JP2000262247A - 免疫調節剤、免疫調節食品および免疫調節飼料 - Google Patents

免疫調節剤、免疫調節食品および免疫調節飼料

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JP2000262247A JP11075396A JP7539699A JP2000262247A JP 2000262247 A JP2000262247 A JP 2000262247A JP 11075396 A JP11075396 A JP 11075396A JP 7539699 A JP7539699 A JP 7539699A JP 2000262247 A JP2000262247 A JP 2000262247A
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幸作 村田
Yasuki Fukuda
泰樹 福田
Mizuo Yajima
瑞夫 矢嶋
Koichi Katsuyama
浩一 勝山
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Asama Chemical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 注射によらないで、経口的または経皮的なＤ
ＮＡの投与、または日常的に食品のように摂取すること
が可能な免疫調節剤または免疫調節食品、飼料を提供す
ること 【解決手段】 枯草菌、乳酸菌、アミノ酸醗酵菌および
大腸菌のような原核微生物の細胞由来のＤＮＡを食品に
添加し、または成形して経口的、経皮的、経粘膜的に投
与できるようにし、また食品、飼料等とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は原核微生物の細胞由
来のＤＮＡを用いる生体の免疫機能調節剤、免疫調節食
品、免疫調節飼料およびトローチ、外用剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体の免疫機能を適切に賦活すること
は、風邪を始めとする感染症や癌の一次予防、アレルギ
ー・アトピー性疾患の予防などに重要と考えられる。原
核微生物の細胞のＤＮＡに免疫増強作用があり、真核微
生物細胞のＤＮＡにはないことは知られていた。しか
し、ＤＮＡの免疫調節活性は試験管内におけるデオキシ
リボヌクレアーゼ処理により失活する（Yamamoto S.,et
al.,Microbiol. Immunol.,36, 983-997, 1992）。ヒト
および動物の消化液酵素にはデオキシリボヌクレアーゼ
が含まれているので、これまでＤＮＡの免疫調節活性は
このものの注射投与でのみ有効と考えられていた。
【０００３】しかし、注射投与は身体に損傷を与え、度
重なる投与には不適である。免疫の増強が必要とされる
体質の改善には、むしろ、日常的に食品のように摂取す
ることにより、または皮膚粘膜に接触させることにより
目的が達成されることが実用上重要である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明の課題
は、注射によらない、例えば経口的、経皮的ＤＮＡの投
与が可能な、または日常的に食品や飼料のように摂取す
ることの可能な免疫調節剤を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため鋭意研究の結果、枯草菌、乳酸菌などの原
核微生物由来のＤＮＡを用いて、経口的、または経皮的
に投与したところ、意外にも免疫調節活性を発現し、本
発明に到達した。
【０００６】すなわち、本発明は、原核微生物の細胞よ
り抽出されたＤＮＡを有効成分とする免疫調節剤であ
り、また免疫調節食品、免疫調節飼料である。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明において、原核微生物とし
ては、特別な細菌であることを要しないが、安全性の観
点から、枯草菌（Bacillus属) 、乳酸菌、アミノ酸醗酵
菌および大腸菌等を挙げることができる。中でも、食品
生産に用いられる納豆菌、乳酸菌、アミノ酸醗酵菌が特
に好ましい。乳酸菌としては、好ましくは Lactobacill
is casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
