JP2000224993A - ＲｅｌＡ結合性阻害因子、その製造方法およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ３５１アミノ酸からなるヒトＲｅｌＡ結合性
阻害因子（ＲＡＩ）及びその製造法、そのＲｅｌＡ結合
性阻害因子をコードするｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡ配列に
選択的にハイブリダイズするフラグメント、そのｃＤＮ
Ａを組み込まれた複製又は発現プラスミド、そのプラス
ミドで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗
体、そのペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物、
そのＲＡＩの抗体を用いた疾患の診断方法。 【効果】 本発明のＲＡＩはＮＦκＢのサブユニットで
あるｐ６５と結合し、ＮＦκＢが関与すると考えられる
成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、喘息、アログラフト
拒絶、炎症性疾患（炎症性関節炎、脈管炎等）、虚血性
疾患、慢性関節リューマチを含む自己免疫疾患、ガンの
転移浸潤、脈管再狭窄及びその他のＮＦκＢが関与して
いる疾患等の治療及び／または予防に有用と考えられ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、転写因子ＮＦκＢ
の活性化を阻害するタンパク質に関する。さらに詳しく
言えば、転写因子ＮＦκＢのサブユニットであるｐ６５
に結合し、ＮＦκＢの転写活性を阻害するタンパクであ
る、ｐ６５結合タンパク（以後、ＲｅｌＡ結合性阻害因
子またはＲＡＩと略記する。）、その製造方法、その因
子をコードするｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡが組み込まれた
ベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そ
の阻害因子の抗体、およびその阻害因子または抗体を含
有する薬学的組成物に関する。

【０００２】また、本発明は、これらのタンパク質の組
換え産生（特にインビボでの産生）、これらのタンパク
質をコードする核酸、発現および複製ベクター、ならび
に特に成人呼吸困難症候群（adult respiratory distre
ss syndrome：ＡＲＤＳ）、喘息、アログラフト拒絶、
炎症性疾患（炎症性関節炎、脈管炎等）、虚血性疾患、
慢性関節リューマチを含む自己免疫疾患、ガンの転移浸
潤および脈管再狭窄およびその他のＮＦκＢに起因する
疾患の治療および／または予防に関する。

【０００３】

【従来の技術】炎症においては、多くの異なる遺伝子の
発現が亢進されている。それらにはインターロイキン、
転写因子、付着分子、および凝固系の成分などをコード
する遺伝子がある。そして、これらの遺伝子の多くの転
写には、転写因子であるＮＦκＢが関与しているとされ
ている。

【０００４】転写因子ＮＦκＢは、細胞中の細胞質で発
現されることが知られている。ＮＦκＢ様のタンパク質
による遺伝子の転写誘導は、そのタンパクの活性化によ
りおこる。活性化により、予め形成された転写因子の細
胞質から核への移行が可能となる。この移行は、ＩκＢ
と呼ばれる抑制タンパク質のリン酸化と分解により、制
御されていることが知られている。

【０００５】転写因子ＮＦκＢは、κ軽鎖エンハンサー
内の１０塩基配列モチーフに結合した形で成熟Ｂ細胞か
ら初めて単離された。そのため、当初はＮＦκＢは成熟
Ｂ細胞のこの発生期に特異的であると考えられていた
が、ＮＦκＢ様タンパク質が多くの細胞で同定されてき
たため、遺伝子転写の誘導に一般的に関与していること
が示された。このことは、いくつかの誘導遺伝子におけ
る活性型ＮＦκＢ結合部位の機能的同定により確かめら
れている。

【０００６】ＮＦκＢは、５０ｋＤａサブユニット（ｐ
５０）および６５ｋＤａサブユニット（ｐ６５）からな
るヘテロダイマーである。核内因子であるＮＦカッパー
Ｂ（ＮＦκＢ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を
含むウイルスの遺伝子発現や、特に免疫や炎症応答にお
ける種々の細胞内の遺伝子の発現を調節するＤＮＡ配列
に特異的に結合するタンパク複合体である。哺乳類の細
胞におけるＮＦκＢファミリーの因子には、プロトオン
コ遺伝子であるｃ−Ｒｅｌ、ｐ５０／ｐ１０５（ＮＦκ
Ｂ１）、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ｐ５２／ｐ１００（ＮＦ
κＢ２）およびＲｅｌＢ等が含まれる。これら全てのタ
ンパクは、ＤＮＡ結合、二量化およびＮＦκＢの核内移
行を担う、Ｒｅｌ相同ドメイン（ＲＨＤ）として知られ
る、保存された相同性のある３００アミノ酸領域を共有
する。

【０００７】ほとんどの細胞で、Ｒｅｌファミリーは、
異なった特異性を持った様々な組み合わせのヘテロまた
はホモ二量化体を形成することができる。Ｒｅｌファミ
リーに属する転写因子の調節に共通する特徴は、ＩＫＢ
ｓとして知られる阻害分子の一種と不活性複合体として
細胞質中へ遊離されることである。フォルボルエステ
ル、インターロイキン１、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−
α）、ウイルス感染および多くの分裂促進因子（マイト
ジェン）およびサイトカイン等の様々な誘発物質による
細胞を処理することにより、細胞質にある複合体の解離
と遊離ＮＦκＢの核内への移行が引き起こされる。細胞
質複合体の解離は、ＩＫＢタンパクのリン酸化と引き続
く蛋白分解によって、引き金が引かれることが知られて
いる。この蛋白の分解は残されたＮＦκＢヘテロ二量体
の核局在配列を露出させることになり、それがＮＦκＢ
の核移行とそれに引き続くＮＦκＢのターゲット遺伝子
中にあるＤＮＡ調節エレメントへの結合へと導かれる。
ｐ６５サブユニットは、しばしば、ＮＦκＢ複合体に検
出され、非常に強い転写活性化能力を有している。ｐ６
５は、他のＮＦκＢファミリー因子と二量化し、その強
力な転写活性化領域を介して遺伝子発現を活性化する。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＮＦ
κＢの転写活性を阻害する新規なタンパク（ＮＦκＢの
阻害因子）、その製造方法、その因子をコードするｃＤ
ＮＡ、そのｃＤＮＡが組み込まれたベクター、そのベク
ターで形質転換された宿主細胞、その阻害因子の抗体、
およびその阻害因子あるいは抗体を含有する薬学的組成
物を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、既知のＮ
ＦκＢ阻害因子であるＩκＢ以外に、新規な阻害因子が
存在するのではないかと考え、ＮＦκＢ、特にｐ６５サ
ブユニットに着目して鋭意努力した。その結果、新規な
ＮＦκＢ阻害因子を見出し、そのアミノ酸配列、そのア
ミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列ならびに因子の機
能および組織分布等の性質を確認し、本発明を完成し
た。

【００１０】本発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子は、核内
タンパクと考えられ、ＮＦκＢのＤＮＡ結合活性を妨げ
ることにより、ＮＦκＢ依存性の転写活性化を阻害す
る。ＲｅｌＡ結合性阻害因子は４つの連続アンキリンお
よびＳＨ３領域を含む、５３ＢＰ２のＣ末端と非常に高
いホモロジーを有する遺伝子である。ＲｅｌＡ結合性阻
害因子は、核内に局在し、ＴＮＦ−αによって誘導され
るｐ６５と一致した局在を示した。さらに、ＲｅｌＡ結
合性阻害因子は、ＮＦκＢの活性化を阻害したが、一時
的に形質転換した細胞において、ｐ５３依存性の転写活
性化には作用しなかった。それゆえ、ＲｅｌＡ結合性阻
害因子は、ＮＦκＢ依存性転写調節のもう一つの機序に
関わる、新規なｐ６５結合タンパクであると言える。本
発明者は、これらの相互作用を、インビトロにおいては
細菌で発現した融合タンパク、インビボにおいては共免
疫沈降／ウエスタンブロッティングアッセイにより確認
した。

【００１１】５３ＢＰ２と非常に類似しているにもかか
わらず、ＲｅｌＡ結合性阻害因子は酵母２ハイブリッド
アッセイで、Ｐ５３との相互作用が見られなかった。こ
のタンパクをコードするｃＤＮＡは、５３ＢＰ２のタン
パク−タンパク相互作用に重要な、４つのアンキリンリ
ピートおよびＳＨ３ドメインを含む、Ｃ末端の２００ア
ミノ酸と高い構造ホモロジーを有している。ヒトにおい
て、ＲｅｌＡ結合性阻害因子のｍＲＮＡは、心臓、胎盤
および前立腺に特異的に発現しており、肝臓、骨格筋お
よび末梢血白血球では、顕著に発現が少なかった。

【００１２】近年、ｃＤＮＡの作製技術やシークエンス
技術は急速に発展し、大量のｃＤＮＡのシークエンスを
迅速に行なうことができるようになった。そこでこれら
の技術を利用して、様々な細胞や組織からｃＤＮＡライ
ブラリーを作製し、ランダムにｃＤＮＡをクローニング
して塩基配列を決定し、相当するポリペプチドを発現さ
せた後、その生理機能を解析していくという方法が発展
しつつある。そのような技術の一環として、酵母２−ハ
イブリッド法が知られている。

