JP2000229889A - 抗白髪剤のスクリーニング方法 - Google Patents
抗白髪剤のスクリーニング方法Info
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- JP2000229889A JP2000229889A JP11027705A JP2770599A JP2000229889A JP 2000229889 A JP2000229889 A JP 2000229889A JP 11027705 A JP11027705 A JP 11027705A JP 2770599 A JP2770599 A JP 2770599A JP 2000229889 A JP2000229889 A JP 2000229889A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗白髪剤の新規なスクリーニング方法の提
供。 【解決手段】 抗白髪剤のスクリーニング方法におい
て、被験物質の存在下でメラノサイトを培養し、該培養
されたメラノサイトを、毛乳頭細胞の培養上清と接触せ
しめ、そして該メラノサイトが前記培養上清に向って移
動するか否か又は移動の程度を観察することを特徴とす
る方法。
供。 【解決手段】 抗白髪剤のスクリーニング方法におい
て、被験物質の存在下でメラノサイトを培養し、該培養
されたメラノサイトを、毛乳頭細胞の培養上清と接触せ
しめ、そして該メラノサイトが前記培養上清に向って移
動するか否か又は移動の程度を観察することを特徴とす
る方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は抗白髪剤のスクリー
ニング方法に関する。
ニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】髪の黒色は黒色色素であるメラニンによ
り提供され、メラニンはメラノサイトにおいて、チロシ
ナーゼ等メラニン生合成系の酵素群により生合成され
る。皮膚メラノサイトは皮膚に比較的低密度で分布して
いるのに対して、毛包メラノサイトは毛包の毛乳頭に比
較的高密度で分布している。この原因として、毛乳頭
は、毛乳頭への毛包メラノサイトの遊走現象を惹起して
いると考えられている。抗白髪剤のスクリーニング方法
としては、黒色色素であるメラニンの生合成経路にチロ
シナーゼが関与していることに注目して、チロシナーゼ
の合成を促進する物質を探索する方法が提案されている
（特開平９−２６３５４０号等）。
り提供され、メラニンはメラノサイトにおいて、チロシ
ナーゼ等メラニン生合成系の酵素群により生合成され
る。皮膚メラノサイトは皮膚に比較的低密度で分布して
いるのに対して、毛包メラノサイトは毛包の毛乳頭に比
較的高密度で分布している。この原因として、毛乳頭
は、毛乳頭への毛包メラノサイトの遊走現象を惹起して
いると考えられている。抗白髪剤のスクリーニング方法
としては、黒色色素であるメラニンの生合成経路にチロ
シナーゼが関与していることに注目して、チロシナーゼ
の合成を促進する物質を探索する方法が提案されている
（特開平９−２６３５４０号等）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、毛乳頭への
メラノサイトの遊走現象を利用して、全く新しい抗白髪
剤のスクリニーング方法を提供しようとするものであ
る。
メラノサイトの遊走現象を利用して、全く新しい抗白髪
剤のスクリニーング方法を提供しようとするものであ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、メラノサ
イトの遊走現象を解明すべく研究を行った結果、毛乳頭
細胞をインビトロで培養すれば、メラノサイトの遊走を
惹起する蛋白質性の遊走因子が生産され、それによりメ
ラノサイトの遊走を人為的に生じさせることが出来るこ
とを目出し、さらに、メラノサイトとのインキュベーシ
ョンによりメラノサイトの遊走性を増強する物質は抗白
髪剤としての活性を有することを見出し、本発明を完成
させた。
イトの遊走現象を解明すべく研究を行った結果、毛乳頭
細胞をインビトロで培養すれば、メラノサイトの遊走を
惹起する蛋白質性の遊走因子が生産され、それによりメ
ラノサイトの遊走を人為的に生じさせることが出来るこ
とを目出し、さらに、メラノサイトとのインキュベーシ
ョンによりメラノサイトの遊走性を増強する物質は抗白
髪剤としての活性を有することを見出し、本発明を完成
させた。
【０００５】従って本発明は、抗白髪剤のスクリーニン
グ方法において、被験物質の存在下でメラノサイトを培
養し、該培養されたメラノサイトを、毛乳頭細胞の培養
上清と接触せしめ、そして該メラノサイトが該培養上清
に向って移動するか否か、又は移動の程度を観察するこ
とを特徴とする方法を提供する。
グ方法において、被験物質の存在下でメラノサイトを培
養し、該培養されたメラノサイトを、毛乳頭細胞の培養
上清と接触せしめ、そして該メラノサイトが該培養上清
に向って移動するか否か、又は移動の程度を観察するこ
とを特徴とする方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】毛乳頭細胞の調製、培養及び培養
上清の調製 頭皮切片は形成外科的に正常日本人頭部より切除したも
