JP2000249925A - 共焦点レーザ顕微鏡の調整方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、切り換えるビームスプリッタの個数
が増えても又は使用する共焦点ピンホールの数が増えて
も、共焦点ピンホールの調整回数を少なくして調整工数
を大幅に削減することである。 【解決手段】各励起用ビームスプリッタ３３ａ〜３３ｄ
の相互間の角度データ及び各共焦点ピンホール４０，４
４，４８でのスポット光の位置データを求め、分光用フ
ィルタユニット３７，３８内の各分光用フィルタ３７ａ
〜３７ｃ，３８ａ〜３８ｃの相互間の角度データ及び各
共焦点ピンホール４０，４４，４８でのスポット光の位
置データを求め、これら角度データ及び位置データに基
づいて任意の励起用ビームスプリッタ３３ａ〜３３ｄと
各分光用フィルタ３７ａ〜３７ｃ，３８ａ〜３８ｃとを
組み合わせたときの各共焦点ピンホール４０，４４，４
８の調整位置を演算し求める。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、レーザ光で標本の
焦点面を走査したときの標本からの光、特に蛍光を波長
別に分離して複数の光検出器で検出する共焦点レーザ顕
微鏡の調整方法及びその装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】共焦点レーザ走査型顕微鏡は、レーザ光
を対物レンズにより集光して標本上（焦点面）にスポッ
ト光として結ばせるとともに、光走査手段によりこのス
ポット光を標本上に２次元走査し、標本からの光を共焦
点ピンホールを通して光検出器により検出するもので、
例えば特開平８−２７１７９２号公報に開示されてお
り、使用するレーザ波長や多様な蛍光色素に対応するた
めにレーザ光と標本からの光を分離するビームスプリッ
タを複数種類備えている。

【０００３】このような共焦点レーザ走査型顕微鏡で
は、ビームスプリッタを切り換えたときにその角度がず
れると、共焦点ピンホール面での結像位置が変化するの
で、光が共焦点ピンホールを通過する光量を測定しなが
ら電動ステージ等で共焦点ピンホールを動かし、この共
焦点ピンホールの位置を補正する必要がある。そして、
この補正を各ビームスプリッタ毎に行ってその補正位置
をコンピュータに記憶させ、対応するビームスプリッタ
を光路に挿入したときにその補正位置に共焦点ピンホー
ルを動かしている。

【０００４】又、検出する標本からの光、すなわち蛍光
が複数波長に亘る場合には、例えば特開平６−１６７６
５４号公報に記載されているように検出する光を波長毎
に分離し、これら波長毎にそれぞれ共焦点ピンホール、
光検出器を設けるようにしている。

【０００５】図５はかかる特開平６−１６７６５４号公
報に記載されている倒立型走査型レーザ顕微鏡における
光路を示した概略構成図であって、３つの標準ブロック
１〜３及び任意の数の付加的レーザモジーュル４，５か
らなっている。このうち標準ブロック１は顕微鏡鏡基で
あり、標準ブロック２はスキャンモジュールであり、標
準ブロック３は検出器モジュールである。

【０００６】レーザ６から出力されたレーザ光は、シャ
ッタ７からビームスプリッタ８によりビームエキスパン
ダ９，１０に偏向してコリメータレーザ光とし、次のビ
ームスプリッタ１１によりコリメータレーザ光を偏向ユ
ニット１２、１３によりＸ、Ｙ方向に偏向する。

【０００７】この偏向ユニット１２，１３を通過後、コ
リメータレーザ光は、全反射ミラー１４により対物レン
ズ１５に偏向され、この対物レンズ１５により図示しな
いプレパラート上の標本の焦点面に集光する。

【０００８】レーザ光によりプレパラートから発せられ
た蛍光乃至反射光は、対物レンズ１５とビームスプリッ
タ１１との間を同じ光路を通って反対方向に通過する。

【０００９】蛍光は、波長がレーザ光とは異なるからビ
ームスプリッタ１１を通過する。そして、蛍光は、異な
るスペクトル通過特性を有する２つの別のビームスプリ
ッタ１６，１７及び全反射ミラー１８を介して３つの並
列の共焦点検出チャネルに供給される。

【００１０】これら共焦点検出チャネルは、それぞれ１
つの共焦点結像レンズ１９〜２１、１つの共焦点ピンホ
ール２２〜２４及びレーザ光を電気信号に変換するため
の光検出器２５〜２７を有し、３つの異なる波長での蛍
光分析ができる。なお、共焦点ピンホール２２〜２４
は、それぞれ芯合わせ、開口の大きさ調整が独立して可
能であり、各ビームスプリッタ１６、１７、１８を別の
スペクトル特性のものに切り換えたときにはそれぞれ芯
合わせするものとなっている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、特開平
６−１６７６５４号公報に開示されているようにビーム
スプリッタ１６、１７、１８を切換えるときに行う共焦
点ピンホール２２〜２４の芯調整は、数十μのピンホー
ル径を精密に合わせる必要があり、手間がかかるもので
ある。この調整を例えば励起用ビームスプリッタ１１を
切換えたときは全ての共焦点ピンホール２２〜２４に対
して行う必要がある。また、ビームスプリッタ１７を切
換えたときは共焦点ピンホール２３の調整を行う必要が
あり、さらに、ビームスプリッタ１６を切換えた時は二
つの共焦点ピンホール２３，２４を調整しなければなら
ない。つまり、共焦点ピンホール２２〜２４に至るまで
に一回でも分光用ビームスプリッタの反射があると調整
が必要になる。さらに、切換えるビームスプリッタの数
が増えたり、共焦点ピンホールの数を増やしたりすると
調整工数は増大する。

