JP2000262292A

JP2000262292A - プロトペクチナーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する形質転換体、及び該形質転換体を用いる繊維の精練方法

Info

Publication number: JP2000262292A
Application number: JP11076432A
Authority: JP
Inventors: Takuo Sakai; 拓夫坂井; Makoto Takao; 誠高雄
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-03-19
Filing date: 1999-03-19
Publication date: 2000-09-26

Abstract

(57)【要約】【課題】新規なプロトペクチナーゼの提供を目的
とする。【解決手段】本発明によれば、プロトペクチナーゼを
コードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクタ
ー、形質転換体などが提供される。これらの遺伝子及び
形質転換体類を用いることにより、簡便かつ安価に大量
の繊維を精練することができる。また、当該遺伝子類
を、植物組織の処理を含む様々な分野で適用することが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、プロトペクチナー
ゼをコードする新規な遺伝子に関し、詳しくは、当該遺
伝子を含有する組換えベクター、形質転換体、当該形質
転換体を製造する方法ならびに当該形質転換体を用いる
繊維の精練方法及び当該方法で処理された繊維に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】綿繊維に代表されるセルロース繊維は、
セルロースからなる二次膜及びこの膜をワインディング
層を介して覆う一次膜とで構成されている。一次膜は、
ペクチン、ワックス及びタンパク質からなり、ペクチン
が主要成分となっている。繊維の吸水性、染色性、脱色
及び肌触りを向上させるためには、この一次膜を除去す
る必要があり、この処理は一般に精練と呼ばれている。
精練には、従来水酸化ナトリウムと精練助剤などの混合
液を用いて、高温下で繊維を処理する方法が採用されて
いる。しかし、この方法は多くのエネルギーを要する
上、強アルカリ性廃液の処理に多大な費用がかかるとい
う問題を有していた。この問題を解決するため、プロト
ペクチナーゼを用いる精練方法が提案されている（特開
平6-220772号）。

【０００３】プロトペクチナーゼは、植物組織からペク
チンを遊離させる酵素の総称であり、植物組織からペク
チンを遊離させるとともに遊離のペクチンを限定分解す
るＡタイプ（発酵と工業：37, 928-938, 1978)と、植物
組織からペクチンを遊離させるが、遊離のペクチンの分
解活性を有しないＢタイプ（Agric.Biol.Chem., 52,109
1-1093,1988；Agric.Biol.Chem., 53, 1213-1223,198
9；Agric.Biol.Chem.,54, 879-889,1990；Eur.J.Bioche
m., 226, 285-291, 1994；Biosci.Biotech.Biochem., 5
8, 353-358, 1994）に分類される。特にＢタイプに関し
て、本発明者は、ペクチンとセルロースの間に存在する
アラビナンに作用し、ペクチンを植物組織から遊離させ
るプロトペクチナーゼを見出し、精練における該酵素の
利用を示している（PCT/JP/02794号及びPCT/JP/02795
号）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、精練に
おいては、繊維の種類又は用途などによって必要とされ
る性質が異なるため、アラビナンに作用するものに限ら
ず、他の作用機序でペクチンを繊維から遊離させること
ができるプロトペクチナーゼを利用可能にする必要があ
る。また、プロトペクチナーゼは、食品、医薬品及び化
粧品の原料として用いられるペクチンの製造（特公平6-
8322号）など、植物組織の処理を含む様々な分野で有用
であることからも、かかる酵素を安価に生産でき、使用
できる方法を開発することが望まれている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、様々な塩
濃度条件に設定したクロマトグラフィに付して得られた
バチラス属の細菌由来のタンパク質に関して鋭意研究を
行った結果、ペクチンのみに作用し、これを繊維から遊
離させるプロトペクチナーゼをコードする新規な遺伝子
を見いだし、当該遺伝子を含有する形質転換体の製造、
ならびに当該形質転換体を用いる繊維の精練方法などを
確立し、本発明を完成するに至った。したがって、本発
明によれば、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、又はこの配列において１もしくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列から
なり、かつプロトペクチナーゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子が提供される。また、当該遺伝子を
含有する組換えベクター、形質転換体、当該形質転換体
を製造する方法ならびに当該形質転換体を用いる繊維の
精練方法及び当該方法で処理された繊維が提供される。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明において、プロトペクチナ
ーゼをコードする遺伝子は、配列番号１に示すアミノ酸
配列からなるタンパク質、又はこの配列において１もし
くは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつプロトペクチナーゼ活性を有
するタンパク質をコードする遺伝子である。欠失、置換
又は付加されたアミノ酸は、当該アミノ酸をコードする
塩基配列を部位特異的突然変異法又は点突然変異法など
の当業者に周知の方法に付すことにより得られるが、こ
のような変化を受けるアミノ酸の数、種類及び位置は、
産生されるタンパク質がプロトペクチナーゼ（以下、PP
ase と略記する) 活性を有する限り、特に限定されな
い。

