＨｙｄ３２２１株より
得られたモノクローナル抗体をｍＡｂ３２２１と、ハイ
ブリドーマＨｙｄ１０２１４株より得られたモノクロー
ナル抗体をｍＡｂ１０２１４と、また、ハイブリドーマ
Ｈｙｄ２８１３１株より得られたモノクローナル抗体を
ｍＡｂ２８１３１と夫々命名した。

【００５２】実施例２ 抗ｓＧＣモノクローナル抗体の
特性 実施例１に於いて得られた本発明の抗ｓＧＣモノクロー
ナル抗体３種類のうち、ｍＡｂ３２２１及びｍＡｂ２８
１３１の特性を以下に示す。 （１）イムノグロブリンクラス 精製したモノクローナル抗体のイムノグロブリンクラス
は、クラス・サブクラス判定キット（Mouse Typer sub-
isotyping kit；バイオラッド社製）を用いて決定し
た。その結果、これらモノクローナル抗体は、何れもＩ
ｇＧ１、κであった。

【００５３】（２）抗体力価 実施例１の（４）と同様の方法により、ウエスタンブロ
ット分析を行い、２次抗体であるアルカリ性ホスファタ
ーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体由来のアルカリ性ホスファ
ターゼ活性に基づいて抗体力価を求めた。その結果、0.
1μg／mlのｓＧＣに対する抗体力価は、ｍＡｂ３２２１
が0.1μg／ml、ｍＡｂ２８１３１が２μg／mlであっ
た。尚、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、7.5％ポリアクリルアミ
ドゲルを用い、Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685(1
970)に記載の方法に従い行い、泳動後、クーマシー・ブ
リリアント・ブルーで染色処理した。また、各レーンは
ｓＧＣ0.1μg／mlを夫々含む。その結果を図２に示す。
尚、図２中の各レーン番号は以下の結果を夫々示す。 Ｌａｎｅ ａ：ｍＡｂ３２２１を用いたウエスタンブロ
ッティ ング ｂ：ｍＡｂ２８１３１を用いたウエスタンブロッテ
ィング （３）中和活性 精製ｓＧＣ100μg／mlに対し、各精製モノクローナル抗
体を50，100，150，200，250μg／mlずつ加え、４℃で
一晩加温した。また、抗体の代わりにマウス非免疫血清
ＩｇＧを用いて同様に行ったもの（抗体無添加）を対照
とした。次いで、得られた精製ｓＧＣと精製モノクロー
ナル抗体との反応液中のｓＧＣ活性（ｃＧＭＰ量）を、
以下に示す方法で測定した。各反応液を、MnCl２ １m
M、テオフィリン １mM、ジチオスレイトール １mM及び
グアノシン ５’−三リン酸（GTP） １mMを含有する50m
M トリス−塩酸緩衝液（pH7.4）100μlと混合し、37℃
で５分間加温した。加温後、９倍量のエタノールを加え
ることによって反応を停止させ、遠心分離処理して上清
を得た。該上清をエバポレータで乾燥し、得られた乾燥
物を、EDTA １mMを含む50mM トリス−塩酸緩衝液（pH7.
4）で溶解した。該溶液中のｃＧＭＰ量を［³Ｈ］cyclic
GMP immunoassay system（TRK500：アマーシャム社
製）を用いて測定した。その結果を図３に示す。

【００５４】尚、図３に於いて、縦軸は、抗体無添加の
場合のｃＧＭＰ濃度をｓＧＣ活性100％として求めた相
対ｓＧＣ活性値（％）を、横軸は、抗体添加量（μg／m
l）を夫々示す。また、図３中に於いて、−○−は抗体
無添加の場合を、−●−はｍＡｂ３２２１添加の場合
を、また、−◎−はｍＡｂ２８１３１添加の場合の結果
を夫々示す。