のを用いた（主に男性後頭部由来）。切除後はＤＭＥＭ
培地等に浸した状態で氷上保存し、なるべくその日のう
ちに処理する。以下の作業は実体顕微鏡観察下、クリー
ンベンチ内で行う。入手した頭皮切片を、鋭いスカルペ
ルを用いて真皮の直下で上下に切り分ける。毛包は脂肪
層に埋っているので、先鋭ピンセットを用いて一本ずつ
引き抜く。抜いた毛包は処理直前までＤＭＥＭ中に置
く。
上清の調製 頭皮切片は形成外科的に正常日本人頭部より切除したも
のを用いた（主に男性後頭部由来）。切除後はＤＭＥＭ
培地等に浸した状態で氷上保存し、なるべくその日のう
ちに処理する。以下の作業は実体顕微鏡観察下、クリー
ンベンチ内で行う。入手した頭皮切片を、鋭いスカルペ
ルを用いて真皮の直下で上下に切り分ける。毛包は脂肪
層に埋っているので、先鋭ピンセットを用いて一本ずつ
引き抜く。抜いた毛包は処理直前までＤＭＥＭ中に置
く。
【０００７】単離したヒト毛包より先鋭ピンセットおよ
び注射針の尖端を用いて毛乳頭を可能なかぎりキズをつ
けずに採取する。採取した毛乳頭は通常の培養シャーレ
に３〜10個ほどの割合で（ＤＭＥＭ）＋１０％（ＦＢ
Ｓ）中に静置する。この状態で２週間、５％ＣＯ2 存在
下で振動を与えずに静置し、着床した毛乳頭よりＯｕｔ
Ｇｒｏｗｔｈしてきた細胞のみを２５cm2 の培養用フラ
スコに継代し、継代回数３〜７の間で培養上清を採取す
る。
び注射針の尖端を用いて毛乳頭を可能なかぎりキズをつ
けずに採取する。採取した毛乳頭は通常の培養シャーレ
に３〜10個ほどの割合で（ＤＭＥＭ）＋１０％（ＦＢ
Ｓ）中に静置する。この状態で２週間、５％ＣＯ2 存在
下で振動を与えずに静置し、着床した毛乳頭よりＯｕｔ
Ｇｒｏｗｔｈしてきた細胞のみを２５cm2 の培養用フラ
スコに継代し、継代回数３〜７の間で培養上清を採取す
る。
【０００８】培養上清の採取に際しては、コンフルエン
ト状態の細胞を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭで最低１時
間リンスしたのち、新しいＤＭＥＭ（ＦＢＳ不含）を加
え、一晩以上（特記しない場合は通常１６〜１８時間）
放置したのち培地（無血清ＤＭＥＭ）を採取し、冷却遠
心機で１００００rpm 、１５分間遠心した上清を分取し
て用いる。培養上清は、調製後すぐに使用することもで
き、あるいは、例えば−１３５℃にて凍結保存し、必要
に応じて解凍して使用することができる。
ト状態の細胞を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭで最低１時
間リンスしたのち、新しいＤＭＥＭ（ＦＢＳ不含）を加
え、一晩以上（特記しない場合は通常１６〜１８時間）
放置したのち培地（無血清ＤＭＥＭ）を採取し、冷却遠
心機で１００００rpm 、１５分間遠心した上清を分取し
て用いる。培養上清は、調製後すぐに使用することもで
き、あるいは、例えば−１３５℃にて凍結保存し、必要
に応じて解凍して使用することができる。
【０００９】毛包メラノサイトの調製 毛乳頭調製の場合と同じ手法で、毛包を単離した後、シ
ャーレに０．５％コラゲナーゼ（タイプＶ，Ｓｉｇｍ
ａ）（初代培養培地にて調製）を０．５ml用意し、そこ
へ毛包を移す。３７℃、３０分間インキュベートする。
実体顕微鏡下でピンセットを用いて結合織毛根鞘をはが
す。単離した毛包はＰＢＳ（−）中に置き、終濃度０．
１％になるようトリプシンを加え、３７℃１０分間、イ
ンキュベートする。
ャーレに０．５％コラゲナーゼ（タイプＶ，Ｓｉｇｍ
ａ）（初代培養培地にて調製）を０．５ml用意し、そこ
へ毛包を移す。３７℃、３０分間インキュベートする。
実体顕微鏡下でピンセットを用いて結合織毛根鞘をはが
す。単離した毛包はＰＢＳ（−）中に置き、終濃度０．
１％になるようトリプシンを加え、３７℃１０分間、イ
ンキュベートする。
【００１０】遠心してトリプシンを除き培地を２ml加え
ピペッティングにより分散させる。コラーゲン・コート
した培養器でＭＧＭ４（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｈ社）＋２％
ＦＣＳ培地中で培養を開始する。細胞は当初外毛根鞘由
来と思われるケラチノサイトが大多数を占めるが、２週
間ほどでその一部が分化して剥がれ始める。そのすき間
に、メラノサイトが出現し２−３週間以内にシャーレの
大部分を占めるようになる。
ピペッティングにより分散させる。コラーゲン・コート
した培養器でＭＧＭ４（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｈ社）＋２％
ＦＣＳ培地中で培養を開始する。細胞は当初外毛根鞘由
来と思われるケラチノサイトが大多数を占めるが、２週
間ほどでその一部が分化して剥がれ始める。そのすき間
に、メラノサイトが出現し２−３週間以内にシャーレの
大部分を占めるようになる。
【００１１】その後、２５cm2 の培養用フラスコに細胞
を移し、以後は２％ＦＣＳ＋ＭＧＭ４とＨＦＭ（森永生
化学研究所）を等量混合し、それに１％のＦＣＳを加え
た培地で培養を継続する。この系で継代後約１ヵ月、約
１×１０6 から４×１０6 の範囲で対数的に増殖する毛
包由来メラノサイトを得ることができる。平均的な細胞
倍加時間は約７日である。皮膚メラノサイトは、Ｃｌｏ
ｎｅｔｉｃｈ社から購入した「ＮＨＥＭ２４８６」とい