【０００７】ここで、PPase 活性とは、植物組織からペ
クチンを遊離させる作用、すなわち植物組織中の水不溶
性プロトペクチンの限定的な加水分解により水溶性ペク
チンを遊離させる作用をいう。より詳しくは、PPase 活
性を有するタンパク質は、活性がレモン果皮由来のプロ
トペクチンを基質として測定でき、以下の酵素学的性質
を有する：1)プロトペクチナーゼ活性を有する；2)SDS-
ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル上での分子量が約
43,000である；3)至適pHが 8.0である；4)至適温度が60
℃である；及び5)Cu、Hg、Mn及びZnにより阻害を受け
る。このようなタンパク質を、以降のこの明細書におい
て PPase-BS として示す。

【０００８】本発明の遺伝子は、最終的に産生されるタ
ンパク質、つまり PPase-BS を宿主の細胞外に分泌させ
ることを目的として任意のシグナルペプチドが付加され
ていてもよい。この場合、シグナルペプチドが付加され
た遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、又はこの配列において１もしくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列から
なり、かつプロトペクチナーゼ活性を有するタンパク質
をコードすることができる。

【０００９】また、本発明の遺伝子は、配列番号３に示
す配列の塩基番号 358〜1557で表される塩基配列を有す
ることができ、シグナルペプチドが付加された場合に
は、配列番号３の配列の塩基番号 295〜1557で表される
塩基配列を有することができる。

【００１０】これらの遺伝子は、バチラス属細菌の培養
物をクロマトグラフィに付して得た、レモン果皮由来の
プロトペクチンを基質とする際に PPase活性を有するタ
ンパク質の部分アミノ酸配列に基づいて設計したプライ
マーをポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 法で用いることによ
り、単離され、決定された。したがって、本発明の遺伝
子は、バチラス属に属する細菌又はこれらの変異体、好
ましくはバチラス・ズブチリス(Bacillus subtilis) BS
株（通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所受
託番号 FERM BP-6031)を由来として、PCR 法による DNA
の増幅により得ることができる。バチラス・ズブチリス
BS株は、グラム陽性の桿菌で、胞子形成能を有し、プロ
テアーゼ産生能が低く、プロトペクチナーゼの産生がグ
ルコースにより抑制されるという特徴を有する。この微
生物は、茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号 3
05-0046)の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所に、平成９年７月30日付けで上述の受託番号 FERM BP
-6031 の下に寄託されている。

【００１１】上記のようにして得られた本発明の遺伝子
は、遺伝子工学の技術を用いてベクターに導入すること
により、組換えベクターを製造することができる。ベク
ターは、所望の宿主で遺伝子を発現するのに適切なベク
ターであれば、いずれのタイプのものも用いることがで
き、一般的には、強力なプロモーターを有するマルチコ
ピーベクターを用いることが好ましい。例えば、 pBlue
Script II SK＋（Stratagene社製）又は pUB110 (T.J.G
ryczan, S.Contente及び D.Dubuan:J.Bacteriol., 34,
318-329 (1978)) などが挙げられる。

【００１２】また、本発明の遺伝子を含有する組換えベ
クターは、プロトプラスト法、塩化カルシウム法、エレ
クトロポレーション法又はパーティクル・ガンなどの常
法により任意の宿主を形質転換し、形質転換体を製造す
ることができる。宿主は、微生物、植物又は動物のいず
れであってもよいが、微生物であることが好ましく、バ
チラス属のほか、エシェリキア・コリ（Escherichia co
li）のようなグラム陰性細菌、サッカロマイセス属(Sac
charomyces) の酵母類、アスペルギルス属(Aspergillu
s) の真菌類などを用いることができる。これらのう
ち、バチラス・ズブチリス又はエシェリキア・コリの使
用が特に好ましく、ベクターが pBlueScriptII SK＋で
ある場合はエシェリキア・コリを用い、 pUB110 にはバ
チラス・ズブチリスを用いることができる。形質転換体
の選択は、特に限定されないが、抗生物質耐性のような
ベクターが有する性質により行うことが容易である。

【００１３】本発明の遺伝子を含有する形質転換体は、
用いる宿主によって好気的又は嫌気的条件下で、液体培
地又は固体培地のいずれかの適当な培地に接種して通気
撹拌又は振盪培養などに付されることにより、PPase-BS
を産生することができる。培地成分は特に限定されない
が、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及びその他の必須
栄養素を適切な条件で含有する培地を使用することが好
ましい。炭素源としては、例えばガラクトース、グルコ
ース、ショ糖、酢酸など、窒素源としては、無機のアン
モニウム塩や硝酸塩、酵母エキス、ダイズ粉などが挙げ
られる。培地のpHは、炭酸ナトリウム又は炭酸カリウム
などにより任意のpHに調整することができる。培養条件
は、宿主などによって決定されるが、一般的には37℃に
おいて16〜48時間程度培養することが好ましい。

