JP2000292705A

JP2000292705A - 走査型顕微鏡

Info

Publication number: JP2000292705A
Application number: JP11097302A
Authority: JP
Inventors: Hideyuki Takaoka; 高岡秀行
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1999-04-05
Filing date: 1999-04-05
Publication date: 2000-10-20
Also published as: US6496267B1

Abstract

(57)【要約】【課題】蛍光観察と同一の注目領域における形態情報
等を蛍光観察と併せて同時観察でき、かつ、短時間で両
者の観察画像を得ることができる走査型顕微鏡。【解決手段】低コヒーレンス光源１と、光源１からの
光を第１光路と第２光路に分割する手段２と、一方の光
路又は両光路を通過した光に周波数差を生じさせる周波
数変調手段３ａ，３ｂと、第１光路に配置され試料５に
光を照射しまた試料５からの光を集光する対物光学系４
と、光軸に垂直な面内で試料５と対物光学系４による照
射光とを相対的に走査する手段１２と、第１光路と第２
光路を合成する手段８と、合成された光から周波数差の
干渉信号を検出する干渉信号検出系９と、低コヒーレン
ス光により励起された試料５からの蛍光を分岐する手段
１０と、分岐された蛍光を検出する蛍光検出系１１とを
有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、走査型顕微鏡に関
し、特に、形態観察と蛍光観察との同時観察が可能でし
かも短時間で両者の観察画像を得ることができる走査型
顕微鏡に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生体組織等の不透明な散乱体内部が観察
できる手法として、米国特許第５，３２１，５０１号等
に開示されているような低コヒーレンス干渉法と呼ばれ
る手法が知られている。図１１はこの低コヒーレンス干
渉法のための一般的な光学系を示している。コヒーレン
ス長が短い光源８１を用い、この光源８１からの光をビ
ームスプリッター８２により試料５へ導く信号光路と、
反射鏡８３へ導く参照光路とに分割する。それぞれの光
路を往復して戻ってきた光を再びビームスプリッター８
２で合成したとき、参照光路と略等しい光路長を形成す
る信号光路の試料５内の観測位置６にあって、略コヒー
レンス長に等しい光軸方向の範囲に存在する領域から散
乱されて戻ってきた光のみが参照光と干渉する。したが
って、この干渉信号を検出器８４で検出することによ
り、試料５内部の情報を光軸方向において選択的に得る
ことができる。通常、参照光路の反射鏡８３を光軸方向
に移動することにより、試料の深さ方向の走査を行うと
同時に、参照光にドップラーシフトを与える。一般的に
低コヒーレンス干渉法では、干渉信号の中ドップラーシ
フト周波数のビート信号を検波する、いわゆるヘテロダ
イン干渉計測を行うので、非常に高いＳ／Ｎ比での測定
を行うことができる。したがって、光源８１に近赤外光
等を用いれば、散乱体試料５の表面から数ミリメートル
もの深さ位置からの微弱な散乱光も検出することができ
る。さらに、信号光あるいは試料５を光軸に垂直な面内
で走査することにより、光軸に垂直な断面の画像を得る
ことができる。

【０００３】一方、反射鏡を移動させずに、信号光路と
参照光路のそれぞれに音響光学素子を配置し、それぞれ
の変調周波数の差に相当するビート信号を検出する低コ
ヒーレンス干渉法が、^Journal of Modern Optics", vo
l.45, no.4, p.765(1998) に掲載されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ところで、生物試料等
の観察法の一つとして、細胞組織や特定の物質を蛍光色
素標識し、励起光を照射したときの蛍光像を観察する蛍
光観察法があり、試料を薄くスライスして顕微鏡観察す
る場合もあるが、最近では、生物標本等を生きたままの
状態で観察したいというニーズも多くなり、試料表面よ
り深い位置での蛍光像を得たいという要求も高まってき
た。

【０００５】蛍光観察時には、蛍光標識された組織や物
質等の形態情報、及び、その周囲の空間的構造の情報等
を同時に観察できることが望ましいが、通常の顕微鏡観
察において厚い試料の内部の情報を得ることは難しい。
また、そのような形態情報等を観察する際に、例えば生
きたままの生体組織の時間的な生体活動の変化を観察し
ようとする場合等では、観察に要する時間は可能な限り
短いことが望ましい。また、蛍光観察と同時に形態観察
等を行う場合、蛍光標識に励起光が長時間照射され続け
ると、蛍光色素の褪色が起こり時間と共に蛍光像が暗く
なってしまうため、この場合も同様に迅速な観察が求め
られる。

【０００６】前記した特許や文献には、蛍光観察法に関
する記述はなく、蛍光観察時に低コヒーレンス干渉計測
を行うような構成については触れられていない。また、
低コヒーレンス干渉計測法において、参照光路の反射鏡
を移動させながら観測を行う方式では、試料内の光軸に
対して垂直な断面を観察する場合にも反射鏡の移動を行
わなければならないため、一般に光軸に垂直な断面を観
察する蛍光顕微鏡観察と同時に低コヒーレンス干渉計測
を行う場合に、反射鏡の機械的駆動を必要とする分、計
測時間が長くなってしまうという欠点があった。