【００１２】又、特開平８−２７１７９２号公報に開示
されているように、調整は１度のみにして、補正位置を
コンピュータに記憶させたとしても、例えば図２で励起
用ビームスプリッタ１１の交換する数が３種類、分光用
ビームスプリッタフ１６、１７及び全反射ミラー１８の
交換数が、ビームスプリッタ１６では３個、ビームスプ
リッタ１７で３個とすると、３＊３＋３＊３＊３＋３＝
３９通りの調整を行った後に補正値をコンピュータに入
力することになり面倒である。

【００１３】そこで本発明は、切換えるビームスプリッ
タの個数が増えても、又は使用する共焦点ピンホールの
数が増えても、共焦点ピンホールの調整回数を少なくし
て調整工数を大幅に削減できる共焦点レーザ顕微鏡の調
整方法及びその装置を提供することを目的とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の本発明
は、レーザ光を標本側に反射するとともに標本からの光
を透過するそれぞれ異なる波長特性を持った複数の励起
ビームスプリッタを保持し、これら励起ビームスプリッ
タのうちいずれか１つの励起ビームスプリッタをレーザ
光の光路上に配置する励起ビームスプリッタユニット
と、この励起ビームスプリッタにおける励起ビームスプ
リッタの透過光路上に少なくとも１段配置され、それぞ
れ異なる分光波長を持った複数の分光ビームスプリッタ
を保持し、これら分光ビームスプリッタのうちいずれか
１つを励起ビームスプリッタの透過光路上に配置する分
光ビームスプリッタユニットと、この分光ビームスプリ
ッタユニットに保持されているいずれか１つの分光ビー
ムスプリッタの反射光路上及び透過光路上にそれぞれ各
共焦点結像レンズ及びピンホールを介して配置された複
数の光検出器とを備え、複数の励起ビームスプリッタの
相互間の角度データ、共焦点ピンホール面での光の位置
データを求める第１の工程と、分光ビームスプリッタユ
ニットにおける複数の分光ビームスプリッタの相互間の
角度データ、共焦点ピンホール面での光の位置データを
求める第２の工程と、第１及び第２の工程で求められた
各角度データ及び各位置データに基づいて任意の励起ビ
ームスプリッタと分光ビームスプリッタとを組み合わせ
たときの各共焦点ピンホールの調整位置を求める第３の
工程と、を有する共焦点レーザ顕微鏡の調整方法であ
る。

【００１５】請求項２記載の本発明は、レーザ光を標本
側に反射するとともに標本からの光を透過するそれぞれ
異なる波長特性を持った複数の励起ビームスプリッタを
保持し、これら励起ビームスプリッタのうちいずれか１
つの励起ビームスプリッタをレーザ光の光路上に配置す
る励起ビームスプリッタユニットと、この励起ビームス
プリッタにおける励起ビームスプリッタの透過光路上に
少なくとも１段配置され、それぞれ異なる分光波長を持
った複数の分光ビームスプリッタを保持し、これら分光
ビームスプリッタのうちいずれか１つを励起ビームスプ
リッタの透過光路上に配置する分光ビームスプリッタユ
ニットと、この分光ビームスプリッタユニットに保持さ
れているいずれか１つの分光ビームスプリッタの反射光
路上及び透過光路上にそれぞれ各共焦点結像レンズ及び
各共焦点ピンホールを介して配置された複数の光検出器
と、分光ビームスプリッタユニットと共焦点ピンホール
との間に配置された共焦点結像レンズとを具備し、分光
ビームスプリッタユニットから共焦点ピンホールまで無
反射で光を到達させ、かつ励起ビームスプリッタから共
焦点結像レンズまで到達する光の分光フィルタによる反
射回数を１回以内とする共焦点レーザ顕微鏡の調整装置
である。

【００１６】

【発明の実施の形態】(1) 以下、本発明の一実施の形態
について図面を参照して説明する。

【００１７】図１は共焦点レーザ走査型顕微鏡の調整装
置の構成図である。

【００１８】レーザ装置３０は、複数の波長を発振する
もので、そのレーザ出射端にはシングルモードのファイ
バ３１が接続されている。このファイバ３１の出射口に
は、コリメートレンズ３２が配置されファイバ３１から
出射された照明光を適切な大きさの径の平行光に整形す
るものとなっている。