【００１４】上記のようにして得られた形質転換体の培
養物は、例えば加熱した緩衝液に、綿、麻のような未精
練のセルロース繊維又は布を浸漬して保温した後、反応
することにより、温和な条件下で繊維を精練することが
できる。培養物は、培養上清又は培養精製物、すなわち
PPase-BS 自体のいずれの形態であってもよく、例え
ば、培養上清は、遠心分離又はろ過などにより培養液か
ら宿主細胞を除くか、又は培養液から宿主細胞を回収し
た後に酵素処理又は超音波処理に付し、次いで遠心分離
して得ることができる。また、PPase-BSは、これらの液
から通常の手段、例えば、乾燥又は限外ろ過などによる
濃縮、塩析又は溶媒沈殿による沈殿、透析、ゲルろ過ク
ロマトグラフィー、あるいはイオン交換クロマトグラフ
ィーなどの通常のタンパク質の精製手段を組み合わせる
ことによって得ることができる。処理条件は、培養物の
形態、処理される繊維の種類、処理後に望まれる繊維の
特性又は用途などによって適宜決定されるが、例えば培
養物に培養上清を用いる場合、50〜60℃の範囲に加熱し
た緩衝液に、PPase-BSが繊維 1g に対し約25単位の濃度
になるよう培養上清を加えて数時間処理することができ
る。なお、繊維が糊付け加工されている場合は、糊抜き
剤で事前に処理するか、又は糊抜き剤を処理液中に入れ
て同時に処理してもよい。

【００１５】処理液に溶出した遊離ペクチンの定量試験
によれば、本発明の形質転換体又はその培養物を用いて
精練処理した繊維からは、多量のペクチンが遊離するこ
とが認められている。また、これらの繊維は、通常の方
法で処理したものと強度などの点で差異がなく、むしろ
染色性又は繊維の風合いの良好な繊維として得ることが
できる。

【００１６】さらに、本発明の遺伝子又は形質転換体な
どを用いることにより、本来 PPase-BS を産生しないか
又は当該酵素を少量しか産生しない生物を宿主として、
高純度の PPase-BS を大量かつ容易に産生させ、又はそ
の量を増大させることができる。

【００１７】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるも
のではない。実施例１：酵素の精製バチラス・ズブチリス BS 株を、ＳＰ培地(1.5% ダイズ
粉（不二製油）、 1.2% KH₂PO₄、 2.8% K₂HPO₄、pH7.0)
に接種し、37℃で22時間振盪培養した。培養液を遠心分
離して上清を得た。上清をロータリーエバポレーターで
濃縮した後、50% 飽和硫酸アンモニウムを含む 20mM 酢
酸緩衝液 (pH6.0)に対して４℃で一晩透析し、同緩衝液
で平衡化した Butyl-Toyopearl 650M （東ソー製）カラ
ムにかけた。同じ緩衝液で十分に洗浄した後、 50-30%
の飽和硫酸アンモニウムの連続的直線濃度勾配により溶
出して、PPase 活性を有する画分を分取して集めた。

【００１８】PPase活性は、レモン果皮由来のプロトペ
クチンを基質として以下のように坂井らの方法（Method
s in Enzymology, 161, 335-350, 1988, W.A. Woodおよ
び T. Kellogg 編、Academic Press）に従って測定し
た；基質10μg を含有する 990μl の酢酸緩衝液 (100
mM、 pH6.0) に酵素液10μl を加え、これを37℃で１時
間インキュベートした後、反応液をろ過する: ろ液 125
μl 、水125 μl 、 0.2% カルバゾールを含有するエタ
ノール 250μl 、および 31.5 N 硫酸 3 ml を混合して
75℃で20分間インキュベートする。反応液を氷冷した
後、525 nmの吸光度を測定する。PPase 活性は、１分間
当たり１μmol のガラクチュロン酸量と発色度の関係式
から算出して表示した。

【００１９】上記のようにして集めた PPase活性を有す
る画分を 20 mM酢酸緩衝液 (pH6.0)に対して４℃で一晩
透析し、20 mM 酢酸緩衝液 (pH6.0)で平衡化した CM-To
yopearl 650M（東ソー製）カラムにかけた。同じ緩衝液
で十分に洗浄した後、 0-0.5Mの食塩連続的直線濃度勾
配により溶出して、同活性を有する画分をさらに分取し
て集めた。次に、この画分を50% 飽和硫酸アンモニウム
を含む 20 mM酢酸緩衝液 (pH6.0)に対して４℃で一晩透
析し、同緩衝液で平衡化した Butyl-Toyopearl 650M
（東ソー製）カラムにかけた。同じ緩衝液で十分に洗浄
した後、硫酸アンモニウム 50-30% 飽和の連続的直線濃
度勾配により溶出して、酵素活性を有する画分を分取し
て集めた。この画分を 100mM NaCl を含む 20 mM酢酸緩
衝液(pH6.0) で平衡化したSuperdex 75 （ファルマシア
バイオテク製）カラムにかけた。100mM NaClを含む 20
mM酢酸緩衝液(pH6.0) で溶出して、 PPase活性を有する
画分を分取し集めた。得られた酵素液はSDS-ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動上で単一のバンドを示したので、
これを精製酵素サンプルとして以下の操作に使用した。
精製の結果を表１に示す。