う正常皮膚メラノサイトを付属のＭＧＭ３培地で培養し
たものを用いた。
を移し、以後は２％ＦＣＳ＋ＭＧＭ４とＨＦＭ（森永生
化学研究所）を等量混合し、それに１％のＦＣＳを加え
た培地で培養を継続する。この系で継代後約１ヵ月、約
１×１０6 から４×１０6 の範囲で対数的に増殖する毛
包由来メラノサイトを得ることができる。平均的な細胞
倍加時間は約７日である。皮膚メラノサイトは、Ｃｌｏ
ｎｅｔｉｃｈ社から購入した「ＮＨＥＭ２４８６」とい
う正常皮膚メラノサイトを付属のＭＧＭ３培地で培養し
たものを用いた。
【００１２】被験物質の存在下でのメラノサイトの培養 対数増殖期にある皮膚メラノサイト（ＮＨＥＭ２４８
６）を約５×１０5 ／２５cm2 フラスコの濃度で播種
し、ＭＧＭ３培地を用いて培養する。抗白髪効果のある
被験物質（この場合はサンショウ抽出物）を、０．１％
（乾燥残分２ppm 相当）を添加し、１週間培養した。被
験物質非添加の細胞を同様に用意し、対照とした。
６）を約５×１０5 ／２５cm2 フラスコの濃度で播種
し、ＭＧＭ３培地を用いて培養する。抗白髪効果のある
被験物質（この場合はサンショウ抽出物）を、０．１％
（乾燥残分２ppm 相当）を添加し、１週間培養した。被
験物質非添加の細胞を同様に用意し、対照とした。
【００１３】スクリーニング操作 メラノサイトに対する被験物質の遊走性増強作用を調べ
るため、上記のようにして調製した毛乳頭細胞培養上清
と、被験物質により処理したメラノサイトとを接触せし
める。メラノサイトの受動的（拡散による）移動を防止
するため、上記の接触は図１に示すごとく、多孔性膜３
を介して行くのが好ましい。多孔性膜の孔径は、毛包メ
ラノサイトが走化性に基いて通知できる程度のものであ
り、好ましくは８〜１２μｍ程度が好ましい。
るため、上記のようにして調製した毛乳頭細胞培養上清
と、被験物質により処理したメラノサイトとを接触せし
める。メラノサイトの受動的（拡散による）移動を防止
するため、上記の接触は図１に示すごとく、多孔性膜３
を介して行くのが好ましい。多孔性膜の孔径は、毛包メ
ラノサイトが走化性に基いて通知できる程度のものであ
り、好ましくは８〜１２μｍ程度が好ましい。
【００１４】具体的には、図１において、ウエル２を有
するプレート１のウエル中に毛乳頭細胞培養上清を満た
し、その上に多孔性膜３を覆い、その上に前記ウエル２
と適合する位置に貫通孔４を有するプレート５を載置
し、該貫通孔にメラノサイトを含む培養液を入れて静置
する。静置は約３５〜３８℃にて約１４〜２０時間行
う。その後上記プレートから多孔性膜を脱着し、毛乳頭
細胞培養上清に接していた膜面に付着しているメラノサ
イトを顕微鏡により観察すればよい。上記の実験におい
ては、被験物質の不存在下で培養したメラノサイトを対
照として用いて、上記と同様にして膜面に付着したメラ
ノサイトを顕微鏡観察し、両者を比較すればよい。
するプレート１のウエル中に毛乳頭細胞培養上清を満た
し、その上に多孔性膜３を覆い、その上に前記ウエル２
と適合する位置に貫通孔４を有するプレート５を載置
し、該貫通孔にメラノサイトを含む培養液を入れて静置
する。静置は約３５〜３８℃にて約１４〜２０時間行
う。その後上記プレートから多孔性膜を脱着し、毛乳頭
細胞培養上清に接していた膜面に付着しているメラノサ
イトを顕微鏡により観察すればよい。上記の実験におい
ては、被験物質の不存在下で培養したメラノサイトを対
照として用いて、上記と同様にして膜面に付着したメラ
ノサイトを顕微鏡観察し、両者を比較すればよい。
【００１５】
【実施例】次に実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。実施例１ ．メラノサイトの遊走性の確認 （１）ヒト皮膚メラノサイトの調製 ヒト皮膚メラノサイトは、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｈ社より、
ＮＨＥＭ２４８６と称する細胞を購入して使用した。
明する。実施例１ ．メラノサイトの遊走性の確認 （１）ヒト皮膚メラノサイトの調製 ヒト皮膚メラノサイトは、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｈ社より、
ＮＨＥＭ２４８６と称する細胞を購入して使用した。
【００１６】（２）ヒト毛乳頭培養上清の調製 ヒト毛乳頭は形成外科的に正常日本人頭皮より切除した
頭皮から単離した毛包より採取した。ヒト毛包は次のよ
うにして調製した。頭皮切片は形成外科的に正常日本人
頭部より切除したものを用いた（主に男性後頭部由
来）。切除後はＤＭＥＭ培地等に浸した状態で氷上保存
し、その日のうちに処理した。以下の作業は実体顕微鏡
観察下、クリーンベンチ内で行った。入手した頭皮切片
を、鋭いスカルペルを用いて真皮の直下で上下に切り分
け、毛包は脂肪層に埋っているので、先鋭ピンセットを
用いて一本ずつ引き抜き、そして抜いた毛包は処理直前
までＤＭＥＭ中に置いた。
頭皮から単離した毛包より採取した。ヒト毛包は次のよ
うにして調製した。頭皮切片は形成外科的に正常日本人
頭部より切除したものを用いた（主に男性後頭部由
来）。切除後はＤＭＥＭ培地等に浸した状態で氷上保存
し、その日のうちに処理した。以下の作業は実体顕微鏡
観察下、クリーンベンチ内で行った。入手した頭皮切片
