JP2000262281A - 架橋グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents
架橋グルコースデヒドロゲナーゼInfo
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- JP2000262281A JP2000262281A JP11074219A JP7421999A JP2000262281A JP 2000262281 A JP2000262281 A JP 2000262281A JP 11074219 A JP11074219 A JP 11074219A JP 7421999 A JP7421999 A JP 7421999A JP 2000262281 A JP2000262281 A JP 2000262281A
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- enzyme
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- pqqgdh
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼの熱
安定性を高めることを目的とする。 【解決手段】 二官能性試薬により架橋された水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨ。
安定性を高めることを目的とする。 【解決手段】 二官能性試薬により架橋された水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、熱安定性を高める
ように改良されたグルコースデヒドロゲナーゼに関す
る。
ように改良されたグルコースデヒドロゲナーゼに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】糖尿病患者は年々増加する傾向にあり、
糖尿病の診断や、患者の在宅管理が非常に重要であるた
め、血糖値を簡便かつ迅速に測定しうるグルコースセン
サーが開発されている。グルコースセンサー素子として
は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）が最もよく用い
られている。ＧＯＤは、熱に安定であり、安価に大量に
供給される酵素であるため、頻繁に用いられてきた。Ｇ
ＯＤのグルコースの検出原理としては、ＧＯＤのグルコ
ースの酸化反応の際に消費される酸素を検出する酸素電
極型または生成される過酸化水素を検出する過酸化水素
電極型が開発された。しかしこの方法では高い印加電位
のため、血液中の他の酸化還元物質に影響を受けてしま
うため、１９８０年代からは様々な電子メディエーター
を用いて、印加電位をさげるメディエーター型のセンサ
ーが開発されてきている。しかしＧＯＤは、溶存酸素濃
度が高くなると電子をメディエーターではなく酸素にも
渡してしまうため、正確な測定ができない。そこで、溶
存酸素濃度に影響されないメディエーター型の理想的な
センサー素子としてグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）が
注目されるようになった。ＧＤＨのなかでも、補酵素結
合型のＰＱＱグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）
は、触媒活性が高く、ターンオーバー数が高いため、応
答電流値が高く、応答時間もはやい。つまり、正確で迅
速な測定が可能である。また、補酵素結合型であるため
反応溶液中に高価な補酵素を添加する必要がない。さら
に、酵素が水溶性であれば緩衝溶液中に界面活性剤が不
要であり、取り扱いが容易であるという利点があるた
め、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔ
ｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨ（ＰＱＱＧＤＨ−
Ｂ）はグルコースセンサーの素子として非常に理想的で
ある。
糖尿病の診断や、患者の在宅管理が非常に重要であるた
め、血糖値を簡便かつ迅速に測定しうるグルコースセン
サーが開発されている。グルコースセンサー素子として
は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）が最もよく用い
られている。ＧＯＤは、熱に安定であり、安価に大量に
供給される酵素であるため、頻繁に用いられてきた。Ｇ
ＯＤのグルコースの検出原理としては、ＧＯＤのグルコ
ースの酸化反応の際に消費される酸素を検出する酸素電
極型または生成される過酸化水素を検出する過酸化水素
電極型が開発された。しかしこの方法では高い印加電位
のため、血液中の他の酸化還元物質に影響を受けてしま
うため、１９８０年代からは様々な電子メディエーター
を用いて、印加電位をさげるメディエーター型のセンサ
ーが開発されてきている。しかしＧＯＤは、溶存酸素濃
度が高くなると電子をメディエーターではなく酸素にも
渡してしまうため、正確な測定ができない。そこで、溶
存酸素濃度に影響されないメディエーター型の理想的な
センサー素子としてグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）が
注目されるようになった。ＧＤＨのなかでも、補酵素結
合型のＰＱＱグルコース脱水素酵素（ＰＱＱＧＤＨ）
