JP2000292427A - 抗原もしくは抗体の測定法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】複数の抗原もしくは抗体を同時もしくは同一装
置内で測定する方法及び測定試薬を提供する。 【解決手段】試料注入口に便を溶解した液約３００μｌ
を添加する。添加した試料中に検出する抗原が存在する
と色素結合ラテックス標識抗体と反応し、更に、その複
合体は次の反応部位で固定化されている抗体により捕獲
されて標識物のシグナルを与える。 【効果】複数の抗原もしくは抗体を同時に測定すること
が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は臨床検査診断に用い
られる方法および試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】疾病の起因となっている病原体の検出
は、培養法、免疫化学法および遺伝子検査法等が一般的
に知られている。病原体を特定することは、治療方針を
立てるために必須であるにもかかわらず、病原体が多種
多様であるがために簡便に検査することは困難であっ
た。

【０００３】例えば、小児下痢症の病原体は、細菌やウ
イルスにわたって５種以上の病原体が知られている。従
って、これら病原体を同定するには、５種以上の各病原
体に対する検査を個々に実施しなければならないため、
検査時間が長くなり、検査結果が診療に行かされにくい
という問題があった。

【０００４】よって、迅速且つ簡便に病原体を検出もし
くは同定する方法が望まれていた。

【０００５】本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、２種
以上の病原体を同時もしくは同一装置内で、免疫化学的
手法を用いて、検出又は同定する方法および試薬を発明
するに至った。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】２種以上の病原体を同
時もしくは同一装置内で免疫化学的に検出する方法およ
び試薬により、病原体を迅速且つ簡便に検出もしくは同
定して、診断治療に有用な検査方法を提供する。

【０００７】

【解決する手段】本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、
公知の免疫化学手法を用いて、２種以上の病原体を同時
もしくは同一装置内で検出もしくは同定する方法を見出
し、本発明を完成させるに至った。

【０００８】本発明の実施態様の例を挙げて本発明を詳
細に説明する。公知の免疫化学手法として酵素免疫化学
測定法や化学発光化学測定法等の標識物を用いる免疫化
学測定法がある。酵素免疫化学測定法を例に取れば、従
来の方法では、マイクロタイタープレート固相の各ウエ
ルに同一組成の抗体もしくは抗原を固定化して、検体と
反応させ抗原抗体反応により固相に分析対象物を捕獲す
る。次いで、標識抗体もしくは抗原を反応させた後、分
析対象物の量に対応する信号を発生させ、その信号を検
出することにより分析対象物の存否や濃度等を求める。

【０００９】本発明の方法では、上記のマイクロタイタ
ープレートを用いる場合、全ウエルに同一組成の抗体も
しくは抗原を固相化するのではなく、目的とする病原体
の数に応じた抗体もしくは抗原の２種以上をそれぞれの
ウエルに固相化する。例えば５種類の抗原もしくは抗体
を固相化する場合には、ウエルＮｏ．１から５にそれぞ
れ抗原もしくは抗体Ｎｏ．１から５を対応させて固相化
させる。このウエルＮｏ．１から５を１セットにして使
用する。

【００１０】同一検体を上記ウエルＮｏ．１から５に反
応させた後、それぞれの標識抗原もしくは抗体を反応さ
せ、各ウエルの信号を測定して病原体の検出もしくは同
定を行う。以上のように、各々の抗原もしくは抗体に対
する標識抗原もしくは抗体を用いても良いが、分析対象
物の組合わせによっては分析対象物の共通抗原もしくは
共通抗原を認識する抗体を用いることもできる。本発明
により、同時又は同一装置で複数の病原体を検出または
測定することが可能になる。

【００１１】上記の例では各ウエルに各抗原もしくは抗
体を固相化させたセットを調製したが、本発明は更に、
一つのウエルに複数の抗原もしくは抗体を固相化させて
おくことも含まれる。例えば２種類の抗原もしくは抗体
を一つのウエルに固相化させ、検体を反応させた後、各
標識抗原もしくは抗体を反応させ、信号を計測する。こ
の場合、標識物質をそれぞれ異なった標識物質を用いる
ことにより、それぞれの信号を識別できる。このような
標識物質の組み合わせとして、異なった酵素の組み合わ
せ、例えばペルオキシダーゼとアルカリホスファターゼ
およびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの組み合わせ、異なっ
た発光物質の組み合わせ、例えばアクリヂニウムエステ
ルとエクオリンの組み合わせ、更に、酵素、発光物質お
よび蛍光物質の組み合わせも利用でき、異なった信号を
生じる組み合わせであれば特に限定されない。

