JP2000290300A - 抗プラスミノーゲン抗体、プラスミノーゲン測定方法及び測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 プラスミノーゲンとは結合し、かつリポタン
パク質（ａ）、又はアポリポタンパク質（ａ）とは、結
合しない抗体を得、試料中に存在するリポタンパク質
（ａ）、又はアポリポタンパク質（ａ）を測り込むこと
なく、真のプラスミノーゲン濃度を正確かつ簡便に得る
ことができる試料中のプラスミノーゲンの測定方法及び
測定試薬を提供する。 【構成】 プラスミノーゲンに結合し、かつリポタンパ
ク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結合しな
い、抗プラスミノーゲン・モノクローナル抗体。この抗
プラスミノーゲン・モノクローナル抗体を使用する、プ
ラスミノーゲンの測定方法、及び測定試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血液の線溶系にお
いて、セリンプロテアーゼ作用によりフィブリンの溶解
を行うプラスミンの前駆体であるプラスミノーゲンに関
し、このプラスミノーゲンに特異的に結合する抗プラス
ミノーゲン・モノクローナル抗体、試料中のプラスミノ
ーゲン濃度を正確に測定することができる測定方法、及
び測定試薬を提供する。本発明は、分子生物学分野、医
療分野、特に臨床検査分野において有用なものである。

【０００２】

【従来の技術】プラスミノーゲンは、分子量が約９１キ
ロダルトンの一本鎖の糖タンパク質である。このプラス
ミノーゲンは、組織より遊離された組織アクチベータ
ー、又はウロキナーゼ等のプラスミノーゲン活性化因子
によって活性化されてプラスミンとなる。プラスミン
は、いわゆるセリンプロテアーゼであって、血管内に形
成されたフィブリンに作用し分解溶離させ、フィブリン
分解産物（ＦＤＰ）を生成させて、血栓の溶解を行う。

【０００３】血漿中のプラスミノーゲン濃度は、播種性
血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、肝実質障害等で低値とな
るので、このプラスミノーゲン濃度を測定することは、
播種性血管内凝固症候群等の診断にとって大変重要なも
のである。血漿等の試料中のプラスミノーゲンの測定に
は、プラスミノーゲンをプラスミノーゲン活性化因子に
より活性化してプラスミンに変えた後にその酵素活性を
測定する方法と、プラスミノーゲンに結合する抗体を用
いてプラスミノーゲンを抗原として（物質として）、免
疫学的に測定する方法が知られている。

【０００４】免疫学的に試料中のプラスミノーゲンの測
定を行う場合、試料中に存在するリポタンパク質
（ａ）、又はリポタンパク質（ａ）の低密度リポタンパ
ク質以外の部位であるアポリポタンパク質（ａ）をも測
り込んでしまい、得られたプラスミノーゲン濃度測定値
に正の誤差が生じ、正しい測定値が得られないという問
題があった。

【０００５】これは、アポリポタンパク質（ａ）分子と
プラスミノーゲン分子とでは、８０％以上という非常に
高い相同性があるため、プラスミノーゲンを免疫原とし
てプラスミノーゲンに対する抗体を作製した場合、この
抗体が、リポタンパク質（ａ）、又はアポリポタンパク
質（ａ）にも結合してしまうからである（交叉反応）。

【０００６】このリポタンパク質（ａ）、又はアポリポ
タンパク質（ａ）にも結合してしまう抗プラスミノーゲ
ン抗体を、リポタンパク質（ａ）、又はアポリポタンパ
ク質（ａ）を結合させた担体が充填されたカラムに通
し、リポタンパク質（ａ）、又はアポリポタンパク質
（ａ）に結合する抗体を担体に結合させて吸収し、素通
りした抗体だけを集め、リポタンパク質（ａ）、及びア
ポリポタンパク質（ａ）には結合しない抗体だけをこの
アフィニティークロマトグラフィー操作により得ること
ができる。しかしながら、この操作は、煩雑であって、
人手や器具・装置やコストがかかり、一定の品質の抗体
を安価に調製するには、適さないものであった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】前記のような現状に鑑
みて、本発明者らは、プラスミノーゲンの免疫学的な測
定方法及び測定試薬において、試料中のリポタンパク質
（ａ）、又はアポリポタンパク質（ａ）を測り込んでし
まい、測定値に正の誤差が生じてしまう問題を、従来技
術とは異なる手段を用いて解決することを課題とした。

【０００８】即ち、プラスミノーゲンとは結合し、かつ
リポタンパク質（ａ）、又はアポリポタンパク質（ａ）
とは、結合しない抗体を得、試料中に存在するリポタン
パク質（ａ）、又はアポリポタンパク質（ａ）を測り込
むことなく、真のプラスミノーゲン濃度を正確かつ簡便
に得ることができる試料中のプラスミノーゲンの測定方
法及び測定試薬の提供を課題としたものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の発明を
包含する。 （１） プラスミノーゲンに結合し、かつリポタンパク
質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結合しな
い、抗プラスミノーゲン・モノクローナル抗体。 （２） 試料中のプラスミノーゲンの測定方法におい
て、プラスミノーゲンに結合し、かつリポタンパク質
（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結合しないモ
ノクローナル抗体を使用する、プラスミノーゲンの測定
方法。 （３） 試料中のプラスミノーゲンの測定試薬におい
て、プラスミノーゲンに結合し、かつリポタンパク質
（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結合しないモ
ノクローナル抗体を使用する、プラスミノーゲンの測定
試薬。

【００１０】

【発明の実施の態様】〔１〕抗体 本発明における、抗プラスミノーゲン・モノクローナル
抗体は、ヒト等のプラスミノーゲンに結合し、かつリポ
タンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結
合しない、モノクローナル抗体である。

【００１１】この本発明の抗体は、モノクローナル抗体
であればどのようなものでもよく、このモノクローナル
抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａ
ｂ’等）をも含むものである。