は、触媒活性が高く、ターンオーバー数が高いため、応
答電流値が高く、応答時間もはやい。つまり、正確で迅
速な測定が可能である。また、補酵素結合型であるため
反応溶液中に高価な補酵素を添加する必要がない。さら
に、酵素が水溶性であれば緩衝溶液中に界面活性剤が不
要であり、取り扱いが容易であるという利点があるた
め、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔ
ｉｃｕｓ由来の水溶性ＰＱＱＧＤＨ（ＰＱＱＧＤＨ−
Ｂ）はグルコースセンサーの素子として非常に理想的で
ある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＰＱＱ
ＧＤＨは、ＧＯＤと比べてダイナミックレンジが狭く、
基質特異性および安定性が低いため、実用可能なＰＱＱ
ＧＤＨセンサーを開発するためには、これらの点で酵素
を改良する必要がある。
ＧＤＨは、ＧＯＤと比べてダイナミックレンジが狭く、
基質特異性および安定性が低いため、実用可能なＰＱＱ
ＧＤＨセンサーを開発するためには、これらの点で酵素
を改良する必要がある。
【０００４】従って、本発明は熱安定性の向上したＰＱ
ＱＧＤＨ−Ｂを提供することを目的とする。
ＱＧＤＨ−Ｂを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決する手段】本発明は、二官能性試薬により
架橋された水溶性ＰＱＱＧＤＨを提供する。本発明の架
橋型ＰＱＱＧＤＨは、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨと比較
して高い熱安定性を有する。好ましくは、本発明のＰＱ
ＱＧＤＨは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏ
ａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨである。ま
た、好ましくは、二官能性試薬はグルタルアルデヒドで
ある。
架橋された水溶性ＰＱＱＧＤＨを提供する。本発明の架
橋型ＰＱＱＧＤＨは、天然の水溶性ＰＱＱＧＤＨと比較
して高い熱安定性を有する。好ましくは、本発明のＰＱ
ＱＧＤＨは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏ
ａｃｅｔｉｃｕｓ由来水溶性ＰＱＱＧＤＨである。ま
た、好ましくは、二官能性試薬はグルタルアルデヒドで
ある。
【０００６】本発明はまた、本発明に従う架橋型水溶性
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを提供する。
ＰＱＱＧＤＨを用いるグルコースセンサーを提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】架橋 本発明は、二官能性試薬により架橋された水溶性ＰＱＱ
ＧＤＨを特徴とする。本明細書において用いる場合、
「二官能性試薬」とは、２つの反応性官能基を有する化
学種を表す。本発明において用いることができる二官能
性試薬としては、例えば、グルタルアルデヒドおよびグ
リオキサールが挙げられる。
ＧＤＨを特徴とする。本明細書において用いる場合、
「二官能性試薬」とは、２つの反応性官能基を有する化
学種を表す。本発明において用いることができる二官能
性試薬としては、例えば、グルタルアルデヒドおよびグ
リオキサールが挙げられる。
【０００８】酵素を高分子等の担体に固定化するために
二官能性試薬を用いることはよく知られている。この場
合、酵素のコンフォメーションを維持してその活性を保
持させるためには、酵素それ自体の分子内架橋を回避す
べきであると一般に考えられてきた。したがって、酵素
を分子内架橋することによりその安定性が向上したこと
は驚くべき発見であった。
二官能性試薬を用いることはよく知られている。この場
合、酵素のコンフォメーションを維持してその活性を保
持させるためには、酵素それ自体の分子内架橋を回避す
べきであると一般に考えられてきた。したがって、酵素
を分子内架橋することによりその安定性が向上したこと
は驚くべき発見であった。
【０００９】二官能性試薬による架橋は、酵素を適当な
溶媒に溶解し、二官能性試薬を加えて室温またはそれ以
下の温度で反応させた後に、未反応試薬を除去すること
により行うことができる。反応は、酵素濃度１μｇ／ｍ
ｌ−１００μｇ／ｍｌの範囲で行うことが好ましい。濃
度が１μｇ／ｍｌより低いと反応速度が著しく低く実用
的ではない。また、酵素濃度が１００μｇ／ｍｌより高
いと酵素の適正なコンフォメーションが維持されないた
めに酵素活性が低下する。さらに濃度が高くなると、分
子間架橋が生じ、酵素蛋白質が凝集して酵素活性が著し
く低下すると予測される。酵素濃度が５０μｇ／ｍｌ以
下であることが最も好ましい。また、二官能性試薬の終
濃度は、好ましくは０．０１−５％、より好ましくは
０．１−２．５％である。さらに、未反応の二官能性試
薬が溶液中に残存していると、酵素活性が低下するおそ
れがあるため、透析、カラムクロマトグラフィー等の方
法により、未反応の二官能性試薬を除去することが好ま
しい。グルコースセンサー 本発明はまた、電極上に本発明に従う架橋ＰＱＱＧＤＨ
を固定化してなるグルコースセンサーを特徴とする。電
極としては、金電極、白金電極、カーボンペースト電
極、グラッシーカーボン電極、グラファイト電極などを
用いることができる。この電極上に本発明の酵素を固定