【００１３】これにより、一度に大量の類似タンパクが
釣り上げられ、また、蛍光マーカーなどのレポーター遺
伝子を組み込むことにより、目的とするタンパクのみを
簡便に採取することができるようになった。本発明者
は、この酵母２−ハイブリッド法を用いてＮＦκＢタン
パクのサブユニットであるｐ６５をプローブとして用い
て、新規なｐ６５に結合し、その活性を阻害する新規な
因子を見つけるべく、実験を重ね、本発明因子を見出し
た。

【００１４】本発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子の配列が
新規であることは、ホモロジー検索により確認した。後
に詳述する本発明の配列の製造方法で得られたいくつか
のクローンのうち、本発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子の
配列のみが新規であった。本発明のＲｅｌＡ結合性阻害
因子のアミノ酸配列は、配列番号１に記載の通りであ
る。このアミノ酸配列は、４つのアンキリンリピートと
ＳＨ３領域を有しているので、Ｒｅｌファミリーの一種
であると考えられる。

【００１５】

【発明の構成】本発明は、（１）配列番号１で示される
アミノ酸配列からなるＲｅｌＡ結合性阻害因子、（２）
前記（１）に記載したＲｅｌＡ結合性阻害因子をコード
するｃＤＮＡ、（３）配列番号２で示される塩基配列を
有するｃＤＮＡ、（４）配列番号３で示される塩基配列
を有するｃＤＮＡ、に関する。

【００１６】本発明は、実質的に純粋な形である配列番
号１で示されるアミノ酸配列からなるＲｅｌＡ結合性阻
害因子、そのホモローグ、その配列のフラグメントおよ
びそのホモローグに関する。本発明はさらにそれらのＲ
ｅｌＡ結合性阻害因子をコードするｃＤＮＡに関する。
より具体的には、配列番号２または３で示される塩基配
列を有するｃＤＮＡ、および配列番号２または３で示さ
れる塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメン
トを有するｃＤＮＡに関する。

【００１７】実質的に純粋な形である、配列番号１で示
されるアミノ酸配列を有する本発明のＲｅｌＡ結合性阻
害因子とは、一般に、生産時のポリペプチドの９０％以
上、例えば、９５、９８または９９％が配列番号１で示
されるアミノ酸配列を有するＲｅｌＡ結合性阻害因子で
あることを意味する。

【００１８】配列番号１で示されるアミノ酸配列からな
る本発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子のホモローグとは、
一般に少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０
個、例えば４０、６０または１００個の連続したアミノ
酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８
０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性であ
るものであり、そのようなホモローグは、以後本発明の
ＲｅｌＡ結合性阻害因子として記載される。

【００１９】さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配
列からなる本発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子のフラグメ
ント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、
少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５ア
ミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６
０アミノ酸部分を意味する。

【００２０】配列番号２または３で示される塩基配列を
有するｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするｃＤＮＡ
とは、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくと
も３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した
塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なく
とも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同
性であるものであり、そのようなｃＤＮＡは、以後本発
明のｃＤＮＡとして記載される。ハイブリダイズするｃ
ＤＮＡには、相補配列も含まれる。ハイブリダイズの条
件は、ストリンジェントであることが望ましい。

【００２１】配列番号２または３で示される塩基配列を
有するｃＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩
基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２
５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラ
グメントも本発明のｃＤＮＡに含まれる。

【００２２】さらに、本発明には、本発明のｃＤＮＡを
組み込まれた複製または発現ベクターが含まれる。ベク
ターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記
ｃＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの
制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファ
ージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそ
れ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばルシフェラーゼ
発現遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよ
い。ベクターは、イン・ビトロ（in vitro）において、
例えばｃＤＮＡに対応するＲＮＡの製造、宿主細胞の形
質転換に用いることができる。

【００２３】さらに、本発明には、配列番号２または３
で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディ
ングフレームを有するｃＤＮＡを含む本発明のｃＤＮＡ
を複製または発現させるためのベクターで形質転換され
た宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵
母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。

【００２４】さらに、本発明には、本発明のＲｅｌＡ結
合性阻害因子を発現させるための条件下で、本発明の宿
主細胞を培養することからなる本発明のＲｅｌＡ結合性
阻害因子の製造方法も含まれる。培養は、本発明のＲｅ
ｌＡ結合性阻害因子が発現し、宿主細胞より製造される
条件下で行なわれることが好ましい。

【００２５】本発明のｃＤＮＡは、上記のようなベクタ
ーのアンチセンス領域に挿入する等の方法によりアンチ
センスを製造することもできる。このようなアンチセン
スは、細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御す
るために用いることもできる。

【００２６】本発明は、本発明におけるＲｅｌＡ結合性
阻害因子のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を
も含む。さらに本発明におけるＲｅｌＡ結合性阻害因子
のモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造方法
をも含む。モノクローナル抗体は、本発明のＲｅｌＡ結
合性阻害因子、またはその断片を抗原として用い、通常
のハイブリドーマの技術により製造することができる。
ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウ
サギ等）に本発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子を接種し、
免疫血清を回収する、通常の方法により製造することが
できる。

【００２７】本発明には、本発明のＲｅｌＡ結合性阻害
因子、その抗体と薬学的に許容される賦形剤および／ま
たは担体を含有する薬学的組成物も含まれる。本発明に
は、本発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子の抗体を用いた前
記したようなＮＦκＢが関連した疾患等の診断方法も含
まれる。抗体を用いた診断は、種々知られているが、例
えば抗原抗体反応を用いて、酵素量をＥＩＡ法等で測定
することにより行なわれる。

【００２８】（１）の本発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子
としては、配列番号１で示されたアミノ酸配列を有する
もの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、配列番
号１中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリ
ペプチド等）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの
（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、
およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入された
ものも含まれる。よく知られているように、ひとつのア
ミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅ
ｔは１種類、Ｌｅｕは６種類）知られている。従って、
ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくｃＤＮＡ
の塩基配列を変えることができる。

【００２９】（２）で特定される本発明のｃＤＮＡに
は、（１）の配列番号１で示されるＲｅｌＡ結合性阻害
因子をコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基
配列を変えることによって、ＲｅｌＡ結合性阻害因子の
生産性が向上することがある。（３）で特定される配列
番号２で示されるｃＤＮＡは、（２）のｃＤＮＡの一態
様であり、天然型配列を表わす。（４）に示される配列
番号３のｃＤＮＡは、（３）で特定されるｃＤＮＡに天
然の非翻訳部分を加えた配列を示す。（５）配列番号４
は、（４）に示される配列番号３のｃＤＮＡおよび
（１）に示されるアミノ酸配列の対応を示す。

【００３０】配列番号３で示される塩基配列を有するｃ
ＤＮＡおよび配列番号１で示されるアミノ酸配列を有す
る本発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子の作製は、以下の方
法に従って行なわれる。

【００３１】１）ｐ６５に相互作用するタンパクの同定
には、酵母２−ハイブリッド法が用いられる。ｐ６５の
中央部分（二量化ドメイン、核移行シグナルおよび多プ
ロリン含有の特徴を有する。）を、酵母ＧＡＬ４のＤＮ
Ａ結合ドメインと同一フレーム中に有するように、プラ
スミド（ｐＡＳ２−１等）にクローニングする。 ２）得られたプラスミドをプローブとして、ＧＡＬ４転
写活性化ドメインベクターｐＡＣＴ２中に構築された、
ヒトｃＤＮＡライブラリー（胎盤、脳等）をスクリーニ
ングする。

【００３２】酵母（Ｙ１９０株等）をスクリーニングに
用いて、酵母形質転換体を得る。そのうち、選択培地上
で成長したクローンを、フィルターリフト・ガラクトシ
ダーゼアッセイで青色発色を基準に選別する。３） 別
の酵母（Ｙ１８７株等）を用いた再スクリーニングを行
ない、ｐ６５プローブに特異的に相互作用するプラスミ
ドクローンを確認する。これらのクローンは、両鎖のＤ
ＮＡシーケンシングにより、同定することができる。

【００３３】４）得られたクローンのうち公知のものを
除くことにより、本発明ＲｅｌＡ結合性阻害因子をコー
ドしているクローンを得る。 ５）得られたＤＮＡの断片を用いて、ヒトライブラリー
（胎盤、脳など）を用いて、プラークハイブリダイゼー
ションにより、単離し、目的とする約６ｋｂｐの全長ｃ
ＤＮＡを単離する。 ６）単離したｃＤＮＡを元に、公知の方法により発現細
胞（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞等）を用いて本発明のタン
パクであるＲｅｌＡ結合性阻害因子を得る。