【００１２】上述の例は、マイクロタイタープレートを
用いた例であるが、本発明は更に、固相の形態を特に限
定するものではない。抗原もしくは抗体を固定化できる
ものであれば利用できる。例えば、ガラスフィルター、
濾紙およびメンブランフィルター等も用いる事ができ
る。このような多孔性の固相を用いる場合には、検体や
標識抗原もしくは抗体を膜表面に対して垂直方向および
平行方向の何れの方向にに移動させる方法も適用でき
る。すなわち、膜表面に垂直な方向に移動させる方法の
例として、複数個の反応部位を持つ一連のデバイスの各
反応部位にそれぞれ検体を反応させ、標識抗原もしくは
抗体を反応させた後信号を検出する方法がある。

【００１３】一方、平行に移動させる例として、複数個
の反応装置を一連に組み込んだ装置や一つの反応装置内
に複数個の反応部位を直線状にならべた装置が可能であ
る。これらの装置は一般にイムノクロマト法といわれる
ものを応用できる。ここで用いられる標識物は、前述の
酵素、発光および蛍光物質の他、金属コロイド粒子、着
色ラテックス粒子や蛍光粒子等の粒子状物質に抗原もし
くは抗体を標識することもできる。

【００１４】本発明の方法において、検出又は測定され
る抗原もしくは抗体は免疫学的に反応する物質であれば
特に限定されないが、例えば、小児下痢症診断のための
病原体、ロタウイルス、カルシウイルス、コロナウイル
ス、アデノウイルスおよびエンテロウイルスを検出、同
定するためのセットが有用である。また上気道感染症の
診断にはインフルエンザウイルス、パラインフルエンザ
ウイルス、ＲＳウイルスやマイコプラズマニューモニエ
等の細菌の検出、同定のセットが有用である。さらに、
インフルエンザウイルスの型別診断（ホンコンＡ、Ｂ
他）のセットや肝炎ウイルスの型別診断（Ａ，Ｂおよび
Ｃ等）セット、ＨＩＶ，Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝
炎ウイルスの抗原又は抗体の検査セット等も可能であ
る。

【００１５】本発明はウイルスだけではなく細菌および
その代謝産物の検出同定にも適用される。血液中に細菌
が感染して引き起こされる敗血症は重篤な病態をしめ
し、その起炎菌を迅速に検出同定することは、診断治療
に有用である。そのために、スタフィロコッカスアウレ
ウス、ストレプトコッカス ニューモニエおよびストレ
プトコッカス ピヨゲネス等のセットが可能である。

【００１６】その他、病原性大腸菌の型別診断のセット
等、同時に複数種の病原体の検出、同定には取り分け本
発明は有用である。

【００１７】上述のごとく複数種の病原体の検出同定の
みならず、例えば癌胎児性抗原類のセットによる癌の診
断や甲状腺ホルモン関連項目セットによる内分泌検査等
も本発明により可能である。

【００１８】

【実施例】本発明を更に説明するため実施例を挙げて説
明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるもので
はない。

【００１９】

【実施例１】市販のマイクタイタープレート（８ウエル
×１２）に抗ロタウイルス抗体、抗カルシウイルス抗
体、抗コロナウイルス抗体、抗アデノウイルス抗体およ
び抗エンテロウイルス抗体をそれぞれ２０μｇ／ｍｌと
なるように２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝
７．２）で調製した。Ａウエルには抗ロタウイルス抗
体、Ｂウエルには抗カルシウイルス抗体、Ｃウエルには
抗コロナウイルス抗体、Ｄウエルには抗アデノウイルス
抗体およびＥウエルには抗エンテロウイルス抗体をそれ
ぞれ１００μｌずつを分注した。分注後２〜８℃で一夜
放置後、各抗体液を除去し、０．１％ＢＳＡを含む２０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．２）で洗浄
後、同緩衝液３００μｌずつを分注し、２〜８℃で一夜
放置した。調製した抗体固定プレートを用いて測定を行
った。

【００２０】

【実施例２】実施例１で調製した抗体固定プレートの緩
衝液を除いた後、あらかじめ１％ＢＳＡおよび０．１５
Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ＝７．２）１０ｍｌに小児下痢症の患者の糞便１
ｇを溶解した試料１００μｌずつをＡウエルからＥウエ
ルに分注し、室温で４５分間反応させた。反応終了後、
反応液を吸引除去し、洗浄液で洗浄後、Ａウエルにはペ
ルオキシダーゼ標識抗ロタウイルス抗体、Ｂウエルには
ペルオキシダーゼ標識抗カルシウイルス抗体、Ｃウエル
にはペルオキシダーゼ標識抗コロナウイルス抗体、Ｄウ
エルにはペルオキシダーゼ標識抗アデノウイルス抗体お
よびＥウエルにはペルオキシダーゼ標識抗エンテロウイ
ルス抗体をそれぞれ１００μｌずつを分注した。室温で
４５分反応後、反応液を吸引除去し、洗浄液で洗浄後、
オルソフェニレンジアミン−過酸化水素基質液１００μ
ｌずつを分注し、室温で４５分反応後、２Ｎ−硫酸を１
００μｌずつを分注して反応を終了させ、各ウエルの４
９２ｎｍでの吸光度を測定した。その結果を表１に示
す。