【００１２】この本発明の抗体は、プラスミノーゲンの
クリングル１、クリングル２、及びクリングル３ドメイ
ンを免疫原として用い、調製してもよい。また、この本
発明の抗体は、プラスミノーゲン全体を免疫原として用
い、調製してもよい。

【００１３】この本発明の抗体は、プラスミノーゲン全
体、又はクリングル１、クリングル２、及びクリングル
３ドメイン等のプラスミノーゲンの一部を抗体産生用免
疫原として動物に免疫し、プラスミノーゲンに結合し、
かつリポタンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質
（ａ）とは結合しない抗体を選択することにより得るこ
とができる。

【００１４】この抗体産生用免疫原は、前記の物質その
ものを抗体産生用免疫原として動物に免疫してもよい
し、これらの物質と担体（キャリア）を結合させたもの
を抗体産生用免疫原として動物に免疫してもよい。

【００１５】なお、抗体産生用免疫原として用いる物質
が低分子物質の場合には、担体と結合したものを免疫す
るのが一般的であるものの、アミノ酸数５のペプチドを
免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報
告〔木山ら「日本薬学会第１１２年会講演要旨集３」，
１２２頁，１９９２年〕もあるので、担体を使用するこ
とは必須ではない。

【００１６】担体を使用する場合には、スカシガイのヘ
モシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、ヒト血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミン、
ポリ−Ｌ−リジン、ポリアラニルリジン、ジパルミチル
リジン、破傷風トキソイド、又は多糖類等の担体として
公知なものを用いることができる。

【００１７】そして、抗体産生用免疫原として用いる前
記の物質と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサ
クシニミドエステル法、Ｎ−サクシミジル−３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオン酸法、ビスジアゾ化ベンジ
ジン法、又はジパルミチルリジン法等の公知の結合法を
用いることができる。

【００１８】また、ニトロセルロース粒子、ポリビニル
ピロリドン、又はリポソーム等の担体に前記の物質を吸
着させたものを、抗体産生用免疫原とすることもでき
る。

【００１９】以下、モノクローナル抗体の調製法につい
て説明を行う。モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞
融合法〔Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６
巻，４９５〜４９７頁，１９７５年〕によるハイブリド
ーマ、又はエプスタンーバーウイルス等のウイルスによ
る腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができ
る。

【００２０】細胞融合法による本発明のモノクローナル
抗体の調製は、以下の操作により行うことができる。ま
ず、プラスミノーゲン全体、又はクリングル１、クリン
グル２、及びクリングル３ドメイン等のプラスミノーゲ
ンの一部を抗体産生用免疫原（担体は使用してもよい
し、使用しなくてもよい）として、哺乳動物（マウス、
ヌードマウス、ラット等、例えば近交系マウスのＢＡＬ
Ｂ／ｃ）、又は鳥類（ニワトリ等）に免疫する。

【００２１】抗体産生用免疫原の免疫量は、免疫動物の
種類、免疫注射部位等により適宜決められるものである
が、例えば、マウスの場合には一匹当たり一回につき
０．１μｇ〜５ｍｇの抗体産生用免疫原を免疫注射する
のが好ましい。なお、抗体産生用免疫原はアジュバント
を添加混合して免疫注射をすることが好ましい。アジュ
バントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイ
ント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバ
ント、又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用い
ることができる。

【００２２】免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内、又は
背部等の部位に行えばよい。初回免疫後、１〜２週間間
隔で皮下、静脈内、腹腔内、又は背部等の部位に抗体産
生用免疫原を追加免疫注射する。この追加免疫注射の回
数としては２〜６回が一般的である。この場合も抗体産
生用免疫原はアジュバントを添加混合して追加免疫注射
をすることが好ましい。初回免疫の後、免疫動物の血清
中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行
い、抗体価がプラトーに達したら、抗体産生用免疫原を
生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解し
たものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。

【００２３】この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の
脾細胞、リンパ節細胞、又は末梢リンパ球等の抗体産生
能を有する細胞を取得する。

【００２４】この免疫動物より得られた抗体産生能を有
する細胞と哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラット
等）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させ
るのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン
・グアニン・ホスホリポシル・トランスフェラーゼ（Ｈ
ＧＰＲＴ）、又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を
欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／
ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３
−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣ
ＲＢ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株
（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５
３株（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１
４株（ＪＣＲＢ ００２９）などを用いることができ
る。

【００２５】細胞融合は、各種分子量のポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）、リポソーム又はセンダイウイルス
（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融
合法により行うことができる。

【００２６】ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴ
Ｋ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミ
ノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）
を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエロ
ーマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に
培養し、増殖させることができる。

【００２７】このようにして得られたハイブリドーマの
培養上清を、ＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の
免疫学的測定法により測定することにより、プラスミノ
ーゲンに結合し、かつリポタンパク質（ａ）及びアポリ
ポタンパク質（ａ）とは結合しない抗体を産生するハイ
ブリドーマを選択することができ、この方法と限界希釈
法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うこ
とにより、本発明のモノクローナル抗体の産生細胞株を
単離して得ることができる。

【００２８】このモノクローナル抗体産生細胞株を適当
な培地で培養して、その培養上清から本発明に使用する
モノクローナル抗体を得ることができるが、培地として
は無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、こ
の場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥ
Ｍ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等
の培地を用いることができる。

【００２９】また、モノクローナル抗体産生細胞株を、
これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した
哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたま
った腹水より本発明のモノクローナル抗体を得ることも
できる。

【００３０】このようにして得られたモノクローナル抗
体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析
法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、又は
アフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいは
これらの方法を組み合わせることにより、精製された本
発明のモノクローナル抗体を得ることができる。