化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、
高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆す
る方法、導電性ポリマーに吸着させる方法などがあり、
これらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明
の架橋型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定
化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層
としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的に
は、本発明の架橋型ＰＱＱＧＤＨを担体蛋白質と混合し
た後、グルタルアルデヒドで処理することによりカーボ
ン電極上に固定化する。好ましくは、次にアミン基を有
する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキング
する。これは、酵素の架橋処理により、固定化に必要な
遊離基の数が不十分となるため、担体蛋白質の網目を形
成させることによって酵素の漏れを防ぐことができると
考えられるからである。担体蛋白質としては、ＰＱＱＧ
ＤＨの酵素活性に悪影響を与えない限り、任意の蛋白
質、例えばウシ血清アルブミンを用いることができる。
溶媒に溶解し、二官能性試薬を加えて室温またはそれ以
下の温度で反応させた後に、未反応試薬を除去すること
により行うことができる。反応は、酵素濃度１μｇ／ｍ
ｌ−１００μｇ／ｍｌの範囲で行うことが好ましい。濃
度が１μｇ／ｍｌより低いと反応速度が著しく低く実用
的ではない。また、酵素濃度が１００μｇ／ｍｌより高
いと酵素の適正なコンフォメーションが維持されないた
めに酵素活性が低下する。さらに濃度が高くなると、分
子間架橋が生じ、酵素蛋白質が凝集して酵素活性が著し
く低下すると予測される。酵素濃度が５０μｇ／ｍｌ以
下であることが最も好ましい。また、二官能性試薬の終
濃度は、好ましくは０．０１−５％、より好ましくは
０．１−２．５％である。さらに、未反応の二官能性試
薬が溶液中に残存していると、酵素活性が低下するおそ
れがあるため、透析、カラムクロマトグラフィー等の方
法により、未反応の二官能性試薬を除去することが好ま
しい。グルコースセンサー 本発明はまた、電極上に本発明に従う架橋ＰＱＱＧＤＨ
を固定化してなるグルコースセンサーを特徴とする。電
極としては、金電極、白金電極、カーボンペースト電
極、グラッシーカーボン電極、グラファイト電極などを
用いることができる。この電極上に本発明の酵素を固定
化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、
高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆す
る方法、導電性ポリマーに吸着させる方法などがあり、
これらを組み合わせて用いてもよい。好ましくは本発明
の架橋型ＰＱＱＧＤＨはホロ化した形態で電極上に固定
化するが、アポ酵素の形態で固定化し、ＰＱＱを別の層
としてまたは溶液中で提供することもできる。典型的に
は、本発明の架橋型ＰＱＱＧＤＨを担体蛋白質と混合し
た後、グルタルアルデヒドで処理することによりカーボ
ン電極上に固定化する。好ましくは、次にアミン基を有
する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキング
する。これは、酵素の架橋処理により、固定化に必要な
遊離基の数が不十分となるため、担体蛋白質の網目を形
成させることによって酵素の漏れを防ぐことができると
考えられるからである。担体蛋白質としては、ＰＱＱＧ
ＤＨの酵素活性に悪影響を与えない限り、任意の蛋白
質、例えばウシ血清アルブミンを用いることができる。
【００１０】グルコース濃度の測定は、以下のようにし
て行うことができる。恒温セルにＰＱＱおよびＣａＣｌ
2を、ならびにメディエーターを含む緩衝液を入れ、一
定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシ
アン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェ
ナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作
用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した
カーボンペースト電極を用い、対極（例えば白金電極）
および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用い
る。カーボンペースト電極に一定の電圧を印加して、電
流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電
流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により
作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグ
ルコース濃度を計算することができる。
て行うことができる。恒温セルにＰＱＱおよびＣａＣｌ
2を、ならびにメディエーターを含む緩衝液を入れ、一
定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシ
アン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェ
ナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作
用電極として本発明の改変型ＰＱＱＧＤＨを固定化した
カーボンペースト電極を用い、対極（例えば白金電極）
および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用い
る。カーボンペースト電極に一定の電圧を印加して、電
流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電
流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により
作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグ
ルコース濃度を計算することができる。
【００１１】
【実施例】以下の実施例においては、次の試薬および装
置を用いた。基質ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）は三
菱瓦斯化学（株）から購入した。架橋処理にはグルタル
アルデヒド２５％水溶液（一級）（キシダ化学（株））
を用いた。電極の作製には、カーボンペースト電極（内
径３．０ｍｍ、外径６．０ｍｍ）およびカーボンペース
トオイルベース（いずれもＢＡＳ社）を用いた。 実施例１ 酵素の調製 ＰＱＱＧＤＨ−Ｂの生産には、プラスミドベクターｐＴ
ｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位にＰＱＱＧＤＨ−Ｂをコードする遺伝子１．５
ｋｂを挿入して構築したプラスミドｐＧＢ２（図１）
を、ＰＱＱＧＤＨの生産能を欠く大腸菌ＰＰ２４１８株
に導入して得た形質転換体を用いた。大腸菌を２リット
ルのファーメンターで常法により培養し、ＩＰＴＧで誘
導した。集菌、洗浄した菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で懸濁し、フレンチプレスで破砕した
後、遠心分離（１００００ｇで２０分間、４℃）を２回
行い未破砕菌体を除去した。これの上清を超遠心分離
（５００００ｒ．ｐ．ｍ．、６０分間、４℃）し、その
上清を水溶性画分として得た。これを、１００倍量の１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１晩透析した。
置を用いた。基質ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）は三
菱瓦斯化学（株）から購入した。架橋処理にはグルタル
アルデヒド２５％水溶液（一級）（キシダ化学（株））
を用いた。電極の作製には、カーボンペースト電極（内
径３．０ｍｍ、外径６．０ｍｍ）およびカーボンペース
トオイルベース（いずれもＢＡＳ社）を用いた。 実施例１ 酵素の調製 ＰＱＱＧＤＨ−Ｂの生産には、プラスミドベクターｐＴ
ｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位にＰＱＱＧＤＨ−Ｂをコードする遺伝子１．５
ｋｂを挿入して構築したプラスミドｐＧＢ２（図１）
を、ＰＱＱＧＤＨの生産能を欠く大腸菌ＰＰ２４１８株
に導入して得た形質転換体を用いた。大腸菌を２リット
ルのファーメンターで常法により培養し、ＩＰＴＧで誘
導した。集菌、洗浄した菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で懸濁し、フレンチプレスで破砕した
後、遠心分離（１００００ｇで２０分間、４℃）を２回
行い未破砕菌体を除去した。これの上清を超遠心分離
（５００００ｒ．ｐ．ｍ．、６０分間、４℃）し、その
上清を水溶性画分として得た。これを、１００倍量の１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１晩透析した。
【００１２】透析後の粗精製酵素を、０．２μｍのフィ
ルターで濾過し、同じくフィルターで濾過した、１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をＡバッファー、０．８
ＭＮａＣｌ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をＢバ
ッファーとして、Ａバッファーで平衡化した陽イオン交
換カラムクロマトグラフィー用充填カラム、ＣＭＴＯＹ
ＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍカラムを用いて、Ｂバッファー４
０％／６０分のグラジェントによりＰＱＱＧＤＨ−Ｂを
溶出させた。流速は３ｍｌ／ｍｉｎで行った。蛋白質の
検出には２８０ｎｍの吸光度を用い、ピークの部分を分
取した。
ルターで濾過し、同じくフィルターで濾過した、１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をＡバッファー、０．８
ＭＮａＣｌ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をＢバ
ッファーとして、Ａバッファーで平衡化した陽イオン交
換カラムクロマトグラフィー用充填カラム、ＣＭＴＯＹ
ＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍカラムを用いて、Ｂバッファー４