【００１９】このコリメートレンズ３２からのレーザ光
の光路上には、励起用ビームスプリッタユニット３３が
配置されている。この励起用ビームスプリッタユニット
３３は、図２に示すようにターレットの同心円上に反
射、透過の波長特性が異なる４個の励起用ビームスプリ
ッタ３３ａ〜３３ｄが配置されており、ここではビーム
スプリッタ３３ａが光路上に配置されている。

【００２０】このビームスプリッタ３３ａにより反射さ
れたレーザ光は、ＸＹガルバノメータミラー３４により
２次元方向に偏向されるものとなっている。そして、レ
ーザ光は、瞳投影レンズ３５を透過して図示しない顕微
鏡の結像レンズ、対物レンズを通過して標本上にスポッ
トを結び、かつこのスポットが、標本上を２次元に走査
する。

【００２１】そして、標本からの光、ここでは蛍光は、
対物レンズから結像レンズ、瞳投影レンズ３５、ＸＹガ
ルバノメータミラー３４というようにレーザ光を照射し
たときと同じ光路を逆方向に進む。そして、標本を照射
するレーザ光と標本からの蛍光とを分離する励起用ビー
ムスプリッタ３３ａを透過する。

【００２２】この励起用ビームスプリッタ３３ａの透過
光路上には、ミラー３６が配置され、このミラー３６の
反射光路上には、分光用ビームスプリッタ（以下、分光
用フィルタユニットと称する）３７，３８が配置されて
いる。このうち分光用フィルタユニット３７には、図３
に示すように１チャンネル用の分光波長の異なるビーム
スプリッタ、ここではフィルタ３７ａ〜３７ｃ及び１チ
ャンネルでは蛍光検出しないで後続側の２、３チャンネ
ル側に蛍光をスルーさせる光路補正ガラス３７ｄが同心
円上に配置されている。

【００２３】また、分光用フィルタユニット３８には、
図４に示すように２チャンネル用の分光波長の異なるフ
ィルタ３８ａ〜３８ｃ及び２チャンネルでは蛍光検出し
ないで３チャンネル側に蛍光をスルーさせる光路補正ガ
ラス３８ｄが同心円上に配置されている。ここで図１で
は光路上にフィルタ３７ａ，３８ａが配置されている。

【００２４】これら分光用フィルタユニット３７，３８
のうち分光用フィルタ３７ａで反射された１チャンネル
用光路には、共焦点結像レンズ３９、共焦点ピンホール
４０、レーザ反射光をカットするバリアフィルタ４１及
び１チャンネル光検出器４２が配置されている。また、
分光用フィルタ３８ａで反射された２チャンネル用光路
には、共焦点結像レンズ４３、共焦点ピンホール４４、
レーザ反射光をカットするバリアフィルタ４５及び２チ
ャンネル光検出器４６が配置されている。そして、分光
用フィルタ３８ａを透過した３チャンネル用光路には、
共焦点結像レンズ４７、共焦点ピンホール４８、レーザ
反射光をカットするバリアフィルタ４９及び３チャンネ
ル光検出器５０が配置されている。

【００２５】反射ミラー３６で反射した蛍光は、波長の
短い順に１チャンネル、２チャンネル、３チャンネルの
光路に分光用フィルタ３７ａ，３８ａにより分けられ
る。このうち分光用フィルタ３７ａで反射した波長の蛍
光は、共焦点結像レンズ３９により共焦点ピンホール４
０上に結像してバリアフィルタ４１を透過して１チャン
ネルの光検出器４２で検出される。

【００２６】又、分光用フィルタ３７ａを透過して分光
用フィルタ３８ａで反射した波長の蛍光は、共焦点結像
レンズ４３により共焦点ピンホール４４上に結像してバ
リアフィルタ４５を透過して２チャンネルの光検出器４
６で検出される。さらに、分光用フィルタ３８ａを透過
した波長の蛍光は、共焦点結像レンズ４７により共焦点
ピンホール４８上に結像してバリアフィルタ４９を透過
して３チャンネルの光検出器５０で検出されるものとな
っている。

【００２７】これら共焦点ピンホール４０，４４，４８
は、それぞれ各ＸＹ電動ステージ５１，５２，５３に取
り付けられており、各光検出器４２，４６，５０で検出
される光量が最大となるように芯出し調整されている。

【００２８】また、各分光用フィルタ３７ａ，３８ａと
各共焦点ピンホール４０，４４，４８の間には、それぞ
れ各共焦点結像レンズ３９，４３，４７が設けられて、
かつこれら共焦点結像レンズ３９，４３，４７と共焦点
ピンホール４０，４４，４８との間には反射光学系が存
在しないものとなっている。

【００２９】さらに励起用ビームスプリッタ３３ｂから
各共焦点結像レンズ３９，４３，４７に至るまでの光路
の間で、分光用のフィルタユニット３７，３８での反射
回数が１，２チャンネルでは１回、３チャンネルでは０
回と、いずれも１回以下となっている。