del-brueckii, Streptococcusfaecalis, Biphidobacte
rium longumなどを挙げることができ、アミノ酸醗酵菌
としては、例えば Corynebacterium glutamicum, Coryn
ebacterium herculis, Brevibacterium flavum, Microb
acterium ammoniaphilum, Escherichia coliを挙げるこ
とができる。
【０００８】原核微生物の細胞からのＤＮＡの調製法は
公知の方法によることができるが、例えば、Corynebact
erium glutamicumを適当な培地で培養した後、遠心分離
して集菌し、０．８５％生理食塩水で洗浄後、生理食塩
液または精製水に懸濁し、リゾチームなどの細菌細胞壁
溶解酵素を添加して菌体を溶解する。この溶解液に冷却
された純エタノールを徐々に加えて、エタノール濃度が
４０重量％で不溶化してくるＤＮＡをガラス棒で巻き取
る。得られたＤＮＡを６０重量％エタノール、７０重量
％エタノール、８０重量％エタノールで順次洗浄後、真
空下で乾燥させ高純度のＤＮＡ標品が得られる。
【０００９】得られたＤＮＡ標品をそのまま食品や飼
料、飲料に添加したり、通常医薬品製造で用いられてい
る増量剤、賦形剤などと混合し、必要に応じて適当な剤
形に成形し、製剤または食品とすることができる。ま
た、液剤とすることもできる。
【００１０】原核微生物ＤＮＡの免疫調節活性は化学的
に安定であり、通常の飼料に添加しても、実施例４およ
び実施例５に示した如く、飼料成分と反応したり熱失活
することはなかった。このことは、本ＤＮＡを含有する
免疫調節食品および免疫調節剤の製造工程に、加熱調理
や加熱殺菌処理も自由に実施出来ることを示している。
原核微生物由来ＤＮＡの免疫調節活性は、上記の如く安
定なものであり、経時変化は認められず、従って該当製
品の保存、流通の過程で機能が失われることはない。
【００１１】ＤＮＡは、免疫調節剤として水溶液の形で
投与する場合には、特に、ＤＮＡ分画を超音波処理また
は制限酵素処理などにより低分子化すると、粘度が低下
し、飲用に好都合である。超音波処理は、例えば、ＤＮ
Ａ標品を１％濃度になるように精製水を加え、氷水で冷
却しながら５分乃至２０分間超音波を照射する。原核微
生物の細胞由来のＤＮＡ分子が免疫調節活性を発現する
のは塩基配列に特徴があり、真核細胞と異なり、ＣｐＧ
配列を多く含むことに起因することが知られている（Kr
ieg A. M.et.al, Nature 374; 546-549, 1995)。従っ
て、制限酵素処理は、制限酵素のうち、ＣｐＧ結合を切
断するもの以外であれば特に選ばない。酵素処理は通常
の制限酵素処理方法によればよい。
【００１２】ＤＮＡを食品に添加して与える場合、対象
となる食品には特に制約はないが、例えば、パン、麺、
米飯等の主食類；カマボコ、ハム、ソーセージ、調理サ
ラダ、漬物等の副食物；みそ、しょうゆ、スープ、タ
レ、ドレッシング等の調味料；牛乳、ココア飲料、バタ
ー、マーガリン、チーズ、アイスクリーム等の乳製品；
クッキー、ビスケット、ウエハス、あめ、チューインガ
ムなどの菓子類；果汁飲料、ジャム等の果実加工品；ペ
ット飼料、水産・畜産用飼料等に添加できる。
【００１３】本発明におけるＤＮＡを主剤として与える
場合は粉末、顆粒、倍散、カプセル、お菓子、ドリンク
剤などの経口的用途が可能である。その他、経皮的に軟
膏、湿布剤、液剤、浴剤、経粘膜的にトローチ、座剤、
うがい剤とすることも可能である。経皮的用途には上記
低分子化されたものが好適である。本発明の免疫調節剤
は経口摂取で用いる場合の標準的な摂取量はＤＮＡとし
て一日０．００１〜１００ｇ相当量で、特に上限はな
い。経皮的用途の場合のＤＮＡの濃度は０．００１〜１
００％であるが、特に制約はない。
【００１４】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明する。なお、実施例中、％、部はともに重量基準で
ある。
【００１５】実施例１（細胞ＤＮＡの抽出） ブイヨン培地１０ｍｌを含むＬ字管に Corynebacterium
glutamicum IAM 12435 を摂取し、３０℃で７時間振盪
培養した。この培養液の各１ｍｌを三村らの培地（醗酵
工学雑誌 第４１巻 第５号 ｐ．275-281, 1863)１０
０ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコ１０本に接種