【００３４】ＢＬＡＳＴサーチの結果、アンキリンリピ
ートおよびＳＨ３ドメインは別として、ＲｅｌＡ結合性
阻害因子配列は、現行データベース中のどのタンパクと
も相同性がなかった。このようにして得られたｃＤＮＡ
は、そのものが全長またはほぼ全長であることを確認す
る必要がある。ノザンブロットでのｍＲＮＡサイズとの
比較により、本発明のポリペプチドはほぼ全長であるこ
とを確認した。

【００３５】配列番号２および３で示される塩基配列が
一旦確定されると、その後は、化学合成によって、ある
いは本発明の塩基配列の断片を化学合成し、これをプロ
ーブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の
ｃＤＮＡを得ることができる。さらに、本発明のｃＤＮ
Ａを組み込んだベクターｃＤＮＡを適当な宿主に導入
し、これを増殖させることによって、目的とするｃＤＮ
Ａを必要量得ることができる。

【００３６】本発明のポリペプチドを取得する方法とし
ては、（１） 生体または培養細胞から精製単離する方
法、（２） ペプチド合成する方法、または（３） 遺
伝子組み換え技術を用いて生産する方法、などが挙げら
れるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。

【００３７】遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチド
を生産するための発現系（宿主−ベクター系）として
は、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞
の発現系が挙げられる。

【００３８】例えば、大腸菌で発現させる場合には、成
熟タンパク部分またはプロフォームタンパク部分をコー
ドするｃＤＮＡの５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付
加し、得られたｃＤＮＡを、適当なプロモーター（例え
ば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬ
プロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、
大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、
ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを
作製する。

【００３９】次に、この発現ベクターで形質転換した大
腸菌（例えば、E. Coli ＤＨ５α、E. Coli ＪＭ１０
９、E. Coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養し
て、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることが
できる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例え
ば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリ
プラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することも
できる。さらに、他のポリペプチドとのフュージョン・
プロテイン（fusion protein）を生産することもでき
る。

【００４０】また、哺乳動物細胞で発現させる場合に
は、例えば、配列番号３で示される塩基配列をコードす
るｃＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルス
ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウ
イルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプ
ロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＳＲαプ
ロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプ
ロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製す
る。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞
（例えば、ヒト未分化好酸球白血病ＥＯＬ細胞、ＣＯＳ
−７細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換
し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、
その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。
以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生
化学的方法によって単離精製することができる。

【００４１】

【発明の効果】本発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子（ポリ
ペプチド）は、転写活性化因子であるＮＦκＢのサブユ
ニットであるｐ６５に核内で結合し、ＮＦκＢを阻害す
るため、核内での遺伝子の転写を阻害し、特に成人呼吸
困難症候群（adult respiratory distress syndrome：
ＡＲＤＳ）、喘息、アログラフト拒絶、炎症性疾患（炎
症性関節炎、脈管炎等）、虚血性疾患、自己免疫疾患
（特にＡＩＤＳ）、ガンの転移浸潤、脈管再狭窄および
ＮＦκＢに起因するその他の疾患の治療および／または
予防に有用である。また、本発明のＲｅｌＡ結合性因子
は、心臓の発生、心臓での炎症抑制に関与しており、心
筋細胞の再生のために用いることができる。また、本発
明の抗体を用いることにより、上記の疾患の診断に用い
ることもできる。

【００４２】本発明には、本発明のＲｅｌＡ結合性阻害
因子、その抗体またはアンチセンスと薬学的に許容され
る賦形剤および／または担体を含有する薬学的組成物も
含まれる。

【００４３】本発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子、Ｒｅｌ
Ａ結合性阻害因子をコードするｃＤＮＡ、抗体またはア
ンチセンスを投与する際には、経口投与のための固体組
成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与の
ための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。経口
投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル
剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセルには、ソフト
カプセルおよびハードカプセルが含まれる。

【００４４】投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、
投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人
あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲
で、一日一回から数回経口投与されるか、または成人一
人当り、一回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲
で、一日一回から数回非経口投与される。もちろん前記
したように、投与量は種々の条件により変動するので、
上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範
囲を超えて必要な場合もある。

【００４５】本発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子の抗体
は、上記疾患の診断のために用いることができる。本発
明のＲｅｌＡ結合性阻害因子のポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体を用いて、生体における本発明Ｒ
ｅｌＡ結合性阻害因子の定量が行なえ、これによって本
発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子と疾患との関係の研究あ
るいは疾患の診断等に利用することができる。

【００４６】ポリクローナル抗体およびモノクローナル
抗体は本発明のポリペプチドあるいはその断片を抗原と
して用いて常法により作製することができる。さらに、
本発明のＲｅｌＡ結合性阻害因子（ポリペプチド）を用
いることにより、本ポリペプチドと結合する蛋白（ＮＦ
κＢ）の精製あるいは遺伝子クローニングをすることが
できる。また本発明ＲｅｌＡ結合性阻害因子のアゴニス
ト、アンタゴニストの検索に用いることもできる。

【００４７】本発明のｃＤＮＡは、多大な有用性が期待
される本発明ＲｅｌＡ結合性阻害因子を生産する際の重
要かつ必須の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治
療（遺伝子欠損症の治療またはアンチセンスＤＮＡ（Ｒ
ＮＡ）によって、ＲｅｌＡ結合性阻害因子の発現を停止
させることによる治療等）に利用できる。また、本発明
のｃＤＮＡをプローブとしてジェノミック（genomic）
ＤＮＡを分離できる。同様にして、本発明ｃＤＮＡと相
同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、またヒト
以外の生物における本発明ＲｅｌＡ結合性阻害因子と相
同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離することも可能
である。

【００４８】

【実施例】以下に実施例および参考例を挙げて本発明を
より具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限
するものではない。

【００４９】実施例１：プラスミド−プラスミドの構築 プラスミド−プラスミドの構築は、常法により行なっ
た。酵母２−ハイブリッドシステムにより、ヒトｐ６５
断片（アミノ酸１７６−４０５）を、ｐＡＳ２−１（ク
ローンテック社、パロアルト）にクローニングした。Ｂ
ａｍＨＩ制限サイトを含む５’および３’オリゴヌクレ
オチド、すなわち、Forward：５’−ＧＧＣＧＧＡＴＣ
ＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＴＧＴＣ−３’（配列
番号５）、およびReverse：５’−ＧＣＴＧＧＡＴＣＣ
ＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣ−３’（配列番
号６）を用いたＰＣＲを行ない、得られたプラスミドを
ｐＡＳ２−１−ｐ６５（１７６−４０５）と命名した。
ライブラリースクリーニングで得られた最も長いＲｅｌ
Ａ結合性阻害因子インサート（Rel A Associated Inhib
itor；以下、ＲＡＩと略記する。）であるｐＡＣＴ２−
ｐ３５をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断した。このＥ
ｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を精製し、ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ
Ｉで消化したｐＧＥＸ−５Ｘ−２（ファルマシア社）に
クローニングした。

【００５０】ＲＡＩのｃＤＮＡのクローニングは以下の
ように行なった。ＲＡＩの全長をＳａｌＩおよびＢａｍ
ＨＩ制限サイトを含むオリゴヌクレオチド、すなわちFo
rward：５’−ＣＡＡＴＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＴＣ
ＴＧＡＣＴＣＴＴＧＣＴＧ−３’（配列番号７）、およ
びReverse：５’−ＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧ
ＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＴＴＧＴ−３’（配列番号８）を
用いてそれぞれ増幅し、ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片とし
てｐＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドにクローニングし、ＧＦ
Ｐと同一フレームでＲＡＩとの融合タンパクを合成する
ことのできるｐＥＧＦＰ−ＲＡＩプラスミドを得た。ｐ
ＥＧＦＰ−ＲＡＩを、ＢｓｓＨＩＩおよびＢａｍＨＩで
切断し、クレノー酵素によって平坦化することにより、
これをｐＥＧＦＰ−Ｃ１にクローニングすることによ
り、ｐＥＧＦＰ−ＲＡＩ（１−１４６）を作製した。

【００５１】相当するＲＡＩ断片を、それぞれＥｃｏＲ
ＩおよびＢａｍＨＩを含むオリゴヌクレオチドＦ１３
２、すなわちForward：５’−ＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣ
ＴＧＴＧＣＴＧＣＧＧＡＡＧＧＣＧ−３’（配列番号
９）、およびReverse：５’−ＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣ
ＴＣＡＧＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＴＴＧＴ−３’（配列
番号１０）を用いたＰＣＲにより増幅し、ｐＥＧＦＰ−
Ｃ１にクローニングすることにより、ｐＥＧＦＰ−ＲＡ
Ｉ（１３２−３５１）を作製した。ｐＥＧＦＰ−ＲＡＩ
から、全長ＲＡＩ断片を、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ベク
ターのＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限サイトにインサー
トすることによりｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−ＲＡＩを作製し
た。全てのＰＣＲは、エクスパンド・ハイフィディリテ
ィー・システム（ベーリンガーマンハイム社）を用い
た。

