JP2000236880A

JP2000236880A - 蛋白質変異体の生産方法、蛋白質変異体ライブラリーの作製方法、および蛋白質変異体をコードするｃＤＮＡのライブラリーの作製方法

Info

Publication number: JP2000236880A
Application number: JP11041538A
Authority: JP
Inventors: Toru Imamura; 亨今村; Shinko Asada; 眞弘浅田; Osamu Suzuki; 理鈴木; Shuichi Oka; 修一岡; Atsuko Yoneda; 敦子米田
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1999-02-19
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2000-09-05
Anticipated expiration: 2019-02-19
Also published as: JP3790810B2

Abstract

(57)【要約】【課題】蛋白質分子一次構造上の任意の部位へのペプ
チドの挿入による変異体蛋白質のライブラリーを構築す
ること、及び当該ライブラリーから所望の変異体蛋白質
を選択することを目的とする。【解決手段】蛋白質の一次構造上の無作為な部位にア
ミノ酸またはペプチドが導入された変異体をコードする
cDNAのライブラリーを作製し、このライブラリー中のcD
NAがコードしている蛋白質変異体を発現させることを特
徴とする、蛋白質変異体のライブラリーを作製する方
法。蛋白質の一次構造上の無作為な部位にアミノ酸また
はペプチドが導入された変異体をコードするcDNAのライ
ブラリーを作製し、このライブラリー中のcDNAがコード
している蛋白質変異体を発現させ、目的の蛋白質変異体
を発現している細胞を選択し、この細胞に蛋白質変異体
を産生させることを特徴とする、蛋白質変異体を生産す
る方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質の一次構造
上の無作為な部位に任意のアミノ酸またはペプチドを導
入した変異蛋白質の生産方法、当該変異蛋白質のライブ
ラリーを作製する方法、および当該変異蛋白質をコード
するcDNAのライブラリーを作製する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アミノ酸の直鎖状重合体である蛋白質の
一次構造の改変には、従来、化学的手法と並んで遺伝子
工学的手法が用いられてきた。遺伝子工学的手法を用い
ての蛋白質構造の改変には、DNA構造上に塩基の置換、
欠失、導入を生じせしめ、これを翻訳させることによっ
て、アミノ酸の置換、欠失、導入をもたらすことが一般
的に行われてきた。しかし、このような変異の導入は、
意図した特定の部位に、特定の変異をもたらすことしか
できず、意図しない無作為な部位に導入することはでき
なかった。

【０００３】また、従来の技術では、各種の変異蛋白質
を作成するためには、それぞれをコードする cDNA を個
別に作成、単離しなければならなかった。近年、蛋白質
構造活性相関の研究によって機能ドメインの解明が進
み、任意の蛋白質の一次構造上に様々な機能を有する異
種のペプチドを導入する技術が開発されたが、蛋白質の
機能改変をもたらす最適な導入位置を決定するために
は、試行錯誤によらなければならなかった。

【０００４】さらに、近年、糖蛋白質の糖鎖が蛋白質部
分の機能に与える重要性が理解されるに伴い、既知蛋白
質の一次構造上に糖鎖を付加されうる配列を有するペプ
チドを導入して糖鎖付加を生じせしめる技術が開発され
たが、該糖鎖付加配列アミノ酸の導入位置の最適化につ
いては試行錯誤によるしかなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、機能
改変につながる構造活性相関情報の無い蛋白質、もしく
は機能改変が予測できない蛋白質の構造改変を行って改
変した機能を有する蛋白質を取得するために、一次構造
上の無作為な部位に任意のアミノ酸またはペプチドを導
入した蛋白質変異体ライブラリーを製造する技術を提供
することにある。さらに、この変異体ライブラリーの中
から、望ましい機能に変化した蛋白質を選択することに
より、意図した機能改変蛋白質を得るためのアミノ酸ま
たはペプチド導入部位の最適化を図る技術を提供するこ
とにある。

【０００６】本発明の別の課題は、機能改変につながる
構造活性相関情報の無い蛋白質、もしくは機能改変が予
測できない蛋白質に糖鎖修飾を導入して改変した機能を
有する蛋白質を取得するために、一次構造上の無作為な
部位に糖鎖修飾アミノ酸またはペプチドを導入した糖鎖
修飾蛋白質変異体ライブラリーを製造する技術を提供す
ることにある。さらに、この糖鎖修飾変異体ライブラリ
ーの中から、望ましい機能に変化した糖蛋白質を選択す
ることにより、意図した機能改変糖蛋白質を得るための
糖鎖修飾アミノ酸またはペプチド導入部位の最適化を図
る技術を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、蛋白質をコードす
るcDNAを含む環状プラスミドを無作為な位置で一カ所切
断し、この部位にアミノ酸またはペプチドをコードする
DNAを導入することによって、翻訳された蛋白質の一次
構造上の任意の位置にアミノ酸またはペプチドを導入す
る技術を完成した。これによって、蛋白質の一次構造上
の様々な部位にアミノ酸またはペプチドが導入された変
異体ライブラリーを構築することが可能となった。

【０００８】本発明者らは、当該技術を分泌型単純蛋白
質 secFGF-1 に適用し、各種糖鎖付加配列アミノ酸を導
入することによって、secFGF-1を糖鎖修飾された蛋白質
として生産することに成功した。本明細書において、
「FGF」とは、繊維芽細胞増殖因子（fibroblast growth
factor）をいう。さらに、本発明者らは、当該ライブ
ラリーより、機能改変 secFGF-1 を選択する技術をも同
時に完成し、その結果、蛋白質への変異導入による機能
改変をシングルステップで完成する手法を完成した。本
発明はこのような知見に基づいて完成されたものであ
る。

【０００９】すなわち、本発明は、蛋白質をコードする
cDNAを環状プラスミドに組み込み、この環状プラスミド
を無作為な位置で一カ所切断し、この切断部位に、アミ
ノ酸またはペプチドをコードするDNAを導入することを
特徴とする、蛋白質の一次構造上の無作為な部位にアミ
ノ酸またはペプチドが導入された変異体をコードするcD
NAのライブラリーを作製する方法を提供する。本明細書
において、「蛋白質の一次構造上の無作為な部位にアミ
ノ酸またはペプチドが導入された変異体をコードするcD
NAのライブラリー」とは、蛋白質の一次構造上の無作為
な部位にアミノ酸またはペプチドが導入された種々の変
異体をコードするcDNAの集団をいい、これらのcDNAは、
通常、プラスミドやウイルスなどのベクターに組み込ま
れた状態にある。

【００１０】本発明のcDNAライブラリー作製法は、以下
の工程：（ａ）蛋白質をコードするcDNAを環状プラスミドに組み
込む工程、（ｂ）前記環状プラスミドを無作為な位置で
一カ所切断する工程、（ｃ）アミノ酸またはペプチドを
コードするDNAを前記プラスミドの切断部位に導入する
が、ここで、アミノ酸またはペプチドをコードするDNA
の５'末端側および／または３'末端側に、追加のヌクレ
オチドを付加することにより、アミノ酸またはペプチド
のフレームがそれを導入される蛋白質のフレームと一致
するクローンを取得できるようにする工程、（ｄ）前記
アミノ酸またはペプチドをコードするDNAを導入された
プラスミドを宿主細胞に導入して、形質転換体を得る工
程、（ｅ）前記形質転換体から、プラスミドを回収する
工程、（ｆ）回収されたプラスミドから、アミノ酸また
はペプチドをコードするDNAと蛋白質をコードするcDNA
とを含む領域のDNAを切り出す工程、（ｇ）切り出したD
NAを発現ベクターに組み込む工程、（ｈ）前記発現ベク
ターを宿主細胞に導入する工程、および（ｉ）前記宿主
細胞において、蛋白質変異体を発現させる工程を含んで
もよい。また、（ｃ）の工程で、アミノ酸またはペプチ
ドをコードするDNAを、選択マーカー遺伝子と連結した
状態で、プラスミドの切断部位に導入し、（ｄ）の工程
で、選択マーカー遺伝子の発現に基づいて形質転換体を
選別し、（ｆ）の工程で、選択マーカー遺伝子を除去す
るとよい。

【００１１】また、本発明は、蛋白質の一次構造上の無
作為な部位にアミノ酸またはペプチドが導入された変異
体をコードするcDNAのライブラリーを作製し、このライ
ブラリー中のcDNAがコードしている蛋白質変異体を発現
させることを特徴とする、蛋白質変異体のライブラリー
を作製する方法を提供する。本明細書において、「蛋白
質変異体のライブラリー」とは、種々の蛋白質変異体の
集団をいう。