を、鋭いスカルペルを用いて真皮の直下で上下に切り分
け、毛包は脂肪層に埋っているので、先鋭ピンセットを
用いて一本ずつ引き抜き、そして抜いた毛包は処理直前
までＤＭＥＭ中に置いた。
【００１７】単離したヒト毛包より先鋭ピンセットおよ
び注射針の尖端を用いて毛乳頭を可能なかぎりキズをつ
けずに採取した。採取した毛乳頭は通常の培養シャーレ
に３〜１０個ほどの割合でＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に
静置した。この状態で２週間、５％ＣＯ2 存在下で振動
を与えずに静置し（静置中に何らかの形で振動を与えた
場合には毛乳頭の着床率が低下する）、着床した毛乳頭
よりＯｕｔＧｒｏｗｔｈしてきた細胞のみを２５cm2 の
培養用フラスコに継代し、継代回数３〜７の間で培養上
清を採取した。
び注射針の尖端を用いて毛乳頭を可能なかぎりキズをつ
けずに採取した。採取した毛乳頭は通常の培養シャーレ
に３〜１０個ほどの割合でＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に
静置した。この状態で２週間、５％ＣＯ2 存在下で振動
を与えずに静置し（静置中に何らかの形で振動を与えた
場合には毛乳頭の着床率が低下する）、着床した毛乳頭
よりＯｕｔＧｒｏｗｔｈしてきた細胞のみを２５cm2 の
培養用フラスコに継代し、継代回数３〜７の間で培養上
清を採取した。
【００１８】培養上清の採取に際しては、コンフルエン
ト状態の細胞を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭで最低１時
間リンスしたのち、新しいＤＭＥＭ（ＦＢＳ不含）を加
え、一晩以上（特記しない場合は通常１６〜１８時間）
放置したのち培地（無血清ＤＭＥＭ）を採取し、冷却遠
心機で１００００rpm 、１５分間遠心した上清を分取し
て用いた。培養上清は、保存状態による遊走活性の差異
を測定する実験を行うときおよび直ちに遊走活性の測定
を行う場合を除いて、分注して−１３５度に保存した。
ト状態の細胞を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭで最低１時
間リンスしたのち、新しいＤＭＥＭ（ＦＢＳ不含）を加
え、一晩以上（特記しない場合は通常１６〜１８時間）
放置したのち培地（無血清ＤＭＥＭ）を採取し、冷却遠
心機で１００００rpm 、１５分間遠心した上清を分取し
て用いた。培養上清は、保存状態による遊走活性の差異
を測定する実験を行うときおよび直ちに遊走活性の測定
を行う場合を除いて、分注して−１３５度に保存した。
【００１９】（３）メラノサイトの遊走性の確認 無血清ＤＭＥＭを用いて採取したヒト毛乳頭細胞の培養
上清を４８穴ケモタキシスチャンバーの下層チャンバー
に２８μＬ入れた。１２μｍ穴のポリカーボネートフィ
ルターを光沢のある面を上にして下層チャンバーを被
い、プラスチックパッキングを被せた後、上層チャンバ
ーを乗せ、下層チャンバー内の液体とフィルターの間に
気泡が存在しないことを確認した後に、上下層チャンバ
ーをしっかりネジ止めした。
上清を４８穴ケモタキシスチャンバーの下層チャンバー
に２８μＬ入れた。１２μｍ穴のポリカーボネートフィ
ルターを光沢のある面を上にして下層チャンバーを被
い、プラスチックパッキングを被せた後、上層チャンバ
ーを乗せ、下層チャンバー内の液体とフィルターの間に
気泡が存在しないことを確認した後に、上下層チャンバ
ーをしっかりネジ止めした。
【００２０】ヒト皮膚メラノサイトは、トリプシン処理
により培養器よりはがし、相当のトリプシンインヒビタ
ーで処理した後に遠心し、無血清ＤＭＥＭに３５，００
０cells ／mLになるように懸濁した。懸濁細胞は使用直
前まで３７℃に放置した。各チャンバーwell（上層チャ
ンバー）ごとに４３μＬの細胞懸濁液を加える。適当な
大きさのタッパーウェアに蒸留水で湿らせたキムタオル
を敷き、チャンバー全体をその中にいれ、タッパーの蓋
をしっかり占めた後に全体を消毒用エタノールで処理
し、３７℃の５％ＣＯ2 インキュベーター中に一晩（平
均１６〜１８時間）放置した。
により培養器よりはがし、相当のトリプシンインヒビタ
ーで処理した後に遠心し、無血清ＤＭＥＭに３５，００
０cells ／mLになるように懸濁した。懸濁細胞は使用直
前まで３７℃に放置した。各チャンバーwell（上層チャ
ンバー）ごとに４３μＬの細胞懸濁液を加える。適当な
大きさのタッパーウェアに蒸留水で湿らせたキムタオル
を敷き、チャンバー全体をその中にいれ、タッパーの蓋
をしっかり占めた後に全体を消毒用エタノールで処理
し、３７℃の５％ＣＯ2 インキュベーター中に一晩（平
均１６〜１８時間）放置した。
【００２１】翌日、上層チャンバーをはずし、フィルタ
ーを７０％エタノール中に７分浸して細胞を固定した。
ついで蒸留水中に７分浸し、ケモタキシスチャンバーに
付属のスクレーパーで、移動していない細胞を除去した
（光沢面の細胞）。フィルターを室温で約１時間乾燥さ
せた後に、５％ＧＩＭＺＡ液中に２０分間浸し、蒸留水
で洗浄した後フィルターをふたたび乾燥させた。
ーを７０％エタノール中に７分浸して細胞を固定した。
ついで蒸留水中に７分浸し、ケモタキシスチャンバーに
付属のスクレーパーで、移動していない細胞を除去した