【００５２】全ての構築物は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ダ
イターミネーター・サイクルシーケンシング・レディー
リアクションキット（パーキンエルマー社）を用いた、
ジデオキシヌクレオチドシーケンシングにより確認し
た。

【００５３】ジェネリックなｐ５３応答エレメントをプ
ロモーターに含む、ＰＧ１３−Ｌｕｃプラスミド、およ
びヒト野生型ｐ５３を発現するｐＣＭＶ−ｐ５３ｗｔプ
ラスミドは、Ｂ．ボゲルスタイン博士より提供いただい
た。４ｋＢｗ−Ｌｕｃおよび４ｋＢｍ−Ｌｕｃの構築は
既報によった。

【００５４】マッチメーカー・ツーハイブリッドシステ
ム・プロトコール（クローンテック社）に従って、酵母
２ハイブリッドスクリーン−ｐＡＳ２−１−ｐ６５（１
７６−４０５）をプローブとして、ヒト胎盤および脳ｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ポジティブ
酵母クローンを、ヒスチジンによる栄養要求性およびβ
−ガラクトシダーゼの発現により選んだ。プラスミド由
来のライブラリーをポジティブクローンから分離し、得
られたプラスミドでＥ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株を形質
転換した。

【００５５】その後の２−ハイブリッドアッセイは、Ｇ
ａｌ１レポーター遺伝子を組み込んだイーストＹ１８７
株に、プラスミドを導入することにより行なった。β−
ガラクトシダーゼの発現を検出することにより、それぞ
れの結合を確認した。

【００５６】ｐ６５（１７６−４０５）と特定的に相互
作用するｃＤＮＡクローンを含んだプラスミドを、制限
酵素地図、特定のプライマーを用いたＰＣＲおよび両鎖
のＤＮＡシーケンシングにより同定した。米国立バイオ
テクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のオンラインサ
ービスを用いて、シーケンスネットワークＢＬＡＳＴサ
ーチを行なった。

【００５７】実施例２：細胞培養および形質転換 ＨｅＬａ、２９３ＴおよびＳａｏｓ−２およびＣＯＳ−
１細胞を、熱変性ウシ胎児血清（１０％）、グルタメー
ト（１ｍＭ）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）および
ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を添加したダ
ルベッコ変法イーグル培地中、３７℃で培養した。ジャ
ーカットヒトＴ細胞株を、熱変性ウシ胎児血清（１０
％）および抗生物質を加えたＲＰＭＩ１６４０中に保存
した。この細胞を、スーパーフェクト形質転換試薬（キ
アゲン社）をメーカーの指示通り用いて、形質転換し
た。

【００５８】実施例３：リコンビナントタンパクの精製
と発現 グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合
タンパクをコードするｐＧＥＸ−５Ｘ−２プラスミドで
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を形質転換し、
イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ、０．１ｍＭ）で２８℃で一夜処理した。リ
コンビナントＧＳＴ−融合タンパクを、緩衝液Ａ（トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4；５０ｍＭ）、ＤＴＴ（１ｍ
Ｍ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、ＥＧＴＡ（0.1ｍＭ）、食
塩（１００ｍＭ）、ベンズアミジン（１ｍＭ）、フェニ
ルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）（0.1
ｍＭ）、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン
（0.1ｍＭ）、0.25％（ｖ／ｖ）ノニデトＰ−４０（Ｎ
Ｐ−４０））中、グルタチオン−セファロースビーズ
（ファルマシアバイオテック社）を用いて、細菌抽出物
とインキュベートすることにより精製した。ビーズを氷
冷した緩衝液Ａで５回洗浄後、緩衝液Ａ（１ｍｌ）に懸
濁した。５〜２０％ドデシルスルフェートナトリウム−
ポリアクリルアミドを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い
て、クーマッシー青で染色することにより、結合ＧＳＴ
融合タンパクの精製と定性を行なった。

【００５９】実施例４：インビトロアッセイ ＴＮＴ Ｔ７／ＳＰ６小麦胚抽出カップリングシステム
（プロメガ社）を、メーカーの指示通り用いて、³⁵Ｓ−
メチオニンでラベルしたｐ６５を作製した。インビトロ
でのタンパク−タンパク相互作用を調べるために、５ｍ
ｇの精製ＧＳＴ−ＲＡＩ融合タンパク、またはネガティ
ブコントロールとしてＧＳＴと、インビトロで合成し³⁵
Ｓ−メチオニンでラベルしたｐ６５とを反応させ、グル
タチオンセファロースビーズを加えて、２５℃で１時
間、緩衝液Ａ（２５０ｍｌ）中で、インキュベートし
た。ビーズを、0.1％ＮＰ−４０を含有する氷冷緩衝液
Ａ（１ｍｌ）を用いて、懸濁および遠心分離を５回繰り
返すことにより洗浄した。目的のタンパクを、等量のＳ
ＤＳ用緩衝液でビーズから溶出し、３分間煮沸し、５〜
２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに溶解し、オートラジオグラフ
ィーで現像した。

【００６０】実施例５：全長ＲＡＩの単離 酵母２ハイブリッドスクリーニングで得られた、最も長
いＲＡＩの断片を、ハイブリダイゼーションプローブと
して用いて、ヒト胎盤５’−ストレッチプラスｃＤＮＡ
ライブラリー（クローンテック社）をスクリーニングし
た。プローブを、プライムイット・ランダムプライマー
・ラベリングキット（ストラタジェン社）を用いて、³²
Ｐでラベルした。ハイブリダイゼーションは、メーカー
の指示通り行なった。フィルターを、終端ストリンジェ
ンシー0.1×ＳＳＣ−0.5％ＳＤＳを用いて６５℃で洗浄
し、増強スクリーンを用い、Ｘ線フィルム（Ｘ−オマッ
トＡＲ；イーストマンコダック社）に一夜曝した。フィ
ルムを現像し、フィルター上のハイブリダイゼーション
により、ＲＡＩのｃＤＮＡクローンを同定・単離した。
ファージを、アガロースプラグからＳＭ緩衝液で溶出
し、４℃で保存した（１次プラークプール）。２次およ
び３次プラーク精製を、１次プールと同様に行ない、単
一プラークが単離されるまで、この操作を繰り返した。

【００６１】実施例６：ウェスターンブロッティング 全長ＲＡＩをＦＬＡＧエピトープタグを入れるために、
５’末端のオープンフレームで消化したＣＭＶプロモー
ター発現ベクターにクローニングした。前記したスーパ
ーフェクト形質転換試薬を用いて、２９３Ｔ細胞が形質
転換された。ＳＤＳ含有緩衝液中の全細胞抽出物からタ
ンパクを単離した。ウェスターンブロッティングはアン
チーＦＬＡＧ抗体（サンタクルツ社）を用いた、1000倍
希釈で、通常の方法により行なった。第二次抗体とし
て、１／2500に希釈した西洋ワサビパーオキシダーゼを
接合した抗ウサギＩｇＧ抗体を用い、タンパクのバンド
は、ケミルミネッセンス（アマーシャム社）を用いて現
像した。

【００６２】実施例７：共免疫沈殿 形質転換後、２９３Ｔ細胞を２４時間培養し、採取した
（増やした）。ＰＢＳ洗浄後、細胞を氷冷した可溶化緩
衝液（３５０ｍｌ，トリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.4；５０
ｍＭ），食塩（１５０ｍＭ），ＥＤＴＡ（２ｍＭ）、Ｐ
ＭＳＦ（１ｍＭ），ＤＴＴ（１ｍＭ），ＮＰ−４０（0.
2％），フッ化ナトリウム（１０ｍＭ），アポロチニン
（１０μｇ／ｍｌ），ロイペプチン（１０μｇ／ｍ
ｌ），およびペプスタチンＡ（１μｇ／ｍｌ））で３０
分間可溶化した。可溶化物を遠心分離した上清を、抗Ｆ
ＬＡＧ Ｍ２マウスモノクローナル抗体（コダック
社）、コントロールマウスモノクローナル抗体（ダコー
社）またはウサギポリクローナルＩκＢ−α抗体（サン
タクルツ社）と４℃で一夜、続いてタンパクＡセファロ
ース（ファルマシア社）と４時間インキュベートした。
ビーズを、可溶化緩衝液（１ｍｌ）で６回洗浄した。目
的タンパクを等量のＳＤＳ緩衝液で溶出し、１０％−Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。抗ＮＦκＢｐ６５（Ｃ−２
０）抗体（サンタクルツ社）を用いた、ウェスターンブ
ロッティングは、前記と同様に行なった。

【００６３】実施例８：ノザンブロッティングハイブリ
ダイゼーション ヒューマン複数組織ブロッツ（クローンテック社）を用
いたノザンブロッティングハイブリダイゼーションはメ
ーカーの指示通り行なった。ＲＡＩの全長ｃＤＮＡをプ
ローブとして用いた。同一量のＲＮＡがブロットされて
いることを確かめるために、ブロットは、さらにβ−ア
クチン断片によりプローブされた。