０％／６０分のグラジェントによりＰＱＱＧＤＨ−Ｂを
溶出させた。流速は３ｍｌ／ｍｉｎで行った。蛋白質の
検出には２８０ｎｍの吸光度を用い、ピークの部分を分
取した。
【００１３】次に、分取したサンプルを、０．２Ｍ Ｎ
ａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化
したヒドロキシアパタイトカラムに負荷し、０．２Ｍ−
０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）／６０分のグラジェントによりＰＱＱＧＤＨ−Ｂを
溶出させた。溶出は１ｍｌ／ｍｉｎで行い、２分ごとに
溶出液を回収した。得られた活性画分を１００倍量の１
０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析し、脱塩
を行った。 実施例２ ＰＱＱＧＤＨ−Ｂの酵素活性測定方法 ＰＱＱＧＤＨ−Ｂの酵素活性測定は、１０ｍＭリン酸緩
衝液ｐＨ７.０中においてＰＭＳ（フェナジンメトサル
フェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールイ
ンドフェノール）を用いておこなった。ＤＣＩＰの６０
０ｎｍの吸光度変化を追跡し、その吸光度の減少速度を
酵素の反応速度とした。このとき、１分間に１μｍｏｌ
のＤＣＩＰが還元される酵素活性を１ユニットとした。
また、ＤＣＩＰのｐＨ７.０におけるモル吸光係数は１
６.３ｍＭ-1とした。測定には分光光度計ＵＶ−１２０
０（島津製作所製）を用いた。 実施例３ 架橋型酵素の調製 実施例１で調製した酵素を、１ｍＭ ＰＱＱ、１ｍＭ
ＣａＣｌ2の存在下で、３０分間室温でインキュベート
しホロ化した。ホロ化した酵素に、終濃度０．１、１．
０、２．５％となるようにＧＡを加え、３０分間室温で
攪拌した。未架橋対照としてＧＡのかわりに水を用いて
架橋処理と同様の処理を行った。これを１０００倍量の
１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析、また
はＮＡＰ−１０カラムを用いて未反応のＧＡを除去し
た。これらの酵素の活性を上述の方法にしたがって測定
した。
ａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化
したヒドロキシアパタイトカラムに負荷し、０．２Ｍ−
０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）／６０分のグラジェントによりＰＱＱＧＤＨ−Ｂを
溶出させた。溶出は１ｍｌ／ｍｉｎで行い、２分ごとに
溶出液を回収した。得られた活性画分を１００倍量の１
０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析し、脱塩
を行った。 実施例２ ＰＱＱＧＤＨ−Ｂの酵素活性測定方法 ＰＱＱＧＤＨ−Ｂの酵素活性測定は、１０ｍＭリン酸緩
衝液ｐＨ７.０中においてＰＭＳ（フェナジンメトサル
フェート）−ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロフェノールイ
ンドフェノール）を用いておこなった。ＤＣＩＰの６０
０ｎｍの吸光度変化を追跡し、その吸光度の減少速度を
酵素の反応速度とした。このとき、１分間に１μｍｏｌ
のＤＣＩＰが還元される酵素活性を１ユニットとした。
また、ＤＣＩＰのｐＨ７.０におけるモル吸光係数は１
６.３ｍＭ-1とした。測定には分光光度計ＵＶ−１２０
０（島津製作所製）を用いた。 実施例３ 架橋型酵素の調製 実施例１で調製した酵素を、１ｍＭ ＰＱＱ、１ｍＭ
ＣａＣｌ2の存在下で、３０分間室温でインキュベート
しホロ化した。ホロ化した酵素に、終濃度０．１、１．
０、２．５％となるようにＧＡを加え、３０分間室温で
攪拌した。未架橋対照としてＧＡのかわりに水を用いて
架橋処理と同様の処理を行った。これを１０００倍量の
１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析、また
はＮＡＰ−１０カラムを用いて未反応のＧＡを除去し
た。これらの酵素の活性を上述の方法にしたがって測定
した。
【００１４】結果を図２に示す。架橋処理前の酵素の活
性を１００％とすると、０．１％ＧＡを用いて架橋処理
をした場合、約２８％の活性が維持された。高い濃度の
ＧＡで処理した場合には、活性はより低下した。対照と
して水を用いて処理した場合には、活性は約１２％に低
下した。 実施例４ 熱安定性の評価 実施例１で調製した酵素を、架橋時の蛋白質濃度をそれ
ぞれ９９．０９、４９．５５、３９．６４、３３．０３
μｇ／ｍｌとして、実施例３にしたがって、０．１％Ｇ
Ａで架橋処理した。次に、架橋処理酵素を蛋白質濃度
１．０μｇ／ｍｌに調製し、５５℃で０〜４０分間イン
キュベートすることにより熱処理し、酵素の残存活性を
測定した。未架橋対照としてＧＡのかわりに水を用いて
架橋処理と同様の処理を行った。
性を１００％とすると、０．１％ＧＡを用いて架橋処理
をした場合、約２８％の活性が維持された。高い濃度の
ＧＡで処理した場合には、活性はより低下した。対照と
して水を用いて処理した場合には、活性は約１２％に低
下した。 実施例４ 熱安定性の評価 実施例１で調製した酵素を、架橋時の蛋白質濃度をそれ
ぞれ９９．０９、４９．５５、３９．６４、３３．０３
μｇ／ｍｌとして、実施例３にしたがって、０．１％Ｇ