【００５５】図３の結果から明らかなように、本発明の
抗ｓＧＣモノクローナル抗体は、何れもｓＧＣ活性に影
響を与えないことが判る。

【００５６】（４）交差反応性 ｉ）膜結合型ＧＣ（ｍＧＣ）の調製 Kuno T., et al., J. Biochem., 261, 5817-5823(1986)
に記載の方法に従って、以下のようにしてｍＧＣを調製
した。ラット脳８gに、10倍量の緩衝液Ａ〔EDTA １mM、
ジチオスレイトール １mM、フェニルメチルスルフォニ
ルフルオライド（PMSF） 0.1mMを含有する50mM トリス
−塩酸緩衝液（pH7.6）〕を加え、ポリトロンホモジナ
イザーでホモジナイズした。次いで、これを100000×g
で４℃60分間遠心分離処理し、得られた沈殿物を、緩衝
液Ａ、緩衝液Ｂ〔KCl 0.6M含有緩衝液Ａ〕及び緩衝液Ｃ
〔ジチオスレイトール １mM及びPMSF 0.1mMを含む20mM
トリス−塩酸緩衝液（pH7.6）〕で連続的に洗浄した。
洗浄後、該沈殿物を、濃度が２mg／mlとなるように緩衝
液Ｃで希釈、懸濁した。該懸濁液に、Lubrol-PX（シグ
マ社製）を0.2％（v/v）加え、１時間攪拌した後、1000
00×gで４℃60分間遠心分離処理し、上清を得た。尚、
得られた上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図４に示す。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、サンプル量10μgタンパク質、10
％ポリアクリルアミドゲルを用い、LaemmliU. K., Natu
re, 227, 680-685(1970)に記載の方法に従い行い、泳動
後、クーマシー・ブリリアント・ブルーで染色処理し
た。

【００５７】ｉｉ）ｍＧＣに対する交差反応性 実施例１の（４）と同様の方法により、各モノクローナ
ル抗体10μg／mlを用いて、上記ｉ）で得られたｍＧＣ
を含む上清10μgのウエスタンブロット分析を行った。
その結果を図４に併せて示す。尚、図４中の各レーン番
号は以下の結果を夫々示す。 Ｌａｎｅ ３：ｍＧＣを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ａ：ｍＡｂ３２２１を用いたウエスタンブロッティ
ング ｂ：ｍＡｂ２８１３１を用いたウエスタンブロッテ
ィング 図４から明らかなように、本発明の抗ｓＧＣモノクロー
ナル抗体は、何れもｍＧＣに交差反応を示さないことが
判る。

【００５８】（５）エピトープ 上記（２）に於いて得られた図２（各モノクローナル抗
体のｓＧＣに対する反応性を示すウエスタンブロット分
析）の結果から、ｍＡｂ３２２１は、ｓＧＣを構成する
α及びβ両サブユニットを認識し、ｍＡｂ２８１３１
は、βサブユニットのみを認識することが確認された。
また、ｍＡｂ３２２１のエピトープは、ウシ肺由来ｓＧ
Ｃのα及びβ両サブユニットの推定アミノ酸配列の相同
性（Ｎ末端領域：47％、中間領域：47％、Ｃ末端領域：
60％）、９種類のｓＧＣサブユニット（ヒト、ラット、
ウシ、ショウジョウバエの各サブユニット）間で保存さ
れているアミノ酸数（Ｎ末端領域：１個、中間領域：25
個、Ｃ末端領域：51個）が確認されており、Ｃ末端領域
は触媒ドメインである可能性が強いと推定されている
〔James R. S., Biochemistry, 34,14668-14674(199
5)〕こと、及び本発明のモノクローナル抗体ｍＡｂ３２
２１がα及びβ両サブユニットを認識すること、また、
後述の実験例１、実験例２に示すようにラット由来のｓ
ＧＣとも反応すること（ウシ、ラット間で交差があるこ
と）、並びに上記（３）で示したようにｓＧＣ活性に影
響しなかったこと等を考慮すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よりヘムが脱離した条件、即ち、立体構造が失われた変
性ｓＧＣに於いては、触媒ドメインであると推定されて
いるＣ末端領域の活性領域を除いたα及びβ両サブユニ
ットに共通なアミノ酸配列をもつ領域、例えばαサブユ
ニットのアミノ酸配列Ser-361からLys-368領域及びβサ
ブユニットのアミノ酸配列Gly-128からLys-151領域又は
これらの領域の一部、或いは極めて近似したアミノ酸配
列をもつ領域を認識していることが示唆される。

【００５９】実施例３ 各種条件下に於ける抗ｓＧＣモ
ノクローナル抗体結 合ｓＧＣの結合解離定数
（Ｋｄ）及び最大結合（Ｂｍａ
ｘ） （１）ヘム不含ｓＧＣの調製 Tomita, T., et al., J. Biochem., 122, 531-536(199
7)に記載の方法に従い、ＮＯ認識部位であるヘムをｓＧ
Ｃから除いて、ＮＯと結合し得ないｓＧＣ（ヘム不含ｓ
ＧＣ）を以下のように調製した。実施例１の（１）に於
いて得られたGTP−アガロースカラムクロマトグラフィ
ーにより採取したｓＧＣ活性を含むフラクションのpH
を、0.5M 酢酸ナトリウム溶液（pH5.0）でpH5.8に調整
した。該溶液を氷冷下１時間放置し、生じた沈殿物を85
000×gで20分間遠心分離処理し、得られた沈殿物を、0.
5M 酢酸ナトリウム溶液（pH5.8）で２回洗浄した。洗浄
後、該沈殿物を少量の５mM ジチオスレイトール含有25m
M トリエタノールアミン（pH7.4）に懸濁し、得られた
懸濁液を可溶化するまで４℃で放置後、これをヘム不含
ｓＧＣ標品とした。