【００１２】さらに、本発明は、蛋白質の一次構造上の
無作為な部位にアミノ酸またはペプチドが導入された変
異体をコードするcDNAのライブラリーを作製し、このラ
イブラリー中のcDNAがコードしている蛋白質変異体を発
現させ、目的の蛋白質変異体を発現している細胞を選択
し、この細胞に蛋白質変異体を産生させることを特徴と
する、蛋白質変異体を生産する方法を提供する。本発明
の蛋白質変異体生産法は、以下の工程：（ａ）蛋白質に特異的な応答を示す細胞株を用意する工
程、（ｂ）蛋白質の一次構造上の無作為な部位にアミノ
酸またはペプチドが導入された変異体をコードするcDNA
を組み込んだ発現ベクターを前記細胞株に導入すること
により、cDNAライブラリーを作製する工程、（ｃ）前記
応答を検出して、応答を示す細胞を選択する工程、およ
び（ｄ）選択した細胞を培養して、培養液および／また
は培養細胞から目的の蛋白質変異体を回収する工程を含
んでもよい。

【００１３】変異を受ける蛋白質としては、いかなる蛋
白質であってもよい。一例として、FGF ファミリーに属
する因子およびその近縁の因子、ヘパリン結合性増殖因
子ファミリーに属する因子およびその近縁の因子を挙げ
ることができ、より具体的には、以下の（ａ）〜（ｆ）
の蛋白質を挙げることができる。（ａ）配列番号２(FGF-1a)のアミノ酸配列からなる蛋白
質。（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたア
ミノ酸配列からなり、FGF-1活性を有する蛋白質。

【００１４】（ｃ）配列番号４(FGF-6/1a)のアミノ酸配
列からなる蛋白質。（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたア
ミノ酸配列からなり、FGF-6/1a活性を有する蛋白質。（ｅ）配列番号６(secFGF-1)のアミノ酸配列からなる蛋
白質。（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたア
ミノ酸配列からなり、secFGF-1活性を有する蛋白質。

【００１５】導入されるアミノ酸またはペプチドとして
は、いかなるアミノ酸またはアミノ酸２個以上よりなる
いかなるペプチドであってもよいが、特に、機能性ペプ
チドが、蛋白質機能の改変を期待できるので、好適であ
る。例えば、糖鎖の付加を受けることができるアミノ酸
またはペプチドを導入することによって、糖鎖付加型変
異体を作成することができる。糖鎖の付加を受けること
ができるペプチドとしては、Asn-X-Ser, Asn-X-Thr,Y-T
hr-Pro-Z-Pro, Ser-Gly (X, Y, Z は任意のアミノ酸）
などが挙げられ、これらを含む多種多様なペプチドが含
まれる。

【００１６】糖鎖が硫酸化多糖またはグリコサミノグリ
カンである場合には、糖鎖の付加を受けることができる
ペプチドはプロテオグリカンコアタンパク質またはその
一部分であるとよい。糖鎖がN-型糖鎖（アスパラギン結
合型糖鎖）である場合には、糖鎖の付加を受けることが
できるペプチドがN-型糖鎖付加アミノ酸配列を含むペプ
チドであるとよい。糖鎖がO-型糖鎖（セリン・スレオニ
ン結合型糖鎖）である場合には、糖鎖の付加を受けるこ
とができるペプチドがO-型糖鎖付加アミノ酸配列を含む
ペプチドであるとよい。

【００１７】さらにまた、本発明は、上記の蛋白質変異
体生産法により生産することができる新規な蛋白質変異
体を提供する。蛋白質変異体としては、FGFファミリー
に属する因子またはその近縁の因子の変異体、ヘパリン
結合性増殖因子ファミリーに属する因子またはその近縁
の因子の変異体などを挙げることができる。例えば、上
記(a)〜(f)の蛋白質の変異体、具体的には、配列番号２
５、２７、２９、３１、３３または３５のアミノ酸配列
を含むFGF-1変異体を挙げることができる。以下、本発
明を詳細に説明する。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明において、アミノ酸または
ペプチドを導入する蛋白質としてはいかなる蛋白質であ
ってもよい。また、導入するアミノ酸またはペプチドと
してはいかなるアミノ酸またはペプチドであってもよ
い。以下、具体例として、ヘパリン結合性増殖因子 FGF
-1に糖鎖結合配列を含むペプチドを導入する例を示す
が、本発明はこれに限定されるものではない。ペプチド
を導入する蛋白質としては、例えば、以下の（ａ）〜
（ｆ）のいずれかの蛋白質であるとよい。

【００１９】（ａ）配列番号２(FGF-1a)のアミノ酸配列
からなる蛋白質。（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたア
ミノ酸配列からなり、FGF-1活性を有する蛋白質。（ｃ）配列番号４(FGF-6/1a)のアミノ酸配列からなる蛋
白質。（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたア
ミノ酸配列からなり、FGF-6/1a活性を有する蛋白質。（ｅ）配列番号６(secFGF-1)のアミノ酸配列からなる蛋
白質。（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたア
ミノ酸配列からなり、secFGF-1活性を有する蛋白質。

【００２０】配列番号２、４、および６のアミノ酸配列
を有する蛋白質は、例えば、配列番号１、３、および５
のDNA配列によりそれぞれコードされる。これらの蛋白
質は、FGFファミリーに属する因子のペプチド配列の
他、糖鎖の付加を受けることができるペプチド配列やシ
グナルペプチドの配列を含んでいるものもある。本明細
書でいうヘパリン結合性蛋白質及びFGFは、配列表に記
載されたcDNAが一次的に規定する蛋白質に加え、細胞か
ら分泌される際にそのアミノ末端に存するシグナルペプ
チドと呼ばれる分泌の為のペプチド配列が切断された形
の蛋白質を含む。

【００２１】以下、具体例として、糖鎖結合配列を含む
ペプチドを導入する例を示すが、本発明はこれに限定さ
れるものではない。蛋白質に共有結合した糖鎖としては
ヘパラン硫酸やコンドロイチン硫酸などの硫酸化多糖、
グリコサミノグリカン、N-型糖鎖、およびO-型糖鎖を例
示することができるが、これらに限定されることはな
い。本明細書でいう硫酸化多糖とは、蛋白質の一次構造
に存するセリン残基に結合したキシロースを起点として
伸長する、もしくは後述のN-型糖鎖やO-型糖鎖の非還元
末端側に伸長する、あるいは遊離状態で存在する多様な
糖鎖構造を総称するものであり、その多くはアミノ糖と
ウロン酸（またはガラクトース）の二糖単位の繰り返し
構造をもち、いくつかの水酸基あるいはアミノ基が硫酸
基で置換されているものをいう。

【００２２】また、グリコサミノグリカンとは、同様の
構造を有するものであるが、硫酸基での置換がないもの
も含む。本明細書では、これらを総称して、硫酸化多糖
等と記す。具体的な構造は、「糖鎖の細胞における運
命」（永井・箱守・木幡編、講談社サイエンティフィッ
ク）などに記載されており、代表的な糖鎖配列を図１に
示す。本明細書でいうN-型糖鎖とは、蛋白質の一次構造
に存するアスパラギン残基に結合したN-アセチルグルコ
サミンを起点として伸長する多様な糖鎖構造を総称する
ものである。具体的な構造は、「糖鎖の細胞における運
命」（永井・箱守・木幡編、講談社サイエンティフィッ
ク）などに記載されており、代表的な糖鎖配列を図２に
示す。

【００２３】本明細書でいうO-型糖鎖とは、蛋白質の一
次構造に存するセリン残基またはスレオニン残基に結合
したN-アセチルガラクトサミンを起点として伸長する多
様な糖鎖構造を総称するものである。具体的な構造は、
「糖鎖の細胞における運命」（永井・箱守・木幡編、講
談社サイエンティフィック）などに記載されており、代
表的な糖鎖配列を図３に示す。これらの硫酸化多糖等、
N-型糖鎖およびO-型糖鎖は、その機能を発揮する限りに
おいて、その糖鎖配列の一部に、付加、欠失、置換また
は修飾があってもよい。

【００２４】本明細書において、「機能改変」とは、対
象の蛋白質の活性が変化することを意味する。機能改変
の例として、生理活性（増殖促進活性、分化促進活性
等）の単純な改変のみならず、活性発現に要求される補
因子の必要性の変化や、熱、酸またはアルカリに対する
抵抗性の変化といった物理的安定性の変化、血中半減期
の変化等によって示される生物学的安定性の変化などが
挙げられる。糖鎖付加配列を含むペプチドを分泌型FGF-
1に導入し、糖鎖付加型FGF-1を製造する方法の一例を以
下に説明する。