（光沢面の細胞）。フィルターを室温で約１時間乾燥さ
せた後に、５％ＧＩＭＺＡ液中に２０分間浸し、蒸留水
で洗浄した後フィルターをふたたび乾燥させた。
【００２２】フィルター全体をスライドグラスに封入し
て、移動した細胞の数を倒立顕微鏡下で計数した。下層
チャンバー内の液体によって遊走をした細胞は核が青紫
色に呈色しているので、その数を各wellごとの遊走細胞
数とした。各試験ごとのＮは最低３wellとり、平均値を
その試験の遊走活性として計算した。また、必要に応じ
てフィルター表面を写真にとった。対照として、ヒト毛
乳頭細胞培養上清の代りに新鮮な培地を用いて上記と同
じ実験を行った。
て、移動した細胞の数を倒立顕微鏡下で計数した。下層
チャンバー内の液体によって遊走をした細胞は核が青紫
色に呈色しているので、その数を各wellごとの遊走細胞
数とした。各試験ごとのＮは最低３wellとり、平均値を
その試験の遊走活性として計算した。また、必要に応じ
てフィルター表面を写真にとった。対照として、ヒト毛
乳頭細胞培養上清の代りに新鮮な培地を用いて上記と同
じ実験を行った。
【００２３】その結果を図１及び図２に示す。これらの
写真において、円い点はフィルターの孔であり、長円形
の無い点はメラノサイトのギームサ染色された核を示
す。図１に示すごとく、ヒト毛乳頭培養上清を使用した
場合には上層に存在したメラノサイトが多孔性膜の膜を
通って毛乳頭細胞の培養上清に移行し、該培養上清に接
するフィルター面にメラノサイトが付着したのに対し
て、図２に示すごとく、新鮮な培地を用いた場合にはメ
ラノサイトは移動せず、この結果、毛乳頭細胞の培養上
清にはメラノサイトを誘引する物質が生産されているこ
とが明らかになった。
写真において、円い点はフィルターの孔であり、長円形
の無い点はメラノサイトのギームサ染色された核を示
す。図１に示すごとく、ヒト毛乳頭培養上清を使用した
場合には上層に存在したメラノサイトが多孔性膜の膜を
通って毛乳頭細胞の培養上清に移行し、該培養上清に接
するフィルター面にメラノサイトが付着したのに対し
て、図２に示すごとく、新鮮な培地を用いた場合にはメ
ラノサイトは移動せず、この結果、毛乳頭細胞の培養上
清にはメラノサイトを誘引する物質が生産されているこ
とが明らかになった。
【００２４】実施例２．抗白髪剤のスクリーニング （１）サンショウ抽出物の調製 サンショウの果皮５００ｇを室温で１週間エタノール浸
漬し、この抽出液中のエタノールを留去して９．７ｇの
サンショウ抽出物を得た。
漬し、この抽出液中のエタノールを留去して９．７ｇの
サンショウ抽出物を得た。
【００２５】（２）サンショウ抽出物によるメラノサイ
トの処理 ２個の２５cm2 フラスコに同じ条件でヒト皮膚メラノサ
イト（ＮＨＥＭ２４８６；白人皮膚由来；Ｃｌｏｎｅｔ
ｉｃｈ社より入手）をセミコンフルエント（約５×１０
5 細胞／フラスコ）になるように播種し、一方のフラス
コにはサンショウ抽出物０．１％（乾燥残分２ppm 相
当）を添加し、他方のフラスコにはサンショウ抽出物を
添加しないで、１週間培養した。
トの処理 ２個の２５cm2 フラスコに同じ条件でヒト皮膚メラノサ
イト（ＮＨＥＭ２４８６；白人皮膚由来；Ｃｌｏｎｅｔ
ｉｃｈ社より入手）をセミコンフルエント（約５×１０
5 細胞／フラスコ）になるように播種し、一方のフラス
コにはサンショウ抽出物０．１％（乾燥残分２ppm 相
当）を添加し、他方のフラスコにはサンショウ抽出物を
添加しないで、１週間培養した。
【００２６】次に、実施例１に記載したのと同じ方法に
より、上記ヒト皮膚メラノサイトの遊走能力を測定し
た。その結果、サンショウ抽出物により処理しなかった
皮膚メラノサイトの遊走能力（多孔性膜を通過した細胞
数）を１００とした場合、サンショウ抽出物により処理
した皮膚メラノサイトの遊走能力（多孔性膜を通過した
細胞数）は約２３０であり、サンショウ抽出物はメラノ
サイト遊走能力を増強することが確認された。結果を図
６に示す。
より、上記ヒト皮膚メラノサイトの遊走能力を測定し
た。その結果、サンショウ抽出物により処理しなかった
皮膚メラノサイトの遊走能力（多孔性膜を通過した細胞
数）を１００とした場合、サンショウ抽出物により処理
した皮膚メラノサイトの遊走能力（多孔性膜を通過した
細胞数）は約２３０であり、サンショウ抽出物はメラノ
サイト遊走能力を増強することが確認された。結果を図
６に示す。
【００２７】（３）ヒト皮膚メラノサイトの増殖に対す
るサンショウ抽出物の効果 ヒト皮膚メラノサイト（ＮＨＥＭ２４８６；白人皮膚由
来；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｈ社より入手）を、ＭＧＭ３培地
中で、９６穴培養プレートにおいて１×１０4細胞／ウ
エルの濃度で２日間培養し、ＭＢＭ２（Ｃｌｏｎｅｔｉ
ｃｈ社に２％ＦＢＳ，５μｇ／mlインシュリン、０．５
μｇ／mlヒドロコーチゾン、５０μｇ／mlゲンタマイシ
ン、５０μｇ／mlアンホテリシン−Ｂを添加したもの）
中で２日間デプレートし、サンショウ抽出物を種々の量
（乾燥残分濃度として０〜１０ppm)添加し、さらに２日
間培養した。サンショウ抽出物を添加しなかった場合
（添加量０ppm)のメラノサイトの数を１００とした場
合、サンショウ抽出物を添加して培養したメラノサイト
の相対数は図３に示す通りとなり、サンショウ抽出物に