【００６４】実施例９：顕微鏡下での観察 ＨｅＬａ細胞を４穴チャンバースライドで培養し、スー
パーフェクト形質転換試薬（キアゲン社）を用いて、種
々のＧＦＰ融合タンパクを発現するプラスミドで形質転
換した。２４時間後、細胞を４％パラフォルムアルデヒ
ドと１５分間反応させることにより固定し、ＤＮＡ結合
染料ヘキスト−33342を用いて、室温で１５分間染色
し、次いでリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した。ＧＦＰ
融合タンパクの細胞内局在を、蛍光顕微鏡解析により観
察した。

【００６５】実施例１０：免疫蛍光顕微鏡での観察 ｐＥＧＦＰ−ＲＡＩ（0.1ｍｇ）でＨｅＬａ細胞を形質
転換し、４穴チャンバースライドで培養した。形質転換
後２４時間で、細胞をＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で
処理または処理せずに前記した方法で免疫染色した。簡
単に言えば、細胞を４％（ｗ／ｖ）パラフォルムアルデ
ヒド／ＰＢＳを用いて室温下、１０分間処理して固定
し、次いで0.5％トリトンＸ−１００／ＰＢＳで室温
下、２０分間処理した。これらを、ウサギｐ６５ポリク
ローナル抗体（サンタクルツ社）と３７℃で１時間イン
キュベートした。ＰＢＳ洗浄後、ＴＲＩＴＣを結合した
ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（カペルオルガノンテクニカ
社）と３７℃で３０分間インキュベートした。細胞核の
形態を観察するために、ヘキスト−33342で室温下１５
分間染色した。スライドを蛍光顕微鏡下に観察した。

【００６６】実施例１１：ルシフェラーゼアッセイ ＨｅＬａおよびＳａｏｓ−２細胞を１２穴プレートで培
養し、スーパーフェクト形質転換試薬（キアゲン社）を
用いて形質転換した。それぞれの形質転換には、５０ｎ
ｇのｋＢ依存性プラスミドもしくはミュータントレポー
タープラスミド（４ｋＢｗ−Ｌｕｃまたは５ｋＢｍ−Ｌ
ｕｃ）、または２５０ｎｇのｐ５３依存性ルシフェラー
ゼレポータープラスミド（ＰＧ１３−Ｌｕｃ）、および
３０ｎｇの内部標準プラスミドｐＲＬ−ＴＫを用いた。
形質転換ＤＮＡの総量を1.5μｇにするために、空ベク
ターｐＥＢＶＨｉｓＢまたはｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２を
用いて調節した。形質転換後２４時間して細胞を採取
し、ルシフェラーゼ活性を測定した（Sato, T. et al,
AIDS Res. Hum. retrovir. 14, 293-298(1998)）。ジャ
ーカット細胞を指示されたプラスミドで形質転換した。
形質転換から２４時間後、細胞を５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ
−αで２４時間刺激し、ルシフェラーゼ活性の測定のた
めに採取した。

【００６７】実施例１２：ゲル電気泳動シフトアッセイ ２９３Ｔ細胞を２４時間形質転換し、核抽出物を既報の
方法により調製した（Okamoto, T., et al, Virology 1
77, 606-614(1990)）。核を抽出緩衝液（３５ｍｌ；Ｈ
ＥＰＥＳ（５０ｍＭ），ｐＨ7.4，塩化カリウム（５０
ｍＭ），食塩（３５０ｍＭ），ＥＤＴＡ（0.1ｍＭ），
ＤＴＴ（１ｍＭ），ＰＭＳＦ（0.1ｍＭ），グリセリン
（１０％））を用いて可溶化した。

【００６８】タンパク量を、ＤＣタンパクアッセイ（バ
イオ−ラッド社）を用いて測定した。ゲル電気泳動シフ
トアッセイ（ＥＭＳＡ）は（Yang, J.-P., et al, FEBS
Lett. 361, 89-96(1995):Liu, Z.-Q., et al, FEBS Le
tt. 385, 109-113(1996)）に従い、ヒト免疫不全ウイル
スのＬＴＲから得られたｋＢ配列を用いて行なった。ま
た、対照としてＯｃｔ−コンセンサスオリゴヌクレオチ
ド：５’−ＴＧＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＧ
ＡＡ−３’（配列番号１１）を用いた。オリゴヌクレオ
チドは、ＤＮＡポリメラーゼクレノー断片（タケダバイ
オメディカルズ社）および［α−³²Ｐ］ｄＡＴＰ（3000
Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＩＣＮファーマシューティカルズ社）
を用いてラベル化した。ＤＮＡ結合反応は、室温で１５
分間、１０μｌで、５μｇの核抽出物を用いて行なっ
た。結合複合体の解析は、５％ポリアクリルアミドゲル
中、0.5×トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液を用いた電
気泳動およびオートラジオグラフィーにより行なった。
ＤＮＡ競合実験には、プローブの５０倍等量の過剰量の
非ラベル競合オリゴヌクレオチドを反応混合物に加え
た。

【００６９】結果：ｐ６５結合タンパクとしてのＲＡＩ
のｃＤＮＡクローンの単離 ｐ６５に相互作用するタンパクの同定には、酵母２−ハ
イブリッド法を用いた。二量化ドメイン、核移行シグナ
ルおよび多プロリン含有の特徴を有するｐ６５のアミノ
酸ＤＮＡ断片（１７６−４０５）を、酵母ＧＡＬ４のＤ
ＮＡ結合ドメインをフレーム中に有するｐＡＳ２−１に
クローニングした。得られたプラスミド、ｐＡＳ２−１
−ｐ６５（１７６−４０５）をプローブとして、ＧＡＬ
４転写活性化ドメインベクターｐＡＣＴ２中に構築され
たヒトｃＤＮＡライブラリー（胎盤および脳）をスクリ
ーニングした。酵母Ｙ１９０株をスクリーニングに用い
て、約1.56×１０⁶の酵母Ｙ１９０形質転換体が得られ
た。そのうち、７８クローンが選択培地上で成長し、フ
ィルターリフトガラクトシダーゼアッセイで青色を呈し
た。酵母Ｙ１８７株を用いた再スクリーニングでは、ｐ
６５に特異的に結合するタンパクをコードする６３個の
プラスミドクローンが見出された。これらのクローン
は、両鎖のＤＮＡシーケンシングにより同定された。

【００７０】すでにｐ６５結合タンパクとして同定され
ていることに加えて、一次ヌクレオチドシーケンシング
では、ＩκＢ−β／Ｔｒｉｐ９（４クローン）、ｐ５０
／ｐ１０５（３クローン）、ｐ６５／ＲｅｌＡ（２クロ
ーン）、ｃ−Ｒｅｌ（１クローン）および５３ＢＰ２
（２クローン）であり、４つのクローンは、ＧｅｎＢａ
ｎｋデータベースには登録されていないタンパクをコー
ドしている未知の遺伝子が分離されたことが明らかにな
った（これらは全て、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー由
来である。）。

【００７１】本発明者は、この新規なタンパクをＲｅｌ
Ａ結合性阻害因子（ＲＡＩ）と命名した。４つのクロー
ンは同じ３’末端を有してはいるが、異なるインサート
サイズを有していることが２−ハイブリッドスクリーニ
ングにより同定された。ｐ６５とＲＡＩ間の相互作用を
確認するために、リコンビナントＲＡＩとｐ６５タンパ
ク間のインビトロアッセイを行なった。ｐＡＣＴ２−Ｒ
ＡＩから取り出したｃＤＮＡインサートをＧＳＴ発現プ
ラスミドのフレームの中に組み込み、ＧＳＴ−ＲＡＩ融
合タンパクを作成した。ＧＳＴ融合タンパクをＥ．ｃｏ
ｌｉで発現させ、グルタチオンセファロースビーズを用
いて精製した（図１、レーン１および２）。

【００７２】［³⁵Ｓ］メチオニンでラベルしたｐ６５を
小麦胚抽出によるインビトロ転写・翻訳プロトコールを
用いて合成した（図１、レーン３）。グルタチオンセフ
ァロースビーズに結合させた精製ＧＳＴ融合タンパクを
インビトロ合成したｐ６５タンパクとインキュベートし
た。ビーズを洗浄し、目的物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解
析し、次いでオートラジオグラフィーに供した。図１で
は、ｐ６５がＲＡＩと強力に相互作用していることが示
されている（レーン５）。ｐ６５がコントロールである
ＧＳＴタンパクとは相互作用していないことから、ｐ６
５とＲＡＩの結合は特異的であると考えられる（レーン
４）。