【００３０】このような構成では、共焦点ピンホール４
０，４４，４８上のスポット光の結像位置ずれの原因
が、反射部材の折り返し位置に影響されることなく、励
起用ビームスプリッタユニット３３と反射する１個以下
の分光用フィルタユニット３７，３８の切換えによる角
度差のみに限定できる。

【００３１】演算処理装置５４は、１〜３チャンネルの
各光検出器４２，４６，５０の各検出出力信号を受けて
各共焦点ピンホール４０，４４，４８の各調整位置を求
めるもので、第１及び第２の位置データ演算手段５５，
５６及びピンホール調整位置演算手段５７の各機能を有
している。

【００３２】このうち第１の位置データ演算手段５５
は、励起用ビームスプリッタユニット３３における各励
起用ビームスプリッタ３３ａ〜３３ｄの相互間の角度デ
ータ、共焦点ピンホール４８面での光の位置データを求
める機能を有している。

【００３３】第２の位置データ演算手段５６は、各分光
用フィルタユニット３７，３８のそれぞれにおける各分
光用フィルタ３７ａ〜３７ｃ，３８ａ〜３８ｃの相互間
の角度データ、各共焦点ピンホール４０，４４面でのス
ポット光の位置データを求める機能を有している。

【００３４】ピンホール調整位置演算手段５７は、第１
及び第２の位置データ演算手段５５，５６でそれぞれ求
められた各角度データ及び各位置データに基づいて任意
の励起用ビームスプリッタ３３ａ〜３３ｄと各分光フィ
ルタ３７ａ〜３７ｃ、３８ａ〜３８ｃとを組み合わせた
ときの各共焦点ピンホール４０，４４，４８の調整位置
を求める機能を有している。

【００３５】次に上記の如く構成された装置の作用につ
いて説明する。

【００３６】先ず、各励起用ビームスプリッタ３３ａ〜
３３ｄ、分光用フィルタ３７ａ〜３７ｃ、３８ａ〜３８
ｃの切換えに伴う、共焦点ピンホール４０，４４，４８
の調整値の演算について説明する。最初に、第１の位置
データ演算手段５５の作動により各励起用ビームスプリ
ッタ３３ａ〜３３ｄの相互の角度データ、共焦点ピンホ
ール４８面でのスポット光の位置データを求める。

【００３７】励起用ビームスプリッタ３３ａを光路にい
れ、分光用フィルタユニット３７の光路に光路補正ガラ
ス３７ｄをセットするとともに分光用フィルタユニット
３８の光路に光路補正ガラス３８ｄをセットする。これ
ら補正ガラス３７ｄ，３８ｄは、光の角度には影響せず
に光を平行移動させて、各共焦点結像レンズ３９，４
３，４７の中心付近に光が入射するようにする為のもの
である。そして、３チャンネルの検出器５０の光量が最
大となるように共焦点ピンホール４８を電動ＸＹステー
ジ５３により駆動、調整する。

【００３８】次に、励起用ビームスプリッタ３３ｂ，３
３ｃ，３３ｄと順次切換えて、各々の励起用ビームスプ
リッタ３３ｂ，３３ｃ，３３ｄに対して、各共焦点ピン
ホール４８の位置調整を上記同様に行う。ここで、この
時のＸＹ電動ステージ５３の座標値（スポット光の位
置）が下記の値であったとする。

【００３９】 ３チャンネルの共焦点ピンホール４８の座標 励起用ビームスプリッタが３３ａのとき （Ｘ３ａ，Ｙ３ａ） 励起用ビームスプリッタが３３ｂのとき （Ｘ３ｂ，Ｙ３ｂ） 励起用ビームスプリッタが３３ｃのとき （Ｘ３ｃ，Ｙ３ｃ） 励起用ビームスプリッタが３３ｄのとき （Ｘ３ｄ，Ｙ３ｄ） 左がＸ座標、右側がＹ座標。

【００４０】従って、次にビームスプリッタ３３ａに対
するそれぞれのビームスプリッタの共焦点ピンホール４
８の調整位置の座標の変化量は下記のようになる。

【００４１】励起用ビームスプリッタ３３ｂについて （ΔＲＸ３ｂ，ΔＲＹ３ｂ）＝（Ｘ３ｂ−Ｘ３ａ，Ｙ３
ｂ−Ｙ３ａ） 励起用ビームスプリッタ３３ｃについて （ΔＲＸ３ｃ，ΔＲＹ３ｃ）＝（Ｘ３ｃ−Ｘ３ａ，Ｙ３
ｃ−Ｙ３ａ） 励起用ビームスプリッタ３３ｄについて （ΔＲＸ３ｄ，ΔＲＹ３ｄ）＝（Ｘ３ｄ−Ｘ３ａ，Ｙ３
ｄ−Ｙ３ａ） 左がＸ成分、右がＹ成分の座標の変化量を示す。

【００４２】ここで、共焦点結像レンズ３９，４３，４
７の焦点距離をｆとすると、基準となるビームスプリッ
タ３３ａに対する、他の励起用ビームスプリッタ３３
ｂ，３３ｃ，３３ｄの角度差は下記のようになる。