【００６０】尚、当該ヘム不含ｓＧＣは、Mg²⁺存在下で
の比活性が精製ｓＧＣ（ヘム含有ｓＧＣ）に比べて62〜
74％程度に減少していた。

【００６１】（２）結合解離定数（Ｋｄ）及び最大結合
（Ｂｍａｘ） 所定の条件に於ける抗ｓＧＣモノクローナル抗体のＫｄ
及びＢｍａｘを、以下の様に測定した。精製モノクロー
ナル抗体ｍＡｂ３２２１（72μg／ml）100μlを、カル
ボキシメチル化デキストラン センサー チップIAsis（F
ison社製）にマニュアルに従い固定化した。該チップを
ツウィーン20含有リン酸緩衝液（PBST）〔NaCl ８g／
l，KCl 0.2g／l，Na２HPO４・12H２O 2.9g／l，KH２PO４
0.2g／l及びツウィーン20 0.05％（w／v）含有。pH7.
4〕で洗浄し、未結合のモノクローナル抗体を除去し
た。次いで、該チップ内のvolume 100μlにPBSTを注入
し、ガス無添加PBSTとした。また、注入したPBSTに、Ｎ
Ｏガス又は一酸化炭素（ＣＯ）ガスを５分間バブリング
して添加し、ＮＯガス添加PBST及びＣＯガス添加PBSTと
した。得られたガス無添加PBST、ＮＯガス添加PBST又は
ＣＯガス添加PBSTに、実施例１で得られたｓＧＣ又は上
記（１）で得られたヘム不含ｓＧＣを所定の濃度となる
ように夫々添加してレーザー反射光の角度の変化を測定
し、Ｋｄ及びＢ_maxを求めた。得られた結果を表１に夫
々示す。

【００６２】

【００６３】

【表１】表１

【００６４】また、図５にガス無添加PBST中でｓＧＣを
用いた場合のｓＧＣとモノクローナル抗体との結合の結
果を、図６にＮＯガス添加PBST中でのｓＧＣを用いた場
合のｓＧＣとモノクローナル抗体との結合の結果を、図
７にＮＯガス添加PBST中でのヘム不含ｓＧＣを用いた場
合のｓＧＣとモノクローナル抗体との結合の結果を、ま
た、図８にＣＯガス添加PBST中でのｓＧＣを用いた場合
のｓＧＣとモノクローナル抗体との結合の結果を夫々示
す。尚、図５〜８に於いて、縦軸はレーザー反射光の変
化（arc sec.）を、横軸はｓＧＣ濃度（M）を夫々示
す。

【００６５】（３）結果 表１及び図５並びに図６の結果から明らかなように、本
発明の抗ｓＧＣモノクローナル抗体（ｍＡｂ３２２１）
は、ＮＯ存在下でのｓＧＣに対するＫｄが、ＮＯ不存在
下でのそれに対して100倍以上も低く、また、ＮＯ存在
下でのＢｍａｘがＮＯ不存在下に比べて20倍以上も高い
ことが判る。これに対して、表１及び図５並びに図８の
結果から明らかなように、ｓＧＣを活性化することが知
られているＣＯ存在下でのｓＧＣに対するＫｄは、ガス
不存在下でのそれに対して10倍程度低いだけであり、ま
た、Ｂｍａｘは同程度であることが判る。これらのこと
から、本発明の抗ｓＧＣモノクローナル抗体（ｍＡｂ３
２２１）は、ＮＯ結合型でない通常のｓＧＣよりもＮＯ
結合型ｓＧＣをより強く認識することが判る。また、表
１及び図５並びに図７の結果から明らかなように、ＮＯ
存在下でのヘム不含ｓＧＣに対するＫｄ及びＢｍａｘ
は、ＮＯ不存在下でのｓＧＣに対するそれと同程度であ
ることが判る。即ち、本発明の抗ｓＧＣモノクローナル
抗体（ｍＡｂ３２２１）は、ｓＧＣのＮＯ認識部位であ
るヘムを認識するのではなく、ｓＧＣの蛋白質部分を認
識することが判る。尚、上記結果と実施例２の（５）の
結果、並びに後述する実験例１及び２の結果とを考慮す
ると、ラット小脳プルキンエ細胞等の摘出細胞に於い
て、即ち、立体構造を保持したｓＧＣに於いて、本発明
の抗ｓＧＣモノクローナル抗体（ｍＡｂ３２２１）は、
ＮＯがｓＧＣ中のヘムと結合することにより生じるｓＧ
Ｃのコンフォーメーショナルチェンジ（立体構造変化）
を、α及びβサブユニット間の歪みとして強く認識する
ものと考えられる。以上のことから、本発明の抗ｓＧＣ
モノクローナル抗体ｍＡｂ３２２１は、ＮＯ結合型ｓＧ
Ｃを強く認識する性質を有するので、本発明の抗体と、
ＮＯ認識部位であるヘムを含有するｓＧＣを用いれば、
簡便且つ高感度にＮＯを検出し得ることが示唆される。