【００７３】実施例１３：全長ＲＡＩの単離 酵母２−ハイブリッドスクリーニングにより単離された
４つの独立クローンは同じ遺伝子由来の部分ｃＤＮＡで
あった。全長クローンを得るために、２−ハイブリッド
スクリーニングで単離されたＲＡＩのｃＤＮＡ断片を用
いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブ
リダイゼーションした。約１０⁶プラークをスクリーニ
ングし、約１ｋｂから６ｋｂの長さの９つのｃＤＮＡク
ローンが単離された。一番長い２つのｃＤＮＡの両鎖を
シーケンシングし、これらがＲＡＩの完全なオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）を有することを見出し
た。このクローンは５’末端が異なるが、それぞれｐＡ
ＣＴ２−ＲＡＩ中の全ての配列を含んでいた。両者は
５’末端の非翻訳領域に、Ａｌｕリピートエレメントを
含んでいた。有望なＲＡＩの翻訳開始コドンはインフレ
ームストップコドンの２７ｂｐ上流に位置していた。脊
椎動物では、翻訳は９０％以上、一番初めのメチオニン
から始まるため、ファーストＡＴＧ（ＣＴＧＧＣＧＡＴ
Ｇ）の５’核酸配列がコンセンサス翻訳開始配列と似て
いないが、本発明者はこのＡＴＧを翻訳開始サイトと推
定した。ＤＮＡ配列解析により、４０ｋＤａの質量を持
つと思われる３５１アミノ酸残基からなる推定タンパク
をコードすると予測される、オープンリーディングフレ
ームが発見された。興味深いことに、ＢＬＡＳＴサーチ
で、このタンパクのＣ末端は酵母２−ハイブリッドスク
リーニングにより、ｐ５３結合タンパクとして以前報告
した、５３ＢＰ２のＣ末端と非常にホモロジーが高いこ
とが明らかとなった（Iwabuchi, K. et al, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 91,6098-6102(1994)）。

【００７４】ＲＡＩタンパクは５３ＢＰ２と同様、Ｃ末
端に連続した４つのアンキリンリピート（１４５Ａｒｇ
−１７４Ａｓｎ、１７６Ｐｒｏ−２０７Ａｌａ、２０９
Ｖａｌ−２４１Ａｌａ、２４３Ｐｈｅ−２７５Ｇｌｕ）
およびＳＨ３ドメイン（２８７Ｔｙｒ−３３８Ｐｈｅ）
を含み、Ｃ末端の２２３アミノ酸残基において、５３Ｂ
Ｐ２とアミノ酸が５２％同一であることが予想された。
ＢＬＡＳＴサーチの結果、アンキリンリピートおよびＳ
Ｈ３ドメインは別として、ＲＡＩ配列は現行データベー
ス中のどのタンパクとも関連性がなかった。

【００７５】実施例１４：ヒト組織中のＲＡＩの組織分
布 ＲＡＩの発現分布を確かめるために、ヒト複数組織ブロ
ットのノザンブロッティング解析を行なった。図２で示
されるように、ほとんどの場合、ＲＡＩのｍＲＮＡは、
約6.0ｋｂと約3.4ｋｂのバンドとして検出された。図２
からも明らかなように、ＲＡＩのｍＲＮＡの発現は、ヒ
ト心臓、胎盤および前立腺で顕著であり、肝臓、骨格
筋、精巣および末梢血白血球では目立って少なかった。