【００３１】〔２〕測定方法、測定試薬 本発明における、プラスミノーゲンに結合し、かつリポ
タンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結
合しないモノクローナル抗体を使用する、試料中のプラ
スミノーゲンの測定方法及び測定試薬は、試料中に存在
するリポタンパク質（ａ）、又はアポリポタンパク質
（ａ）を測り込むことなく、真のプラスミノーゲン濃度
を正確かつ簡便に得ることができる測定方法及び測定試
薬である。本発明の測定方法及び測定試薬における、プ
ラスミノーゲンに結合し、かつリポタンパク質（ａ）及
びアポリポタンパク質（ａ）とは結合しないモノクロー
ナル抗体の詳細は、先に記載したとおりである。

【００３２】本発明の測定方法及び測定試薬において
は、プラスミノーゲンに結合し、かつリポタンパク質
（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結合しないモ
ノクローナル抗体として、前記の性質を有する抗体のう
ち１種類の抗体を用いるだけでなく、前記の性質を有す
る複数種類の抗体を組み合わせて用いてもよい。

【００３３】そして、本測定方法（本測定試薬）は、抗
原抗体反応を利用する測定方法（測定試薬）、即ち免疫
学的測定方法（免疫学的測定試薬）であればいずれの方
法（試薬）においても、その測定方法（測定試薬）で使
用される抗体として、前記の抗体を用いることにより、
所期の効果を奏するものである。

【００３４】例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法、
ＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ
法）、発光免疫測定法、酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫
比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス凝集反応、ラテックス比
濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応、単純免疫拡散
法、ロケット免疫電気泳動法、又はウエスタンブロット
法等により本測定方法（本測定試薬）は実施される。

【００３５】本発明の測定方法（測定試薬）により測定
を行うものは、試料中に含まれる、ヒト等のプラスミノ
ーゲンの全体、又はこの構成部分である。なお、本明細
書においては、これらを総称して「プラスミノーゲン」
と記載する。

【００３６】本測定方法（本測定試薬）における試料と
しては、ヒト又は動物の、血液、血清、血漿、尿、髄
液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒト若しくは
動物の脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉、又は神経組
織等の抽出液；ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁
液；細胞の抽出液等、プラスミノーゲンが含まれる可能
性のある生体試料であれば対象となる。

【００３７】本測定方法（本測定試薬）を、酵素免疫測
定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、又は発光免疫
測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法（免疫学
的測定試薬）により実施する場合には、サンドイッチ法
又は競合法により行うこともできる。

【００３８】サンドイッチ法の場合には、固相化抗体又
は標識抗体等、直接プラスミノーゲンと結合する抗体の
いずれかに前記の抗体を用いればよい。

【００３９】固相担体としては、ポリスチレン、ポリカ
ーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポ
リエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリ
レート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロー
ス、セファロース、ガラス、金属、セラミックス、又は
磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試
験管、スティック、又は試験片等の形状の固相担体を用
いることができる。

【００４０】固相化抗体は、固相担体と抗体を物理的吸
着法、化学的結合法、又はこれらの併用等の公知の方法
により調製することができる。

【００４１】標識物質としては、酵素免疫測定法の場合
には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファ
ターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアー
ゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素
酵素、又はアミラーゼ等を、蛍光免疫測定法の場合に
は、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチル
ローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチ
オシアネート、又はジクロロトリアジンイソチオシアネ
ート等を、そして放射免疫測定法の場合には、トリチウ
ム、ヨウ素１２５、又はヨウ素１３１等を用いることが
できる。

【００４２】また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ−ＦＭ
ＮＨ_２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−
ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系、又はジオキセタ
ン化合物系等を用いることができる。

【００４３】標識物質と抗体との結合法は、グルタルア
ルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、
又は過ヨウ素酸法等の公知の方法を用いることができ
る。

【００４４】測定の操作法は公知の方法〔日本臨床病理
学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のた
めのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行
会，１９８３年，石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第
３版，医学書院，１９８７年，北川常廣ら編「蛋白質核
酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，
１９８７年〕等により行うことができる。

【００４５】例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同
時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体
を反応させて、固相化抗体−プラスミノーゲン−標識抗
体の複合体を形成させる。そして、未結合の標識抗体を
洗浄分離して、結合標識抗体量又は未結合標識抗体量よ
り試料中のプラスミノーゲン量を測定することができ
る。

【００４６】具体的には、酵素免疫測定法の場合は、標
識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生
成物の量を光学的方法等により測定する。

【００４７】蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識に
よる蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質
標識による放射線量を測定する。

【００４８】発光免疫測定法の場合は発光反応系による
発光量を測定する。

【００４９】本測定方法（本測定試薬）を、免疫比濁
法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝
集反応、又は粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成
を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目
視的に測る測定方法（測定試薬）により実施する場合に
は、溶媒として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、又はグッ
ド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリ
コール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませて
もよい。

【００５０】抗体を固相担体に感作させて用いる場合に
は、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−ブタ
ジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマ
ー、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプ
セル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、
金属化合物、金属、セラミックス、又は磁性体等の材質
よりなる粒子を使用することができる。

【００５１】この感作の方法としては、物理的吸着法、
化学的結合法、又はこれらの方法の併用等の公知の方法
を使うことができる。

【００５２】測定の操作法は公知の方法により行うこと
ができるが、例えば、光学的方法により測定する場合に
は、試料と抗体、又は試料と固相担体に感作させた抗体
を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透
過光や散乱光を測定する。また、目視的に測定する場合
には、プレートやマイクロタイタープレート等の容器中
で、試料と固相担体に感作させた抗体を反応させ、凝集
の状態を目視的に判定する。なお、目視的に測定する代
わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定
を行ってもよい。

【００５３】

【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【００５４】〔実施例１〕 プラスミノーゲンに結合
し、かつリポタンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質
（ａ）とは結合しないモノクローナル抗体の調製