【表１】

【００２０】実施例２：酵素の特徴付け 2.1 分子量 PPase-BS の分子量を10% SDS-PAGEゲル上の移動度から
推定したところ、約43,000であった。また、この酵素を
100mM NaClを含む 20 mM酢酸緩衝液(pH6.0) で平衡化し
た Superdex 75ゲルろ過カラムにかけてその分子量を推
定したところ、約32,000であった。 2.2 pHおよび温度安定性 PPase-BS を各種pHで37℃16時間インキュベートした
後、実施例１に記載の方法で酵素活性を測定したとこ
ろ、pH３〜10で 80%以上残存していた。また PPase-BS
を20mM酢酸緩衝液 (pH6.0)中で、各種温度で30分間イン
キュベートした後、酵素活性を測定したところ、60℃以
下の温度で 80%以上残存していた。 2.3 至適pHおよび至適温度 PPase活性を反応pHまたは反応温度を変化させた以外は
実施例１に記載の方法で測定したところ、 pH8.0および
60℃で最高の活性を示した。 2.4 各種イオンの影響 PPase活性を、下記の表２に記載の各種物質を１mMの濃
度で含有する反応液中で pH8.0、50℃で測定したとこ
ろ、活性は CuSO₄、 HgCl₂、 MnCl₂およびZnCl₂存在下
でほぼ完全に阻害された。

【表２】

【００２１】実施例３：部分アミノ酸配列の決定 3.1 N-末端アミノ酸配列の決定精製PPase-BS 22.5 μg を 5% メルカプトエタノールに
より還元した後、10%PAGEにおいて分離した。分離した
タンパク質をブロッティング溶液中（10% メタノール/1
0mM CAPS/NaOH(pH11))において PVDF 膜 (Immobilon Ps
q)に電気的 (100V、1.5hr)にブロッティングした。この
PVDF 膜を蒸留水で洗浄した後、0.1%クマシーブルーR-
250/50% メタノールにて染色した。脱色は 50%メタノー
ルにて行い、染色されたバンドを切り出し蒸留水にて洗
浄した後、N-末端アミノ酸配列の同定を Applied Biosy
stems model 492 を用いて行った。同定したPPase-BSの
N-末端アミノ酸配列の結果を配列番号５に示す。 3.2 部分アミノ酸配列の同定精製PPase-BS 22.5 μg を 1% ブロムシアンを含む70%
ギ酸 100μl を加えて溶解、反応させた。反応終了後、
窒素気流下に乾固し、約 100μl の 70%ギ酸に再溶解し
た後乾固した。生じたペプチド断片を逆相HPLCにより分
取し、部分アミノ酸配列を同定した。その結果を配列番
号６に示す。

【００２２】実施例４：PCR 法による遺伝子断片の増幅 4.1 ゲノム DNAの調製バチラス・ズブチリス BS のゲノムDNA は、Molecular
Cloning 3rd Edition(1993 )に従い、CTABを用いて調製
した。 4.2 プライマーの調製 PCR 法によりゲノムDNA から PPase-BS 遺伝子の部分断
片を増幅するために、実施例３で同定した部分アミノ酸
配列より、配列番号７及び８に示す２種類の degenerat
e oligonucleotide primerを自動ＤＮＡ合成機で合成し
た。プライマーN-1 （配列番号７）は、配列番号５に示
した配列のアミノ酸番号１から７の部分配列に対応する
塩基配列として設計した。プライマーN-2 （配列番号
８）は、配列番号６に示したアミノ酸配列に対応する塩
基配列の相補鎖として設計した。

【００２３】4.3 ＰＣＲ LA-PCRキット（宝酒造製）を用い、下記反応条件下でバ
チラス・ズブチリス BS のゲノムDNA よりＰＣＲを行っ
た。反応液： 10x バッファー 5.0 μl dNTPミックス 8.0 μl プライマー N-1 2.5 μl （最終濃度 10 μM) プライマー N-2 2.5 μl （最終濃度 10 μM) LA Taqポリメラーゼ 0.5 μl ゲノム DNA 1.5 μl (500 ng) H₂O 30 μl 計 50 μl 増幅条件：94℃、１分／１サイクル 94℃、１分；50℃、１分；72℃、２分／30サイクル反応終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、
増幅した約 380bpの DNA断片をガラス吸着法により回収
した。この断片を常法に従い T4 リガーゼによりプラス
ミド pBlueScript II SK＋(Stratagene 社製）の EcoRV
切断部位に結合後、エシェリキア・コリJM109 を形質転
換した。得られた形質転換株をＬＢ培地で培養し、回収
した菌体よりアルカリ・ＳＤＳ法 [バーンボイム（Birn
boim) ら、Nucleic Acids Res., 7, 1513. 1979]を使用
してプラスミドを抽出後、RNaseA処理、PEG(ポリエチレ
ングリコール）沈殿及びフェノール抽出により除蛋白
し、エタノール沈殿にてプラスミドDNA を調製した。こ
うして調製したプラスミドDNA の塩基配列の決定は、 A
LF DNAシークエンサー (ファルマシア社製）を使用して
行った。得られたDNA 断片の塩基配列を配列番号４に示
す。