よるメラノサイト増殖促進効果が認められた。
るサンショウ抽出物の効果 ヒト皮膚メラノサイト（ＮＨＥＭ２４８６；白人皮膚由
来；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｈ社より入手）を、ＭＧＭ３培地
中で、９６穴培養プレートにおいて１×１０4細胞／ウ
エルの濃度で２日間培養し、ＭＢＭ２（Ｃｌｏｎｅｔｉ
ｃｈ社に２％ＦＢＳ，５μｇ／mlインシュリン、０．５
μｇ／mlヒドロコーチゾン、５０μｇ／mlゲンタマイシ
ン、５０μｇ／mlアンホテリシン−Ｂを添加したもの）
中で２日間デプレートし、サンショウ抽出物を種々の量
（乾燥残分濃度として０〜１０ppm)添加し、さらに２日
間培養した。サンショウ抽出物を添加しなかった場合
（添加量０ppm)のメラノサイトの数を１００とした場
合、サンショウ抽出物を添加して培養したメラノサイト
の相対数は図３に示す通りとなり、サンショウ抽出物に
よるメラノサイト増殖促進効果が認められた。
【００２８】（４）ヒト毛包メラノサイトのチロシナー
ゼ活性に対するサンショウ抽出物の効果 ヒトの頭皮からヒト毛包メラノサイトを次のようにして
調製した。毛乳頭調製の場合と同じ手法で、毛包を単離
した後、シャーレに０．５％コラゲナーゼ（タイプＶ，
Ｓｉｇｍａ）（初代培養培地にて調製）を０．５ml用意
し、そこへ毛包を移した。３７℃、３０分間インキュベ
ートした。実体顕微鏡下でピンセットを用いて結合織毛
根鞘をはがした。単離した毛包はＰＢＳ（−）中に置
き、終濃度０．１％になるようトリプシンを加え、３７
℃１０分間インキュベートした。遠心してトリプシンを
除き培地を２ml加えピペッティングにより分散させた。
コラーゲン・コートした培養器でＭＧＭ４（Ｃｌｏｎｅ
ｔｉｃｈ社）＋２％ＦＣＳ培地中で培養を開始した。
ゼ活性に対するサンショウ抽出物の効果 ヒトの頭皮からヒト毛包メラノサイトを次のようにして
調製した。毛乳頭調製の場合と同じ手法で、毛包を単離
した後、シャーレに０．５％コラゲナーゼ（タイプＶ，
Ｓｉｇｍａ）（初代培養培地にて調製）を０．５ml用意
し、そこへ毛包を移した。３７℃、３０分間インキュベ
ートした。実体顕微鏡下でピンセットを用いて結合織毛
根鞘をはがした。単離した毛包はＰＢＳ（−）中に置
き、終濃度０．１％になるようトリプシンを加え、３７
℃１０分間インキュベートした。遠心してトリプシンを
除き培地を２ml加えピペッティングにより分散させた。
コラーゲン・コートした培養器でＭＧＭ４（Ｃｌｏｎｅ
ｔｉｃｈ社）＋２％ＦＣＳ培地中で培養を開始した。
【００２９】細胞は当初外毛根鞘由来と思われるケラチ
ノサイトが大多数を占めるが、２週間ほどでその一部が
分化して剥がれ始めた。そのすき間に、メラノサイトが
出現し２−３週間以内にシャーレの大部分を占めるよう
になった。その後、２５cm2の培養用フラスコに細胞を
移し、以後は２％ＦＣＳ＋ＭＧＭ４とＨＦＭ（森永生化
学研究所）を等量混合し、それに１％のＦＣＳを加えた
培地で培養を継続した。この系で継代後約１ヵ月培養
し、約１×１０6 から４×１０6 の範囲で対数的に増殖
する毛包由来メラノサイトを得ることができた。平均的
な細胞倍加時間は約７日である。
ノサイトが大多数を占めるが、２週間ほどでその一部が
分化して剥がれ始めた。そのすき間に、メラノサイトが
出現し２−３週間以内にシャーレの大部分を占めるよう
になった。その後、２５cm2の培養用フラスコに細胞を
移し、以後は２％ＦＣＳ＋ＭＧＭ４とＨＦＭ（森永生化
学研究所）を等量混合し、それに１％のＦＣＳを加えた
培地で培養を継続した。この系で継代後約１ヵ月培養
し、約１×１０6 から４×１０6 の範囲で対数的に増殖
する毛包由来メラノサイトを得ることができた。平均的
な細胞倍加時間は約７日である。
【００３０】９６穴培養プレート中でＮＨＥＭ２４８６
培地に６０００細胞／ウエルのヒト毛包メラノサイトを
播種し、２日間培養した後、ＭＢＭ２培地（Ｃｌｏｎｅ
ｔｉｃｈ社）、２％ＦＢＳ，５μｇ／mlインシュリン、
０．５μｇ／mlヒドロコーチゾン、５０μｇ／mlゲンタ
マイシン、５０μｇ／mlアンホテリシン−Ｂを添加した
もの）中で２日間デプレートし、所望定量（０ppm(無添
加）〜２０ppm)のサンション抽出物を添加してさらに２
日間培養し、チロシナーゼ活性を測定した。
培地に６０００細胞／ウエルのヒト毛包メラノサイトを
播種し、２日間培養した後、ＭＢＭ２培地（Ｃｌｏｎｅ
ｔｉｃｈ社）、２％ＦＢＳ，５μｇ／mlインシュリン、
０．５μｇ／mlヒドロコーチゾン、５０μｇ／mlゲンタ
マイシン、５０μｇ／mlアンホテリシン−Ｂを添加した
もの）中で２日間デプレートし、所望定量（０ppm(無添
加）〜２０ppm)のサンション抽出物を添加してさらに２
日間培養し、チロシナーゼ活性を測定した。
【００３１】チロシナーゼの測定は次のようにして行っ
た。培養液を除去した残りの細胞をＰＢＳ（−）で２回
洗浄し、細胞に４５μｌの１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０／ＰＢＳ（−１）を添加し、３０秒間振動を与えた
後、５μｌの１０mM ＤＬ−ＤＰＡ／ＰＢＳ（−）−Ｔ
ｒｉｔｏｎを添加し、３７℃にて１時間インキュベート
した後４７５nmの吸光度を測定した。サンショウ抽出物
無添加（０ppm)の場合のチロシナーゼ活性を１００とし