し、３０℃で２１時間振盪培養した。この培養物をさら
に２４リットルの三村らの培地に加え、ジャーファーメ
ンターで培養を継続した。なお、この時対数期にペニシ
リンＧを０．２ユニット／ｍｌになるように添加した。
菌体を遠心して集菌し、約１，０００ｇの湿菌体を得
た。生理食塩液で１回遠心洗浄の後、菌体に生理食塩水
５リットルを加えて懸濁し、攪拌しながら卵白リゾチー
ム１ｇを加え、３７℃で２時間攪拌の後、６５℃に温度
を上昇させて菌体を破壊させ、−２０℃に冷却した純エ
タノールを徐々に添加して、エタノール濃度が４０％で
不溶化してくるＤＮＡをガラス棒で巻取り、得られたＤ
ＮＡを６０％エタノール、７０％エタノール、８０％エ
タノールで順次洗浄後、真空下で乾燥させ、５ｇのＤＮ
Ａ標品を得た。
【００１６】実施例２（ＤＮＡの超音波処理） 実施例１で得られたＤＮＡ標品を１０ｍｇ／ｍｌ濃度に
精製水にとかし、超音波処理装置（久保田製作所（株）
製、Insonator 201M型) の容器にＤＮＡ溶液を７０ｍｌ
入れ、０℃で冷却しながら９０ｋＨｚで５分間超音波処
理した。これに−２０℃の純冷エタノールを２倍量加
え、一昼夜−２０℃に放置後沈殿物を遠心分離し、真空
乾燥により超音波処理ＤＮＡ標品７００ｍｇを得た。
【００１７】実施例３（ＤＮＡの制限酵素分解） 実施例１で得られたＤＮＡ標品に精製水を加えてＤＮＡ
として１０ｍｇ／ｍｌ濃度に溶かし、この１ｍｌに対
し、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、１ｍＭ Dithiothreitol 、
１００ｍＭＮａＣｌに含むｐＨ７．５の１００ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液１ｍｌを加え、さらに制限酵素EcoRI(タカ
ラ酒造（株）製）１万単位を加えて３７℃で２時間反応
させた。これに３Ｍの酢酸ナトリウム溶液を０．２ｍｌ
加えた後、−２０℃の純冷エタノールを２．５倍量加
え、一昼夜−２０℃に放置後沈殿物を遠心分離し、沈殿
を６０％エタノール、７０％エタノール、８０％エタノ
ールで順次リンスし、真空下で乾燥させ、８ｍｇの制限
酵素処理ＤＮＡ標品が得られた。
【００１８】実施例４（細菌ＤＮＡを添加した飼料また
は飲水による細網内皮系の賦活） 免疫調節作用の指標として、細網内皮系の賦活に及ぼす
細菌ＤＮＡの影響を検査した。飲水での投与は、溶液の
粘度を低下させるために、超音波処理した評品を用い
た。ＩＣＲ系雌６週令のマウスを１群５匹とし、ＤＮＡ
として０．１％、１％に含むＤＮＡ添加飼料、またはＤ
ＮＡ添加飲水を与えた。７日間連続して与えた後、コロ
イド状カーボン（ペリカンインク）を８ｍｇ／１００ｇ
体重宛静脈内に投与し、０、３、６、９、１２、１５分
後に眼底静脈叢より２０μｌを採血し、０．１％炭酸ナ
トリウム４ｍｌに加え、波長６７５ｎｍでの吸光度を測
定した。カーボンの血液中からの半減消失時間（cleara
nce rate t 1/2) はＫａｔｏらの方法（Kato I. etal.,
Microbiol. Immunol.,27,611-618, 1983）により算出し
た。結果を表１に示した。
【００１９】
【表１】
【００２０】表１の結果のごとく、細菌由来のＤＮＡに
は細網内皮系の賦活作用が認められるのに対し、真核細
胞（酵母）のＤＮＡにはその活性は認められなかった。
【００２１】なお、B.natto ＤＮＡは実施例１に準じて
調製した。また、酵母ＤＮＡは Saccharomyces cerevis
iae FT-1をＹＰＤ培地（２．０％ブドウ糖、１％酵母エ
キス、２．０％バクトペプトン、ｐＨ５．０）に接種
し、３０℃にて培養した菌体をＥＤＴＡを０．１ｍＭ含
有するTris−塩酸緩衝液ｐＨ７．０中でザイモリエイス
（生化学工業（株）製）１０単位／ｍｌ処理により溶菌
の後、ＳＤＳを２％に加えて酵母核を破壊し、さらに、
実施例１の場合と同様に純冷エタノール処理により酵母
ＤＮＡ標品を調製した。また、B.nattｏＤＮＡおよび酵
母ＤＮＡの超音波処理物は実施例２にそれぞれ準じて調
製した。
【００２２】実施例５（細菌ＤＮＡを添加した飼料又は
飲水による癌の増殖抑制） 細菌ＤＮＡ標本として、C.glutamicum IAM 12435由来Ｄ
ＮＡ（実施例１）、および比較対照として、実施例４に
記載した酵母由来のＤＮＡを用いた。各ＤＮＡ評品をＤ
ＮＡとして１％含有する飼料（品温９０℃で２０分加熱