【００２４】実施例５： PPase-BS 遺伝子のクローニン
グ 5.1 サザンブロッティングバチラス・ズブチリス BS のゲノムDNA 250 ngを制限酵
素 EcoRIあるいは HindIIIにより完全に消化した後、1%
アガロースゲル電気泳動にかけた。泳動後、ゲルを変性
(1.5 M NaCl/0.5 M NaOH、45分間）、中和（1.5M NaCl/
1M Tris-HCl (pH8.0) 、30分間）させ、分離したDNA を
ナイロン膜（HybondN+, Amersham社製）に転写し、紫外
線照射により固定した。実施例４において得た PCR断片
を含むプラスミドDNA を制限酵素 EcoRI及び HindIIIで
消化後、1%アガロースゲルで電気泳動し、ガラス吸着法
にて回収した約 380kbのDNA 断片を PPase-BS 遺伝子の
フルクローニングのためのプローブDNA として用いた。
プローブDNA は、Fluoresein Gene Images labelling k
it (Amersham社製）を用いて蛍光ラベルを行った。ハイ
ブリダイゼーション、洗浄及びシグナルの検出は、Fluo
resein Gene Images detection kit (Amersham社製）を
用い、添付されたプロトコールに従って行った。その結
果、EcoRI で1.5 kb、 HindIIIで約1.3kbのバンドが検
出された。これらのバンドを用いて、遺伝子クローニン
グを行った。

【００２５】5.2 遺伝子のクローニングバチラス・ズブチリス BS のゲノムDNA 10μg を制限酵
素 EcoRIあるいは HindIIIにより完全に消化した後、1%
アガロースゲル電気泳動にかけ、1.5 kb付近及び 1.3 k
b 付近の画分をそれぞれガラス吸着法により回収した。
これらの DNA断片をそれぞれプラスミド pBlueScript I
I SK＋（Stratagene社製）の EcoRI、あるいは HindIII
切断部位に結合し、エシェリキア・コリJM109 を形質転
換した。得られた形質転換株の DNAをナイロンメンブラ
ンに固定し、実施例４で得た約 380kbの PCR断片をプロ
ーブとしてコロニーハイブリダイゼーション法によりポ
ジティブクローンをスクリーニングした。その結果、 E
coRI 1.5kb付近の溶出 DNAから約 1.5kbの挿入断片を有
する pPPBSE1を、また HindIII 1.3kbの付近の溶出DNA
から約 1.3kbの挿入断片を有する pPPBSH1を得た。 5.3 クローンの解析得られた二つの断片（pPPBSE1 及びpPPBSH1 の挿入断
片）の DNA塩基配列を決定し、実施例４で得た PCR断片
の配列と比較したところ、 pPPBSE1が DNAの5'側を、pP
PBSH1 が3'側をコードし、 395bpの共通の EcoRI-HindI
II断片を有することが判明した。この塩基配列を配列番
号３に示す。

【００２６】実施例６：アミノ酸配列の同定実施例５で解析した塩基配列（配列番号３）には、塩基
番号 295から塩基番号1557に1263塩基からなるオープン
リーディングフレームが存在し、このオープンリーディ
ングフレームは、 420アミノ酸からなるタンパク質をコ
ードすることが推測された。このアミノ酸配列の中に
は、配列番号５に示す PPase-BS の N末端アミノ酸配列
及び配列番号６に示すブロムシアン切断ペプチド断片の
部分アミノ酸配列がそれぞれ見出されたことから、この
アミノ酸配列がコードするタンパク質は PPase-BS であ
ると判断した。このアミノ酸配列を配列番号２に示す。
配列番号２の最初のアミノ酸残基から21アミノ酸残基
は、N-末端領域に電荷を有するアミノ酸 Lysが、また中
央部分に疎水性アミノ酸のクラスターが認められること
から、分泌シグナル配列と考えられる。すなわち、PPas
e-BSのN-末端の20アミノ酸残基の配列が配列番号５に示
すように同定されていることから、PPase-BSは配列番号
２の配列を有するタンパク質として生合成された後、最
初のアミノ酸残基から21番目のアミノ酸 Alaと22番目の
アミノ酸 Alaの間で切断を受け、配列番号１（配列番号
３の 358〜1557番目の塩基に対応）に示すアミノ酸配列
を有する成熟型のタンパク質として菌体外に分泌される
と考えられる。

【００２７】実施例７：エシェリキア・コリを宿主とす
る形質転換体の製造 PPase-BS 遺伝子は、 EcoRI 1.5kb断片と HindIII 1.3
kb 断片に分割してクローニングされたため、両断片を
連結し完全な PPase-BS 遺伝子を構築した。すなわち、
pPPBSH1 の EcoRI切断部位にpPPBSE1 の EcoRI 1.1kb断
片を挿入して PPase-BS 発現ベクター pPPBS-1を作製
し、これに塩化カルシウム法を用いることによりpPPBS-
1 を保持するエシェリキア・コリ DH1を得た。得られた
形質転換体をL-broth 培地（50μg/mlアンピシリンを含
む）において37℃で一晩培養し、 PPase-BS の生産を調
べた。培養液は、遠心分離に付して培養上清と沈殿物に
分離し、さらに、この沈殿物を緩衝液に懸濁後遠心分離
して上清（ペリプラズム画分）、及び沈殿物を超音波処
理後、遠心分離して得られる上清（細胞内画分）に分け
た。これらの画分それぞれについてのペクチン酸リアー
ゼ活性を測定したところ、全ての画分に活性が認められ
たが、ペリプラズム画分に最も強い活性が検出された
（表３）。したがって、組換え PPase-BS は細胞内膜を
通過し、分泌生産されていると考えられる。