た場合の、サンショウ抽出物添加によるチロシナーゼの
相対活性を図５に示す。この表から明らかなように、サ
ンショウ抽出物は、メラニン生合成系の酵素であるチロ
シナーゼの活性を増強せしめた。
た。培養液を除去した残りの細胞をＰＢＳ（−）で２回
洗浄し、細胞に４５μｌの１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０／ＰＢＳ（−１）を添加し、３０秒間振動を与えた
後、５μｌの１０mM ＤＬ−ＤＰＡ／ＰＢＳ（−）−Ｔ
ｒｉｔｏｎを添加し、３７℃にて１時間インキュベート
した後４７５nmの吸光度を測定した。サンショウ抽出物
無添加（０ppm)の場合のチロシナーゼ活性を１００とし
た場合の、サンショウ抽出物添加によるチロシナーゼの
相対活性を図５に示す。この表から明らかなように、サ
ンショウ抽出物は、メラニン生合成系の酵素であるチロ
シナーゼの活性を増強せしめた。
【００３２】（５）サンショウ抽出物の白髪防止効果 被験者として、各試料毎に白髪のある４０〜６０歳の男
女４０名に１日２回（朝、夜）連続４カ月間、表１記載
のサンショウ抽出物を配合したローション、及びサンシ
ョウ抽出物無添加のローション（対照）をハーフヘッド
法で左右頭皮に別々に使用させ、塗布部位の状態を試験
前後で比較し、白髪防止効果を検討した。このローショ
ンを毎日塗布しながら白髪の発生を防止する割合を、塗
布開始前及び塗布開始後４カ月における頭頂部の毛髪１
０００本あたりの白髪の本数を数えた。
女４０名に１日２回（朝、夜）連続４カ月間、表１記載
のサンショウ抽出物を配合したローション、及びサンシ
ョウ抽出物無添加のローション（対照）をハーフヘッド
法で左右頭皮に別々に使用させ、塗布部位の状態を試験
前後で比較し、白髪防止効果を検討した。このローショ
ンを毎日塗布しながら白髪の発生を防止する割合を、塗
布開始前及び塗布開始後４カ月における頭頂部の毛髪１
０００本あたりの白髪の本数を数えた。
【００３３】
【表１】
【００３４】製法 エチルアルコールにサンショウ抽出物、ポリビニルピロ
リドン／酢酸ビニル共重合体、防腐剤及び香料を加えて
均一に溶解した。これに予め溶解しておいた水相部（精
製水、シリコーン誘導体、グリセリン）を添加して溶解
した。
リドン／酢酸ビニル共重合体、防腐剤及び香料を加えて
均一に溶解した。これに予め溶解しておいた水相部（精
製水、シリコーン誘導体、グリセリン）を添加して溶解
した。
【００３５】
【表２】 この試験の結果を次の表に示す。
【００３６】
【表３】 以上の通り、被験物質のメラノサイトの遊走能力増強作
用と抗白髪性とはよく相関しており、被験物質のメラノ
サイト遊走能力増強作用を測定することにより抗白髪剤
のスクリーニングが可能であることが明らかとなった。
用と抗白髪性とはよく相関しており、被験物質のメラノ
サイト遊走能力増強作用を測定することにより抗白髪剤
のスクリーニングが可能であることが明らかとなった。
【図１】図１は、本発明の方法に使用する装置の模式図
である。
である。
【図２】図２は、メラノサイトが毛乳頭細胞培養上清に
対して遊走性を示すことを表わす顕微鏡写真であり、生
物の形態を表わす図面代用写真である。
対して遊走性を示すことを表わす顕微鏡写真であり、生
物の形態を表わす図面代用写真である。
【図３】図３は、メラノサイトが新鮮な培地に対しては
遊走性を示さないことを表わす顕微鏡写真であって、生
物の形態を表わす図面代用写真である。
遊走性を示さないことを表わす顕微鏡写真であって、生
物の形態を表わす図面代用写真である。
【図４】図４は、皮膚メラノサイトの増殖に対するサン
ショウ抽出物の効果を示すグラフである。
ショウ抽出物の効果を示すグラフである。
【図５】図５は、毛包メラノサイトのチロシナーゼ生産
に対するサンション抽出物の効果を示すグラフである。
に対するサンション抽出物の効果を示すグラフである。
【図６】図６は、サンショウ抽出物のメラノサイト遊走
増張効果を示すグラフである。
増張効果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石野 章博 神奈川県横浜市港北区新羽町1050 株式会 社資生堂第一リサーチセンター内 (72)発明者 守屋 佳樹 神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１ 株 式会社資生堂第二リサーチセンター内 (72)発明者 山瀬 由記 神奈川県横浜市港北区新羽町1050 株式会 社資生堂第一リサーチセンター内 (72)発明者 辻 善春 神奈川県横浜市港北区新羽町1050 株式会 社資生堂第一リサーチセンター内 (72)発明者 小島 称央 東京都中央区銀座７−５−５ 株式会社資 生堂内 (72)発明者 伊福 欧二 神奈川県横浜市港北区新羽町1050 株式会 社資生堂第一リサーチセンター内 (72)発明者 田中 直美 神奈川県横浜市港北区新羽町1050 株式会 社資生堂第一リサーチセンター内 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA14 BB04 BB20 CB01 CB16 FA16 GC01 GC30
Claims (2)
- 【請求項１】 抗白髪剤のスクリーニング方法におい
て、被験物質の存在下でメラノサイトを培養し、該培養