【０００７】本発明は従来技術のこのような問題点に鑑
みてなされたものであり、その目的は、厚い試料の内部
や不透明な散乱体の内部を蛍光観察する際に、蛍光観察
と同一の注目領域における形態情報等を蛍光観察と併せ
て同時観察でき、しかも、短時間で両者の観察画像を得
ることができる走査型顕微鏡を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
め、本発明の走査型顕微鏡は、低コヒーレンス光源と、
前記低コヒーレンス光源からの低コヒーレンス光を第１
の光路と第２の光路に分割する手段と、前記第１の光路
又は前記第２の光路あるいはその両光路に配置され、そ
れぞれの光路の光路長を変化させることなく、前記第１
の光路と前記第２の光路を通過したそれぞれの光に周波
数差を生じさせるための周波数変調手段と、前記第１の
光路に配置され、試料に光を照射し、また前記試料から
の光を集光するための対物光学系と、前記第１の光路に
配置され、前記対物光学系の光軸に垂直な面内で、前記
試料と前記対物光学系による照射光とを相対的に走査す
る走査手段と、前記第１の光路と前記第２の光路を合成
する手段と、合成された光から前記周波数差の干渉信号
を検出するための干渉信号検出系と、前記低コヒーレン
ス光により励起された試料からの蛍光を分岐する蛍光分
岐手段と、前記蛍光分岐手段により分岐された蛍光を検
出するための蛍光検出系と、を有することを特徴とす
る。

【０００９】図１に本発明による走査型顕微鏡の構成を
示し、本発明の上記走査型顕微鏡の構成と作用を説明す
る。

【００１０】低コヒーレンス光源１から出た低コヒーレ
ンス光は、第１の光路と第２の光路に光路分割手段２に
より分割される。図１においては、光路分割手段２によ
り反射する光路を第１の光路、透過する光路を第２の光
路とする。それぞれの光路には各光路の光路長を変化さ
せることなく、第１の光路と第２の光路とを通る光の間
に周波数差ｆが生じるように設定された周波数変調手段
３ａ、３ｂがそれぞれ配置される。周波数変調手段は第
１の光路又は第２の光路のどちらか一方にのみ配置して
もよい。第１の光路を通過する光は、対物光学系４によ
り試料５に照射される。試料５により反射、散乱された
光は再び対物光学系４を通過し、第１の光路と第２の光
路を合成する手段７及び８により、第２の光路を通過し
た光と合成され、干渉信号検出系９に導かれる。干渉信
号検出系９では、検出された信号の中、周波数ｆのビー
ト信号を抽出し、その振幅を散乱光強度情報とする。こ
こで、試料５内部から散乱されてくる光の中、第２の光
路の光と干渉するのは、第２の光路の光路長と略等しい
光路長を第１の光路の光路長とするような試料５内の観
測位置６付近からの光であり、その光軸方向の範囲は、
低コヒーレンス光源１のコヒーレント長程度である。し
たがって、コヒーレント長程度のｚ分解能で試料５内の
散乱光強度情報を得ることができる。

【００１１】一方、低コヒーレンス光源１の光によって
励起される蛍光標識を試料５に導入しておくことによ
り、試料５内の特定の組織・物質等を蛍光観察すること
ができる。着目する組織が低コヒーレンス光源１の光の
波長に対して自家蛍光を発するような場合には、蛍光標
識を導入する必要はない。試料５から発せられた蛍光は
蛍光分岐手段１０により低コヒーレンス光と分離され、
蛍光検出系１１に導かれる。

【００１２】したがって、試料５内の同一領域６を低コ
ヒーレンス干渉観察法と蛍光観察法の両手法により同時
に観察することができる。また、対物光学系４の光軸に
垂直な面（図１のｘ−ｙ断面）内で対物光学系４による
照射光を走査手段１２で走査することにより、試料５内
の光軸に垂直な断面の画像を得ることができる。照射光
を走査する代わりに、試料５を走査することもできる。

【００１３】図１１の構成では、試料５中のｘ−ｙ断面
内の１点を観測する場合でも、参照光路の光路長を変化
させて試料のｚ方向の走査を行いながら信号光路との周
波数差を生み出していたが、本発明の周波数変調手段３
ａ、３ｂは、第１、第２のそれぞれの光路の光路長を変
化させないので、ｘ−ｙ断面内の１点を観測するのに機
械的駆動を行う必要がなく、常に第１の光路と第２の光
路との間に周波数差ｆが生じている。したがって、図１
１の構成よりもはるかに高速にｘ−ｙ面の低コヒーレン
ス干渉画像を得ることができる。

【００１４】さらに、低コヒーレンス光源１をパルスレ
ーザーとすることもできる。この場合、蛍光色素がパル
スレーザーにより多光子励起されるようにすることがで
きる。多光子励起では、励起光の集光スポット付近の蛍
光色素のみが励起され、観察面から離れた領域では励起
光が照射されていても蛍光は発光しないため、余分な背
景光が抑制され、蛍光観察のＳ／Ｎ比が向上する。

【００１５】また、蛍光分岐手段１０はダイクロイック
ミラーとすることができる。ダイクロイックミラーの反
射・透過特性を最適に設定することで、試料５からの蛍
光と散乱光（低コヒーレンス光）とを効率的に分離する
ことができ、それぞれの検出効率を向上させることがで
きる。