処理）としたもの、およびＤＮＡとして１％濃度に飲水
に添加したもの（９０℃、２０分加熱処理）を、雌性Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスに自由に摂取させ、２週後にMeth-A腫
瘍を背側部皮下に１×１０6 個を移植し、さらにＤＮＡ
添加飼料を与え続け、腫瘍移植の１５日目に腫瘍を摘出
し、その重量を測定した。結果を表２に示した。
【００２３】
【表２】
【００２４】なお、飼料の調製は下記のように行った。
すなわち、カゼイン２０部、コーン油１０部、ミネラル
ミックス（オリエンタル酵母（株）製）３０部、ビタミ
ンミックス（オリエンタル酵母（株）製）２．０部、コ
ーン澱粉４９部、砂糖１０部、セルロース５部、実施例
１で造ったＤＮＡ１．０部の処方で、常法により配合飼
料を造った。
【００２５】表２より、原核微生物の細胞由来のＤＮＡ
の摂取により、腫瘍の増殖は抑制された。
【００２６】実施例６（外用剤の調製） 皮膚外用液剤を下記の処方により調製した。 超音波処理 C.glutamicum IAM 12435 ＤＮＡ 1.0 ％ グリセリン 5.0 ％ プロピレングリコール 4.0 ％ オレイルアルコール 0.1 ％ エタノール 5.0 ％ 安息香酸 0.05％ 精製水 84.9％ 精製水に超音波処理ＤＮＡ（実施例２）、グリセリン、
プロピレングリコールを加え溶解した。一方、エタノー
ルにオレイルアルコール、安息香酸を室温で溶解した。
これを精製水部に加えて可溶化し、９０℃、２０分加熱
して濾過後、充填した。
【００２７】実施例７（外用剤の調製） 皮膚外用液剤を下記の処方により調製した。 制限酵素処理 C.glutamicum IAM 12435 ＤＮＡ1.0.％ グリセリン 5.0 ％ プロピレングリコール 4.0 ％ オレイルアルコール 0.1 ％ エタノール 5.0 ％ 安息香酸 0.05％ 精製水 84.9％ 精製水に制限酵素処理ＤＮＡ（実施例３）、グリセリ
ン、プロピレングリコールを加え溶解した。一方、エタ
ノールにオレイルアルコール、安息香酸を室温で溶解し
た。これを精製水部に加えて可溶化し、濾過後、充填し
た。
【００２８】実施例８（トローチ剤の調製） トローチ剤を下記の処方により、１００錠分として処方
した。 白糖（微粉末） 100g アラビアゴム（微粉末） 8g 超音波処理ＤＮＡ 5g メントール 0.6mg チモール 0.6mg ユーカリ油 0.002ml レモン油 0.002ml 水 適量 湿式法により顆粒を作り、打錠して１錠約１．２ｇのト
ローチ剤とした。
【００２９】実施例９ 実施例１で得られた C.glutamicum IAM 12435 ＤＮＡ粉
末９０ｍｇ、デンプン３０ｍｇ、アビセル（セルロー
ス、旭化成製）１８０ｍｇの割合で混合して１錠３００
ｍｇのタブレット型の食品を常法により製造した。
【００３０】実施例１０ 実施例１で得られた C.glutamicum IAM 12435 ＤＮＡ粉
末０．０５部、ココアバター１０部、グラニュー糖７
部、牛乳７部、乳化剤０．０５部に精製水を加え、全量
を１００部とし、常法によりココア飲料を製造した。
【００３１】実施例１１ 実施例２で得られた C.glutamicum IAM 12435 ＤＮＡ
０．２部、ココアバター１０部、グラニュー糖７部、牛
乳７部、乳化剤０．０５部に精製水を加え、全量を１０
０部とし、常法によりココア飲料を製造した。
【００３２】実施例１２ ロール式製麺機を用いてＤＮＡ入りの生パスタを造っ
た。処方は準強力粉６５０ｇ、デユラム粉（セモリナ）
３５０ｇ、粉末卵白１０ｇ、粉末卵黄８ｇ、グリアジン
１５ｇ、エタノール３０ｇ、ＤＮＡ（実施例１）１００
ｍｇ、水２８０ｇである。
【００３３】実施例１３ 水洗して水切りした生米５００ｇに水５００ｇとＤＮＡ
（実施例１）３００ｍｇを添加して炊飯した。この処方
の米飯を１日２食、１冬の間（３ケ月）食べ続けたグル
ープ１２名中インフルエンザに罹った人は２名であっ
た。一方、ＤＮＡ無添加グループ（１２名）では８名が
罹り、ＤＮＡの免疫調節作用が認められた。
【００３４】実施例１４ ６５％ホワイトフィッシュミール３９部、大豆粕５部、
ビタミンＢ1 およびその他のビタミン類混合物２部とカ
ルシウム、リンおよびその他のミネラル類混合物２部
に、カルボキシメチルセルロース２部、実施例１で得た
ＤＮＡ０．１部を均一混合して粉末配合飼料を製造し
た。
【００３５】実施例１５ 汎発性強皮症は自己免疫性皮膚疾患として知られ、その