【００２５】ペプチドを導入する蛋白質のcDNAは、DDBJ
(日本DNAデータバンク）など遺伝子バンクに登録され
た配列から適当なプライマーを設計し、当該動物の当該
組織の mRNA より RT-PCR （逆転写 PCR )を行うことに
よって、取得できる。得られたcDNAを適当なプラスミド
に結合することによって、蛋白質をコードする遺伝子の
構築が完成する。cDNAを組み込むプラスミドとしては、
宿主内で複製保持されるものであれば、いずれも使用す
ることができるが、例えば大腸菌由来の pBR322、pUC18
、及びこれらを基に構築されたpET-3cなどを挙げるこ
とができる。

【００２６】また、該蛋白質が、分泌シグナルを持たな
い非分泌型蛋白質である場合には、適当な分泌シグナル
をその 5'-末端に付加することにより、分泌型蛋白質と
することができ、糖鎖付加経路にのせることができると
ともに、精製、活性確認を容易にすることができる。適
当な分泌シグナルとしては、例えば、典型的な分泌型糖
蛋白質のアミノ末端を利用することができ、具体的に
は、マウス FGF-6のN-末端より40残基のアミノ酸などが
挙げられる。

【００２７】得られたプラスミドに、適当な処理を施す
ことにより、当該ベクターを任意の部位で一カ所切断す
ることができる。この処理としては、 10 mM Mg²⁺存在
下での DNase I処理や超音波処理などが挙げられるが、
これらに限定されるものではない。10 mM Mg²⁺存在下で
の DNase I処理を３７度、５分間以内とすると、プラス
ミド内での２カ所以上の切断の頻度を押さえることがで
きる。切断されたベクターは、例えばアガロース電気泳
動等に供することにより、未切断ベクターと分離するこ
とができる。

【００２８】導入するペプチドをコードするDNAは、ア
ミノ酸翻訳コドン表に基づき、任意に合成することによ
って取得できる。あるいは、天然に存在する機能性ペプ
チドをコードする cDNA を前述の方法によって取得する
ことによっても可能である。例えば、N-型糖鎖付加を受
けるアミノ酸配列としては、Asn-X-Thr、Asn-X-Ser（配
列中、X は任意のアミノ酸である。) が挙げられ、これ
をコードするDNAとしては、例えば、配列番号７に示すD
NA配列を含むDNAが挙げられるが、これらに限定される
ものではない。

【００２９】例えば、O-型糖鎖付加を受けるアミノ酸配
列としては、X-Thr-Pro-X-Pro（配列中、X は任意のア
ミノ酸である。）が挙げられ、これをコードするDNAと
しては、例えば、配列番号８に示すDNA配列を含むDNAが
挙げられるが、これらに限定されるものではない。例え
ば、グリコサミノグリカン付加を受けるアミノ酸配列と
しては、 Ser-Glyの繰り返し配列が挙げられ、これをコ
ードするDNAとしては、例えば、配列番号９に示すDNA配
列を含むDNAが挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。

【００３０】例えば、グリコサミノグリカン付加を受け
る別のアミノ酸配列としては、プロテオグリカンのコア
タンパク質の部分配列が挙げられ、これをコードするDN
Aとしては、例えば、配列番号１０に示すDNA配列を含む
DNAが挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。配列番号１０に示すDNA配列がコードするアミノ酸
配列を配列番号１１に示す。当該ペプチドをコードする
DNAの両端、あるいは一端、あるいは内部に選択マーカ
ー遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子）を融合することに
より、導入変異体の選別を容易にすることができる。こ
のとき適当なアダプター配列を用いることができる。内
部に選択マーカー遺伝子を融合する場合には、それを除
去したのちセルフライゲーションを施すことにより、当
該ペプチドをコードするDNA配列になるように設計する
ことができる。

【００３１】さらに、当該ペプチドをコードするDNAと
選択マーカー遺伝子との融合遺伝子の両端、あるいは一
端にその塩基数の和が３ｎ（ｎは整数）となる個数のヌ
クレオチドを付加したものの混合物を用いることによ
り、当該蛋白質の遺伝子の読み枠をそろえることも可能
となる。当該ペプチドをコードするDNAと選択マーカー
遺伝子との融合遺伝子の断片を、一カ所で切断されたベ
クターと結合することにより、蛋白質遺伝子中へのペプ
チドをコードするcDNAの導入が完成する。この結合方法
としては、例えばT. Maniatisら、Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982)に記載
の方法などが挙げられ、具体的には、DNA リガーゼを用
いる方法等、分子生物学で一般的に用いられる方法を適
用することができる。

【００３２】得られたベクターを適当な宿主に導入した
後、選択薬剤存在下で培養することにより、当該遺伝子
と結合したベクターを含む大腸菌のみが生菌として得ら
れる。宿主としては、大腸菌 DH5α株などを例示するこ
とができる。選択マーカー遺伝子としては、アンピシリ
ン耐性遺伝子(Amp)、クロラムフェニコール耐性遺伝子
(Cm)、テトラサイクリン耐性遺伝子(Tc)、カナマイシン
耐性遺伝子(Km)等を例示することができる。

【００３３】得られた形質転換体の混合物からプラスミ
ドを回収し、制限酵素処理によって薬剤耐性マーカー遺
伝子を除去した後、セルフライゲーションを生じせしめ
ることにより、ペプチド導入蛋白質遺伝子ライブラリー
の構築が完成する。上記のようにして作製したプラスミ
ドライブラリーから、分泌シグナル、導入ペプチドおよ
び被導入蛋白質をコードする塩基配列を含む領域（以
下、「導入変異型蛋白質をコードする塩基配列を含む領
域」と記す。) を切り出し、これを発現に適したベクタ
ー中のプロモーターの下流に連結することにより、発現
型ベクターライブラリーを得ることができる。

【００３４】上記の導入変異型蛋白質をコードする塩基
配列を含む領域はその 5'-末端に翻訳開始コドンとして
のATG を有し、また3'-末端には翻訳終始コドンとして
のTAA、TGA またはTAG を有してもよい。さらに該コー
ディング領域にコードされている蛋白質を発現させるに
はその上流にプロモーターを接続する。本発明で用いら
れるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主
に対応して適切なプロモーターであればいかなるもので
もよい。形質転換する宿主が枯草菌である場合には、SP
01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター
など、宿主が酵母である場合には、PHO5プロモーター、
PGK プロモーター、GAPプロモーター、ADH プロモータ
ーなどが挙げられる。また、宿主が動物細胞である場合
には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロ
モーターが挙げられる。

【００３５】上記の組み換えDNAを含むベクターを宿主
細胞に導入することにより、該ベクターを保持する形質
転換体を製造する。宿主細胞としては、目的に適切なも
のならば、いかなるものであってもよい。例えば、糖鎖
付加配列ペプチドの導入による糖鎖付加変異蛋白質の発
現を目的とする際には、蛋白質への糖鎖付加経路を有す
るもの、例えば、酵母 (例えばPichia pasto ris, Sacc
haromyces cerevisiae) 、動物細胞（例えばCOS cell,
CHOcell, BHK cell, NIH3T3 cell, BALB/c3T3 cell, HU
VE cell, LEII cell)、昆虫細胞（例えば、Sf-9 cell
、Tn cell ）などを例示することができる。しかし、
これらに限定されることはない。

【００３６】上記の形質転換は、それぞれの宿主につい
て一般的に行われている方法で行う。また、一般的でな
くとも適用可能な方法ならばよい。例としては、宿主が
酵母であればリチウム法その他の方法により作成したコ
ンピータント細胞に組み換えDNAを含むベクターを温度
ショック法あるいはエレクトロポレーション法により導
入する。宿主が動物細胞であれば、増殖期等の細胞に組
み換え DNAを含むベクターをリン酸カルシウム法、リポ
フェクション法あるいはエレクトロポレーション法によ
り導入する。

【００３７】このようにして得られた形質転換体を培地
にて培養することにより、変異体蛋白質を産生させる。
形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地とし
ては、それぞれの宿主について一般的に用いられている
ものを用いる。または一般的でなくとも適用可能な培地
ならば良い。例としては、宿主が酵母であればＹＰＤ培
地などを用いる。宿主が動物細胞であれば、Dulbecco's
MEMに動物血清を加えたものなどを用いる。

【００３８】培養は、それぞれの宿主について一般的に
用いられている条件で行う。また一般的でなくとも適用
可能な条件ならばよい。例としては、宿主が酵母であれ
ば約25〜37℃で、約12時間〜２週間行い、必要により通
気や撹拌を加えることができる。宿主が動物細胞であれ
ば約32〜37℃で、5% CO₂、100%湿度の条件で約24時間〜
２週間行い、必要により気相の条件を変えたり撹拌を加
えることができる。