【００６６】実験例１ ラット小脳初代培養細胞のｓＧ
Ｃ及びｎＮＯＳの細 胞内局在 （１）ラット小脳初代培養 Anne Kingsbury, et al., Developmental Brain Resear
ch, 17, 17-25(1985)及びSeikwan Oh, et al., Med. Sc
i. Res., 25, 19-20(1997)に記載の方法に準じて以下の
ように行った。７日齢のラット（Wistar）10匹から小脳
を採取し、髄膜を取り除いて細切し、リン酸緩衝液（PB
S）で洗浄した。これに濾過滅菌したパパイン溶液（PBS
緩衝液9.4mlに、20mg／mlパパイン 0.2ml、20mg／mlウ
シ血清アルブミン 0.1ml、20mg／mlＤＬ−システイン塩
酸塩 0.1ml、グルコース 50mg及び１％DNase 0.1mlを溶
解して調製したもの）５mlを加え、35℃で15分間加温し
た。その後、上清を取り除き、再度パパイン溶液を加え
て35℃15分間加温した。上清を取り除いた後、ＣＦ−Ｈ
ＢＢＳ／Ｇ〔ＨＢＳＳ／Ｇ（ビカルボン酸ナトリウム
0.35g及びグルコース 2.5ｇをシグマ社製ハンクの平衡
塩類溶液 １本 1000mlに溶解したもの、pH7.4）490ml
と、１M MgSO４ 12mlを混合したもの〕20mlに懸濁し、
これを細胞濾過膜（0.45μmポア）に通した。得られた
濾液にＨＫ−ＭＥＭ／ＨＦＣＳ〔ＨＫ−ＭＥＭ培地（ギ
ブコ社製ＭＥＭ培地１パックに、グルコース 2.15g、Na
HCO３ 0.2g、KHCO３ 2.0g、30mM Na２SeO４ １μl及び8
4μg／mlゲンタマイシン ２mlを溶解したもの）90％、
ウマ血清（ギブコ社製）５％及び牛胎児血清（FCS：BIO
Whittaker社製）５％の濃度になるように調製したも
の〕10mlを加え、1000rpmで５分間遠心分離処理して上
清を取り除いた。次いで、８×10⁶cells／mlになるよう
にＨＫ−ＭＥＭ／ＨＦＣＳで希釈し、予めポリエチレン
イミン〔１％ポリエチレンイミン：0.15M ホウ酸緩衝液
（pH8.3）＝１：４〕でコートしたカバースリップに、
該希釈液を50μlのせた。３時間後に、ＨＫ−ＭＥＭ／
ＨＦＣＳを加え、37℃、95％O２−５％CO２下で７日間
培養した。