【００１６】さらに、本発明による別の走査型顕微鏡
は、低コヒーレンス光源と、前記低コヒーレンス光源か
らの低コヒーレンス光を第１の光路と第２の光路に分割
する手段と、前記第１の光路又は前記第２の光路あるい
はその両光路に配置され、それぞれの光路の光路長を変
化させることなく、前記第１の光路と前記第２の光路を
通過したそれぞれの光に周波数差を生じさせるための周
波数変調手段と、前記第１の光路に配置され、試料に光
を照射し、また前記試料からの光を集光するための対物
光学系と、前記第１の光路に配置され、前記対物光学系
の光軸に垂直な面内で、前記試料と前記対物光学系によ
る照射光とを相対的に走査する走査手段と、前記第１の
光路と前記第２の光路を合成する手段と、合成された光
から前記周波数差の干渉信号を検出するための干渉信号
検出系と、蛍光励起光源と、前記蛍光励起光源からの励
起光を前記第１の光路において前記低コヒーレンス光と
合成する励起光合成手段と、前記励起光により励起され
た試料からの蛍光を分岐する蛍光分岐手段と、前記蛍光
分岐手段により分岐された蛍光を検出するための蛍光検
出系と、を有することを特徴とする。

【００１７】図２及び図３に本発明による上記別の走査
型顕微鏡の構成を示し、本発明の上記走査型顕微鏡の構
成と作用を説明する。

【００１８】低コヒーレンス光源１からの光が光路分割
手段２により２つの光路に分割され、周波数変調手段３
ａ、３ｂにより生じた周波数差のビート信号を干渉信号
検出系９で検出する部分は図１と同様であるので、説明
は省略する。図１と異なるのは、低コヒーレンス光源１
とは別に蛍光励起光源１５を有することである。図２で
は、蛍光励起光源１５を発した励起光は、励起光合成手
段１６により第１の光路において低コヒーレンス光と合
成され、低コヒーレンス光と共に試料５に照射される。
試料５から発せられた蛍光は、蛍光分岐手段１７により
分離され蛍光検出系１１に導かれる。励起光合成手段と
蛍光分岐手段は、図３の符号１８、１９で示すように、
両者の作用を兼ねて構成することもできる。つまり、図
３においては、素子１８、１９の両者が励起光合成手段
であり、また蛍光分岐手段でもある。

【００１９】本発明においては、低コヒーレンス光源１
とは別に蛍光励起光源１５を有するので、低コヒーレン
ス観察と蛍光観察のそれぞれに最適な波長の光源を別々
に選択することができる。

【００２０】本発明の構成によっても、図１の構成の走
査型顕微鏡と同様に、試料５中の同一領域６を低コヒー
レンス干渉観察法と蛍光観察法の両手法により同時に観
察することができる。また、走査手段１２によりｘ−ｙ
断面の画像を得ることができ、高速な２次元画像観察を
行うことができる。

【００２１】励起光合成手段及び蛍光分岐手段は、少な
くとも２個のダイクロイックミラーで構成することがで
きる。これにより、低コヒーレンス光と蛍光とを効率よ
く分離することができる。

【００２２】また、励起光合成手段と蛍光分岐手段の
中、一方がダイクロイックミラーであり、他方が光路切
り替え可能なミラーであるように構成することができ
る。例えば、図２では、符号１６で示される素子を光路
切り替え可能なミラーとし、符号１７で示される素子を
ダイクロイックミラーとすることができる。図２のよう
に、素子１６がミラーとして第１の光路中に配置されて
いる場合には、蛍光観察のみが行われる。一方、素子１
６と１７の両者を第１の光路から離脱させた場合には、
低コヒーレンス干渉観察のみが行われる。このような構
成をとることで、蛍光観察と低コヒーレンス干渉観察と
を切り替えて観察することができ、試料５からの散乱光
や蛍光が微弱で、少しでも光量損失を防ぎたい場合に有
効である。図３においては、符号１９で示される素子を
光路切り替え可能なミラーとし、符号１８で示される素
子をダイクロイックミラーとすることで同じ作用が得ら
れる。

【００２３】また、以上の本発明の走査型顕微鏡に使用
される周波数変調手段を音響光学素子とすることができ
る。音響光学素子はその駆動周波数に対応して容易に周
波数変調を与えることができるので、低コヒーレンス干
渉法におけるヘテロダイン計測に適している。

【００２４】さらに、以上の本発明の走査型顕微鏡にお
ける干渉信号検出系又は蛍光検出系あるいはその両方を
共焦点系とすることができる。例えば、照明側及びそれ
ぞれの検出系の直前にピンホール等を配置して共焦点系
の構成とすることで、低コヒーレンス干渉観察又は蛍光
観察あるいはその両方における空間分解能を向上させる
ことができる。