されたメラノサイトを、毛乳頭細胞の培養上清と接触せ
しめ、そして該メラノサイトが前記培養上清に向って移
動するか否か又は移動の程度を観察することを特徴とす
る方法。 - 【請求項２】 前記培養されたメラノサイトと毛乳頭細
胞の培養上清とを、多孔性膜を介して接触せしめ、該培
養されたメラノサイトが該膜の孔を通して培養上清側に
移行するか否か又は移行の程度を観察する、請求項２に
記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11027705A JP2000229889A (ja) | 1999-02-04 | 1999-02-04 | 抗白髪剤のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11027705A JP2000229889A (ja) | 1999-02-04 | 1999-02-04 | 抗白髪剤のスクリーニング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000229889A true JP2000229889A (ja) | 2000-08-22 |
Family
ID=12228418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11027705A Pending JP2000229889A (ja) | 1999-02-04 | 1999-02-04 | 抗白髪剤のスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000229889A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020005193A (ko) * | 2000-06-22 | 2002-01-17 | 김정철 | 백모치료제 스크리닝 방법 |
| US7985537B2 (en) | 2007-06-12 | 2011-07-26 | Aderans Research Institute, Inc. | Methods for determining the hair follicle inductive properties of a composition |
| US9023380B2 (en) | 2005-11-22 | 2015-05-05 | Aderans Research Institute, Inc. | Hair follicle graft from tissue engineered skin |
| WO2016085304A1 (ko) * | 2014-11-28 | 2016-06-02 | (주)아모레퍼시픽 | 멜라닌 세포주 계대배양계 및 이를 이용한 노화 수준 판단, 미용 정보 제공, 또는 스크리닝 방법 |
| JP2019004748A (ja) * | 2017-06-23 | 2019-01-17 | ポーラ化成工業株式会社 | 色素沈着抑制剤のスクリーニング方法 |
-
1999
- 1999-02-04 JP JP11027705A patent/JP2000229889A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020005193A (ko) * | 2000-06-22 | 2002-01-17 | 김정철 | 백모치료제 스크리닝 방법 |
| US9023380B2 (en) | 2005-11-22 | 2015-05-05 | Aderans Research Institute, Inc. | Hair follicle graft from tissue engineered skin |
| US7985537B2 (en) | 2007-06-12 | 2011-07-26 | Aderans Research Institute, Inc. | Methods for determining the hair follicle inductive properties of a composition |
| WO2016085304A1 (ko) * | 2014-11-28 | 2016-06-02 | (주)아모레퍼시픽 | 멜라닌 세포주 계대배양계 및 이를 이용한 노화 수준 판단, 미용 정보 제공, 또는 스크리닝 방법 |
| JP2019004748A (ja) * | 2017-06-23 | 2019-01-17 | ポーラ化成工業株式会社 | 色素沈着抑制剤のスクリーニング方法 |
| JP7021734B2 (ja) | 2017-06-23 | 2022-02-17 | ポーラ化成工業株式会社 | 色素沈着抑制剤のスクリーニング方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20061031 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061228 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070130 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20070529 |