【００５５】〔１〕プラスミノーゲンのクリングル１、
クリングル２、及びクリングル３ドメインの調製 新鮮なヒト血漿の１，０００ｍＬに臭化カリウムを添加
し、その密度が１．２１Ｋｇ／Ｌを超えるようにした。
これを、超遠心分離機（日立工機社製；ＳＣＰ８５）を
使用して等密度超遠心分離を行い、その密度が１．２１
Ｋｇ／Ｌを超える血漿タンパク質フラクションを分取し
た。

【００５６】次に、この密度が１．２１Ｋｇ／Ｌを超え
るフラクションを、０．０１％アジ化ナトリウム及び
０．０１％ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）〔以下、緩衝液Ａという〕で十分に透析した
後、この緩衝液Ａで平衡化されているリジン−セファロ
ース・アフィニティークロマトグラフィーカラムにかけ
た。そして、十分に洗浄した後、０．２Ｍの６−アミノ
カプロン酸を含む緩衝液Ａを溶出液として流し、精製・
ヒト・プラスミノーゲンを溶出させた。

【００５７】Ｊｅｎｓｅｎらの方法〔Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ
ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ，３巻，１９１〜
２０９頁，１９８７年〕に従い、この精製・プラスミノ
ーゲンよりヒト・プラスミノーゲンのクリングル１、ク
リングル２、及びクリングル３ドメインを調製した。

【００５８】まず、精製・プラスミノーゲンの５００ｍ
ｇを、０．１Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３（ｐＨ８．３）の１０
ｍＬに溶解した。次に、これにブタ膵エラスターゼ１．
５ｍｇを添加して室温で４時間反応させた後、セファデ
ックスＧ−７５でゲルろ過を行った。このゲルろ過で得
られた４つのピークのうち２番目のピークのフラクショ
ンを分取した。この２番目のピークのフラクションを更
に、緩衝液Ａで平衡化しておいたリジン−セファロース
・アフィニティークロマトグラフィーカラムにかけた。

【００５９】このカラムを、緩衝液Ａで十分に洗浄した
後、０．２Ｍの６−アミノカプロン酸を含む緩衝液Ａを
溶出液として流し、プラスミノーゲンのクリングル１、
クリングル２、及びクリングル３ドメインを溶出させ
た。このようにして、プラスミノーゲンのクリングル
１、クリングル２、及びクリングル３ドメインを調製し
た。

【００６０】〔２〕動物への免疫 （１） 前記〔１〕のようにして得たプラスミノーゲン
のクリングル１、クリングル２、及びクリングル３ドメ
インを抗体産生用免疫原として、その５０μｇを０．２
５ｍＬの生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）
に溶解し、これをフロイント完全アジュバントと等量ず
つ混合しエマルジョンとして、８週齢のメスのＢＡＬＢ
／ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹部皮下に
０．５ｍＬ／１匹を免疫注射した。

【００６１】（２） 初回免疫から２週間後に、前記の
抗体産生用免疫原の３０μｇを０．２５ｍＬの生理食塩
水で溶解し、フロイント不完全アジュバントと等量ずつ
混合しエマルジョンとして、その０．５ｍＬにより追加
免疫注射を行った。この追加免疫注射は２週間おきに行
った。

【００６２】（３） 免疫動物であるこのマウスの血清
中の抗体価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ
法）にて、１週間ごとに測定した。このＥＬＩＳＡ法
は、前記〔１〕で得た精製・ヒト・プラスミノーゲンを
マイクロプレートに１ウエル当たり１μｇずつ固相化
し、適当な濃度に希釈した免疫動物の血清をこれに加え
て反応させ、洗浄後更にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標
識抗マウスＩｇＧ抗体を加えて反応を行わせ、そして洗
浄した後、過酸化水素と２，２’−アジノービス（３−
エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〔ＡＢＴ
Ｓ〕を含んだ発色液を加えて発色させ、ＥＩＡプレート
リーダー（バイオラッド社製）にて４５０ｎｍ（又は４
１５ｎｍ）の吸光度を測定して抗体価を求めるという操
作法により行った。

【００６３】（４） 追加免疫を４回行った後に、抗体
価がプラトーに達したと認められたので、この免疫動物
であるマウスの腹部皮下に、生理食塩水で１００μｇ／
ｍＬとした前記〔１〕で得たプラスミノーゲンのクリン
グル１、クリングル２、及びクリングル３ドメイン〔抗
体産生用免疫原〕の０．５ｍＬを注射した。その後３日
目に、この免疫動物のマウスより脾臓を取得した。

【００６４】〔３〕骨髄腫細胞の増殖 ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・
ホスホリボシル・トランスフェラーゼ欠損の骨髄腫細胞
株であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサー
チソースバンク ９０８５）を、胎生ウシ血清を１０％
含有しグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン
を補ったＲＰＭＩ１６４０組織培養培地（キブコ・オリ
エンタル社製）で増殖を行った。これは、この骨髄腫細
胞を細胞培養用中型ボトル（ヌンク社製、２００ｍＬ
容）内で、ボトルの底面の約８割を細胞が占めるまで増
殖させた。なお、細胞数は、トリパン青染料排除法及び
血球計で計数を行った。

【００６５】〔４〕細胞融合 （１） 前記の免疫動物のマウスから取得した脾臓を、
ステンレススチールメッシュ＃２００を使用して充分に
ほぐし、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で洗浄
しながら濾過した。その後、２００ｇで遠心分離を行
い、脾臓細胞を分離した。更に、再度血清を含まないＲ
ＰＭＩ１６４０培地液で３回脾臓細胞を洗浄した。

【００６６】（２） この脾臓細胞と前記の増殖させた
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株骨髄腫細胞を５対１の割
合で混合した後、遠心分離を行った。混合した細胞を、
ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ベ
ーリンガーマンハイム社製）を５０％含むＲＰＭＩ１６
４０培地液にゆっくりと懸濁した。そして、最終的にポ
リエチレングリコール濃度が５％となるように、これを
ＲＰＭＩ１６４０培地液で徐々に希釈した。