【００４３】励起用ビームスプリッタ３３ｂについて （ΔθＲＸｂ，ΔθＲＹｂ）＝｛ｔａｎ^-1（ΔＲＸ３ｂ
／ｆ），ｔａｎ^-1（ΔＲＹ３ｂ／ｆ）｝ 励起用ビームスプリッタ３３ｃについて （ΔθＲＸｃ，ΔθＲＹｃ）＝｛ｔａｎ^-1（ΔＲＸ３ｃ
／ｆ），ｔａｎ^-1（ΔＲＹ３ｃ／ｆ）｝ 励起用ビームスプリッタ３３ｄについて （ΔθＲＸｄ，ΔθＲＹｄ）＝｛ｔａｎ^-1（ΔＲＸ３ｄ
／ｆ），ｔａｎ^-1（ΔＲＹ３ｄ／ｆ）｝ 左がＸ成分の角度差、右がＹ成分の角度差を示す。

【００４４】次に、第２の位置データ演算手段５６の作
動により分光用フィルタユニット３７，３８内の複数の
分光用フィルタ３７ａ〜３７ｃ，３８ａ〜３８ｃの相互
間の角度データ、各共焦点ピンホール４０，４４面での
スポット光の位置データを求める。

【００４５】光路上に基準となる励起用ビームスプリッ
タ３３ａを入れ、分光用フィルタユニット３７の分光用
フィルタを３７ａにセットする。そして、１チャンネル
の光検出器４２の光量が最大となるように、共焦点ピン
ホール４０を電動ＸＹステージ５１により駆動、調整す
る。

【００４６】同様に、分光用フィルタユニット３７の分
光用フィルタを３７ｂ，３７ｃと順次切換えて、各々の
分光用フィルタ３７ｂ，３７ｃに対して共焦点ピンホー
ル４０の位置調整を行う。ここで、このときのＸＹ電動
ステージ５１（スポット光の位置）の座標値が下記の値
であったとする。

【００４７】１チャンネル共焦点ピンホール（４０）に
ついて 励起用ビームスプリッタ３３ａと分光用フィルタ３７ａ
の組み合わせは （Ｘ３ａ７ａ，Ｙ３ａ７ａ） 励起用ビームスプリッタ３３ａと分光用フィルタ３７ｂ
の組み合わせは （Ｘ３ａ７ｂ，Ｙ３ａ７ｂ） 励起用ビームスプリッタ３３ａと分光用フィルタ３７ｃ
の組み合わせは （Ｘ３ａ７ｃ，Ｙ３ａ７ｃ） 従って、分光用フィルタ３７ａに対するそれぞれの分光
用フィルタ３７ａ〜３７ｃの共焦点ピンホール４０の調
整位置の座標の変化量は下記のようになる。

【００４８】分光用フィルタ３７ｂについて （ΔＢＸ７ｂ，ΔＢＹ７ｂ）＝（Ｘ３ａ７ｂ−Ｘ３ａ７
ａ，Ｙ３ａ７ｂ−Ｙ３ａ７ａ） 分光用フィルタ３７ｃについて （ΔＢＸ７ｃ，ΔＢＹ７ｃ）＝（Ｘ３ａ７ｃ−Ｘ３ａ７
ａ，Ｙ３ａ７ｃ−Ｙ３ａ７ａ） 左がＸ成分、右がＹ成分の座標の変化量を示す。

【００４９】また、分光用フィルタ３７ａに対する、他
の分光用フィルタ３７ｂ，３７ｃの角度差は下記のよう
になる。

【００５０】分光用フィルタ３７ｂについて ｛ΔθＢＸ７ｂ，ΔθＢＹ７ｂ｝＝｛ｔａｎ^-1（ΔＢＸ
７ｂ／ｆ），ｔａｎ^-1（ΔＢＹ７ｂ／ｆ）｝ 分光用フィルタ３７ｃについて ｛ΔθＢＸ７ｃ，ΔθＢＹ７ｃ｝＝｛ｔａｎ^-1（ΔＢＸ
７ｃ／ｆ），ｔａｎ^-1（ΔＢＹ７ｃ／ｆ）｝ 左がＸ成分の角度差、右がＹ成分の角度差を示す。

【００５１】次に、前述したのと同様に光路上に基準と
なる励起用ビームスプリッタ３３ａを入れ、分光用フィ
ルタユニット３７のフィルタを光路補正ガラス３７ｄに
セットし、分光用フィルタユニット３８の分光用フィル
タ３８ａにセットする。そして、２チャンネルの検出器
４６の光量が最大となるように共焦点ピンホール４４を
電動ＸＹステージ５２により駆動、調整する。

【００５２】同様に、分光用フィルタユニット３８の分
光用フィルタ３８ｂ，３８ｃと順次切換えて、各々の分
光用フィルタ３８ｂ，３８ｃに対して、共焦点ピンホー
ル４４の位置調整を行う。ここで、このときのＸＹ電動
ステージ５２の座標値（スポット光の位置）が下記の値
であったとする。