【００６７】（２）蛍光抗体法によるｓＧＣ及びｎＮＯ
Ｓのラット小脳細胞 内局在の確認 ｉ）ラット小脳細胞内のｓＧＣとｎＮＯＳの染色 上記（１）で得られたカバースリップに培養した細胞
を、10％ホルムアルデヒド（蒸留水10mlにパラホルムア
ルデヒド４gを65℃で加熱融解し、40％水酸化ナトリウ
ムを４滴加えて調製したもの）を含有したリン酸緩衝液
（PBS）で10分間固定した後、PBSで５分間、３回洗浄し
た。次いで、これを0.05％トリトンX-100を含有したPBS
中で25℃10分間加温した後、PBSで５分間、３回洗浄し
た。その後、ブロッキング緩衝液中（スキムミルク２g
をPBS 50mlに１時間攪拌溶解した後、2500×gで30分間
遠心分離処理して得られた上清）で25℃20分間加温し
た。加温後、一次抗体として、実施例１で得られた本発
明の抗ｓＧＣモノクローナル抗体（ｍＡｂ３２２１）
（７μg／ml）、マウス抗ｎＮＯＳモノクローナル抗体
（５μg／ml：Transduction Laboratories社製）及びコ
ントロールとしてｓＧＣ及びｎＮＯＳと交差反応がない
ことが確認されたボツリヌスＥ型神経毒素に対する抗体
（７μg／ml）を夫々含む３種のブロッキング緩衝液を
上記のカバースリップに滴下し、４℃で一晩反応させ
た。反応後、夫々のカバースリップをPBSで５分間、３
回洗浄した。得られたカバースリップを、遮光下で、20
μg／mlの二次抗体（ローダミンＢ修飾抗マウスＩｇ
Ｇ：BIOSOURCE INTERNATIONAL社製）と25℃で１時間反
応させた後、PBSで５分間、３回洗浄し、更にブロッキ
ング緩衝液中で25℃20分間加温した。更に、小脳細胞内
でのｓＧＣとｎＮＯＳの発現細胞を同定するために、小
脳内細胞であるプルキンエ細胞、アストロサイト、顆粒
細胞及びオリゴデンドロサイトの夫々のマーカー抗体を
用いて、得られたカバースリップを、I. Kawashima,Bra
in Rsearch, 732, 75-86(1996)に記載の方法に従い以下
のように二重染色した。ｓＧＣ又はｎＮＯＳの染色を行
ったカバースリップと、プルキンエ細胞内のマーカーで
あるマウス抗IP３ レセプター モノクローナル抗体（５
μg／ml：CHEMICON INTERNATIONAL社製）、アストロサ
イト内のマーカーである抗グリア細胞繊維性酸性タンパ
ク質（GFAP）モノクローナル抗体（30μg／ml：シグマ
社製）、顆粒細胞内のマーカーであるマウス抗ＭＡＰ２
（Microtuble-Associated Protein ２）モノクローナル
抗体（10μg／ml：CHEMICON INTERNATIONAL社製）及び
オリゴデンドロサイト内のマーカーである抗ヒト ミエ
リン塩基性タンパク質（MBP）ポリクローナル抗血清（1
0μg／ml：Ultra Clone社製）を夫々含む４種のブロッ
キング緩衝液とを４℃で一晩反応させた。反応後、夫々
のカバースリップをPBSで５分間、３回洗浄した。得ら
れたカバースリップのうち、マウス抗IP３ レセプター
モノクローナル抗体、抗グリア細胞繊維性酸性タンパク
質 モノクローナル抗体及びマウス抗ＭＡＰ２モノクロ
ーナル抗体と反応させたものは、遮光下で、二次抗体と
してPBSで0.5μg／mlとなるように希釈したビオチン化
抗マウスＩｇＧ（アマーシャム社製）を用いて４℃で１
時間反応させた後、PBSで５分間３回洗浄し、次いで発
色剤としてPBSで0.25mg／mlとなるように希釈したスト
レプトアビジン−フルオレセイン（アマーシャム社製）
を用いて25℃で15分間加温反応させ、PBS及び蒸留水で
５分間３回洗浄した後、得られたカバースリップをスラ
イドグラス上にゲルマウント（Biomeda社製）で封入し
た。また、抗ヒト ミエリン塩基性タンパク質 ポリクロ
ーナル抗血清で反応させたカバースリップは、遮光下、
二次抗体としてフルオレセイン標識抗ウサギＩｇＧ（12
μg／ml：Cappel社製）を用いて４℃で１時間反応させ
た後、PBSで５分間、３回洗浄し、得られたカバースリ
ップをスライドグラス上にゲルマウントで封入した。得
られたスライドグラスを、共焦点レーザー顕微鏡（CLS
M：LEICA社製）により倍率400倍で観察、撮影した。

【００６８】ｉｉ）プルキンエ細胞及びアストロサイト
のｓＧＣとｎＮＯ Ｓの二重染色 プルキンエ細胞内及びアストロサイト内でのｓＧＣ及び
ｎＮＯＳの局在場所を確定するために、プルキンエ細胞
及びアストロサイトを、上記ｉ）と同様の方法により抗
ｓＧＣモノクローナル抗体及び抗ｎＮＯＳモノクローナ
ル抗体を用いて二重染色を行った。先ず、一次抗体とし
て実施例１で得られた本発明の抗ｓＧＣモノクローナル
抗体（ｍＡｂ３２２１）（７μg／ml）を、二次抗体と
してローダミンＢ標識抗マウスＩｇＧ（20μg／ml：BIO
SOURCE INTERNATIONAL社製）を用いてｓＧＣを染色した
後、更に一次抗体としてマウス抗ｎＮＯＳモノクローナ
ル抗体（５μg／ml：Transduction Laboratories社製）
を、二次抗体としてPBSで0.5μg／mlとなるように希釈
したビオチン化抗マウスＩｇＧ（アマーシャム社製）
を、発色剤としてPBSで0.25mg／mlとなるように希釈し
たストレプトアビジン−フルオレセイン（アマーシャム
社製）を用いてｎＮＯＳを染色した。得られたスライド
グラスを、共焦点レーザー顕微鏡（CLSM：LEICA社製）
により倍率400倍で観察、撮影した。