【００６７】（３） これより細胞を遠心分離で分離
し、５％のハイブリドーマクローニングファクター（オ
リゲン社製）を含んだＳ−クローン培地（三光純薬社
製）よりなる増殖培地に徐々に分散させた。そして、平
底の９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の
ウエルに、１ウエル当たり１０^６個／１００μＬの細胞
数の細胞を植え、５％の二酸化炭素中３７℃で培養し
た。

【００６８】（４） 細胞融合後１日目に、各ウエルに
１００μＬのＨＡＴ培地（前記の増殖培地に０．０１ｍ
Ｍヒポキサンチン、１．６μＭチミジン及び０．０４μ
Ｍアミノプテリンとなるようにそれそれを補充したも
の、いずれも東京化成社製）を加えた。その後３日間
は、毎日、約半分のＨＡＴ培地を新しいＨＡＴ培地と交
換し、更にその後は、２〜３日毎に同様の交換を行っ
た。

【００６９】（５） 細胞は、顕微鏡で観察を行った。
ハイブリドーマ（融合細胞）のクローンは１０日以後よ
り出現し、１４日以降に、プラスミノーゲンに結合する
抗体の産生を検査するため、ウエルの上澄み液をＥＬＩ
ＳＡ法でスクリーニングした。なお、このＥＬＩＳＡ法
の操作は、前記〔２〕の（３）の操作に準じて行った
が、免疫動物の血清に変えてウエルの上澄み液を用い、
また、精製・ヒト・プラスミノーゲンを固相化したマイ
クロプレート、精製・ヒト・リポタンパク質（ａ）を固
相化したマイクロプレート、及び精製・ヒト・アポリポ
タンパク質（ａ）を固相化したマイクロプレートの各々
で測定を行った。

【００７０】（６） 前記（５）のスクリーニングにお
いて、プラスミノーゲンに結合し、かつリポタンパク質
（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結合しない抗
体を産生していることが判明したウエルのハイブリドー
マを、２４穴のウエルがあるプレートに拡げて培養し、
細胞密度が高くなるに従い、小型ボトル、中型ボトルと
スケールを大きくして培養した。

【００７１】（７） そして、ハイブリドーマはＨＴ培
地（アミノプテリン及びハイブリドーマクローニングフ
ァクターを含まないＨＡＴ培地）で培養、保持した。

【００７２】（８） プラスミノーゲンに結合し、かつ
リポタンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）と
は結合しない抗体の産生をＥＬＩＳＡ法により前記
（５）と同様にして調べたところ、プラスミノーゲンに
結合し、かつリポタンパク質（ａ）及びアポリポタンパ
ク質（ａ）とは結合しない抗体を産生する４個のハイブ
リドーマを確認した。

【００７３】〔５〕ハイブリドーマサブクローニング （１） 前記の４個のハイブリドーマを、限界希釈法に
てサブクローニングした。これらのハイブリドーマの細
胞数を、トリパン青染料排除法及び血球計により計数を
行った。そして、これらのハイブリドーマを、１００μ
ＬのＨＴ培地当たり、０．５個の生育細胞数の割合と１
個の生育細胞数の割合の２種類の割合で懸濁し、９６穴
の平底マイクロプレートの１ウエル当たり１００μＬず
つ分注した。これを、２〜３日毎に培地を交換して、ハ
イブリドーマを増殖させた。

【００７４】（２） ２週間後、顕微鏡下で各ウエルの
コロニー数を調べ、そして、プラスミノーゲンに結合
し、かつリポタンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質
（ａ）とは結合しない抗体を産生するウエルを前記と同
様にしてＥＬＩＳＡ法で調べた。１ウエル中に１コロニ
ーが存在し、そしてこのような抗体を産生するウエルを
それぞれのハイブリドーマについて６個ずつ得た。

【００７５】（３） これを、２４穴のプレートに移
し、細胞生育が良好となるまで２週間培養を行った。

【００７６】（４） その後、これらのハイブリドーマ
を、再度前記（１）及び（２）と同様にしてクローニン
グを行い、それぞれのウエルについて抗体の産生を調べ
たところ、１ウエル中に１コロニーのハイブリドーマが
存在した。そして、プラスミノーゲンに結合し、かつリ
ポタンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは
結合しない抗体を産生するものを全部で４クローン得
た。

【００７７】（５） これらのハイブリドーマ細胞株
を、プラスミノーゲンに結合し、かつリポタンパク質
（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結合しない抗
プラスミノーゲン・モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞株「５９Ｃ１１株」、「６０Ｅ３株」、
「５９Ａ１１株」、及び「５９Ｇ４株」とした。

【００７８】これらのハイブリドーマ細胞株「５９Ｃ１
１株」、「６０Ｅ３株」、「５９Ａ１１株」、及び「５
９Ｇ４株」は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所にそれぞれ「ＦＥＲＭ Ｐ−１７３３６」、「Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１７３３９」、「ＦＥＲＭ Ｐ−１７３３
８」、及び「ＦＥＲＭ Ｐ−１７３３７」として平成１
１年３月２６日付けにて寄託されている。

【００７９】〔６〕モノクローナル抗体の産生 （１） 得られた、プラスミノーゲンに結合し、かつリ
ポタンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは
結合しない抗プラスミノーゲン・モノクローナル抗体産
生細胞株を、中型ボトル（ヌンク社製）の中で、底面の
約８割を細胞が占めるまでＨＴ培地中で培養を行った。

【００８０】（２） その後、これらのハイブリドーマ
を掻き取り、そして２００ｇ、５分間の遠心分離を行い
集めた。次に、これを血清を含まないＲＰＭＩ１６４０
培地液で３回洗浄した後、２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培
地液に懸濁した。