【００３９】当該発現型ベクターライブラリーの中か
ら、機能改変変異体を選択する際には、該蛋白質の性質
に基づき、適当な方法を選択する。例えば、FGF-1蛋白
質にペプチドを導入し、増殖因子活性の変化した変異体
を選択する際には、次に示す一連の手法を適用するが、
これに限定されるものではない。まず、FGF-1特異的な
増殖を示す浮遊細胞株を取得し、これを宿主として発現
型ベクターライブラリーを遺伝子導入し、これを以下の
機能改変変異型 FGF-1選択系に供する。

【００４０】FGF-1特異的な増殖を示す細胞株として
は、FGFレセプターを遺伝子導入したマウス（pro B 細
胞株） Ba/F3などが挙げられるが、これに限定されるわ
けではない。上記の発現型ベクターライブラリーを遺伝
子導入した細胞株を限界希釈し、ヘパリンおよびウシ胎
児血清を含む液体培地中で培養すると、機能改変変異型
FGF-1分泌クローンはオートクラインもしくはパラクラ
インによって、コロニーを形成する。当該クローンを選
択後、RT-PCR等によって、発現 FGFの遺伝子配列を解析
することによって、機能改変 FGF-1の構造すなわち導入
ペプチドの至適部位を決定することができる。

【００４１】得られた機能改変変異型 FGF-1分泌株から
機能改変変異型 FGF-1を得るには、培養液中に放出され
たものを、遠心分離後の上澄み液から直接回収できる。
また、培養菌体あるいは細胞から抽出する場合には、培
養後、ホモジェナイザー、フレンチプレス、超音波、リ
ゾチームおよび／または凍結融解によって菌体あるいは
細胞を破壊することにより菌体外に目的のタンパク質を
溶出させ、可溶性の画分から該タンパク質を得ることが
できる。また目的のタンパク質が不溶性画分に含まれる
場合は菌体あるいは細胞を破壊後、遠心分離により不溶
性画分を回収し、塩酸グアニジンなどを含む緩衝液など
によって可溶性にして回収する方法も用いうる。このほ
か塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤を含む緩衝液
によって直接菌体あるいは細胞を破壊し、菌体外に目的
のタンパク質を溶出させる方法もある。

【００４２】上記上澄み液から機能改変変異型 FGF-1を
精製するには、公知の分離・精製法を適切に組み合わせ
て行うことができる。これらの公知の分離、精製法とし
ては、塩析、溶媒沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動など
が使用されうる。さらに、多くのヘパリン結合性タンパ
ク質については、ヘパリンセファロースを担体としたア
フィニティークロマトグラフィー法が適用できる。

【００４３】このようにして得られた標品は機能改変変
異型 FGF-1の活性が損なわれない限りにおいて透析、凍
結乾燥を行い、乾燥粉末とすることもできる。さらに、
担体として血清アルブミンなどを添加して保存すること
は、標品の容器への吸着を防ぐのに有効である。また、
精製過程、あるいは保存過程での微量の還元剤の共存
は、該標品の酸化を防ぐのに好適である。還元剤として
は、βメルカプトエタノール、ジチオスレイトール、グ
ルタチンなどが挙げられる。本発明の機能改変変異型FG
F-1は、化学的な方法でペプチドを蛋白質に導入するこ
とにより、製造することもできる。以上、機能改変変異
型FGF-1を例にとり本発明を説明したが、ヘパリン結合
性タンパク質以外の蛋白質についても無作為な部位にア
ミノ酸またはペプチドを導入することができる。

【００４４】

【微生物の寄託】本発明の機能改変変異型FGF-1をコー
ドする遺伝子（配列番号２４、２６、２８、３０、３２
および３４のDNA配列をそれぞれ有する。）を組み込ん
だプラスミドpMEXneoを含む大腸菌DH5α株は、工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託番号FERM P-17181、FE
RM P-17182、FERM P-17183、FERM P-17184、FERM P-171
85およびFERM P-17186にて、平成１１年１月２８日に寄
託された。

【００４５】

〔実施例〕

[１]実施例の概要以下、実施例として、N-型糖鎖付加を受ける配列を、繊
維芽細胞増殖因子 FGF-1の一次構造上の無作為な位置に
導入する方法を示し、本発明を具体的に説明する。

【００４６】［２］ペプチド挿入変異体 secFGF-1 cDNA
の構築１）secFGF-1プラスミドの構築 1. FGF-1a/pBluescript II (KS+)プラスミドの作成ヒト FGF-1 cDNAを、J. Exp. Med. (1992), 175 (4), 1
073-1080に従い、ヒトcDNAライブラリーより単離した。
単離されたヒト FGF-1 cDNAを鋳型とし、# 967(5'-GCG
TCG ACA GCG CTA ATT ACA AGA AGC CCA AAC TC-3')（配
列番号１２）および # 630 (5'-CCG AAT TCG AAT TCT T
TA ATC AGA AGA GAC TGG-3')（配列番号１３）をプライ
マーとして PCR反応を行った。特異的に増幅された 434
塩基対のバンドを電気泳動により分離し、これを抽出
後、 EcoR I および Sal Iで二重切断した。得られた、
422 塩基対のバンドを分離抽出し、これを、EcoR I, Sa
lI で二重切断した pBluescript II (KS+) クローニン
グベクター (2934塩基対、Stratageneより購入) に挿入
して、FGF-1a/pBluescript II (KS+) を得た。FGF-1a/p
Bluescript II (KS+) を Aor51H I および Sal Iで順次
消化し、得られた2626塩基対のバンドを分離抽出し、以
下に示す連結反応に用いた。

【００４７】2.マウス FGF-6<NQ> cDNA 断片の作成マウス FGF-6 cDNAを、Oncogene (1990), 5(6), 823-31
に従い、マウスcDNAライブラリーより単離した。単離し
たマウス FGF-6 cDNAを鋳型とし、# 105 (5'-GCG TCG A
CC CAC CAT GTC-3')（配列番号１４）および # 124 (5'
-GCG ATA TCC AGT AGC GTG CCT TGG GCG CG-3') （配列
番号１５）をプライマーとして PCR反応を行った。特異
的に増幅された 138塩基対のバンドを電気泳動により分
離し、これを抽出後、EcoR Vおよび Sal Iで二重切断し
た。得られた、130 塩基対のバンドを分離抽出し、以下
に示す連結反応に用いた。

【００４８】3. secFGF-1 遺伝子の作成マウス FGF-6の PCR産物の EcoR V/Sal I 断片、及び F
GF-1a/pBluescript II(KS+)の Aor51H I/Sal I 断片を
DNA連結反応に供し、secFGF-1/pBluescript II (KS+)ベ
クターを得た。さらにこれを、EcoR Iおよび Sal Iで二
重切断し、得られた、540 塩基対のバンドを分離抽出し
た。これを、EcoR I, Sal I で二重切断した pMEXneo発
現ベクター (5916塩基対、Dr. M. Barbacid, Mol. Cel
l. Biol. (1989) 9(1), 24-33)に挿入して、この工程の
最終産物である secFGF-1 遺伝子を得た。この発現型ベ
クターは、配列番号５の塩基配列を含む。

【００４９】２）DNase I による一カ所切断上記により得られた sec FGF-1/pBluescript II (KS+)
プラスミド 10 ugを 10 mM MgCl₂を含む溶液中で、DNas
e I (400 pg)で 37 度 5分間処理した。反応生成物を
1.4 %アガロースゲル電気泳動により分離し、3474塩基
対の位置に泳動される DNA断片を回収、精製し、以下に
示す連結反応に用いた。

【００５０】３）NLS-Cm断片の作成 NLS-Cm断片はフレーム１、２、３の３通りを作成した。
これは、導入ペプチドのフレームがそれを導入される蛋
白質のフレームと一致するクローンを多数取得するため
である。

【００５１】1. NLS-Cmフレーム１の作成クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミド pCm
を鋳型として、# 3n+1F (5'-gcgcgcgtttaaacttaagcatcg
gcacgtaagaggttccaactt-3')（配列番号１６）、および#
3n+1R (5'-atatatatcccgggcttaagttacgccccgccctgccac
tca-3')（配列番号１７）をプライマーとして PCR反応
を行った。特異的に増幅された741塩基対のバンドを電
気泳動により分離し、これを抽出後、Pme I および Sm
a I で二重切断した。得られた、720塩基対のバンドを
分離抽出し、NLS-Cmフレーム１を得て、以下に示す連結
反応に用いた。