【表３】

【００２８】実施例８：バチラス・ズブチリスを宿主と
する形質転換体の製造バチラス・ズブチリスにおける PPase-BS の発現にはプ
ラスミド pUB110(上述) を使用した。 PPase-BS 遺伝子
を pUB110 の XbaI 切断部位に挿入するために、PCR 法
により PPase-BS 遺伝子に XbaI 切断部位を付加した。
すなわち、配列番号３の 155〜174 番目の塩基に対応す
るプライマー N-3（配列番号９）及び配列番号３の1654
〜1666番目の相補鎖に対応するプライマーN-4 （配列番
号10）を自動ＤＮＡ合成機で合成した。これらを用い、
実施例７で作製したpPPBS-1 を鋳型として実施例 4.3と
同じ条件でＰＣＲを行った。増幅した約1.5 kbの DNA断
片を制限酵素 XbaI により完全に消化した後、1%アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、ガラス吸着法により回収し
た。増幅した DNA断片をプラスミド pUC18（アマシャム
ファルマシアバイオテク社製）の XbaI 切断部位に結合
し、エシェリキア・コリJM109 を形質転換した。得られ
た形質転換株のプラスミドを抽出し、塩基配列を決定
し、 PPase-BS 遺伝子に変異が無いことを確認し、この
プラスミドを pUC18-BS とした。pUC18-BSを XbaI によ
り切断して得た 1.5 kb の PPase-BS 遺伝子断片を pUB
110 の XbaI 切断部位に連結し、プロトプラスト法によ
りバチラス・ズブチリスMI112を形質転換し（5 μg/ml
のカナマイシンを含む L-brothで選択）、pUB110-BS を
作製した。

【００２９】pUB110-BS を保持するバチラス・ズブチリ
スを上記の L-brothで37℃で一晩培養し、実施例７と同
様にして酵素活性を測定した。その結果、培養上清に
は、pUB110のみを保持するバチラス・ズブチリスから得
たものと比較して約５〜８倍のPPase 活性が認められた
ことから、バチラス・ズブチリスで PPase-BS 遺伝子が
発現していることが判明した。

【表４】

【００３０】実施例９：バチラス・ズブチリスを宿主と
する形質転換体による綿布の精練綿繊維の精練の評価方法は、以下に示す方法にしたがっ
て行った。 0.1％ウオミンTE（東海製油工業株式会社）
及び 0.5mM塩化カルシウムを含む 100mMトリス塩酸緩衝
液（pH8.0)１mlに40mgの糊抜き後の未精練の綿布（直径
約５mm）を50℃で浸漬した。次いで、実施例８で調製し
た培養上清を 100倍に希釈したものを10μl 加え、同温
で２時間反応させた後、反応液をろ紙でろ過し、得られ
たろ液中に溶出したペクチン量を実施例１に記載のカル
バゾール硫酸法で測定した。pUB110-BS を保持するバチ
ラス・ズブチリスの培養上清を用いた場合、２時間で9
6.5μg のペクチンが溶出した。これと比較してpUB110
のみを保持するバチラス・ズブチリスの培養上清では2
2.1μg のペクチンしか溶出しないことから、バチラス
・ズブチリスで発現生産した PPase-BS が綿布のペクチ
ンを可溶化し、精練に使用しうることが明らかとなっ
た。

【００３１】

【発明の効果】本発明によれば、プロトペクチナーゼを
コードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクタ
ー、形質転換体などが提供される。これらの遺伝子及び
形質転換体類を用いることにより、簡便かつ安価に大量
の繊維を精練することができる。また、当該遺伝子類
を、植物組織の処理を含む様々な分野で適用することが
できる。