【００８１】（３） 前もって２，６，１０，１４−テ
トラメチルペンタデカンで処置しておいたオスのＢＡＬ
Ｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹腔に、前
記（２）で得たハイブリドーマ懸濁液１ｍＬを注射し
た。注射から２週間以内に腹部の膨張が認められなかっ
た場合には、再度これを繰り返し行った。

【００８２】（４） このマウスの腹部の膨張が認めら
れたときに腹水を採取した。これを２００ｇ、５分間の
遠心分離にかけ、プラスミノーゲンに結合し、かつリポ
タンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結
合しない抗プラスミノーゲン・モノクローナル抗体を含
む上澄み液をハイブリドーマから分離して取得した。

【００８３】〔７〕モノクローナル抗体の精製 （１） プラスミノーゲンに結合し、かつリポタンパク
質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結合しない
抗プラスミノーゲン・モノクローナル抗体を含む上澄み
液の１０ｍＬに、２２℃で硫酸ナトリウム１．８ｇを撹
拌しながら加え、硫酸ナトリウムが完全に溶けてから更
に１時間撹拌を続けて塩析を行った。

【００８４】（２） これを２２℃で遠心分離（７，０
００ｇ、１５分間）を行い、上澄み液と分離して得た沈
殿を、３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２ｍＬに溶解した。

【００８５】（３） 次に、これを前記の塩化ナトリウ
ムを含むリン酸ナトリウム緩衝液に対して充分に透析し
た後、１，０００ｇで２０分間遠心分離し不溶性のもの
を除去した。

【００８６】（４） これを前記の塩化ナトリウムを含
むリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化しておいたＤＥＡＥ
−セルロースイオン交換カラム（セルバ社製）〔１×１
０ｃｍ〕に流速０．４ｍＬ／分で通して、溶出液を２ｍ
Ｌずつ集めた。

【００８７】（５） 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が溶
出液の素通り画分に含まれていることを、２８０ｎｍの
吸光度より確認し、これを集めて２ｍＬに濃縮した。

【００８８】（６） 更に、これをプロテインＡ−セフ
ァロースＣＬ−４Ｂアフィニティークロマトグラフィー
カラム（ファルマシア−エルケービー社製）にかけて精
製を行い、プラスミノーゲンに結合し、かつリポタンパ
ク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結合しな
い抗プラスミノーゲン・モノクローナル抗体を得た。な
お、この得られたモノクローナル抗体の量は、それそれ
タンパク質量で５〜１０ｍｇであった。

【００８９】また、ここで得た抗プラスミノーゲン・モ
ノクローナル抗体の抗体クラスとサブタイプは、市販の
特異抗マウス免疫グロブリン抗血清（ダコ社製）を用い
たオクタロニイ免疫拡散法により、いずれもＩｇＧ_１、
λ鎖と決定した。

【００９０】本実施例で得た、４種類の抗プラスミノー
ゲン・モノクローナル抗体を以下にまとめた。 「５９Ｃ１１株」〔ＦＥＲＭ Ｐ−１７３３６〕由
来の抗プラスミノーゲン・モノクローナル抗体。 「６０Ｅ３株」〔ＦＥＲＭ Ｐ−１７３３９〕由来
の抗プラスミノーケン・モノクローナル抗体。 「５９Ａ１１株」〔ＦＥＲＭ Ｐ−１７３３８〕由
来の抗プラスミノーゲン・モノクローナル抗体。 「５９Ｇ４株」〔ＦＥＲＭ Ｐ−１７３３７〕由来
の抗プラスミノーゲン・モノクローナル抗体。

【００９１】〔実施例２〕 実施例１で得た抗プラスミ
ノーゲン・モノクローナル抗体のプラスミノーゲン、リ
ポタンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）への
反応性の確認 実施例１で得られた、４種類の抗プラスミノーゲン・モ
ノクローナル抗体のプラスミノーゲン、リポタンパク質
（ａ）及びアボリポタンパク質（ａ）への反応性をウエ
スタンブロット法により確かめた。

【００９２】（１） リポタンパク質（ａ）濃度が高い
ヒト血清を、超遠心分離を行い比重が１．０５以上かつ
１．１２以下の部分を分取し、更にリジンーセファロー
ス４Ｂアフィニティークロマトグラフィー（ファルマシ
ア−エルケービー社製）にかけて精製・ヒト・リポタン
パク質（ａ）を得た。

【００９３】更に、この精製・ヒト・リポタンパク質
（ａ）に、最終濃度が１ｍＭとなるようにジチオスレイ
トールを添加した後、再度超遠心分離を行い、比重が
１．２１以上の部分を分取することにより、低密度リポ
タンパク質（ＬＤＬ）部分を除去し、精製・ヒト・アポ
リポタンパク質（ａ）を得た。

【００９４】（２） このリポタンパク質（ａ）及びア
ポリポタンパク質（ａ）並びに実施例１の〔１〕で得た
精製・ヒト・プラスミノーゲンを、０．５ｍｇ／ｍＬに
なるようにそれぞれ別々に生理食塩水に溶解し、これら
の２μＬを試料として、それぞれタイタン・ジェル・リ
ポタンパク質電気泳動キット（ヘレナ研究所社製）を用
いて電気泳動を行った。なお、支持体はアガロースケル
であり、泳動緩衝液はバルビタール緩衝液（ｐＨ８．
８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して行っ
た。

【００９５】（３） 転写はノバ・ブロット・エレクト
ロフォレティック・トランスファー・キット（ファルマ
シア−エルケービー社製）を用いて、その使用説明書に
従い、ドライ方式で行った。

【００９６】（４） 転写用装置上に置いた（２）のア
ガロースゲルの上に、９ｃｍ×９ｃｍのニトロセルロー
ス膜（バイオラッド社製）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン、３９ｍＭグリシン、
０．０３７５％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）、及び２０％（Ｖ／Ｖ）メタノールよりなる転写
用緩衝液を用いて、電流６５ｍＡで２時間転写を行っ
た。