【００６９】（３）結果 抗ｓＧＣモノクローナル抗体とプルキンエ細胞内のマー
カーであるマウス抗IP３ レセプター モノクローナル抗
体を用いて染色した結果と、マウス抗ｎＮＯＳモノクロ
ーナル抗体とプルキンエ細胞内のマーカーであるマウス
抗IP３ レセプター モノクローナル抗体を用いて染色し
た結果から、プルキンエ細胞内では、ｓＧＣは細胞膜辺
縁に、ｎＮＯＳは細胞質全体に局在し、共に点状に存在
していることが判った。また、プルキンエ細胞を抗ｓＧ
Ｃモノクローナル抗体と抗ｎＮＯＳモノクローナル抗体
とで二重染色した結果、プルキンエ細胞内では、ｓＧＣ
がｎＮＯＳを取り囲むように両酵素が隣接して局在して
いることが判った。これに対して、抗ｓＧＣモノクロー
ナル抗体とアストロサイト内のマーカーである抗グリア
細胞繊維性酸性タンパク質 モノクローナル抗体を用い
て染色した結果と、マウス抗ｎＮＯＳモノクローナル抗
体とアストロサイト内のマーカーである抗グリア細胞繊
維性酸性タンパク質 モノクローナル抗体を用いて染色
した結果から、アストロサイト内では、ｓＧＣとｎＮＯ
Ｓとが細胞質内にも偏在していることが、また、アスト
ロサイトを抗ｓＧＣモノクローナル抗体と抗ｎＮＯＳモ
ノクローナル抗体とで二重染色した結果から、アストロ
サイト内では、ｓＧＣは点状に、ｎＮＯＳは大きな固ま
りとなって存在し、両酵素が原形質内でかなりの距離を
おいて偏在することが判った。尚、顆粒細胞又はオリゴ
デンドロサイトを用いて上記と同様に二重染色した結
果、染色（抗体反応物）が認められず、顆粒細胞内及び
オリゴデンドロサイト内では、ｓＧＣとｎＮＯＳは両者
とも存在していなかった。また、コントロールとして、
ｓＧＣ及びｎＮＯＳと交差反応を示さないことが確認さ
れているボツリヌスＥ型神経毒素に対する抗体を用いて
小脳細胞を染色した結果、該抗体に由来する蛍光は観察
されず、本発明の抗ｓＧＣモノクローナル抗体及び抗ｎ
ＮＯＳモノクローナル抗体は、何れも夫々の抗原と特異
的に反応していることが判った。

【００７０】以上の結果から判明した、蛍光抗体法によ
るラット小脳初代培養細胞の抗原特性を表１に示した。
尚、表中の＋は各抗体に由来する蛍光が観察されたこと
を、また、−は各抗体に由来する蛍光が観察されなかっ
たことを夫々示す。

【００７１】

【００７２】

【表２】表２

【００７３】実験例２ 一酸化窒素（ＮＯ）によるｓＧ
Ｃにおける蛍光標識 の輝度の経時的変化 実験例１の（１）で得られた、カバースリップで７日間
培養したラット小脳細胞の培地を、Eric Southam, et a
l., Neuroscience Latters, 130, 107-111(1991)に記載
の方法に準じて、ＮＯ発生剤であるＳ−ニトロソ−Ｎ−
アセチル−ＤＬ−ペニシルアミン〔SNAP：（株）同仁化
学研究所製〕10μMを含有するＨＫ−ＭＥＭ／ＨＦＣＳ
培地と交換し、交換前（０分）、及び交換後、37℃で５
分間、15分間、30分間、45分間、60分間加温したものを
夫々速やかにリン酸緩衝液（PBS）で一回洗浄して、10
％ホルムアルデヒドで固定した。固定したラット小脳細
胞を、一次抗体として本発明の抗ｓＧＣモノクローナル
抗体（ｍＡｂ３２２１）（７μg／ml）を、二次抗体と
してローダミンＢ標識抗マウスＩｇＧ（20μg／ml：BIO
SOURCE INTERNATIONAL社製）を用いて、実験例２の
（２）のｉ）の方法に従って蛍光抗体法によりｓＧＣを
染色した。得られたスライドグラスを、共焦点レーザー
顕微鏡（CLSM：LEICA社製）により倍率400倍で観察、撮
影した。また、同時に該顕微鏡のDens. Programを用い
て、下記のスキャン条件で蛍光輝度の経時変化を測定し
た。 スキャン条件：Pinhole 85，Voltage 576，Offset-26 測定の結果、プルキンエ細胞では、ＮＯ発生剤であるSN
APの添加前と添加後でｓＧＣの蛍光標識の輝度が異な
り、５分、15分と経時的に輝度が上昇し、30分でピーク
を示し、60分でSNAP添加前と同程度の輝度に戻ることが
判った。また、プルキンエ細胞では、SNAPから生じるＮ
Ｏの刺激に対して蛍光標識の輝度が変化することが判っ
た。尚、SNAPを小脳細胞に処理してＮＯで刺激した際、
アストロサイトに存在するｓＧＣの局在及び蛍光強度に
は全く変化はみられなかった。また、ｓＧＣ及びｎＮＯ
Ｓの存在が認められなかったオリゴデンドロサイト及び
顆粒細胞では、SNAP添加によりＮＯの刺激を行っても、
ｓＧＣ蛍光標識の発色自体が認められなかった。