【００５２】2. NLS-Cmフレーム２の作成 pCm を鋳型として、# 3n+2F (5'-atatatcgcgaacttaagca
tcggcacgtaagaggttccaac-3')（配列番号１８）、および
# 3n+2R (5'-atatatatgccggcttaagttacgccccgccctgccac
tca-3')（配列番号１９）をプライマーとして PCR反応
を行った。特異的に増幅された739塩基対のバンドを電
気泳動により分離し、これを抽出後、NaeI および Nru
Iで二重切断した。得られた、720塩基対のバンドを分離
抽出し、NLS-Cmフレーム２を得て、以下に示す連結反応
に用いた。

【００５３】3. NLS-Cmフレーム３の作成 pCm を鋳型として、# 3nF (5'-gcgcgcgttaacttaagcatcg
gcacgtaagaggttccaactt-3')（配列番号２０）、および#
3nR (5'-atataagcgcttaagttacgccccgccctgccactca-3')
（配列番号２１）をプライマーとして PCR反応を行っ
た。特異的に増幅された734塩基対のバンドを電気泳動
により分離し、これを抽出後、Hinc II および Aor51H
I で二重切断した。得られた、717塩基対のバンドを分
離抽出し、NLS-Cmフレーム３を得て、以下に示す連結反
応に用いた。

【００５４】４）ライゲーション DNase I処理した secFGF-1/pBluescript II (KS+)プラ
スミド、及び、NLS-Cmフレーム１あるいはNLS-Cmフレー
ム２あるいはNLS-Cmフレーム３を DNAリガーゼを用いた
DNA連結反応に供した。反応生成物を用いて、大腸菌 D
H5αを形質転換し、これを 30 ug/ml のクロラムフェニ
コール、 50 ug/ml のアンピシリンを含む LB 培地中で
18時間、培養した。

【００５５】増殖した大腸菌からプラスミドを回収、精
製し、制限酵素 Afl II で切断した。反応生成物を 1.4
%アガロースゲル電気泳動により分離し、4194あるいは
4191塩基対の位置に泳動される DNA断片を回収、精製
し、DNA リガーゼを用いた DNA連結反応を行うことによ
りセルフライゲーション（自己結合）させた。これを用
いて、再び大腸菌 DH5αを形質転換し、 50 ug/ml のア
ンピシリンを含む LB 培地中で18時間、培養した。

【００５６】増殖した大腸菌のうち６種を選択し、その
大腸菌からプラスミド DNA (A, B,C, D, E及びF)を回
収、精製し、そのヌクレオチド配列をサイクルシークエ
ンス法によって解読した。その結果、N-型糖鎖付加を受
ける配列をコードする DNAが導入された secFGF-1 の構
造（配列番号２４、２６、２８、３０、３２および３４
の DNA配列をそれぞれ有する。）が明らかになった。こ
れらプラスミドに含まれる糖鎖付加配列導入 secFGF-1
cDNAを以下に示すように発現ベクターへの組み込みに用
いた。なお、配列番号２４、２６、２８、３０、３２お
よび３４の DNA配列配列がコードするアミノ酸配列を配
列番号２５、２７、２９、３１、３３および３５にそれ
ぞれ示す。以上の操作の概略を図４に示す。

【００５７】５）発現ベクターへの組み込み得られたプラスミドA、B、C、D、E及びFを、EcoR Iおよ
び Sal Iで二重切断し、アガロースゲル電気泳動上、55
2あるいは549塩基対のバンドを分離抽出した。これを、
EcoR I、 Sal Iで二重切断した pMEXneo発現ベクター
(5916塩基対) に挿入して、G、H、I、J、K及びLを得
た。

【００５８】[３]挿入配列の機能性の確認 secFGF-1の一次構造上の無作為な位置に導入されたN-型
糖鎖付加を受ける配列が機能していることを以下の方法
により確認した。N-型糖鎖付加を受ける配列をコードす
る DNAが導入された secFGF-1 発現ベクターG、H、I、
J、K及びLを、マウスpro B 細胞株Ba/F3 に遺伝子導入
し、ジェネテイシン存在下で培養することによって遺伝
子導入細胞を選択し、単一クローンを得た。これらの細
胞抽出液を調製し、発現された蛋白質を含むこの抽出液
の一部をN-型糖鎖を特異的に切断する酵素であるN-グリ
カナーゼで消化した。未処理のものと消化物をそれぞれ
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、イムノブロット
により解析した。図５に示すように、６種のベクターの
発現産物であるそれぞれの蛋白質が全て N-グリカナー
ゼにより低分子量化したことから、N-型糖鎖による修飾
を受けたことが確認された。図５中、(-)は未処理、(+)
は酵素処理後の各機能改変変異型 FGF-1のイムノブロッ
トを示す。白三角は secFGF-1 の蛋白質骨格のサイズを
示す。１はFERMP-17185、２はFERM P-17182、３はFERM
P-17181、４はFERM P-17183、５はFERMP-17186、６はFE
RM P-17184のcDNA配列の発現産物である。N-グリカナー
ゼ処理によりsecFGF-1の蛋白質骨格のサイズに低分子量
化したことから、すべての機能改変変異型 FGF-1が N-
型糖鎖修飾を受けたことが確認された。

【００５９】［４］機能改変変異型 FGF-1の選択１）FGF 特異的標的細胞株の作成 FGFレセプター（サブタイプ R1c）の発現ベクター (Dr.
D.M. Ornitzより供与、J. Biol. Chem. (1996) 271(2
5), 15292-15297) を、マウスpro B 細胞株Ba/F3 (理化
学研究所細胞開発銀行 RCB No. 0805)に遺伝子導入
し、ジェネテイシン存在下で培養することによって遺伝
子導入細胞(FGF-R1c/BaF3細胞) を選択した。IL-3非存
在下、10 ng/ml FGF-1、10 ug/mlヘパリン、10 %牛胎児
血清を含む RPMI 1640培地中で増殖する単一クローンを
用いて以下の実験に用いる。

【００６０】２）発現ベクターへの組み込み得られたプラスミドを、EcoRIおよびSalIで２重切断
し、アガロースゲル電気泳動上、552あるいは549塩基対
のバンドを分離抽出した。これを、EcoRI、SalIで２重
切断したpMEXneo発現ベクター(5916塩基対)に挿入し
て、NLS secFGF-1/pMEXneoを得た。

【００６１】３）当該標的細胞株への遺伝子導入得られた NLS sec FGF-1/pMEXneoベクターをエレクトロ
ポレーション法によって FGF-R1c/BaF3細胞に遺伝子導
入し、100 ug/ml ヘパリン、10 %牛胎児血清を含む RPM
I 1640培地中で培養する。14日後、コロニーを形成した
クローンを選択し、このクローンが生産、分泌する機能
改変変異体 secFGF-1 を、以下の解析に用いる。

【００６２】４）機能改変変異型 secFGF-1 の遺伝子の
取得当該クローンを通常培地（IL-3源として 10 % WEHI培養
上清、10 %牛胎児血清を含む RPMI 1640培地）中で培養
し、グアニジンイソチアネート法によって、その total
RNAを回収する。これをランダムヘキサマーをプライマ
ーとする逆転写反応に供し、得られた cDNA を鋳型とし
て #956 (5'-TCTTCCgATAgACTgCgTCg-3')（配列番号２
２）及び #957 (5'-CATTCTAgTTgTggTTTgTCC-3') （配列
番号２３）をプライマーとして PCR反応を行う。この反
応生成物を EcoR I、 Sal Iで二重切断し、EcoR I、 Sa
l Iで二重切断した pMEXneoベクター (5916塩基対) に
挿入して、NLS-secFGF-1/pMEXneoを得た。その DNA配列
をサイクルシークエンス法によって解読し、機能改変変
異型 FGF-1の構造が得られた。そのDNA配列は配列番号
３０および３２に示すものであった。

【００６３】［３］機能改変変異型 FGF-1の生産１）遺伝子導入と大量生産配列番号３０および３２に示すDNA配列を含む発現ベク
ターをリポフェクション法によってCHO-K1細胞（チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞 K1 亜株、理化学研究所細
胞開発銀行 RCB 0285)に遺伝子導入し、ジェネテイシン
存在下で培養することによって遺伝子導入細胞を選択し
た。得られる細胞を培養皿ほぼいっぱいになるまで増や
し、培地を無血清培地に交換することによって物質生産
量を増大させた。２日毎に培地を交換し、得られた馴化
培地は低速遠心分離した後、その上清を４℃で保存し
た。

【００６４】２）機能改変変異型 FGF-1の精製機能改変変異型 FGF-1分泌細胞の馴化培地にヘパリンセ
ファロースビーズを加え、４℃で２時間以上攪拌した。
低速遠心によって沈降するビーズを回収し、生理的リン
酸緩衝液（ PBS : phosphate buffered saline, pH 7.
4）で十分に洗浄後、2.5 M NaClを含む PBSによってヘ
パリン固定化ビーズに結合した蛋白質を溶出した。さら
にこの溶出液に蒸留水を加え塩濃度を低下させた後、再
び、ヘパリン親和性アフィニテイービーズを充填した高
速液体クロマトグラフィーに供し、NaClの濃度勾配によ
って機能改変変異型 FGF-1を溶出した。