【００３２】

【配列表】ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧ <110> Takuo Sakai <120> Gene coding for protopectinase, transformant including the gene , and method for purifying fibers using the transformant. <130> PTS-8839 <160> 10 <210> 1 <211> 399 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 1 Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Ser His Val 20 25 30 Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Asp 35 40 45 Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys Gly Thr Ile Asp Met 50 55 60 Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp 65 70 75 80 Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr 85 90 95 Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Leu Glu Glu Ala Arg Ala Arg 100 105 110 Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val Asp Ile Pro Ala Asn 115 120 125 Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys Ile Val Gly Gly Asn 130 135 140 Phe Gln Ile Lys Ser Asp Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile Glu Phe Gln 145 150 155 160 Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser 165 170 175 Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Ile Asn Gly Gly Thr 180 185 190 His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp 195 200 205 Ser Thr Ser Pro Lys Tyr Phe Gly Arg Lys Tyr Gln His His Asp Gly 210 215 220 Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile Thr Met Ser Tyr Asn 225 230 235 240 Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Asp Ser 245 250 255 Lys Thr Ser Asp Asp Gly Lys Leu Lys Ile Thr Leu His His Asn Arg 260 265 270 Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val Arg Phe Gly Gln Val 275 280 285 His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Ser Ser Ser Asp Tyr 290 295 300 Ala Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser Ser Lys Ile Tyr Ala 305 310 315 320 Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Ser Ala Ala Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Thr Leu Leu 340 345 350 Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn Gly Leu Ser Ser Ser 355 360 365 Val Gly Trp Thr Pro Ser Leu His Gly Thr Ile Asp Ala Ser Ala His 370 375 380 Val Lys Ser Asn Val Ile Ser Gln Ala Gly Ala Gly Lys Leu Asn 385 390 395 <210> 2 <211> 420 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 2 Met Lys Lys Val Met Leu Ala Thr Ala Leu Leu Leu Gly Leu Thr Pro -20 -15 -10 Ala Gly Pro Asn Ala Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Gly Ser Asn -5 -1 1 5 10 Asp Gly Trp Gly Ala Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala 15 20 25 Ser Ser Ser His Val Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser 30 35 40 Ala Leu Gly Lys Asp Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys 45 50 55 Gly Thr Ile Asp Met Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu 60 65 70 75 Asn Asp Tyr Lys Asp Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala 80 85 90 Tyr Asp Pro Ser Thr Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Leu Glu 95 100 105 Glu Ala Arg Ala Arg Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val 110 115 120 Asp Ile Pro Ala Asn Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys 125 130 135 Ile Val Gly Gly Asn Phe Gln Ile Lys Ser Asp Asn Val Ile Ile Arg 140 145 150 155 Asn Ile Glu Phe Gln Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro 160 165 170 Thr Asp Gly Ser Ser Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr 175 180 185 Ile Asn Gly Gly Thr His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp 190 195 200 Gly Ser Arg Pro Asp Ser Thr Ser Pro Lys Tyr Phe Gly Arg Lys Tyr 205 210 215 Gln His His Asp Gly Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile 220 225 230 235 Thr Met Ser Tyr Asn Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Phe 240 245 250 Gly Ser Ser Asp Ser Lys Thr Ser Asp Asp Gly Lys Leu Lys Ile Thr 255 260 265 Leu His His Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val 270 275 280 Arg Phe Gly Gln Val His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr 285 290 295 Ser Ser Ser Asp Tyr Ala Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser 300 305 310 315 Ser Lys Ile Tyr Ala Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Ser 320 325 330 Ala Ala Lys Thr Ile Ser Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp 350 340 345 Ser Gly Thr Leu Leu Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn 350 355 360 Gly Leu Ser Ser Ser Val Gly Trp Thr Pro Ser Leu His Gly Thr Ile 365 370 375 Asp Ala Ser Ala His Val Lys Ser Asn Val Ile Ser Gln Ala Gly Ala 380 385 390 395 Gly Lys Leu Asn <210> 3 <211> 1729 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 3 tttttctgag gatgaagccg ctcaattcga aaaacgttta gatgaaggga aagtgcttct 60 ctttgtgacc gataatgaaa aagtgaaatc ctgggcataa tgcagggata taacccaaaa 120 ggccaacttc ggctttttgg gttttttttg cggtctttgc ggtgtatgtg ttgcagaatg 180 ccgcaataag atagcggaac attttcggtt ctggatgtcc ctcaatttgc tatcatatct 240 ttgtgagaaa ttggaatata atctcacaaa atagaaaatg ggggttcata gtga atg 297 aaa aaa gtg atg tta gcc acg gct ctg ctt tta ggg ttg act cca gct 345 ggg ccg aac gcg gcg gat tta ggc cat caa aca tta gga tca aat gat 393 ggc tgg ggc gcg tac tcg acc ggc aca aca ggc gga tca aaa gct tcg 441 tca tcc cac gtg tat acc gtc agc aac aga aac cag ctt gtc tcg gca 489 tta ggc aag gac acc aac aca acg cca aaa atc att tat att aag gga 537 acg att gac atg aac gtc gat gac aat ctg aag ccg ctt ggt cta aat 585 gat tat aaa gat cca gag tac gat ttg gac aaa tat ttg aaa gcc tat 633 gac cct agc aca tgg ggc aaa aag gag ccg tcg ggg aca cta gaa gag 681 gcg aga gca cga tct cag aaa aat caa aaa gca cga gtc atg gtg gat 729 att ccg gca aac acg acg atc gtc ggt tca ggg aca aat gcc aaa atc 777 gtg ggc gga aat ttc cag atc aag agt gat aat gtc atc atc cgc aac 825 atc gaa ttc cag gat gct tat gat tat ttt ccg caa tgg gat ccg act 873 gac ggc agc tca gga aac tgg aac tca caa tac gac aac atc aca ata 921 aac ggc ggc acg cat ata tgg att gat cat tgt aca ttt aat gac ggt 969 tcc cgt ccg gac agc aca tcg cca aag tat ttc ggc aga aaa tat cag 1017 cac cat gac ggc caa acc gat gct tct aac ggc gct aac tat atc acg 1065 atg tct tac aac tat tat cac gat cat gat aaa agc tcc att ttc gga 1113 tca agc gac agc aaa aca tct gat gac ggc aaa tta aaa atc acg ctc 1161 cat cat aac cgc tat aaa aat atc gtc cag cgc gca ccg aga gtc cgc 1209 ttc ggg cag gtg cac gtt tac aac aac tat tat gaa ggc agc aca agc 1257 tcc tcg gat tat gcc ttc agc tat gcg tgg gga atc gga aaa tca tct 1305 aaa atc tac gct caa aac aat gtc att gac gtg cct gga ctg tca gcc 1353 gct aaa acg atc agc gta ttc agc ggg gga acg gct tta tat gac tca 1401 ggc aca ttg ctg aat ggc acg cag atc aac gca tcg gct gca aac ggg 1449 ctg agt tct tct gtc ggc tgg aca ccg tct ctg cac ggc aca atc gat 1497 gct tcc gcg cat gta aaa tcg aat gtt ata tct caa gcg ggt gcg ggt 1545 aaa cta aat taa gaaatgaaaa aacacaaagg gctgctcacc tttgtgtttt 1597 ttaattaatt aaaatgttta ttaacttagt taaggagtag aatgggaaag gggatcggaa 1657 aacaagtata taggaggaga cctatttatg gcttcagaaa aagacgcagg aaaacagtca 1717 gcagtaaagc tt 1729 <210> 4 <211> 386 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 4 gcg gat tta ggc cat caa aca tta gga tca aat gat ggc tgg ggc gcg 48 tac tcg acc ggc aca aca ggc gga tca aaa gct tcg tca tcc cac gtg 96 tat acc gtc agc aac aga aac cag ctt gtc tcg gca tta ggc aag gac 144 acc aac aca acg cca aaa atc att tat att aag gga acg att gac atg 192 aac gtc gat gac aat ctg aag ccg ctt ggt cta aat gat tat aaa gat 240 cca gag tac gat ttg gac aaa tat ttg aaa gcc tat gac cct agc aca 288 tgg ggc aaa aag gag ccg tcg ggg aca cta gaa gag gcg aga gca cga 336 tct cag aaa aat caa aaa gca cga gtc atg gtg gat att ccg gca aac 384 ac 386 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 5 Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Thr Gly 20 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 6 Val Asp Ile Pro Ala Asn Thr 1 5 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> unsure <222> 3 <223> n = a,c,g or t. <220> <221> unsure <222> 9 <223> n = a,c,g or t. <220> <221> unsure <222> 12 <223> n = a,c,g or t. <400> 7 gcngayytng gncaycarac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> unsure <222> 6 <223> n = a,c,g or t. <220> <221> unsure <222> 9 <223> n = a,c,g or t. <220> <221> unsure <222> 18 <223> n = a,c,g or t. <400> 8 gtrttngcng gdatrtcnac 20 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> unsure <400> 9 ggggaattcc tttgcggtgt atgtgttgc 29 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> unsure <400> 10 ccttctagat acttgttttc c 21