【００７６】実施例１５：ＲＡＩのＮＦκＢ依存性転写
活性化阻害作用 ＲＡＩはＩκＢファミリータンパクと同じように、その
アンキリンリピートおよびＳＨ３ドメインを介して、ｐ
６５と結合することが示されたので、本発明者はＲＡＩ
がｋＢ依存性の転写活性化において他の効果があるか否
か確かめた。ｋＢ配列の４つのタンデムコピーを含むル
シフェラーゼレポータープラスミドと、ＦＬＡＧ−ＲＡ
Ｉおよび／またはｐ６５発現ベクターを一緒に用いて、
２９３Ｔ細胞を形質転換した。形質転換の２４時間後、
ルシフェラーゼ活性を測定した。図３に示されるよう
に、コトランスフェクトされたｐ６５発現プラスミド
は、レポーター遺伝子を強力に転写活性化した（図３，
レーン９）。ＲＡＩ発現プラスミドのコトランスフェク
ションは、ｐ６５によって誘導されるＮＦκＢ活性を用
量依存的に阻害した。より少ない範囲であるにも関わら
ず、ｋＢ依存性ルシフェラーゼ発現のベースレベルにお
けるＲＡＩの阻害効果が観察された（図３，レーン１
１，１３および１５）。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> ONO Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Rel A associated Inhibitor, Preparation and Use thereof <130> ONP3158 <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 351 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (145)...(174) <223> Ankyrin repeat <220> <221> DOMAIN <222> (176)...(207) <223> Ankyrin repeat <220> <221> DOMAIN <222> (209)...(241) <223> Ankyrin repeat <220> <221> DOMAIN <222> (243)...(275) <223> Ankyrin repeat <220> <221> DOMAIN <222> (287)...(338) <223> SH3 domain <400> 1 Met Trp Met Lys Asp Pro Val Ala Arg Pro Leu Ser Pro Thr Arg Leu 1 5 10 15 Gln Pro Ala Leu Pro Pro Glu Ala Gln Ser Val Pro Glu Leu Glu Glu 20 25 30 Val Ala Arg Val Leu Ala Glu Ile Pro Arg Pro Leu Lys Arg Arg Gly 35 40 45 Ser Met Glu Gln Ala Pro Ala Val Ala Leu Pro Pro Thr His Lys Lys 50 55 60 Gln Tyr Gln Gln Ile Ile Ser Arg Leu Phe His Arg His Gly Gly Pro 65 70 75 80 Gly Pro Gly Gly Arg Ser Gln Ser Cys Pro Pro Ser Leu Arg Asp Leu 85 90 95 Arg Pro Gly Gln Gly Pro Leu Leu Leu Pro His Gln Leu Pro Phe His 100 105 110 Arg Pro Ala Pro Ser Gln Ser Ser Pro Pro Glu Gln Pro Gln Ser Met 115 120 125 Glu Met Arg Ser Val Leu Arg Lys Ala Gly Ser Pro Arg Lys Ala Arg 130 135 140 Arg Ala Arg Leu Asn Pro Leu Val Leu Leu Leu Asp Ala Ala Leu Thr 145 150 155 160 Gly Glu Leu Glu Val Val Gln Gln Ala Val Lys Glu Met Asn Asp Pro 165 170 175 Ser Gln Pro Asn Glu Glu Gly Ile Thr Ala Leu His Asn Ala Ile Cys 180 185 190 Gly Ala Asn Tyr Ser Ile Val Asp Phe Leu Ile Thr Ala Gly Ala Asn 195 200 205 Val Asn Ser Pro Asp Ser His Gly Trp Thr Pro Leu His Cys Ala Ala 210 215 220 Ser Cys Asn Asp Thr Val Ile Cys Met Ala Leu Val Gln His Gly Ala 225 230 235 240 Ala Ile Phe Ala Thr Thr Leu Ser Asp Gly Ala Thr Ala Phe Glu Lys 245 250 255 Cys Asp Pro Tyr Arg Glu Gly Tyr Ala Asp Cys Ala Thr Tyr Leu Ala 260 265 270 Asp Val Glu Gln Ser Met Gly Leu Met Asn Ser Gly Ala Val Tyr Ala 275 280 285 Leu Trp Asp Tyr Ser Ala Glu Phe Gly Asp Glu Leu Ser Phe Arg Glu 290 295 300 Gly Glu Ser Val Thr Val Leu Arg Arg Asp Gly Pro Glu Glu Thr Asp 305 310 315 320 Trp Trp Trp Ala Ala Leu His Gly Gln Glu Gly Tyr Val Pro Arg Asn 325 330 335 Tyr Phe Gly Leu Phe Pro Arg Val Lys Pro Gln Arg Ser Lys Val 340 345 350 <210> 2 <211> 1053 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgtggatga aggaccctgt agcaaggcct ctcagcccca cgaggctgca gccagcactg 60 ccaccggagg cacagtcggt gcccgagctg gaggaggtgg cacgggtgtt ggcggaaatt 120 ccccggcccc tcaaacgcag gggctccatg gagcaggccc ctgctgtggc cctgccccct 180 acccacaaga aacagtacca gcagatcatc agccgcctct tccatcgtca tggggggcca 240 gggcccgggg ggcggagcca gagctgtccc ccatcactga gggatctgag gccagggcag 300 ggccccctgc tcctgcccca ccagctccca ttccaccgcc cggccccgtc ccagagcagc 360 ccaccagagc agccgcagag catggagatg cgctctgtgc tgcggaaggc gggctccccg 420 cgcaaggccc gccgcgcgcg cctcaaccct ctggtgctcc tcctggacgc ggcgctgacc 480 ggggagctgg aggtggtgca gcaggcggtg aaggagatga acgacccgag ccagcccaac 540 gaggagggca tcactgcctt gcacaacgcc atctgcggcg ccaactactc tatcgtggat 600 ttcctcatca ccgcgggtgc caatgtcaac tcccccgaca gccacggctg gacacccttg 660 cactgcgcgg cgtcgtgcaa cgacacagtc atctgcatgg cgctggtgca gcacggcgct 720 gcaatcttcg ccaccacgct cagcgacggc gccaccgcct tcgagaagtg cgacccttac 780 cgcgagggtt atgctgactg cgccacctac ctggcagacg tcgagcagag tatggggctg 840 atgaacagcg gggcagtgta cgctctctgg gactacagcg ccgagttcgg ggacgagctg 900 tccttccgcg agggcgagtc ggtcaccgtg ctgcggaggg acgggccgga ggagaccgac 960 tggtggtggg ccgcgctgca cggccaggag ggctacgtgc cgcggaacta cttcgggctg 1020 ttccccaggg tgaagcctca aaggagtaaa gtc 1053 <210> 3 <211> 2640 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggaattcgcg gccgcgtcga caaacaagtg agtctcggct ggagtgcagt ggtgcagtgg 60 tgcaatctcg gctcactgca acctccgcct cctgggttca agcgattcct gtgcctcggc 120 cttccgagta gctgggattg caggcgtgtg ccaccacgcc cggctaattt tttttttttt 180 tttttttttt ttgtattttt agtagagaca gggttcttac catgttggcc aggctggtct 240 caaactcctg atctcaagag atgtggcctg cctccggcct cccaaagttc tgggattaca 300 gggtgttgag ccactctgac tcagccaata atgcatattt ttatttccac ctgctttact 360 gtcagaatga gtaagacaga gaagaaatca ttaaacacca ggattctact tgcctgctgg 420 agttttctgc ctgagatgtt aggagaggaa actctcagga tctcagaaaa tcacatctat 480 cacggttggt agaagtagat tctagagtca gccagaatga gttcaagtcc caactgcatg 540 gctttgggca actgactgtc ctctctgagg cccagattcc ctttcggtaa tgtggagatg 600 gcagtgtatc tacctcacaa agcagtggtg agattacaat aaggtaggca tgtaaagcgc 660 caggcacata ctaactgctc aataaatggg aggcatcata attgtatatt attcacagcc 720 caaggaaagt gtagcccaga gagggcaagg aacttgaccc tgaggtcaac acagaaaatc 780 atgtgctggt tgtatgccct ggaagttgtg gagagggagt gttgggtgtc ttcctgggga 840 cctgtcctct gatgggctct tgttccggct aggacccccc aaacccccca ccgagctgga 900 gcctgagccg gagatagagg ggctgctgac accagtgctg gaggctggcg atgtggatga 960 aggaccctgt agcaaggcct ctcagcccca cgaggctgca gccagcactg ccaccggagg 1020 cacagtcggt gcccgagctg gaggaggtgg cacgggtgtt ggcggaaatt ccccggcccc 1080 tcaaacgcag gggctccatg gagcaggccc ctgctgtggc cctgccccct acccacaaga 1140 aacagtacca gcagatcatc agccgcctct tccatcgtca tggggggcca gggcccgggg 1200 ggcggagcca gagctgtccc ccatcactga gggatctgag gccagggcag ggccccctgc 1260 tcctgcccca ccagctccca ttccaccgcc cggccccgtc ccagagcagc ccaccagagc 1320 agccgcagag catggagatg cgctctgtgc tgcggaaggc gggctccccg cgcaaggccc 1380 gccgcgcgcg cctcaaccct ctggtgctcc tcctggacgc ggcgctgacc ggggagctgg 1440 aggtggtgca gcaggcggtg aaggagatga acgacccgag ccagcccaac gaggagggca 1500 tcactgcctt gcacaacgcc atctgcggcg ccaactactc tatcgtggat ttcctcatca 1560 ccgcgggtgc caatgtcaac tcccccgaca gccacggctg gacacccttg cactgcgcgg 1620 cgtcgtgcaa cgacacagtc atctgcatgg cgctggtgca gcacggcgct gcaatcttcg 1680 ccaccacgct cagcgacggc gccaccgcct tcgagaagtg cgacccttac cgcgagggtt 1740 atgctgactg cgccacctac ctggcagacg tcgagcagag tatggggctg atgaacagcg 1800 gggcagtgta cgctctctgg gactacagcg ccgagttcgg ggacgagctg tccttccgcg 1860 agggcgagtc ggtcaccgtg ctgcggaggg acgggccgga ggagaccgac tggtggtggg 1920 ccgcgctgca cggccaggag ggctacgtgc cgcggaacta cttcgggctg ttccccaggg 1980 tgaagcctca aaggagtaaa gtctagcagg atagaaggag gtttctgagg ctgacagaaa 2040 caagcattcc tgccttccct ccagacctct ccctctgttt tttgctgcct ttatctgcac 2100 ccctcaccct gctggtggtg gtccttgcca ccggttctct gttctcctgg aagtccaggg 2160 aagaaggagg gccccagcct taaatttagt aatctgcctt agccttggga ggtctgggaa 2220 gggctggaaa tcactgggga caggaaacca cttccttttg ccaaatcaga tcccgtccaa 2280 agtgcctccc atgcctacca ccatcatcac atcccccagc aagccagcca cctgcccagc 2340 cgggcctggg atgggccacc acaccactgg atattcctgg gagtcactgc tgacaccatc 2400 tctcccagca gtcttggggt ctgggtggga aacattggtc tctaccagga tccctgcccc 2460 acctctcccc aattaagtgc cttcacacag cactggttta atgtttataa acaaaataga 2520 gaaactttcc ttataaataa aagtagtttg cacagaaaaa aaaaaaacac aaccttcggc 2580 cgccccacca agctctgtct ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaactc gagagttcta 2640 <210> 4 <211> 2640 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (951)...(2003) <400> 4 ggaattcgcg gccgcgtcga caaacaagtg agtctcggct ggagtgcagt ggtgcagtgg 60 tgcaatctcg gctcactgca acctccgcct cctgggttca agcgattcct gtgcctcggc 120 cttccgagta gctgggattg caggcgtgtg ccaccacgcc cggctaattt tttttttttt 180 tttttttttt ttgtattttt agtagagaca gggttcttac catgttggcc aggctggtct 240 caaactcctg atctcaagag atgtggcctg cctccggcct cccaaagttc tgggattaca 300 gggtgttgag ccactctgac tcagccaata atgcatattt ttatttccac ctgctttact 360 gtcagaatga gtaagacaga gaagaaatca ttaaacacca ggattctact tgcctgctgg 420 agttttctgc ctgagatgtt aggagaggaa actctcagga tctcagaaaa tcacatctat 480 cacggttggt agaagtagat tctagagtca gccagaatga gttcaagtcc caactgcatg 540 gctttgggca actgactgtc ctctctgagg cccagattcc ctttcggtaa tgtggagatg 600 gcagtgtatc tacctcacaa agcagtggtg agattacaat aaggtaggca tgtaaagcgc 660 caggcacata ctaactgctc aataaatggg aggcatcata attgtatatt attcacagcc 720 caaggaaagt gtagcccaga gagggcaagg aacttgaccc tgaggtcaac acagaaaatc 780 atgtgctggt tgtatgccct ggaagttgtg gagagggagt gttgggtgtc ttcctgggga 840 cctgtcctct gatgggctct tgttccggct aggacccccc aaacccccca ccgagctgga 900 gcctgagccg gagatagagg ggctgctgac accagtgctg gaggctggcg atg tgg 956 Met Trp 1 atg aag gac cct gta gca agg cct ctc agc ccc acg agg ctg cag cca 1004 Met Lys Asp Pro Val Ala Arg Pro Leu Ser Pro Thr Arg Leu Gln Pro 5 10 15 gca ctg cca ccg gag gca cag tcg gtg ccc gag ctg gag gag gtg gca 1052 Ala Leu Pro Pro Glu Ala Gln Ser Val Pro Glu Leu Glu Glu Val Ala 20 25 30 cgg gtg ttg gcg gaa att ccc cgg ccc ctc aaa cgc agg ggc tcc atg 1100 Arg Val Leu Ala Glu Ile Pro Arg Pro Leu Lys Arg Arg Gly Ser Met 35 40 45 50 gag cag gcc cct gct gtg gcc ctg ccc cct acc cac aag aaa cag tac 1148 Glu Gln Ala Pro Ala Val Ala Leu Pro Pro Thr His Lys Lys Gln Tyr 55 60 65 cag cag atc atc agc cgc ctc ttc cat cgt cat ggg ggg cca ggg ccc 1196 Gln Gln Ile Ile Ser Arg Leu Phe His Arg His Gly Gly Pro Gly Pro 70 75 80 ggg ggg cgg agc cag agc tgt ccc cca tca ctg agg gat ctg agg cca 1244 Gly Gly Arg Ser Gln Ser Cys Pro Pro Ser Leu Arg Asp Leu Arg Pro 85 90 95 ggg cag ggc ccc ctg ctc ctg ccc cac cag ctc cca ttc cac cgc ccg 1292 Gly Gln Gly Pro Leu Leu Leu Pro His Gln Leu Pro Phe His Arg Pro 100 105 110 gcc ccg tcc cag agc agc cca cca gag cag ccg cag agc atg gag atg 1340 Ala Pro Ser Gln Ser Ser Pro Pro Glu Gln Pro Gln Ser Met Glu Met 115 120 125 130 cgc tct gtg ctg cgg aag gcg ggc tcc ccg cgc aag gcc cgc cgc gcg 1388 Arg Ser Val Leu Arg Lys Ala Gly Ser Pro Arg Lys Ala Arg Arg Ala 135 140 145 cgc ctc aac cct ctg gtg ctc ctc ctg gac gcg gcg ctg acc ggg gag 1436 Arg Leu Asn Pro Leu Val Leu Leu Leu Asp Ala Ala Leu Thr Gly Glu 150 155 160 ctg gag gtg gtg cag cag gcg gtg aag gag atg aac gac ccg agc cag 1484 Leu Glu Val Val Gln Gln Ala Val Lys Glu Met Asn Asp Pro Ser Gln 165 170 175 ccc aac gag gag ggc atc act gcc ttg cac aac gcc atc tgc ggc gcc 1532 Pro Asn Glu Glu Gly Ile Thr Ala Leu His Asn Ala Ile Cys Gly Ala 180 185 190 aac tac tct atc gtg gat ttc ctc atc acc gcg ggt gcc aat gtc aac 1580 Asn Tyr Ser Ile Val Asp Phe Leu Ile Thr Ala Gly Ala Asn Val Asn 195 200 205 210 tcc ccc gac agc cac ggc tgg aca ccc ttg cac tgc gcg gcg tcg tgc 1628 Ser Pro Asp Ser His Gly Trp Thr Pro Leu His Cys Ala Ala Ser Cys 215 220 225 aac gac aca gtc atc tgc atg gcg ctg gtg cag cac ggc gct gca atc 1676 Asn Asp Thr Val Ile Cys Met Ala Leu Val Gln His Gly Ala Ala Ile 230 235 240 ttc gcc acc acg ctc agc gac ggc gcc acc gcc ttc gag aag tgc gac 1724 Phe Ala Thr Thr Leu Ser Asp Gly Ala Thr Ala Phe Glu Lys Cys Asp 245 250 255 cct tac cgc gag ggt tat gct gac tgc gcc acc tac ctg gca gac gtc 1772 Pro Tyr Arg Glu Gly Tyr Ala Asp Cys Ala Thr Tyr Leu Ala Asp Val 260 265 270 gag cag agt atg ggg ctg atg aac agc ggg gca gtg tac gct ctc tgg 1820 Glu Gln Ser Met Gly Leu Met Asn Ser Gly Ala Val Tyr Ala Leu Trp 275 280 285 290 gac tac agc gcc gag ttc ggg gac gag ctg tcc ttc cgc gag ggc gag 1868 Asp Tyr Ser Ala Glu Phe Gly Asp Glu Leu Ser Phe Arg Glu Gly Glu 295 300 305 tcg gtc acc gtg ctg cgg agg gac ggg ccg gag gag acc gac tgg tgg 1916 Ser Val Thr Val Leu Arg Arg Asp Gly Pro Glu Glu Thr Asp Trp Trp 310 315 320 tgg gcc gcg ctg cac ggc cag gag ggc tac gtg ccg cgg aac tac ttc 1964 Trp Ala Ala Leu His Gly Gln Glu Gly Tyr Val Pro Arg Asn Tyr Phe 325 330 335 ggg ctg ttc ccc agg gtg aag cct caa agg agt aaa gtc tagcaggata 2013 Gly Leu Phe Pro Arg Val Lys Pro Gln Arg Ser Lys Val 340 345 350 gaaggaggtt tctgaggctg acagaaacaa gcattcctgc cttccctcca gacctctccc 2073 tctgtttttt gctgccttta tctgcacccc tcaccctgct ggtggtggtc cttgccaccg 2133 gttctctgtt ctcctggaag tccagggaag aaggagggcc ccagccttaa atttagtaat 2193 ctgccttagc cttgggaggt ctgggaaggg ctggaaatca ctggggacag gaaaccactt 2253 ccttttgcca aatcagatcc cgtccaaagt gcctcccatg cctaccacca tcatcacatc 2313 ccccagcaag ccagccacct gcccagccgg gcctgggatg ggccaccaca ccactggata 2373 ttcctgggag tcactgctga caccatctct cccagcagtc ttggggtctg ggtgggaaac 2433 attggtctct accaggatcc ctgccccacc tctccccaat taagtgcctt cacacagcac 2493 tggtttaatg tttataaaca aaatagagaa actttcctta taaataaaag tagtttgcac 2553 agaaaaaaaa aaaacacaac cttcggccgc cccaccaagc tctgtctcca aaaaaaaaaa 2613 aaaaaaaaaa aaaactcgag agttcta 2640 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer containing BamHI restriction site <400> 5 ggcggatccc tccgcctgcc gcctgtc <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer containing BamHI restriction site <400> 6 gctggatccg gggcaggggc tggagcc <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer containing SalI restriction site <400> 7 caatggtcga catggatctg actcttgctg <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer containing BamHI restriction site <400> 8 gatcaggatc ctcaggccaa gctcctttgt <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer F132 containing EcoRI restriction site <400> 9 gcttcgaatt ctgtgctgcg gaaggcg <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer F132 containing BamHI restriction site <400> 10 gatcaggatc ctcaggccaa gctcctttgt <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oct- consensus sequence of kB sequence <400> 11 tgtcgaatgc aaatcactag aa