【００６５】〔試験例１〕 FGFレセプター発現細胞株FGF-R1c/BaF3に対するDNA合成
促進活性 FGF-R1c/BaF3の培養液から、IL-3を除去後、直ちに機能
改変変異型 FGF-1および10 ug/mlヘパリン、10 %ウシ胎
児血清を含む培地を加える。３６時間培養後、放射標識
されたチミジンを４時間取り込ませ、この間に DNA中に
取り込まれた放射能によって新たに合成された DNA量と
する。

【００６６】〔試験例２〕ヒト血管内皮細胞の増殖促進におけるヘパリン依存性 HUVEC（ヒト臍帯由来血管内皮細胞）は 15 % 血清存在
下でもＦＧＦなどの増殖因子が欠乏すると細胞周期が停
止する。このような状態においたHUVEC(Exp. Cell Res.
(1987) 172, 92-100に従って調製した。) に機能改変
変異型 FGF-1を添加し、18時間後、放射標識されたチミ
ジンを６時間取り込ませて、この間にDNA 中に取り込ま
れた放射能によって新たに合成された DNA量とする。

【００６７】[試験例３] 細胞表面レクチン結合活性糖鎖を認識する細胞表面膜タンパク質に対する結合活性
を評価した。非還元末端ガラクトースを認識するマクロ
ファージレクチン (ML) の cDNA の発現ベクター（J. B
iochem., (1992) 111, 331-336に従い、マウス腹腔マク
ロファージ cDNA ライブラリーより単離し、pMEXneoベ
クターに組み込んだ。）をFGFレセプターを持たない Ba
/F3細胞に遺伝子導入し、ジェネテイシン存在下で培養
することによって遺伝子導入細胞を選択した (ML/BaF3
細胞)。この ML/BaF3細胞を標識された機能改変変異型
FGF-1と混合し、インキュベーション後、遠心により細
胞を回収し、培地で洗浄し、細胞に結合している機能改
変変異型 FGF-1の量を測定した。特異的に結合している
量は、ラクトースを含む培地によって解離する量として
評価した。その結果、機能改変変異型FGF-1 は、糖鎖の
効果として細胞表面に結合する量が有為に多いことが示
された。

【００６８】[試験例４] 肝細胞に対する結合活性、細胞内移行活性と細胞増殖促
進活性糖鎖を認識する性質のある膜タンパク質を細胞表面に有
する細胞に対する結合活性、細胞内移行活性および増殖
促進活性を評価した。肝細胞は、その細胞表面に FGFレ
セプターと、非還元末端ガラクトースを認識するアシア
ロ糖蛋白質レセプターをもつ。肝細胞及びその類縁細胞
に機能改変変異型 FGF-1を添加し、試験例３と同様に結
合量を測定した。その結果、機能改変変異型 FGF-1は、
糖鎖の効果として細胞表面に結合する量が有為に多いこ
とが示された。また細胞内に取り込まれた量を測定し
た。その結果、機能改変変異型 FGF-1は、糖鎖の効果と
して細胞内に取り込まれる量が有為に多いことが示され
た。また細胞を標識されていない機能改変変異型 FGF-1
と混合し、18時間後、細胞増殖をあらわすDNA合成量を
放射標識されたチミジンの取り込みによって評価した。
その結果、機能改変変異型 FGF-1は、糖鎖の効果として
細胞増殖促進活性が有為に変化していることが示され
た。

【００６９】

【発明の効果】本発明により、蛋白質一次配列上の無作
為な位置にペプチドを挿入する技術が提供された。この
技術は、蛋白質に人為的に変異を導入する際の、導入部
位の至適化に有効な手段となる。これによって、試行錯
誤的な変異導入を行わずとも、系統的な変異体の作成が
可能となる。