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｄ０６Ｍ 16/00 ＺＤ０６Ｍ 16/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ // Ｄ０６Ｍ 101:06 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA12 CA03 CA07 DA07 EA04 FA18 GA11 GA21 4B050 CC03 CC04 DD02 LL10 4B065 AA19X AA19Y AB01 AC14 AC15 BA01 BA10 CA31 CA60 4L031 AB01 BA33 BA39 CA00

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１に示すアミノ酸配列からな
るタンパク質、又はこの配列において１もしくは数個の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつプロトペクチナーゼ活性を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子。
【請求項２】シグナルペプチドが付加されてなる請
求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】シグナルペプチドが付加された遺伝子
が、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク
質、又はこの配列において１もしくは数個のアミノ酸が
欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、
かつプロトペクチナーゼ活性を有するタンパク質をコー
ドする請求項２に記載の遺伝子。
【請求項４】配列番号３に示す配列の塩基番号 358
〜1557で表される塩基配列を有する請求項１〜３のいず
れか１つに記載の遺伝子。
【請求項５】遺伝子から産生されるタンパク質が、
1)プロトペクチナーゼ活性を有し；2)SDS-ポリアクリル
アミドゲル電気泳動ゲル上での分子量が約43,000であ
り；3)至適pHが 8.0であり；4)至適温度が60℃であり；
かつ5)Cu、Hg、Mn及びZnにより阻害を受ける性質を有す
る請求項１〜４のいずれか１つに記載の遺伝子。
【請求項６】請求項１〜５のいずれか１つに記載の
遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項７】請求項６に記載の組換えベクターを含
む形質転換体。
【請求項８】形質転換体の宿主が、微生物である請
求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】請求項７又は８に記載の形質転換体を
製造する方法。
【請求項１０】請求項７又は８に記載の形質転換体を
用いる繊維の精練方法。
【請求項１１】請求項１０に記載の方法により処理さ
れた繊維。