【００２５】また、本発明の以上の走査型顕微鏡におい
て、第１の光路又は前記第２の光路あるいはその両光路
に、前記低コヒーレンス光の波長域における、前記第１
の光路と前記第２の光路のそれぞれで発生する分散特性
を略等しくする少なくとも１つの分散調整手段を配置す
ることができる。低コヒーレンス光はある大きさのスペ
クトル幅を持っているので、光路中に配置された各光学
素子を通過するとき、その光学素子の分散特性に応じて
波長によりその光路長が異なるという現象が起きる。例
えば、低コヒーレンス光源１のスペクトル分布が図１２
に示されるものであった場合に、図１３で示した分散特
性を持つ光学素子を光が通過すると、図に示すλｌの光
の光路長はλｈの光の光路長よりも長くなる。本発明の
走査型顕微鏡において、低コヒーレンス光が第１の光路
と第２の光路に分割されてから合成されるまでの間に、
各光路ではそれぞれの光路に配置された各々の光学素子
の分散の影響を受けるが、第１の光路と第２の光路とで
分散特性が異なると、第１の光路と第２の光路との光路
長差が波長によって異なるということが起きる。たとえ
第１の光路と第２の光路に使用するそれぞれの光学素子
を同一のものに揃えたとしても、試料５自身が分散を有
するときには、試料５を通過する第１の光路と通過しな
い第２の光路との間で光路長差が波長により異なってし
まう。波長により光路長差が異なると、例えば図１にお
いて干渉信号が検出される試料５内の観測位置６は波長
によりｚ軸方向に異なることになる。したがって、分解
能及びＳ／Ｎ比が劣化することは免れない。

【００２６】そこで、以上の本発明の走査型顕微鏡にお
いて、第１の光路又は第２の光路あるいはその両光路
に、第１の光路と第２の光路のそれぞれで発生する、低
コヒーレンス光の波長域での分散特性を略等しくする分
散調整手段を配置することより、上記のような問題点を
解決することができる。

【００２７】また、第２の光路に配置された少なくとも
１つのその分散調整手段の光学的厚さを可変とすること
ができる。例えば、試料５内部の３次元構造の情報を得
るために、光軸に垂直な面（ｘ−ｙ面）の画像を試料５
の深さ方向に順次観測していくような場合には、ｘ−ｙ
面内の画像の観測後に対物レンズ４あるいは試料５をｚ
方向に移動する。このとき、第１の光路の光路長が変化
するため、それに応じて第２の光路の光路長を変化させ
る必要がある。ここで、第１の光路の光路長変化は試料
５内部を通過する光の光路長変化を含んでいるため、試
料５に分散があれば、それに伴って第１の光路における
分散の影響も変化する。よって、第１の光路長変化に対
し、単純に第２の光路の光学素子間の空気間隔を変化さ
せる等を行うだけでは、第１及び第２の光路の光路長は
等しくなっても、分散の影響は等しくならない。上記の
構成によれば、第２の光路に配置された少なくとも１つ
の分散調整手段の光学的厚さを変化させることができる
ので、観測面のｚ座標変化等に伴う、試料５による分散
の影響の変化に応じた調整を行うことができる。また、
試料５を交換した場合あるいは分散を有する光学素子を
新たに顕微鏡光路内に配置した場合等、顕微鏡光路内で
の分散の影響が変化したときにおいても、観察を行う時
点での最適な分散の調整をその都度行うことができる。

【００２８】さらに、その分散調整手段の光学的厚さを
変化させることにより、試料５内の観測面の試料５表面
からの深さ位置が調整可能であるように構成することが
できる。分散調整手段の光学的厚さを変化させると第２
の光路の光路長が変化するので、第２の光路の光路長と
略等しい光路長を第１の光路の光路長とするような試料
内の観測位置６も変化することになる。ここで、対物光
学系４の焦点深度をコヒーレンス長よりも十分大きくし
ておけば、ｘ−ｙ面内の分解能をほとんど変化させずに
観測位置６のｚ座標を変化させることができる。よっ
て、分散調整手段の光学的厚さを変化させることによ
り、試料５内の観測面の深さ位置（ｚ座標）を変化させ
ることができる。このとき、先に述べたように、分散調
整手段では観察を行う時点での最適な分散の調整を行う
ことができるので、試料５内の観測面の深さ位置調整と
それに伴う分散調整とを同時に行うように構成すること
ができる。

【００２９】また、上記分散調整手段の、前記低コヒー
レンス光の波長域における分散特性が、試料の分散特性
と略等しくなるように構成することができる。この構成
において、分散調整手段の光学的厚さを、試料５の表面
から試料５内の観測位置６までの深さの略２倍程度に設
定しておけば、分散調整手段を通過する光の光路長と、
試料５を通過する光の光路長とが略等しくなるため、試
料５により発生する分散の影響と分散調整手段により発
生する分散の影響とを略等しくすることができる。した
がって、先に述べた観測面の深さ位置調整とそれに伴う
分散調整の両者の同時調整をさらに容易に行うことがで
きる。

【００３０】

【発明の実施の形態】以下、本発明の走査型顕微鏡のい
くつかの実施例を図面に参照にして説明する。

【００３１】（実施例１）図４は、本発明による走査型
顕微鏡の１例の構成を示す光路図である。この実施例
は、低コヒーレンス光源にパルスレーザーを用い、２光
子励起による蛍光像と低コヒーレンス干渉像の両者を同
時に観察するものである。