【００９７】（５） 転写を行ったニトロセルロース膜
を、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９
ｍＭリン酸水素ニナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水
素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ
塩化カリウム（ｐＨ７．２））２０ｍＬに４℃で１晩浸
漬して、ブロッキングを行った。

【００９８】（６） 次にこれを洗浄液〔０．０５％ツ
イーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食
塩水〕２０ｍＬ中で１０分間振とう洗浄を行った。この
操作を３回行った。

【００９９】（７） 実施例１で得られた４種類の抗プ
ラスミノーゲン・モノクローナル抗体（「５９Ｃ１１
株」由来、「６０Ｅ３株」由来、「５９Ａ１１株」由
来、及び「５９Ｇ４株」由来）を、それそれ２０ｍＬの
リン酸緩衝生理食塩水に８０μｇ溶解して４種類の溶液
を調製した。次に、これらの溶液に（６）の操作を行っ
たニトロセルロース膜をそれぞれ室温で２時間浸漬して
反応させた。

【０１００】（８） 前記（６）で得られたニトロセル
ロース膜に、実施例１で得られた４種類の抗プラスミノ
ーゲン・モノクローナル抗体のいずれも作用させないも
のを陰性対照として用意した。

【０１０１】（９） 前記（７）又は（８）の操作を行
ったニトロセルロース膜を洗浄液２０ｍＬで１０分間振
とう洗浄を行った。これを３回行った。

【０１０２】（１０） 次に、パーオキシダーゼ標識抗
マウスＩｇＧ抗体（ダコ社製）を、３％ＢＳＡを含むリ
ン酸緩衝生理食塩水で５００倍希釈して２０ｍＬの溶液
を調製し、これにそれそれのニトロセルロース膜を室温
で２時間浸漬して反応させた。

【０１０３】（１１） これらのニトロセルロース膜を
洗浄液２０ｍＬで１０分間振とう洗浄した。これを３回
行った。

【０１０４】（１２） ０．０２５％３，３’−ジアミ
ノベンジジン四塩酸塩及び０．０１％過酸化水素を含む
リン酸緩衝生理食塩水２０ｍＬに室温で１５分間前記
（１１）のニトロセルロース膜を浸漬して発色させた。

【０１０５】このウエスタンブロット法の結果を図１、
図２、図３及び図４に示した。図１は「５９Ｃ１１株」
由来の抗体を作用させたもの、図２は「６０Ｅ３株」由
来の抗体を作用させたもの、図３は「５９Ａ１１株」由
来の抗体を作用させたもの、そして図４は「５９Ｇ４
株」由来の抗体を作用させたものである。

【０１０６】なお、それぞれの図において、Ｐは精製・
ヒト・プラスミノーゲンを泳動させたレーン、Ｌはリポ
タンパク質（ａ）を泳動させたレーン、Ａはアポリポタ
ンパク質（ａ）を泳動させたレーン、そしてＮは陰性対
照を示す。

【０１０７】図１、図２、図３、及び図４それぞれにお
いて、前記４種類の実施例１で得た抗プラスミノーゲン
・モノクローナル抗体は、いずれも、精製・ヒト・プラ
スミノーゲンを泳動させたレーンにおいて発色を示すこ
とから、プラスミノーゲンと結合することが確かめられ
た。

【０１０８】また、リポタンパク質（ａ）を泳動させた
レーン、及びアポリポタンパク質（ａ）を泳動させたレ
ーンにおいて発色を認めないことから、前記４種類の実
施例１で得た抗プラスミノーゲン・モノクローナル抗体
は、いずれも、リポタンパク質（ａ）及びアポリポタン
パク質（ａ）とは結合しないことが確認できた。

【０１０９】そして、前記４種類の実施例１で得られた
抗プラスミノーゲン・モノクローナル抗体のいずれも作
用させていない陰性対照に発色が見られないことから、
非特異的な発色が起きていないことが示された。

【０１１０】〔実施例３〕 サンドイッチ・ＥＬＩＳＡ
法による、試料中のプラスミノーゲン測定方法（測定試
薬）の構築と検量線の作成実施例１で得た抗プラスミノ
ーゲン・モノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ法（サ
ンドイッチ法）による、試料中のプラスミノーゲンの測
定方法（測定試薬）を構築した。また、検量線を作成し
た。

【０１１１】（１） 前記実施例１で得た、プラスミノ
ーゲンに結合し、かつリポタンパク質（ａ）及びアポリ
ポタンパク質（ａ）とは結合しない抗プラスミノーゲン
・モノクローナル抗体（５９Ｃ１１株由来）を、リン酸
緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素ニナトリウ
ム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩
化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．
２））により１５μｇ／ｍＬとした後、９６ウエルーマ
イクロプレート（ヌンク社製）に１ウエル当たり１００
μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、前記の抗体の
固相化を行った（固相化抗体）。

【０１１２】（２） このマイクロプレートを洗浄液
〔０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸
緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）〕で洗浄した後、ブロッ
キング液〔１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリ
ウムーリン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）〕を
１ウエル当たり３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間
静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄
した。

【０１１３】（３） 市販の精製・ヒト・プラスミノー
ゲン（バイオプール社製）を、１００ｍｇ／ｄＬとなる
ように生理食塩水に溶解した。これを更に生理食塩水で
希釈して、プラスミノーゲン濃度が、１０ｍｇ／ｄＬ、
２０ｍｇ／ｄＬ、及び５０ｍｇ／ｄＬの３種類の試料を
調製した。なお、生理食塩水を、プラスミノーゲン濃度
０ｍｇ／ｄＬの試料とした。

【０１１４】（４） 前記（３）で調製した４種類の試
料を前記のブロッキング液で５，０００倍希釈した後、
前記（２）で調製したマイクロプレートに１ウエル当た
り１００μＬずつ分注し、室温で１時間静置して抗原抗
体反応を行わせた。その後、これを前記の洗浄液で３回
洗浄した。