【００５３】２チャンネル共焦点ピンホール（４４）に
ついて 励起用ビームスプリッタ３３ａと分光用フィルタ３８ａ
の組み合わせは （Ｘ３ａ８ａ，Ｙ３ａ８ａ） 励起用ビームスプリッタ３３ａと分光用フィルタ３８ｂ
の組み合わせは （Ｘ３ａ８ｂ，Ｙ３ａ８ｂ） 励起用ビームスプリッタ３３ａと分光用フィルタ３８ｃ
の組み合わせは （Ｘ３ａ８ｃ，Ｙ３ａ８ｃ） 右側はＸ成分の座標、左側はＹ成分の座標を示す。

【００５４】従って、分光用フィルタ３８ａに対するそ
れぞれの分光用フィルタ３８ａ〜３８ｃの共焦点ピンホ
ール４４の調整位置の変化量を下記のようになる。

【００５５】分光用フィルタ３８ｂについて （ΔＢＸ８ｂ，ΔＢＹ８ｂ）＝（Ｘ３ａ８ｂ−Ｘ３ａ８
ａ，Ｙ３ａ８ｂ−Ｙ３ａ８ａ） 分光用フィルタ３８ｃについて （ΔＢＸ８ｃ，ΔＢＹ８ｃ）＝（Ｘ３ａ８ｃ−Ｘ３ａ８
ａ，Ｙ３ａ８ｃ−Ｙ３ａ８ａ） 左がＸ成分、右がＹ成分の変化量を示す。

【００５６】次に、分光用フィルタ３８ａに対する、他
の分光用フィルタ３８ｂ，３８ｃの角度差は下記のよう
になる。

【００５７】分光用フィルタ３８ｂについて ｛ΔθＢＸ８ｂ，ΔθＢＹ８ｂ｝＝｛ｔａｎ^-1（ΔＢＸ
８ｂ／ｆ），ｔａｎ^-1（ΔＢＹ８ｂ／ｆ）｝ 分光用フィルタ３８ｃについて ｛ΔθＢＸ８ｃ，ΔθＢＹ８ｃ｝＝｛ｔａｎ^-1（ΔＢＸ
８ｃ／ｆ），ｔａｎ^-1（ΔＢＹ８ｃ／ｆ）｝ 左がＸ成分の角度差、右がＹ成分の角度差を示す。

【００５８】次に、ピンホール調整位置演算手段５７の
作動により上記データから任意の励起用ビームスプリッ
タ３３ａ〜３３ｄと分光用フィルタ３７ａ〜３７ｄ，３
８ａ〜３８ｄを組み合わせたときの共焦点ピンホール４
０，４４，４８の調整位置の演算方法を示す。

【００５９】励起用ビームスプリッタ３３ｂ，３３ｃ，
３３ｄおよび分光用フィルタ３７ｂ，３７ｃを組み合わ
せたときの共焦点ピンホール４０の位置は下記のように
なる。

【００６０】 ｛Ｘ３ｐ７ｑ，Ｙ３ｐ７ｑ｝ ＝｛Ｘ３ａ７ａ＋ｆ＊ｔａｎ（ΔθＲＸｐ＋ΔθＢＸ７ｑ）， Ｙ３ａ７ａ＋ｆ＊ｔａｎ（ΔθＲＹｐ＋ΔθＢＹ７ｑ）｝ …（１） ｐ＝ｂ，ｃ，ｄ ｑ＝ｂ，ｃ 右側は調整値のＸ座標、左側は調整値のＹ座標を示す。

【００６１】または、 ｛Ｘ３ｐ７ｑ，Ｙ３ｐ７ｑ｝ ＝｛Ｘ３ａ７ｑ＋ｆ＊ｔａｎ（ΔθＲＸｐ）， Ｙ３ａ７ｑ＋ｆ＊ｔａｎ（ΔθＲＹｐ）｝ …（２） ｐ＝ｂ，ｃ，ｄ ｑ＝ｂ，ｃ 次に、励起用ビームスプリッタ３３ｂ，３３ｃ，３３ｄ
および分光用フィルタ３８ｂ，３８ｃを組み合わせたと
きの共焦点ピンホール４４の位置は下記のようになる。