【００３２】低コヒーレンス光源２１は、中心波長λ_c
＝８５０ｎｍ、スペクトル幅Δλ＝５０ｎｍのパルスレ
ーザーとしている。このときのコヒーレンス長Ｌ_cは、
以下の式により計算される。

【００３３】Ｌ_c＝λ_c ²／Δλ したがって、この低コヒーレンス光源２１のコヒーレン
ス長Ｌ_cは約１４．５μｍである。この光源２１から出
た光をビームスプリッター２２により第１の光路と第２
の光路に分割する。ビームスプリッターの分割比は試料
５からの戻り光強度に応じて適当な値のものを用いるこ
とができる。ここでは、ビームスプリッター２２により
反射された光が進む光路を第１の光路、ビームスプリッ
ター２２を透過する光が進む光路を第２の光路とする。

【００３４】まず、第１の光路について説明する。ビー
ムスプリッター２２により反射された光は第１の光路を
進み、変調周波数８０ＭＨｚの音響光学素子２３ａを通
過し、ビームスプリッター２７、ダイクロイックミラー
３０をそれぞれ透過する。ダイクロイックミラー３０
は、低コヒーレンス光と、この光により２光子励起され
て発せられる蛍光とを分離するものであり、このときの
蛍光の波長が５００〜６００ｎｍ程度であると想定する
と、図５に示したような分光特性を持つものとなる。ダ
イクロイックミラー３０を透過した光は、ｘ−ｙスキャ
ナー３２、対物光学系４ａにより試料５内のｘ−ｙ面内
で走査される。対物光学系４ａは、瞳投影レンズ２６、
結像レンズ２５、対物レンズ２４からなっている。試料
５からの蛍光は、対物光学系４ａ、ｘ−ｙスキャナー３
２を再び通過し、ダイクロイックミラー３０により反射
されて、蛍光検出系３１で検出される。一方、試料５か
らの散乱光（低コヒーレンス光）は、対物光学系４ａ、
ｘ−ｙスキャナー３２を再び通過し、ダイクロイックミ
ラー３０を透過してビームスプリッター２７で反射さ
れ、ビームスプリッター２８を透過後に第２の光路の光
と合成される。

【００３５】次に、第２の光路について説明する。ビー
ムスプリッター２２を透過した光は第２の光路を進み、
後で説明する分散調整手段３３を通過する。その後、折
り返しミラー３５、変調周波数８０．５ＭＨｚの音響光
学素子２３ｂを通過し、ビームスプリッター２８で反射
されて第１の光路の光と合成される。折り返しミラー３
５は矢印で示す方向に移動可能であって、その位置を調
節しておくことにより、観察したい試料内の観測位置６
のｚ座標を予め設定することができる。この折り返しミ
ラー３５の位置は、試料５内の一断面を観察している間
は固定されている。

【００３６】第１の光路において、分散が主に発生する
のは音響光学素子２３ａ、対物光学系４ａ、試料５であ
ると考えられる。前述したように、第１の光路と第２の
光路とで低コヒーレンス光の波長域での分散特性は等し
くなることが望ましいので、第１の光路中の音響光学素
子２３ａと第２の光路中の音響光学素子２３ｂは同一仕
様の音響光学結晶を用い、変調周波数のみ異なるものと
する。そして、第１の光路のみに存在する対物光学系４
ａの分散の影響を補償するために、第２の光路中に、対
物光学系４ａと略同じ分散特性を持つ媒質（分散調整手
段）３３を配置している。媒質３３には、例えば適当な
ガラス材料や液体等を用いることができる。さらに、試
料５も分散を有する場合には、試料５と略同じ分散特性
を持つ媒質３４を第２の光路中に挿入することができ
る。ただし、このとき媒質３４を挿入することにより第
２の光路の光路長が変化することが考えられるため、折
り返しミラー３５により第２の光路の光路長をわずかに
調整することが必要になる場合もある。

【００３７】第１の光路と第２の光路の光はビームスプ
リッター２８で合成され、干渉信号検出系２９で検出さ
れる。ビームスプリッター２８の分割比は、ビームスプ
リッター２２と同様、試料５からの戻り光強度に応じて
適当な値とするのが望ましい。干渉信号検出系２９で
は、音響光学素子２３ａ、２３ｂの変調周波数の差であ
る０．５ＭＨｚの周波数の光の信号強度を検出する。干
渉信号検出系２９からの信号と蛍光検出系３１からの信
号はコンピュータ１３で処理される。コンピュータ１３
はｘ−ｙスキャナー３２も制御し、出力装置１４におい
て、試料５内の観測位置６でのｘ−ｙ面での低コヒーレ
ンス干渉画像と蛍光画像を別々にあるいは合成して表示
する。

【００３８】（実施例２）図６は、本発明による走査型
顕微鏡の別の例の構成を示す光路図である。この実施例
では、低コヒーレンス光源と蛍光励起光源のそれぞれを
有し、光学系の一部に光ファイバーを用いた構成をとっ
ている。