Ａで架橋処理した。次に、架橋処理酵素を蛋白質濃度
１．０μｇ／ｍｌに調製し、５５℃で０〜４０分間イン
キュベートすることにより熱処理し、酵素の残存活性を
測定した。未架橋対照としてＧＡのかわりに水を用いて
架橋処理と同様の処理を行った。
【００１５】結果を図３に示す。架橋時の酵素濃度が約
５０μｇ／ｍｌ以下の場合、ＧＡ架橋により熱安定性が
顕著に向上することがわかった。酵素濃度が高い場合に
は、分子間架橋が生ずるために活性が低下すると考えら
れる。 実施例５ ブロッキング ＧＡ処理後の遊離アルデヒド基をブロッキングし、その
影響を調べた。実施例１にしたがってホロ化した酵素
に、グルタルアルデヒド（ＧＡ）溶液を０．１％になる
ように加え、３０分間室温で攪拌した（架橋時の蛋白質
濃度は約２７μｇ／ｍｌ）。ＧＡの代わりに精製水を加
え、同様の処理をおこなったものを未架橋対照とした。
これを、（１）１０００倍量の１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝
液（ｐＨ７．０）で透析、（２）１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析、（３）終濃度５０
ｍＭリジンとして２０分間室温で攪拌したのち、１０ｍ
ＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析という３種類の
処理を行い、凍結乾燥させ、水で再溶解した。これらの
架橋酵素を５５℃で０〜４０分間熱処理し、残存活性を
測定した。
５０μｇ／ｍｌ以下の場合、ＧＡ架橋により熱安定性が
顕著に向上することがわかった。酵素濃度が高い場合に
は、分子間架橋が生ずるために活性が低下すると考えら
れる。 実施例５ ブロッキング ＧＡ処理後の遊離アルデヒド基をブロッキングし、その
影響を調べた。実施例１にしたがってホロ化した酵素
に、グルタルアルデヒド（ＧＡ）溶液を０．１％になる
ように加え、３０分間室温で攪拌した（架橋時の蛋白質
濃度は約２７μｇ／ｍｌ）。ＧＡの代わりに精製水を加
え、同様の処理をおこなったものを未架橋対照とした。
これを、（１）１０００倍量の１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝
液（ｐＨ７．０）で透析、（２）１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析、（３）終濃度５０
ｍＭリジンとして２０分間室温で攪拌したのち、１０ｍ
ＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で透析という３種類の
処理を行い、凍結乾燥させ、水で再溶解した。これらの
架橋酵素を５５℃で０〜４０分間熱処理し、残存活性を
測定した。
【００１６】結果を図４に示した。ブロッキングをする
ことによりさらに熱安定性が向上している。 実施例６ 架橋型酵素のキャラクタリゼーション 実施例２で得られた最適条件で架橋した酵素について、
グルコース濃度０〜１００ｍＭの範囲でその活性を測定
した。結果を図５に示す。本発明の架橋型酵素のグルコ
ースに対するＶｍａｘは３８８Ｕ／ｍｇであり、Ｋｍは
２０ｍＭであった。 実施例７ 架橋型ＰＱＱＧＤＨを用いた酵素センサーの作製 実施例１で調製した酵素サンプルを、１ｍＭ ＰＱＱ、
１ｍＭ ＣａＣｌ2存在下で、３０分間室温でインキュ
ベートしホロ化した。これを蛋白質濃度３０μｇ／ｍｌ
に調整し、終濃度０．１％となるようＧＡを加えて３０
分間室温で撹拌した後、１０００倍量の１０ｍＭ ＭＯ
ＰＳで透析した。この酵素５Ｕにカーボンペースト２０
ｍｇを加え、１晩凍結乾燥した。これをよく混合した
後、すでにカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカ
ーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨
した。電極表面に１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン５
μｌを滴加し、室温で乾燥させた。この電極を１％のＧ
Ａを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中
で、３０分間室温で処理したのち、２０ｍＭリジンを含
む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、２０
分間室温で攪拌し、ＧＡをブロッキングした。
ことによりさらに熱安定性が向上している。 実施例６ 架橋型酵素のキャラクタリゼーション 実施例２で得られた最適条件で架橋した酵素について、
グルコース濃度０〜１００ｍＭの範囲でその活性を測定
した。結果を図５に示す。本発明の架橋型酵素のグルコ
ースに対するＶｍａｘは３８８Ｕ／ｍｇであり、Ｋｍは
２０ｍＭであった。 実施例７ 架橋型ＰＱＱＧＤＨを用いた酵素センサーの作製 実施例１で調製した酵素サンプルを、１ｍＭ ＰＱＱ、
１ｍＭ ＣａＣｌ2存在下で、３０分間室温でインキュ
ベートしホロ化した。これを蛋白質濃度３０μｇ／ｍｌ
に調整し、終濃度０．１％となるようＧＡを加えて３０
分間室温で撹拌した後、１０００倍量の１０ｍＭ ＭＯ
ＰＳで透析した。この酵素５Ｕにカーボンペースト２０
ｍｇを加え、１晩凍結乾燥した。これをよく混合した
後、すでにカーボンペーストが約４０ｍｇ充填されたカ
ーボンペースト電極の表面だけに充填し、濾紙上で研磨