【００２１】

【表１】

【００２２】以上の結果Ａウエルの吸光度がブランクの
吸光度より有意に高く、本下痢症の糞便中にはＡウエル
と反応する病原体、ロタウイルスが存在することがわか
った。このように本発明では短時間に同時に複数種の検
出同定が可能であった。

【００２３】

【実施例３】免疫反応用チューブに抗Ｂ型肝炎ウイルス
表面抗原抗体（抗ＨＢｓ抗体）および抗Ｂ型肝炎ウイル
スｅ抗原抗体（抗ＨＢｅ抗体）を１０μｇ／ｍｌで３０
０μｌずつ分注して一夜２〜８℃で放置した。抗体液を
除去し、０．１％ＢＳＡを含む２０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ＝７．２）で洗浄後、同緩衝液５００μ
ｌずつを分注し、２〜８℃で一夜放置した。調製した抗
体固定チューブを用いて測定を行った。

【００２４】

【実施例４】実施例３で調製した抗体固定チューブの緩
衝液を除いた後、１％ＢＳＡおよび０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．
２）３００μｌに患者の血清２０μｌを分注し、室温で
攪拌しながら９分間反応させた。反応終了後、反応液を
吸引除去し、洗浄液で洗浄後、あらかじめ調製しておい
たアクリジニウムエステル標識抗ＨＢｓ抗体とエクオリ
ン標識抗ＨＢｅ抗体の混合組成液３００μｌを分注し
た。室温で９分反応後、反応液を吸引除去し、洗浄液で
洗浄後、先ずエクオリンの発光開始剤である０．１Ｍ塩
化カルシウム液を３００μｌ分注し、発光検出器で発光
強度を測定した。次いで反応液を除去し、アクリジニウ
ムエステルの発光開始剤である０．１Ｎ水酸化ナトリウ
ム液３００μｌを分注して、発光検出器で発光強度を測
定した。その結果を表２に示す。

【００２５】

【表２】

【００２６】以上の結果、血清ＡはＨＢｓ抗原とＨＢｅ
抗原の両方が陽性で、血清Ｂは共に陰性、血清ＣはＨＢ
ｓ抗原のみが陽性であることが判った。

【００２７】

【実施例５】小児下痢症診断のための装置として図１に
示したデバイスを調製した。試料注入孔に便を溶解した
液を約３００μｌを添加する。添加した試料中に検出す
る抗原が存在すると色素結合ラテックス標識抗体と反応
して更に、その複合体は次の反応部位で固定化されてい
る抗体により捕獲され標識物がシグナルを与える。実施
例２で測定した試料を本装置で測定すると、ロタウイル
スの箇所で陽性の反応がみられた。

【００２８】

【実施例６】小児下痢症診断のための装置として図２に
示したデバイスを調製した。試料注入孔に便を溶解した
液を約３００μｌを添加する。添加した試料中に検出す
る抗原が存在すると色素結合ラテックス標識抗体と反応
して更に、その複合体は次の反応部位で固定化されてい
る抗体により捕獲され標識物がシグナルを与える。実施
例２で測定した試料を本装置で測定すると、ロタウイル
スの箇所で陽性の反応がみられた。

【００２９】

【発明の効果】従来は分析対象物の種類の数に応じた分
析回数が必要であったが、本発明により、複数の抗原も
しくは抗体を同時もしくは同一装置内で測定することが
可能で、分析対象物の種類の数に関係なく一度で分析が
可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】小児下痢症原因ウイルス検出装置である。

【図２】別形態の小児下痢症原因ウイルス検出装置であ
る。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２種以上の抗原もしくは抗体を同時もし
   くは同一装置内において、免疫化学的に検出又は測定す
   る方法。
2. 【請求項２】 抗原もしくは抗体がウイルス、リケッチ
   ア、細菌および真菌である病原体もしくは病原体に対す
   る抗体を検出又は測定する請求項１の方法。
3. 【請求項３】 ２種以上の抗原もしくは抗体を同時もし
   くは同一装置内において、免疫化学的に検出又は測定す
   る試薬。
4. 【請求項４】 抗原もしくは抗体がウイルス、リケッチ
   ア、細菌および真菌である病原体もしくは病原体に対す
   る抗体を検出又は測定する請求項２の試薬。