【００３９】始めに、低コヒーレンス干渉観察を行う光
学系について説明する。低コヒーレンス光源４１は、中
心波長λ_c＝１３００ｎｍ、スペクトル幅Δλ＝５０ｎ
ｍのファイバー光源としている。このときのコヒーレン
ス長Ｌ_cは約３４μｍである。この光源４１から出た光
は光ファイバーに入射され、ファイバー分割器４２によ
り分割され、分割されたそれぞれの光は音響光学素子４
３ａ、４３ｂを通過する。ファイバー分割器４２の分割
比は、実施例１のビームスプリッター２２、２８と同様
に適宜設定される。ここでは、音響光学素子４３ａを通
過する光の光路を第１の光路、音響光学素子４３ｂを通
過する光の光路を第２の光路とする。

【００４０】まず、第１の光路について説明する。変調
周波数８０ＭＨｚの音響光学素子４３ａを通過した光
は、ファイバー分割器４７を通過し、後で説明するダイ
クロイックミラー４９を透過し、ｘ−ｙスキャナー３
２、対物光学系４ａを通って試料５に照射される。試料
５で散乱された光は、対物光学系４ａ、ｘ−ｙスキャナ
ー３２を再び通過し、ダイクロイックミラー４９を透過
して、ファイバー分割器４７を通って、ファイバー分割
器４８において第２の光路と合成される。

【００４１】次に、第２の光路について説明する。変調
周波数８０．５ＭＨｚの音響光学素子４３ｂを通過した
光は、コリメーターレンズ５０により平行光となり、分
散調整手段５１を通過し、集光レンズ５２により再びフ
ァイバーに入射される。分散調整手段５１は、第１の光
路と第２の光路のそれぞれで発生する分散の分散特性を
略等しくするような媒質である。本実施例では光ファイ
バーを用いているため、第１の光路と第２の光路で光フ
ァイバーの長さが大きく異なる場合には、光ファイバー
の分散も考慮することが望ましい。一方、コリメーター
レンズ５０と集光レンズ５２との間の距離は調節可能で
あり、試料５内の観測位置６に対して、第１の光路の光
路長と第２の光路の光路長とが等しくなるように調節で
きる。これにより観測位置６のｚ座標を予め設定するこ
とができる。

【００４２】第１の光路と第２の光路はファイバー分割
器４８により合成され、干渉信号検出系２９で検出され
る。干渉信号検出系２９では、音響光学素子４３ａ、４
３ｂの変調周波数の差である０．５ＭＨｚの周波数の光
の信号強度を検出する。

【００４３】次に、蛍光観察を行う光学系について説明
する。蛍光励起光源４４は、波長４８８ｎｍのアルゴン
イオンレーザーとし、この励起光による試料５からの蛍
光波長はおよそ５２０ｎｍ程度であるとしている。蛍光
励起光源４４を出た光は、ダイクロイックミラー４５を
透過し、ピンホール４６を通過して、ダイクロイックミ
ラー４９で反射され、ｘ−ｙスキャナー３２、対物光学
系４ａを通って試料５に照射される。試料５で励起され
た蛍光は、対物光学系４ａ、ｘ−ｙスキャナー３２を再
び通過し、ダイクロイックミラー４９で反射され、ピン
ホール４６を通過後、ダイクロイックミラー４５で反射
されて蛍光検出系３１により検出される。ここで、ダイ
クロイックミラー４５は励起光と蛍光を分離するもので
あり、ダイクロイックミラー４９は低コヒーレンス光と
励起光あるいは蛍光を分離するものである。したがっ
て、ダイクロイックミラー４５、４９はそれぞれ図７、
図８に示す分光特性を持つものとなる。

【００４４】本実施例の走査型顕微鏡では、低コヒーレ
ンス干渉観察光学系においてはファイバー出射端５３
が、蛍光観察光学系においてはピンホール４６が、それ
ぞれ共焦点ピンホールの役目をしており、分解能あるい
はセクショニング効果の向上に有効である。

【００４５】また，本実施例では、低コヒーレンス干渉
観察の光学系の主要部分が光ファイバーで接続されてお
り、光学素子のレイアウトが比較的自由であるため、既
存のレーザー走査型蛍光顕微鏡に対し低コヒーレンス干
渉観察のための光学系を容易に付加できるという特徴を
有している。

【００４６】（実施例３）図９は、本発明による走査型
顕微鏡の別の例の構成を示す光路図である。この実施例
では、低コヒーレンス光源と蛍光励起光源のそれぞれを
有し、光学系の一部に光ファイバーを用いた構成をとっ
ており、実施例２の構成と基本的な部分は同じであるた
め、実施例２と異なる部分について説明する。

【００４７】本実施例では、実施例２におけるダイクロ
イックミラー４９の部分が、図１０に示すように、ダイ
クロイックミラー６１、ミラー６２、空穴６３の何れか
を選択できるターレット６４で構成されている。ダイク
ロイックミラー６１を選択した場合は、実施例２と同様
に、低コヒーレンス干渉観察と蛍光観察を同時に行うこ
とができる。一方、ミラー６２を選択した場合は、蛍光
観察のみを、空穴６３を選択した場合には、低コヒーレ
ンス干渉観察のみを行うことができる。このような構成
にすることで、蛍光強度や低コヒーレンス光の散乱強度
が非常に微弱な場合等、わずかでも信号光量を増加させ
て観察したい場合に、容易に光路を切り替えて観察を行
うことができる。