【００７０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director-General of Agency of Industrial Science and Technology <120> A process for producing a mutant protein, a process for preparing a mutant protein library and a process for preparing a mutant protein-encoding cDNA library <130> 11900243 <160> 35 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 408 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(408) <400> 1 atg gct aat tac aag aag ccc aaa ctc ctc tac tgt agc aac ggg ggc 48 Met Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly 1 5 10 15 cac ttc ctg agg atc ctt ccg gat ggc aca gtg gat ggg aca agg gac 96 His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp 20 25 30 agg agc gac cag cac att cag ctg cag ctc agt gcg gaa agc gtg ggg 144 Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly 35 40 45 gag gtg tat ata aag agt acc gag act ggc cag tac ttg gcc atg gac 192 Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp 50 55 60 acc gac ggg ctt tta tac ggc tca cag aca cca aat gag gaa tgt ttg 240 Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu 65 70 75 80 ttc ctg gaa agg ctg gag gag aac cat tac aac acc tat ata tcc aag 288 Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys 85 90 95 aag cat gca gag aag aat tgg ttt gtt ggc ctc aag aag aat ggg agc 336 Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser 100 105 110 tgc aaa cgc ggt cct cgg act cac tat ggc cag aaa gca atc ttg ttt 384 Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe 115 120 125 ctc ccc ctg cca gtc tct tct gat 408 Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 130 135 <210> 2 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly 1 5 10 15 His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp 20 25 30 Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly 35 40 45 Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp 50 55 60 Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu 65 70 75 80 Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys 85 90 95 Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser 100 105 110 Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe 115 120 125 Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 130 135 <210> 3 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(525) <220> <223> Description of Artificial Sequence:artificial chimera (Mus musculus/Homo sapiens) <400> 3 atg tcc cgg gga gca gga cgt gtt cag ggc acg ctg cag gct ctc gtc 48 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 1 5 10 15 ttc tta ggc gtc cta gtg ggc atg gtg gtg ccc tca cct gcc ggc gcc 96 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 cgc gcc aac ggc acg cta ctg gac gct aat tac aag aag ccc aaa ctc 144 Arg Ala Asn Gly Thr Leu Leu Asp Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu 35 40 45 ctc tac tgt agc aac ggg ggc cac ttc ctg agg atc ctt ccg gat ggc 192 Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly 50 55 60 aca gtg gat ggg aca agg gac agg agc gac cag cac att cag ctg cag 240 Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln 65 70 75 80 ctc agt gcg gaa agc gtg ggg gag gtg tat ata aag agt acc gag act 288 Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr 85 90 95 ggc cag tac ttg gcc atg gac acc gac ggg ctt tta tac ggc tca cag 336 Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln 100 105 110 aca cca aat gag gaa tgt ttg ttc ctg gaa agg ctg gag gag aac cat 384 Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His 115 120 125 tac aac acc tat ata tcc aag aag cat gca gag aag aat tgg ttt gtt 432 Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val 130 135 140 ggc ctc aag aag aat ggg agc tgc aaa cgc ggt cct cgg act cac tat 480 Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr 145 150 155 160 ggc cag aaa gca atc ttg ttt ctc ccc ctg cca gtc tct tct gat 525 Gly Gln Lys Ala Ile Leu 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CDS <222> (1)..(525) <220> <223> Description of Artificial Sequence:artificial chimera (Mus musculus/Homo sapiens) <400> 5 atg tcc cgg gga gca gga cgt gtt cag ggc acg ctg cag gct ctc gtc 48 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 1 5 10 15 ttc tta ggc gtc cta gtg ggc atg gtg gtg ccc tca cct gcc ggc gcc 96 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 cgc gcc caa ggc acg cta ctg gac gct aat tac aag aag ccc aaa ctc 144 Arg Ala Gln Gly Thr Leu Leu Asp Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu 35 40 45 ctc tac tgt agc aac ggg ggc cac ttc ctg agg atc ctt ccg gat ggc 192 Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly 50 55 60 aca gtg gat ggg aca agg gac agg agc gac cag cac att cag ctg cag 240 Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln 65 70 75 80 ctc agt gcg gaa agc gtg ggg gag gtg tat ata aag agt acc gag act 288 Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr 85 90 95 ggc cag tac ttg gcc atg gac 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:a nucleotide sequence encoding amino acid sequence Ser-Gly-Ser-Gly <400> 9 tctggctctg ga 12 <210> 10 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:a nucleotide sequence encoding a partial sequence of the core protein in a proteoglycan <220> <221> CDS <222> (1)..(258) <400> 10 atg gcc ccc gcc cgt ctg ttc gcg ctg ctg ctg ttc ttc gta ggc gga 48 Met Ala Pro Ala Arg Leu Phe Ala Leu Leu Leu Phe Phe Val Gly Gly 1 5 10 15 gtc gcc gag tcg atc cga gag act gag gtc atc gac ccc cag gac ctc 96 Val Ala Glu Ser Ile Arg Glu Thr Glu Val Ile Asp Pro Gln Asp Leu 20 25 30 cta gaa ggc cga tac ttc tcc gga gcc cta cca gac gat gag gat gta 144 Leu Glu Gly Arg Tyr Phe Ser Gly Ala Leu Pro Asp Asp Glu Asp Val 35 40 45 gtg ggg ccc ggg cag gaa tct gat gac ttt gag ctg tct ggc tct gga 192 Val Gly Pro Gly Gln Glu Ser Asp Asp Phe Glu Leu Ser Gly Ser Gly 50 55 60 gat ctg gat gac ttg gaa gac tcc atg atc ggc cct gaa gtt 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Description of Artificial Sequence:#105 primer <400> 14 gcgtcgaccc accatgtc 18 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:#124 primer <400> 15 gcgatatcca gtagcgtgcc ttgggcgcg 29 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:#3n+1F primer <400> 16 gcgcgcgttt aaacttaagc atcggcacgt aagaggttcc aactt 45 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:#3n+1R primer <400> 17 atatatatcc cgggcttaag ttacgccccg ccctgccact ca 42 <210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:#3n+2F primer <400> 18 atatatcgcg aacttaagca tcggcacgta agaggttcca ac 42 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:#3n+2R primer <400> 19 atatatatgc cggcttaagt tacgccccgc cctgccactc a 41 <210> 20 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:#3nF primer <400> 20 gcgcgcgtta acttaagcat cggcacgtaa gaggttccaa ctt 43 <210> 21 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:#3nR primer <400> 21 atataagcgc ttaagttacg ccccgccctg ccactca 37 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: #956 primer <400> 22 tcttccgata gactgcgtcg 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:#957 primer <400> 23 cattctagtt gtggtttgtc c 21 <210> 24 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mutant FGF-1 gene contained in FERM P-17181 <220> <221> CDS <222> (1)..(540) <400> 24 atg tcc cgg gga gca gga cgt gtt cag ggc acg ctg cag gct ctc gtc 48 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 1 5 10 15 ttc tta ggc gtc cta gtg ggc atg gtg gtg ccc tca cct gcc ggc gcc 96 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met 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Ser Lys Lys His Ala Glu Lys 130 135 140 aat tgg ttt gtt ggc ctc aag aag aat ggg agc tgc aaa cgc ggt cct 480 Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro 145 150 155 160 cgg act cac tat ggc cag aaa gca atc ttg ttt ctc ccc ctg cca gtc 528 Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val 165 170 175 tct tct gat taa 540 Ser Ser Asp 180 <210> 25 <211> 179 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 25 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 1 5 10 15 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 Arg Ala Gln Gly Thr Leu Leu Asp Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly 50 55 60 Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln Gln Asn Leu Ser Pro 65 70 75 80 Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys 85 90 95 Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu 100 105 110 Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe 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15 ttc tta ggc gtc cta gtg ggc atg gtg gtg ccc tca cct gcc ggc gcc 96 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 cgc gcc caa ggc acg cta ctg gac gct aat tac aag aag ccc aaa ctc 144 Arg Ala Gln Gly Thr Leu Leu Asp Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu 35 40 45 ctc tac tgt agc aac ggg ggc cac ttc ctg agg atc ctt ccg gat ggc 192 Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly 50 55 60 aca gtg gat ggg aca agg gac agg agc gac cag cac att cag ctg cag 240 Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln 65 70 75 80 ctc agt gcg gaa agc gtg ggg gag gtg tat ata aag agt acc gag act 288 Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr 85 90 95 ggc cag tac ttg gcc atg gac acc gac ggg ctt tta tac ggc tca cag 336 Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln 100 105 110 aca cca aat gag gaa tgt ttg ttc ctg gaa agg ctg gag gag aac cat 384 Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His 115 120 125 tac aac acc tat ata tcc aag aag cat gca gag aag aat tgg ttt gtt 432 Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val 130 135 140 ggc ctc aag aag aat ggg agc tgc aaa cgc ggt cct cgg act cac tat 480 Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr 145 150 155 160 ggc cag aaa gca atc ttg ttt ctc ccc ctg cca gtc tct tct gat aac 528 Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp Asn 165 170 175 tta agc taa 537 Leu Ser <210> 31 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 31 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 1 5 10 15 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 Arg Ala Gln Gly Thr Leu Leu Asp Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly 50 55 60 Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln 65 70 75 80 Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr 85 90 95 Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln 100 105 110 Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His 115 120 125 Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val 130 135 140 Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr 145 150 155 160 Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp Asn 165 170 175 Leu Ser <210> 32 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mutant FGF-1 gene contained in FERM P-17185 <220> <221> CDS <222> (1)..(537) <400> 32 atg tcc cgg gga gca gga cgt gtt cag ggc acg ctg cag gct ctc gtc 48 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 1 5 10 15 ttc tta ggc gtc cta gtg ggc atg gtg gtg ccc tca cct gcc ggc gcc 96 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 cgc gcc caa ggc acg cta ctg gac aac tta agc gct aat tac aag aag 144 Arg Ala Gln Gly Thr Leu Leu Asp Asn Leu Ser Ala Asn Tyr Lys Lys 35 40 45 ccc aaa ctc ctc tac tgt agc aac ggg ggc cac ttc ctg agg atc ctt 192 Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu 50 55 60 ccg gat ggc aca gtg gat ggg aca agg gac agg agc gac cag cac att 240 Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile 65 70 75 80 cag ctg cag ctc agt gcg gaa agc gtg ggg gag gtg tat ata aag agt 288 Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser 85 90 95 acc gag act ggc cag tac ttg gcc atg gac acc gac ggg ctt tta tac 336 Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr 100 105 110 ggc tca cag aca cca aat gag gaa tgt ttg ttc ctg gaa agg ctg gag 384 Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu 115 120 125 gag aac cat tac aac acc tat ata tcc aag aag cat gca gag aag aat 432 Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn 130 135 140 tgg ttt gtt ggc ctc aag aag aat ggg agc tgc aaa cgc ggt cct cgg 480 Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg 145 150 155 160 act cac tat ggc cag aaa gca atc ttg ttt ctc ccc ctg cca gtc tct 528 Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser 165 170 175 tct gat taa 537 Ser Asp <210> 33 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 33 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 1 5 10 15 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 Arg Ala Gln Gly Thr Leu Leu Asp Asn Leu Ser Ala Asn Tyr Lys Lys 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu 50 55 60 Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile 65 70 75 80 Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser 85 90 95 Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr 100 105 110 Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu 115 120 125 Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn 130 135 140 Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg 145 150 155 160 Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser 165 170 175 Ser Asp <210> 34 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:mutant FGF-1 gene contained in FERM P-17186 <220> <221> CDS <222> (1)..(540) <400> 34 atg tcc cgg gga gca gga cgt gtt cag ggc acg ctg cag gct ctc gtc 48 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 1 5 10 15 ttc tta ggc gtc cta gtg ggc atg gtg gtg ccc tca cct gcc ggc gcc 96 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 cgc gcc caa ggc acg cta ctg gac gct aat tac aag aag ccc aaa ctc 144 Arg Ala Gln Gly Thr Leu Leu Asp Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu 35 40 45 ctc tac tgt agc aac ggg ggc cac ttc ctg agg atc ctt ccg gat ggc 192 Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly 50 55 60 aca gtg gat ggg aca agg gac agg agc gac cag cac att cag ctg cag 240 Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln 65 70 75 80 ctc agt gcg gaa agc gtg ggg gag gtg tat ata aag agt acc gag act 288 Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr 85 90 95 ggc cag tac ttg gcc atg gac acc gac ggg ctt tta tac ggc tca cag 336 Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln 100 105 110 aca cca aat gag gaa tgt ttg ttc ctg gaa agg ctg gag gcg aac tta 384 Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Ala Asn Leu 115 120 125 agc cag aac cat tac aac acc tat ata tcc aag aag cat gca gag aag 432 Ser Gln Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys 130 135 140 aat tgg ttt gtt ggc ctc aag aag aat ggg agc tgc aaa cgc ggt cct 480 Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro 145 150 155 160 cgg act cac tat ggc cag aaa gca atc ttg ttt ctc ccc ctg cca gtc 528 Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val 165 170 175 tct tct gat taa 540 Ser Ser Asp 180 <210> 35 <211> 179 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 35 Met Ser Arg Gly Ala Gly Arg Val Gln Gly Thr Leu Gln Ala Leu Val 1 5 10 15 Phe Leu Gly Val Leu Val Gly Met Val Val Pro Ser Pro Ala Gly Ala 20 25 30 Arg Ala Gln Gly Thr Leu Leu Asp Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly 50 55 60 Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln 65 70 75 80 Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr 85 90 95 Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln 100 105 110 Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Ala Asn Leu 115 120 125 Ser Gln Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys 130 135 140 Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro 145 150 155 160 Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val 165 170 175 Ser Ser Asp