治療にはインターフェロンが有用とされている。ブレオ
マイシン処置によるマウス強皮症モデルを用いて、実施
例６で得られたＤＮＡ外用剤の治療効果を調べた。雌性
６週令ＢＡＬＢ／ｃマウスの６例を１群とし、２群のマ
ウス側背部皮下にブレオマイシン１０μｇ／０．１ｍｌ
を４週連日投与した。一方の群にはＤＮＡ外用剤を、他
の１群には対照群としてＤＮＡを含まない実施例６の製
剤を、ブレオマイシン処置開始より連日５週にわたり、
１日１回ブレオマイシン皮下投与局所に塗布した。塗布
終了の翌日、皮膚の厚さを測定した。対照群の値（Doub
le skin thickness ±SE (mm))) が、5.27±0.66であっ
たのに対し、ＤＮＡ処置群は4.13±0.39であった。すな
わち、ＤＮＡ含有製剤投与群で有意な皮膚硬化の抑制が
認められた。
【００３６】
【発明の効果】本発明によれば、注射によらないで、経
口的または経皮的なＤＮＡの投与、または日常的に食品
や飼料のように摂取することが可能な免疫調節剤を提供
することができ、また免疫調節食品、飼料を提供するこ
とができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/70 ６２５ Ａ６１Ｋ 31/70 ６２５ ４Ｂ０６５ 35/74 35/74 Ｄ ４Ｃ０５７ Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ ４Ｃ０７６ // Ａ２３Ｌ 1/10 Ａ２３Ｌ 1/10 Ｂ ４Ｃ０８６ 1/16 1/16 Ａ ４Ｃ０８７ 2/52 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｚ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｐ 19/34 Ｚ Ｃ１２Ｐ 19/34 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｆ (72)発明者 勝山 浩一 東京都中央区日本橋小伝馬町20番３号 ア サマ化成株式会社内 Ｆターム(参考） 4B017 LC03 LE10 LG14 LK11 LK21 LP01 LP06 4B018 LB02 LB08 LB10 MD44 ME14 MF01 MF12 MF14 4B023 LC09 LE11 LG01 LK06 LP11 4B046 LA06 LB01 LC07 LE16 LG12 LG48 4B064 AF23 CA02 CB04 DA10 4B065 AA01X AA19X AA24X AA26X BB37 BD08 BD09 BD10 BD15 BD27 BD46 CA23 CA41 4C057 AA05 BB02 BB05 DD01 MM04 4C076 AA12 AA49 BB31 CC07 CC29 DD37 DD38 DD41 DD67 EE30 EE58 FF68 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA35 MA52 MA56 MA63 NA10 ZB07 ZB09 4C087 AA01 AA02 AA03 BC34 BC56 BC57 BC58 BC59 BC62 BC65 BC72 CA12 MA35 MA52 MA56 MA63 NA10 ZB07 ZB09

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 原核微生物の細胞より抽出されたＤＮＡ
    を有効成分とする免疫調節剤。
  2. 【請求項２】 原核微生物が枯草菌、乳酸菌、アミノ酸
    醗酵菌または大腸菌である請求項１記載の免疫調節剤。
  3. 【請求項３】 ＤＮＡが超音波処理または制限酵素処理
    により低分子化されている請求項１または２記載の免疫
    調節剤。
  4. 【請求項４】 免疫調節剤が経口的、経皮的または経粘
    膜的に投与される請求項１〜３のいずれか１項記載の免
    疫調節剤。
  5. 【請求項５】 免疫調節剤がトローチである請求項３ま
    たは４記載の免疫調節剤。
  6. 【請求項６】 免疫調節剤が外用剤である請求項３また
    は４記載の免疫調節剤。
  7. 【請求項７】 原核微生物の細胞より抽出されたＤＮＡ
    を含有する免疫調節食品または免疫調節飼料。
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