【００４８】さらに、本実施例では、実施例２における
コリメーターレンズ５０、集光レンズ５２の間の光学系
が異なる。本実施例では、分散調整手段７１と、コンピ
ュータ１３により制御される分散調整手段７２とが配置
されている。分散調整手段７１は、対物光学系４ａの分
散特性と略等しい特性を持つ媒質である。一方、分散調
整手段７２は、その分散特性が試料５の分散特性と略等
しく、さらに光学的厚さの調整量が可変である。これ
は、例えば、ガラス材料や液体等の厚みを変化させて光
学的厚さを調整可能なものである。図９では、台形プリ
ズムを２個重ね合わせ、一方を他方に対してずらすこと
により厚さを変化させている。分散調整手段７２の光学
的厚さは、試料５表面から試料５内の観測位置６までの
深さの略２倍であるように設定されている。したがっ
て、コンピュータ１３により分散調整手段７２の光学的
厚さを変化させると、変化量に伴い、試料５内の観測位
置６のｚ座標を調整することができる。分散調整手段７
２の光学的厚さの変化量は、観測位置のｚ座標の変化に
伴う光路長変化量と略等しいため、分散調整手段７２に
よる分散の調整量は、試料のｚ座標変化による分散の影
響を常に最適に補償することになる。

【００４９】以上の説明から明らかなように、本発明の
走査型顕微鏡は例えば次のように構成することができ
る。

【００５０】〔１〕低コヒーレンス光源と、前記低コ
ヒーレンス光源からの低コヒーレンス光を第１の光路と
第２の光路に分割する手段と、前記第１の光路又は前記
第２の光路あるいはその両光路に配置され、それぞれの
光路の光路長を変化させることなく、前記第１の光路と
前記第２の光路を通過したそれぞれの光に周波数差を生
じさせるための周波数変調手段と、前記第１の光路に配
置され、試料に光を照射し、また前記試料からの光を集
光するための対物光学系と、前記第１の光路に配置さ
れ、前記対物光学系の光軸に垂直な面内で、前記試料と
前記対物光学系による照射光とを相対的に走査する走査
手段と、前記第１の光路と前記第２の光路を合成する手
段と、合成された光から前記周波数差の干渉信号を検出
するための干渉信号検出系と、前記低コヒーレンス光に
より励起された試料からの蛍光を分岐する蛍光分岐手段
と、前記蛍光分岐手段により分岐された蛍光を検出する
ための蛍光検出系と、を有することを特徴とする走査型
顕微鏡。

【００５１】〔２〕前記低コヒーレンス光源がパルス
レーザーであることを特徴とする〔１〕記載の走査型顕
微鏡。

【００５２】〔３〕前記蛍光分岐手段がダイクロイッ
クミラーであることを特徴とする〔１〕又は〔２〕記載
の走査型顕微鏡。

【００５３】〔４〕低コヒーレンス光源と、前記低コ
ヒーレンス光源からの低コヒーレンス光を第１の光路と
第２の光路に分割する手段と、前記第１の光路又は前記
第２の光路あるいはその両光路に配置され、それぞれの
光路の光路長を変化させることなく、前記第１の光路と
前記第２の光路を通過したそれぞれの光に周波数差を生
じさせるための周波数変調手段と、前記第１の光路に配
置され、試料に光を照射し、また前記試料からの光を集
光するための対物光学系と、前記第１の光路に配置さ
れ、前記対物光学系の光軸に垂直な面内で、前記試料と
前記対物光学系による照射光とを相対的に走査する走査
手段と、前記第１の光路と前記第２の光路を合成する手
段と、合成された光から前記周波数差の干渉信号を検出
するための干渉信号検出系と、蛍光励起光源と、前記蛍
光励起光源からの励起光を前記第１の光路において前記
低コヒーレンス光と合成する励起光合成手段と、前記励
起光により励起された試料からの蛍光を分岐する蛍光分
岐手段と、前記蛍光分岐手段により分岐された蛍光を検
出するための蛍光検出系と、を有することを特徴とする
走査型顕微鏡。

【００５４】〔５〕前記励起光合成手段と前記蛍光分
岐手段とが、少なくとも２個のダイクロイックミラーで
構成されることを特徴とする〔４〕記載の走査型顕微
鏡。

【００５５】〔６〕前記励起光合成手段と前記蛍光分
岐手段の中、一方がダイクロイックミラーであり、他方
が光路切り替え可能なミラーであることを特徴とする
〔４〕記載の走査型顕微鏡。

【００５６】〔７〕前記周波数変調手段が音響光学素
子であることを特徴とする〔１〕から〔６〕の何れか１
項記載の走査型顕微鏡。

【００５７】〔８〕前記干渉信号検出系又は前記蛍光
検出系あるいはその両方が共焦点系であることを特徴と
する〔１〕から〔７〕の何れか１項記載の走査型顕微
鏡。

【００５８】

〔９〕前記第１の光路又は前記第２の光
路あるいはその両光路に配置され、前記低コヒーレンス
光の波長域における、前記第１の光路と前記第２の光路
のそれぞれで発生する分散特性を略等しくする少なくと
も１つの分散調整手段を有することを特徴とする〔１〕
から〔８〕の何れか１項記載の走査型顕微鏡。