【００６２】 ｛Ｘ３ｐ８ｑ，Ｙ３ｐ８ｑ｝ ＝｛Ｘ３ａ８ａ＋ｆ＊ｔａｎ（ΔθＲＸｐ＋ΔθＢＸ８ｑ）， Ｙ３ａ８ａ＋ｆ＊ｔａｎ（ΔθＲＹｐ＋ΔθＢＹ８ｑ）｝ …（３） ｐ＝ｂ，ｃ，ｄ ｑ＝ｂ，ｃ または ｛Ｘ３ｐ８ｑ，Ｙ３ｐ８ｑ｝ ＝｛Ｘ３ａ８ｑ＋ｆ＊ｔａｎ（ΔθＲＸｐ）， Ｙ３ａ８ｑ＋ｆ＊ｔａｎ（ΔθＲＹｐ）｝ …（４） ｐ＝ｂ，ｃ，ｄ ｑ＝ｂ，ｃ 以上、組み合わせにおける各共焦点ピンホール４０，４
４，４８の位置の演算方法である。なお上記式（１），
（３）は、励起用ビームスプリッタ３３ａと分光用フィ
ルタ３７ａおよび３８ａのときの調整値を基準にして、
複数の励起用ビームスプリッタの基準３３ａに対する角
度差および分光用フィルタユニット内の複数の分光用フ
ィルタの基準３７ａ，３８ａに対する角度差から調整位
置を計算している。これに対して式（２），（４）で
は、励起用ビームスプリッタ３３ａと各分光用フィルタ
３８ｂ，３８ｃを組み合せたときの共焦点ピンホールの
調整値を元に、基準となる励起用ビームスプリッタ３３
ａに対する組み合せて使用する他の励起用ビームスプリ
ッタ３３ｂ〜３３ｄの角度差から調整位置を計算してい
る。どちらの演算方法を用いてもよいが、式（２），
（４）の演算方法の方が演算回数が少なくなり望まし
い。また、分光用フィルタを透過するとき、光軸の角度
が基本的に変化しないことを前提として計算している。
これらのフィルタの平行度は３″程度に加工容易なので
光軸の角度には影響しない。

【００６３】このように上記一実施の形態においては、
各励起用ビームスプリッタ３３ａ〜３３ｄの相互間の角
度データ、共焦点ピンホール４８面でのスポット光の位
置データを求め、次に分光用フィルターユニット３７，
３８内の各分光用フィルタ３７ａ〜３７ｃ、３８ａ〜３
８ｃの相互間の角度データ、各共焦点ピンホール４０，
４４面でのスポット光の位置データを求め、次にこれら
角度データ、位置データに基づいて任意の励起用ビーム
スプリッタ３３ａ〜３３ｄと分光用フィルタ３７ａ〜３
７ｄ，３８ａ〜３８ｄを組み合わせたときの各共焦点ピ
ンホール４０，４４，４８の調整位置を演算し求めるよ
うにしたので、共焦点ピンホール上の結像位置ずれの原
因を、励起用ビームスプリッタ３３ａ〜３３ｄと反射す
る１個以下の分光用フィルタ３７ａ〜３７ｃ，３８ａ〜
３８ｃの切換えによる角度差のみに限定でき、励起用ビ
ームスプリッタ３３ａ〜３３ｄまたは分光用フィルタユ
ニット３７，３８内のフィルタ３７ａ〜３７ｃ，３８ａ
〜３８ｃの相互間の角度データまたは位置データから任
意の励起用ビームスプリッタ３３ａ〜３３ｄと分光用フ
ィルタ３７ａ〜３７ｃ，３８ａ〜３８ｃを組み合わせた
ときの共焦点ピンホール４０，４４，４８の調整値を演
算により求めることが可能となり、たとえ切換えるビー
ムスプリッタの個数が増えても、又使用する共焦点ピン
ホールの数が増えても、共焦点ピンホールの調整回数、
工数を大幅に削減できる。

【００６４】例えば、本実施の形態の構成で従来技術の
ように全ての組み合わせの調整を行なうと、 ４（励起用ビームスプリッタの個数）＊３（分光用フィ
ルタユニット内のフィルタ数）＊２（分光用フィルタユ
ニットの数）＋４（３チャンネル目の調整数、励起用ビ
ームスプリッタの数）＝２８通り の調整が必要になるところ、本発明では、 ４（励起用ビームスプリッタの数）＋３（分光用フィル
タユニット内のフィルタ数）＊２（分光用フィルタユニ
ットの数）＝１０通り の調整で済み、共焦点ピンホール調整回数が１８回削減
でき、大幅な調整工数の削減となる。

【００６５】なお、本発明は、上記一実施の形態に限定
されるものでなく次の通り変形してもよい。

【００６６】例えば、上記一実施の形態では、励起用ビ
ームスプリッタユニット３３と分光用フィルタユニット
３７，３８をターレット方式により切換えたが、リニア
ガイドを用いたスライド機構でも良い。また、検出チャ
ンネルを３個、分光用フィルタユニットが２個の構成で
あるが、検出チャンネルを４個、５個と増やしていって
も良く、また、増やした方が効果が大きくなるのは言う
までもない。分光用フィルタユニット３７，３８は検出
チャンネル数より、通常、１つ少なくなるので、検出チ
ャンネル数をＮ（Ｎは２以上）とすると、分光用フィル
タユニット数は（Ｎ−１）個となる。

【００６７】又、本発明は、上記一実施の形態に限定さ
れるものでなく、例えば光路補正ガラスを備えていなく
て、全て分光用フィルタである分光用フィルタユニット
であってもよく、光路補正ガラスの代りに分光用フィル
タを用いても上述したものと同様の調整が可能である。