した。電極表面に１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン５
μｌを滴加し、室温で乾燥させた。この電極を１％のＧ
Ａを含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中
で、３０分間室温で処理したのち、２０ｍＭリジンを含
む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、２０
分間室温で攪拌し、ＧＡをブロッキングした。
【００１７】次に、この電極を１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝
液（ｐＨ７．０）中で１時間以上室温で攪拌し、平衡化
した。測定時以外は１ｍＭ ＰＱＱ、１ｍＭ ＣａＣｌ
2 を含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中
で、４℃で保存した。
液（ｐＨ７．０）中で１時間以上室温で攪拌し、平衡化
した。測定時以外は１ｍＭ ＰＱＱ、１ｍＭ ＣａＣｌ
2 を含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中
で、４℃で保存した。
【００１８】恒温セルに１ｍＭ ＰＱＱ、１ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2を含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
を入れ、メディエーターとして、終濃度１ｍＭ ｍ−Ｐ
ＭＳを加え、総量を１０ｍｌとした。そこに作用電極と
して作製したカーボンペースト電極を用い、対極として
白金電極、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いた。
測定は全て２５℃で行った。＋１００ｍＶの電位を印加
し、電流が定常になったところで、適当な濃度のグルコ
ースを加えて、増加した電流値を計測した。グルコース
を加えていないときの電流値を０Ａとした。
Ｃｌ2を含む１０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
を入れ、メディエーターとして、終濃度１ｍＭ ｍ−Ｐ
ＭＳを加え、総量を１０ｍｌとした。そこに作用電極と
して作製したカーボンペースト電極を用い、対極として
白金電極、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いた。
測定は全て２５℃で行った。＋１００ｍＶの電位を印加
し、電流が定常になったところで、適当な濃度のグルコ
ースを加えて、増加した電流値を計測した。グルコース
を加えていないときの電流値を０Ａとした。
【００１９】キャリブレーションカーブを図６に示す。
本発明の架橋型酵素を用いたグルコースセンサーによ
り、１ｍＭ−１２ｍＭの範囲でグルコースの測定が可能
であった。
本発明の架橋型酵素を用いたグルコースセンサーによ
り、１ｍＭ−１２ｍＭの範囲でグルコースの測定が可能
であった。
【図１】 図１は、プラスミドｐＧＢ２の構造を示す。
【図２】 図２は、グルタルアルデヒドにより酵素を処
理した後の残存活性を示す。
理した後の残存活性を示す。
【図３】 図３は、本発明の架橋型酵素の熱安定性を示
す。
す。
【図４】 図４は、グルタルアルデヒド処理後のブロッ
キングの影響を示す。
キングの影響を示す。
【図５】 図５は、種々のグルコース濃度における本発
明の架橋型酵素の活性を示す。
明の架橋型酵素の活性を示す。
【図６】 図６は、本発明の架橋型酵素を用いる酵素セ
ンサーのキャリブレーションカーブを示す。
ンサーのキャリブレーションカーブを示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 二官能性試薬により架橋された水溶性Ｐ
ＱＱＧＤＨ。 - 【請求項２】 前記ＰＱＱＧＤＨが、Ａｃｉｎｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ由来である、
請求項１記載の水溶性ＰＱＱＧＤＨ。 - 【請求項３】 前記二官能性試薬がグルタルアルデヒド
である、請求項１または２記載の水溶性ＰＱＱＧＤＨ - 【請求項４】 電極上に請求項１−３のいずれかに記載
の水溶性ＰＱＱＧＤＨを固定化してなるグルコースセン
サー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11074219A JP2000262281A (ja) | 1999-03-18 | 1999-03-18 | 架橋グルコースデヒドロゲナーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11074219A JP2000262281A (ja) | 1999-03-18 | 1999-03-18 | 架橋グルコースデヒドロゲナーゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000262281A true JP2000262281A (ja) | 2000-09-26 |
Family
ID=13540872