【０１１５】（５） 市販のヤギ抗プラスミノーゲン・
ポリクローナル抗体（医学生物学研究所社製）の５ｍｇ
を、０．５ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）に溶解した。これに０．６ｍｇのＳ−アセチルメル
カプトコハク酸無水物を溶解した０．０１ｍＬのＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミドを加え、室温で３０分間インキ
ュベートした。

【０１１６】次にこれに、０．１ＭＥＤＴＡの０．０２
ｍＬ、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩
衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍヒドロキシ
ルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬを加
え、３０℃で３０分間インキュベートした。これを、５
ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたセファデックスＧ−
２５カラムでゲルろ過を行い、メルカプト・サクシニル
化抗体を得た。

【０１１７】（６） ２ｍｇのパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）を０．３ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶解した。これに、０．２５ｍｇのＮ
−サクシミジル−６−マレイミドヘキサン酸を溶解した
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドの３０μＬを加えて、３
０℃で６０分間インキュベートした。これを、０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化してお
いたセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、
マレイミド化パーオキシダーゼを得た。

【０１１８】（７） 前記（５）で調製したメルカプト
・サクシニル化抗体の２．３ｍｇを、５ｍＭＥＤＴＡを
含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の
０．２５ｍＬに溶解した。これに、前記（６）で調製し
たマレイミド化パーオキシダーゼの１．８ｍｇを０．２
５ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．
０）に溶解したものを添加した。

【０１１９】これを３０℃で２０時間インキュベートし
た後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）
で平衡化しておいたウルトラゲルＡｃＡ３４カラムでゲ
ルろ過を行い、ヤギ抗プラスミノーゲン・ポリクローナ
ル抗体をパーオキシダーゼで標識したＰＯＤ標識抗プラ
スミノーゲン・ポリクローナル抗体を得た。

【０１２０】（８） 前記（７）で得たＰＯＤ標識抗プ
ラスミノーゲン・ポリクローナル抗体をブロッキング液
で５，０００倍に希釈した。これを１ウエル当たり１０
０μＬずつ前記（４）のマイクロプレートの各ウエルに
分注し、室温で１時間静置して反応を行わせた。その
後、これを洗浄液で３回洗浄した。

【０１２１】（９） その後、パーオキシダーゼ反応液
〔３ｍＭ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
（ＴＭＢＺ；メルク社製）を含む５０ｍＭリン酸水素ニ
ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して
２μＬの１．７％過酸化水素を使用直前に添加したも
の〕を１ウエル当たり１００μＬずつ加え、室温で反応
させた。

【０１２２】３０分後に１ウエル当たり１００μＬの４
Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。このマイクロプレー
トを撹拌し、ウェル内の溶液を均一にした後、ＥＩＡマ
イクロプレートリーダー（バイオラッド社製）にて、４
１５ｎｍにおける吸光度の測定を行った。

【０１２３】この結果を図５に示した。

【０１２４】なお、このサンドイッチ・ＥＬＩＳＡ法に
よる試料中のプラスミノーゲンの測定方法（測定試薬）
での検量線を示す図において、縦軸は試料中のプラスミ
ノーゲンの濃度、横軸は４１５ｎｍにおける吸光度の測
定値を表す。但し、吸光度の測定値は、プラスミノーゲ
ン濃度が０ｍｇ／ｄＬの試料の吸光度を盲検値として差
し引いたものを表した。

【０１２５】この図より、本発明によると、試料中のプ
ラスミノーゲンの正確な定量測定が行えることが確認で
きた。

【０１２６】

【発明の効果】本発明の、抗プラスミノーゲン・モノク
ローナル抗体は、リポタンパク質（ａ）、又はアポリポ
タンパク質（ａ）と交叉反応を起こしてしまうという問
題を解決したものである。

【０１２７】そして、本発明の、試料中のプラスミノー
ゲンの測定方法及び測定試薬は、試料中に存在するリポ
タンパク質（ａ）、又はアポリポタンパク質（ａ）を測
り込んでしまうことにより発生する正の誤差が生じず、
真のプラスミノーゲン濃度を正確かつ簡便に得ることが
できる、という効果を有するものである。

【０１２８】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得た抗プラスミノーゲン・モノクロ
ーナル抗体（５９Ｃ１１株由来）のプラスミノーゲン、
リポタンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）へ
の反応性を確かめたウエスタンブロットの図（写真）で
ある。

【図２】実施例１で得た抗プラスミノーゲン・モノクロ
ーナル抗体（６０Ｅ３株由来）のプラスミノーゲン、リ
ポタンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）への
反応性を確かめたウエスタンブロットの図（写真）であ
る。

【図３】実施例１で得た抗プラスミノーゲン・モノクロ
ーナル抗体（５９Ａ１１株由来）のプラスミノーゲン、
リポタンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）へ
の反応性を確かめたウエスタンブロットの図（写真）で
ある。

【図４】実施例１で得た抗プラスミノーゲン・モノクロ
ーナル抗体（５９Ｇ４株由来）のプラスミノーゲン、リ
ポタンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）への
反応性を確かめたウエスタンブロットの図（写真）であ
る。

【図５】本発明の試料中のプラスミノーゲンの測定方法
（測定試薬）における検量線を示した図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】プラスミノーゲンに結合し、かつリポタン
   パク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結合し
   ない、抗プラスミノーゲン・モノクローナル抗体。
2. 【請求項２】試料中のプラスミノーゲンの測定方法にお
   いて、プラスミノーゲンに結合し、かつリポタンパク質
   （ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結合しないモ
   ノクローナル抗体を使用する、プラスミノーゲンの測定
   方法。
3. 【請求項３】試料中のプラスミノーゲンの測定試薬にお
   いて、プラスミノーゲンに結合し、かつリポタンパク質
   （ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）とは結合しないモ
   ノクローナル抗体を使用する、プラスミノーゲンの測定
   試薬。