【００７４】参考例１ ｓＧＣ活性に対するSNAPの効果
と二酸化窒素（ＮＯ ２）濃度 （１）ｓＧＣ活性に対するSNAPの効果 実験例１の（１）で得られた、カバースリップで７日間
培養したラット小脳細胞の培地を、Eric Southam, et a
l., Neuroscience Latters, 130, 107-111(1991)に記載
の方法に準じて、ＮＯ発生剤であるSNAP〔（株）同仁化
学研究所製〕10μMを含有するＨＫ−ＭＥＭ／ＨＦＣＳ
培地と交換し、交換前（０分）、及び交換後、37℃で５
分間、10分間、20分間、30分間、40分間、60分間加温し
たものを夫々速やかにリン酸緩衝液（PBS）で一回洗浄
した。次いで、得られた各反応生成物中のｓＧＣ活性
（ｃＧＭＰ量）を、実施例２の（３）の方法と同様に測
定した。その結果を図９に示す。尚、図９に於いて、縦
軸はｃＧＭＰ濃度（pmol／min／mg protein）を、横軸
はSNAP共存下での加温時間（min）を夫々示す。

【００７５】（２）SNAP添加によるラット小脳細胞培養
培地中のＮＯ２濃度 上記（１）と同様に、カバースリップで７日間培養した
ラット小脳細胞の培地を、SNAP 10μMを含有するＨＫ−
ＭＥＭ／ＨＦＣＳ培地と交換し、交換前（０分）、及び
交換後、37℃で５分間、10分間、20分間、30分間、40分
間、60分間加温した夫々の培地中のＮＯ２濃度を測定し
た。尚、ＮＯ２濃度の測定は、ジアミノナフタレンを使
用するMisko T. P., et al., Analy. Biochem., 214, 1
1-16(1993)に記載の方法に準じて行った。その結果を図
１０に示す。尚、図１０に於いて、縦軸はＮＯ２濃度
（μM）を、横軸はSNAP共存下での加温時間（min）を夫
々示す。

【００７６】（３）結果 図９の結果から明らかなように、SNAP添加後、経時的に
ｃＧＭＰ濃度が上昇し、20〜30分でピークを示し、60分
でSNAP添加前と同程度のｃＧＭＰ濃度に戻ること、即
ち、本発明の抗ｓＧＣモノクローナル抗体を用いた蛍光
抗体法により得られた結果（実験例２）と同様の結果を
示していることが判る。また、図１０の結果から、培地
中のＮＯ２濃度は、SNAP添加後30分で最大に達し、以後
そのレベルを維持していることが判る。即ち、ＮＯは酸
化されてＮＯ２となり、培地中のＮＯ２濃度はＮＯ濃度
に比例するので、SNAP添加後の小脳細胞培養培地中のSN
APから生じるＮＯは、SNAP添加後のｃＧＭＰ活性の変
化、及び実験例２で得られたSNAP添加後のｓＧＣの蛍光
標識の輝度の変化を反映していることが判る。以上のこ
とから、SNAPを添加した後、プルキンエ細胞での本発明
の抗ｓＧＣモノクローナル抗体とｓＧＣとの反応性が、
ＮＯの産生と共に上昇し、ＮＯ産生の減少と共に減少す
ることが判る。