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11074219A Pending JP2000262281A (ja) | 1999-03-18 | 1999-03-18 | 架橋グルコースデヒドロゲナーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000262281A (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1367120A3 (en) * | 2002-05-27 | 2004-06-02 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability |
| JP2006271257A (ja) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Cci Corp | 熱安定性に優れたポリオール脱水素酵素およびその製造方法 |
| JP2008245559A (ja) * | 2007-03-30 | 2008-10-16 | Cci Corp | ポリオール脱水素酵素の製造方法 |
| JP2008263954A (ja) * | 2007-03-29 | 2008-11-06 | Cci Corp | 化学修飾ポリオール脱水素酵素およびその製造方法 |
| US7479383B2 (en) | 2003-09-08 | 2009-01-20 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase excellent in substrate specificity |
| US8232059B2 (en) | 2010-06-14 | 2012-07-31 | Alsultan Abdulrahman A | Method of identifying A. baumannii with OXA-131-like drug resistance in diabetic patients |
| JP2015136313A (ja) * | 2014-01-21 | 2015-07-30 | 株式会社ダイセル | 酵素架橋凝集体、及びこれを備えるマイクロリアクター |
| EP2927319A1 (en) * | 2014-03-31 | 2015-10-07 | Roche Diagnostics GmbH | High load enzyme immobilization by crosslinking |
| JP2018093872A (ja) * | 2006-06-29 | 2018-06-21 | 池田食研株式会社 | グルコース測定用バイオセンサ |
| US10626433B2 (en) | 2005-03-25 | 2020-04-21 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| US10988738B2 (en) | 2002-12-24 | 2021-04-27 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-binding glucose dehydrogenase |
-
1999
- 1999-03-18 JP JP11074219A patent/JP2000262281A/ja active Pending
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| US11155789B2 (en) | 2002-12-24 | 2021-10-26 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-binding glucose dehydrogenase |
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| US7479383B2 (en) | 2003-09-08 | 2009-01-20 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase excellent in substrate specificity |
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| US10738341B2 (en) | 2005-03-25 | 2020-08-11 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| US10883133B2 (en) | 2005-03-25 | 2021-01-05 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
| US10851398B2 (en) | 2005-03-25 | 2020-12-01 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
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| US10626433B2 (en) | 2005-03-25 | 2020-04-21 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Coenzyme-linked glucose dehydrogenase and polynucleotide encoding the same |
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