【００７１】

【配列表フリーテキスト】配列番号７は、アミノ酸配列
Asn-leu-Serをコードするヌクレオチド配列を示す。配
列番号８は、アミノ酸配列Ala-Thr-Pro-Ala-Proをコー
ドするヌクレオチド配列を示す。配列番号９は、アミノ
酸配列Ser-Gly-Ser-Glyをコードするヌクレオチド配列
を示す。配列番号１０は、プロテオグリカンのコアタン
パク質の部分配列をコードするヌクレオチド配列を示
す。

【００７２】配列番号１２は、#967プライマーのヌクレ
オチド配列を示す。配列番号１３は、#630プライマーの
ヌクレオチド配列を示す。配列番号１４は、#105プライ
マーのヌクレオチド配列を示す。配列番号１５は、#124
プライマーのヌクレオチド配列を示す。配列番号１６
は、#3n+1Fプライマーのヌクレオチド配列を示す。配列
番号１７は、#3n+1Rプライマーのヌクレオチド配列を示
す。

【００７３】配列番号１８は、#3n+2Fプライマーのヌク
レオチド配列を示す。配列番号１９は、#3n+2Rプライマ
ーのヌクレオチド配列を示す。配列番号２０は、#3nFプ
ライマーのヌクレオチド配列を示す。配列番号２１は、
#3nRプライマーのヌクレオチド配列を示す。配列番号２
２は、#956プライマーのヌクレオチド配列を示す。配列
番号２３は、#957プライマーのヌクレオチド配列を示
す。

【００７４】配列番号２４は、FERM P-17181に導入され
ている変異型FGF-1遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２６は、FERM P-17182に導入されている変異型
FGF-1遺伝子のヌクレオチド配列を示す。配列番号２８
は、FERM P-17183に導入されている変異型FGF-1遺伝子
のヌクレオチド配列を示す。配列番号３０は、FERM P-1
7184に導入されている変異型FGF-1遺伝子のヌクレオチ
ド配列を示す。配列番号３２は、FERM P-17185に導入さ
れている変異型FGF-1遺伝子のヌクレオチド配列を示
す。配列番号３４は、FERM P-17186に導入されている変
異型FGF-1遺伝子のヌクレオチド配列を示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、代表的硫酸化多糖・グリコサミノグリ
カン糖鎖の構造を示す。

【図２】図２は、代表的N-型糖鎖の構造を示す。G はガ
ラクトース、GNはN-アセチルグルコサミン、M はマンノ
ース、F はフコース、Sia はシアル酸を示す。

【図３】図３は、代表的O-型糖鎖構造を示す。G はガラ
クトース、GalNAcはN-アセチルガラクトサミンを示す。

【図４】図４は、ペプチド挿入変異体secFGF-1 cDNAの
構築を示す。

【図５】図５は、FERM P-17185、FERM P-17182、FERM P
-17181、FERM P-17183、FERM P-17186およびFERM P-171
84に導入された変異型FGF-1のcDNAの発現産物の未処理
（−）、N-グリカナーゼによる処理後（＋）のイムノブ
ロットを示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１月２４日（２０００．１．２
４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者鈴木理茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者岡修一茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者米田敦子茨城県つくば市稲荷前2418Ｂ201 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA20 BA21 BA80 CA04 CA06 DA02 EA04 FA10 GA13 GA14 HA01 HA09 4B064 AG02 CA10 CA19 CC24 DA16 DA20 4B065 AA77X AA80X AA90X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA03 BA05 BA25 CA24 CA60 4H045 AA10 AA20 BA10 BA53 CA40 DA01 EA20 FA72 FA74 HA05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛋白質をコードするcDNAを環状プラスミ
ドに組み込み、この環状プラスミドを無作為な位置で一
カ所切断し、この切断部位に、アミノ酸またはペプチド
をコードするDNAを導入することを特徴とする、蛋白質
の一次構造上の無作為な部位にアミノ酸またはペプチド
が導入された変異体をコードするcDNAのライブラリーを
作製する方法。
【請求項２】以下の工程：（ａ）蛋白質をコードするcDNAを環状プラスミドに組み
込む工程、（ｂ）前記環状プラスミドを無作為な位置で
一カ所切断する工程、（ｃ）アミノ酸またはペプチドを
コードするDNAを前記プラスミドの切断部位に導入する
が、ここで、アミノ酸またはペプチドをコードするDNA
の５'末端側および／または３'末端側に、追加のヌクレ
オチドを付加することにより、アミノ酸またはペプチド
のフレームがそれを導入される蛋白質のフレームと一致
するクローンを取得できるようにする工程、（ｄ）前記
アミノ酸またはペプチドをコードするDNAを導入された
プラスミドを宿主細胞に導入して、形質転換体を得る工
程、（ｅ）前記形質転換体から、プラスミドを回収する
工程、（ｆ）回収されたプラスミドから、アミノ酸また
はペプチドをコードするDNAと蛋白質をコードするcDNA
とを含む領域のDNAを切り出す工程、（ｇ）切り出したD
NAを発現ベクターに組み込む工程、（ｈ）前記発現ベク
ターを宿主細胞に導入する工程、および（ｉ）前記宿主
細胞において、蛋白質変異体を発現させる工程を含む請
求項１記載の方法。
【請求項３】（ｃ）の工程で、アミノ酸またはペプチ
ドをコードするDNAを、選択マーカー遺伝子と連結した
状態で、プラスミドの切断部位に導入し、（ｄ）の工程
で、選択マーカー遺伝子の発現に基づいて形質転換体を
選別し、（ｆ）の工程で、選択マーカー遺伝子を除去す
る請求項２記載の方法。
【請求項４】蛋白質の一次構造上の無作為な部位にア
ミノ酸またはペプチドが導入された変異体をコードする
cDNAのライブラリーを作製し、このライブラリー中のcD
NAがコードしている蛋白質変異体を発現させることを特
徴とする、蛋白質変異体のライブラリーを作製する方
法。
【請求項５】蛋白質の一次構造上の無作為な部位にア
ミノ酸またはペプチドが導入された変異体をコードする
cDNAのライブラリーを作製し、このライブラリー中のcD
NAがコードしている蛋白質変異体を発現させ、目的の蛋
白質変異体を発現している細胞を選択し、この細胞に蛋
白質変異体を産生させることを特徴とする、蛋白質変異
体を生産する方法。
【請求項６】以下の工程：（ａ）蛋白質に特異的な応答を示す細胞株を用意する工
程、（ｂ）蛋白質の一次構造上の無作為な部位にアミノ
酸またはペプチドが導入された変異体をコードするcDNA
を組み込んだ発現ベクターを前記細胞株に導入すること
により、cDNAライブラリーを作製する工程、（ｃ）前記
応答を検出して、応答を示す細胞を選択する工程、およ
び（ｄ）選択した細胞を培養して、培養液および／また
は培養細胞から目的の蛋白質変異体を回収する工程を含
む請求項５記載の方法。
【請求項７】導入するアミノ酸またはペプチドが、糖
鎖の付加を受けることができるものである請求項５また
は６記載の方法。
【請求項８】導入するアミノ酸またはペプチドが、硫
酸化多糖、グリコサミノグリカン、N-型糖鎖、O-型糖鎖
のいずれかもしくはそれらの組み合わせの付加を受ける
ことができるものである請求項５〜７のいずれかに記載
の方法。
【請求項９】蛋白質が、 FGFファミリーに属する因子
またはその近縁の因子である請求項５〜８のいずれかに
記載の方法。
【請求項１０】蛋白質が、ヘパリン結合性増殖因子フ
ァミリーに属する因子またはその近縁の因子である請求
項５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】蛋白質が、以下の（ａ）〜（ｆ）のい
ずれかの蛋白質である請求項５〜１０のいずれかに記載
の方法。（ａ）配列番号２(FGF-1a)のアミノ酸配列からなる蛋白
質。（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたア
ミノ酸配列からなり、FGF-1活性を有する蛋白質。（ｃ）配列番号４(FGF-6/1a)のアミノ酸配列からなる蛋
白質。（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたア
ミノ酸配列からなり、FGF-6/1a活性を有する蛋白質。（ｅ）配列番号６(secFGF-1)のアミノ酸配列からなる蛋
白質。（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは修飾されたア
ミノ酸配列からなり、secFGF-1活性を有する蛋白質。
【請求項１２】請求項５記載の方法により生産するこ
とができる新規な蛋白質変異体。