【図面の簡単な説明】

【図１】 大腸菌で発現させたＧＳＴおよびＧＳＴ−Ｒ
ＡＩ融合タンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析後ＣＢＢ染
色した様子を示し（レーン１および２）、前記タンパク
を標識したｐ６５でプロッティングした後、オートラジ
オグラフに供した様子を示す（レーン３〜５）。レーン
３は標識量をレーン５の１／１０にしたものである。

【図２】 ヒトの各組織におけるＲＡＩのｍＲＮＡの発
現量の違いを示すノザンブロッティング解析図である。
下部はβ−アクチンの発現量を示す。

【図３】 ＮＦκＢ依存性の転写活性化をＲＡＩが用量
依存的に阻害する様子を示す。レーン９はＲＡＩを発現
させない場合のｐ６５の転写活性化作用をルシフェラー
ゼ活性で示す。この作用はＲＡＩの発現で用量依存的に
阻害されている（レーン１１、レーン１３、１５）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 9/10 11/00 11/00 11/06 11/06 19/02 19/02 29/00 29/00 １０１ １０１ 35/04 35/04 37/06 37/06 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に純粋な形である配列番号１で示
   されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または前記
   ポリペプチドのホモローグ、そのフラグメントまたはそ
   のフラグメントのホモローグからなるポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号１で示されるアミノ酸配列から
   なる請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１記載のポリペプチドからなるＲ
   ｅｌＡ結合性阻害因子。
4. 【請求項４】 請求項３に記載されたポリペプチドをコ
   ードするｃＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   請求項４記載のｃＤＮＡ、またはその配列に選択的にハ
   イブリダイズするフラグメント。
6. 【請求項６】 配列番号３で示される塩基配列を有する
   請求項４記載のｃＤＮＡ、またはその配列に選択的にハ
   イブリダイズするフラグメント。
7. 【請求項７】 請求項４から６のいずれかに記載のｃＤ
   ＮＡが組み込まれた複製または発現ベクター。
8. 【請求項８】 請求項７記載の複製または発現ベクター
   で形質転換された宿主細胞。
9. 【請求項９】 請求項１乃至３のいずれかに記載のポリ
   ペプチドを発現させるための条件下で請求項８記載の宿
   主細胞を培養することを特徴とする該ポリペプチドの製
   造方法。
10. 【請求項１０】 請求項１乃至３のいずれかに記載のポ
    リペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗
    体。
11. 【請求項１１】 請求項１乃至３のいずれかに記載のポ
    リペプチドまたは請求項９記載の抗体またはアンチセン
    ス、および薬学的に許容される賦形剤および／または担
    体を含有することを特徴とする薬学的組成物。
12. 【請求項１２】 請求項１乃至３のいずれかに記載のポ
    リペプチドからなるＲｅｌＡ結合性阻害因子活性を測定
    することを特徴とする成人呼吸困難症候群、喘息、アロ
    グラフト拒絶、炎症性疾患、虚血性疾患、慢性関節リュ
    ーマチを含む自己免疫疾患、ガンの転移浸潤、脈管再狭
    窄およびその他のＮＦκＢに起因する疾患の診断方法。
13. 【請求項１３】 請求項１０記載の抗体を用いることを
    特徴とする成人呼吸困難症候群、喘息、アログラフト拒
    絶、炎症性疾患（炎症性関節炎、脈管炎等）虚血性疾
    患、慢性関節リューマチを含む自己免疫疾患、ガンの転
    移浸潤、脈管再狭窄およびその他のＮＦκＢに起因する
    疾患の診断方法。