【００６８】

【発明の効果】以上詳記したように本発明によれば、切
り換えるビームスプリッタの個数が増えても又は使用す
る共焦点ピンホールの数が増えても、共焦点ピンホール
の調整回数を少なくして調整工数を大幅に削減できる共
焦点レーザ顕微鏡の調整方法及びその装置を提供でき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係わる共焦点レーザ走査型顕微鏡の調
整装置の一実施の形態を示す構成図。

【図２】同装置における励起用ビームスプリッタユニッ
トの構成図。

【図３】同装置における分光用フィルタユニットの構成
図。

【図４】同装置における分光用フィルタユニットの構成
図。

【図５】従来技術における光路の概略図。

【符号の説明】

３０：レーザ装置、 ３１：ファイバ、 ３２：コリメータレンズ、 ３３：励起用ビームスプリッタユニット、 ３３ａ〜３３ｄ：励起用ビームスプリッタ、 ３４：ＸＹガルバノメータミラー、 ３５：瞳投影レンズ、 ３６：ミラー、 ３７，３８：分光用フィルタユニット、 ３７ａ〜３７ｃ，３８ａ〜３８ｃ：分光用フィルタ、 ３７ｄ，３８ｄ：光路補正ガラス、 ３９，４３，４７：共焦点結像レンズ、 ４０，４４，４８：共焦点ピンホール、 ４１，４５，４９：バリアフィルタ、 ４２，４６，５０：光検出器、 ５１，５２，５３：ＸＹ電動ステージ、 ５４：演算処理装置、 ５５：第１の位置データ演算手段、 ５６：第２の位置データ演算手段、 ５７：ピンホール調整位置演算手段。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G043 AA01 DA06 EA01 FA01 FA02 GA04 GB01 GB03 GB18 GB19 HA01 HA02 HA05 HA09 JA00 JA01 JA03 KA09 LA01 NA01 2H052 AA08 AA09 AB24 AB25 AC04 AC15 AC26 AC29 AC34 AD33 AD35 AD36 AF07

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 レーザ光を標本側に反射するとともに前
   記標本からの光を透過するそれぞれ異なる波長特性を持
   った複数の励起ビームスプリッタを保持し、これら励起
   ビームスプリッタのうちいずれか１つの励起ビームスプ
   リッタを前記レーザ光の光路上に配置する励起ビームス
   プリッタユニットと、 この励起ビームスプリッタにおける前記励起ビームスプ
   リッタの透過光路上に少なくとも１段配置され、それぞ
   れ異なる分光波長を持った複数の分光ビームスプリッタ
   を保持し、これら分光ビームスプリッタのうちいずれか
   １つを前記励起ビームスプリッタの透過光路上に配置す
   る分光ビームスプリッタユニットと、 この分光ビームスプリッタユニットに保持されているい
   ずれか１つの分光ビームスプリッタの反射光路上及び透
   過光路上にそれぞれ各共焦点結像レンズ及びピンホール
   を介して配置された複数の光検出器とを備え、 複数の前記励起ビームスプリッタの相互間の角度デー
   タ、前記共焦点ピンホール面での光の位置データを求め
   る第１の工程と、 前記分光ビームスプリッタユニットにおける複数の前記
   分光ビームスプリッタの相互間の角度データ、前記共焦
   点ピンホール面での光の位置データを求める第２の工程
   と、 前記第１及び第２の工程で求められた各角度データ及び
   各位置データに基づいて任意の前記励起ビームスプリッ
   タと前記分光ビームスプリッタとを組み合わせたときの
   前記各共焦点ピンホールの調整位置を求める第３の工程
   と、を有することを特徴とする共焦点レーザ顕微鏡の調
   整方法。
2. 【請求項２】 レーザ光を標本側に反射するとともに前
   記標本からの光を透過するそれぞれ異なる波長特性を持
   った複数の励起ビームスプリッタを保持し、これら励起
   ビームスプリッタのうちいずれか１つの励起ビームスプ
   リッタを前記レーザ光の光路上に配置する励起ビームス
   プリッタユニットと、 この励起ビームスプリッタにおける前記励起ビームスプ
   リッタの透過光路上に少なくとも１段配置され、それぞ
   れ異なる分光波長を持った複数の分光ビームスプリッタ
   を保持し、これら分光ビームスプリッタのうちいずれか
   １つを前記励起ビームスプリッタの透過光路上に配置す
   る分光ビームスプリッタユニットと、 この分光ビームスプリッタユニットに保持されているい
   ずれか１つの分光ビームスプリッタの反射光路上及び透
   過光路上にそれぞれ各共焦点結像レンズ及び各共焦点ピ
   ンホールを介して配置された複数の光検出器と、 前記分光ビームスプリッタユニットと前記共焦点ピンホ
   ールとの間に配置された共焦点結像レンズとを具備し、 前記分光ビームスプリッタユニットから前記共焦点ピン
   ホールまで無反射で光を到達させ、かつ前記励起ビーム
   スプリッタから前記共焦点結像レンズまで到達する光の
   分光フィルタによる反射回数を１回以内とすることを特
   徴とする共焦点レーザ顕微鏡の調整装置。