【００７７】

【００７８】

【発明の効果】本発明の抗可溶性グアニル酸シクラーゼ
（ｓＧＣ）モノクローナル抗体は、ｓＧＣを特異的に認
識し得るので、生体内や細胞内・組織内等でのｓＧＣの
局在場所、或いはｓＧＣと他の生体内（細胞内・組織
内）成分との相互関係やこれらの生理学的意義等を自体
公知の免疫学的測定法等を用いて解明する際に有用に使
用される。また、特に、本発明の抗ｓＧＣモノクローナ
ル抗体のうち、ｓＧＣを特異的に認識し、且つ一酸化窒
素（ＮＯ）結合型ｓＧＣを認識する抗ｓＧＣモノクロー
ナル抗体は、例えば、生体内や細胞内・組織内等でのＮ
ＯとｓＧＣとの相互関係、或いはＮＯのｓＧＣへの効果
やこれらの生理的機能及び病理的意義等を自体公知の免
疫学的測定法等を用いて解明する際に有用に使用され、
更には、これを用いて生体、細胞等の生体試料中、或い
は大気中等に存在するＮＯを簡便に且つ高感度に精度良
く検出することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた精製可溶性グアニル酸シク
ラーゼ（ｓＧＣ）を用いたドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の
結果を示す図である。

【図２】実施例２で得られた、本発明のモノクローナル
抗体を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す図で
ある。

【図３】実施例２で得られた、本発明のモノクローナル
抗体のｓＧＣに対する中和活性の有無を検討した結果を
示す図である。

【図４】実施例２で得られた膜結合性グアニル酸シクラ
ーゼ（ｍＧＣ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、及び
本発明のモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッ
ト分析の結果を夫々示す図である。

【図５】実施例３で得られた、ガス無添加ツウィーン20
含有リン酸緩衝液（PBST）中でｓＧＣを用いた場合のｓ
ＧＣとモノクローナル抗体との結合の結果を示す図であ
る。

【図６】実施例３で得られた、ＮＯガス添加PBST中での
ｓＧＣを用いた場合のｓＧＣとモノクローナル抗体との
結合の結果を示す図である。

【図７】実施例３で得られた、ＮＯガス添加PBST中での
ヘム不含ｓＧＣを用いた場合のヘム不含ｓＧＣとモノク
ローナル抗体との結合の結果を示す図である。

【図８】実施例３で得られた、一酸化炭素（ＣＯ）ガス
添加PBST中でのｓＧＣを用いた場合のｓＧＣとモノクロ
ーナル抗体との結合の結果を示す図である。

【図９】参考例１で得られた、小脳細胞中のサイクリッ
クグアノシン−３’，５’−一リン酸濃度とＳ−ニトロ
ソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシルアミン（SNAP）添加
後の加温時間との関係を示す図である。

【図１０】参考例１で得られた、小脳培養培地中の二酸
化窒素（ＮＯ２）とSNAP添加後の加温時間との関係を示
す図である。

【符合の説明】

図２中の各レーン番号は以下の結果を夫々示す。 Ｌａｎｅ ａ：ｍＡｂ３２２１を用いたウエスタンブロ
ッティ ング ｂ：ｍＡｂ２８１３１を用いたウエスタンブロッテ
ィング 図３中、○−は抗体無添加の場合を、−●−はｍＡｂ３
２２１添加の場合を、また、−◎−はｍＡｂ２８１３１
添加の場合の結果を夫々示す。 図４中の各レーン番号は以下の結果を夫々示す。 Ｌａｎｅ ３：ｍＧＣを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ ａ：ｍＡｂ３２２１を用いたウエスタンブロッティ
ング ｂ：ｍＡｂ２８１３１を用いたウエスタンブロッテ
ィング

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１１年２月４日（１９９９．２．４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】可溶性グアニル酸シクラーゼに特異的な
モノクローナル抗体

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA43 DA02 GA03 GA18 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 CE04 CE06 CE10 DA14 4B065 AA91X AA92X AC14 BA08 BA24 CA25 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 CA40 DA76 EA51 FA72 GA06 GA10 GA15 GA21

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 可溶性グアニル酸シクラーゼを特異的に
   認識するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 可溶性グアニル酸シクラーゼを特異的に
   認識し、且つ一酸化窒素結合型可溶性グアニル酸シクラ
   ーゼをも認識するモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のモノクローナル
   抗体を産生するハイブリドーマ。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のハイブリドーマを培養
   することを特徴とする請求項１又は２に記載のモノクロ
   ーナル抗体の製造方法。
5. 【請求項５】 請求項２に記載のモノクローナル抗体を
   用いることを特徴とする一酸化窒素の検出方法。
6. 【請求項６】 請求項２に記載のモノクローナル抗体を
   含んでなる一酸化窒素検出用試薬。