【００５９】〔１０〕前記第２の光路に配置された少
なくとも１つの前記分散調整手段の光学的厚さが可変で
あることを特徴とする

〔９〕記載の走査型顕微鏡。

【００６０】〔１１〕前記分散調整手段の光学的厚さ
を変化させることにより、前記試料内の観測面の試料表
面からの深さ位置が調整可能であることを特徴とする
〔１０〕記載の走査型顕微鏡。

【００６１】〔１２〕前記分散調整手段の、前記低コ
ヒーレンス光の波長域における分散特性が、前記試料の
分散特性と略等しいことを特徴とする〔１０〕又は〔１
１〕記載の走査型顕微鏡。

【００６２】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
の走査型顕微鏡によれば、厚い試料の内部や不透明な散
乱体の内部を蛍光観察する際に、蛍光観察と同一の注目
領域における低コヒーレンス干渉画像を蛍光画像と併せ
て同時観察でき、しかも短時間で両者の観察画像を得る
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による走査型顕微鏡の構成を示す図であ
る。

【図２】低コヒーレンス光源と蛍光励起光源を有する本
発明の走査型顕微鏡の構成を示す図である。

【図３】励起光合成手段と蛍光分岐手段をそれぞれの作
用を兼ねて構成した走査型顕微鏡の構成を示す図であ
る。

【図４】本発明の実施例１の走査型顕微鏡の光路図であ
る。

【図５】実施例１のダイクロイックミラーの分光特性を
示す図である。

【図６】本発明の実施例２の走査型顕微鏡の光路図であ
る。

【図７】実施例２の一方のダイクロイックミラーの分光
特性を示す図である。

【図８】実施例２の他方のダイクロイックミラーの分光
特性を示す図である。

【図９】本発明の実施例３の走査型顕微鏡の光路図であ
る。

【図１０】実施例３のターレットの構成を示す図であ
る。

【図１１】従来の低コヒーレンス干渉光学系の構成を示
す図である。

【図１２】低コヒーレンス光源のスペクトルの例を示す
図である。

【図１３】分散特性の例を示す図である。

【符号の説明】

１…低コヒーレンス光源２…光路分割手段３ａ、３ｂ…周波数変調手段４、４ａ…対物光学系５…試料６…試料内の観測位置７、８…第１の光路と第２の光路を合成する手段９…干渉信号検出系１０…蛍光分岐手段１１…蛍光検出系１２…走査手段１３…コンピュータ１４…出力装置１５…蛍光励起光源１６…励起光合成手段１７…蛍光分岐手段１８、１９…励起光合成手段兼蛍光分岐手段２１…パルスレーザー２２…ビームスプリッター２３ａ、２３ｂ…音響光学素子２４…対物レンズ２５…結像レンズ２６…瞳投影レンズ２７、２８…ビームスプリッター２９…干渉信号検出系３０…ダイクロイックミラー３１…蛍光検出系３２…ｘ−ｙスキャナー３３、３４…分散調整手段３５…折り返しミラー４１…ファイバー光源４２、４７、４８…ファイバー分割器４３ａ、４３ｂ…音響光学素子４４…蛍光励起光源４５、４９…ダイクロイックミラー４６…ピンホール５０…コリメーターレンズ５１…分散調整手段５２…集光レンズ５３…ファイバー出射端６１…ダイクロイックミラー６２…ミラー６３…空穴６４…ターレット７１…分散調整手段７２…光学的厚さ可変の分散調整手段８１…光源８２…ビームスプリッター８３…反射鏡８４…検出器

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】低コヒーレンス光源と、前記低コヒーレンス光源からの低コヒーレンス光を第１
の光路と第２の光路に分割する手段と、前記第１の光路又は前記第２の光路あるいはその両光路
に配置され、それぞれの光路の光路長を変化させること
なく、前記第１の光路と前記第２の光路を通過したそれ
ぞれの光に周波数差を生じさせるための周波数変調手段
と、前記第１の光路に配置され、試料に光を照射し、また前
記試料からの光を集光するための対物光学系と、前記第１の光路に配置され、前記対物光学系の光軸に垂
直な面内で、前記試料と前記対物光学系による照射光と
を相対的に走査する走査手段と、前記第１の光路と前記第２の光路を合成する手段と、合成された光から前記周波数差の干渉信号を検出するた
めの干渉信号検出系と、前記低コヒーレンス光により励起された試料からの蛍光
を分岐する蛍光分岐手段と、前記蛍光分岐手段により分岐された蛍光を検出するため
の蛍光検出系と、を有することを特徴とする走査型顕微
鏡。
【請求項２】低コヒーレンス光源と、前記低コヒーレンス光源からの低コヒーレンス光を第１
の光路と第２の光路に分割する手段と、前記第１の光路又は前記第２の光路あるいはその両光路
に配置され、それぞれの光路の光路長を変化させること
なく、前記第１の光路と前記第２の光路を通過したそれ
ぞれの光に周波数差を生じさせるための周波数変調手段
と、前記第１の光路に配置され、試料に光を照射し、また前
記試料からの光を集光するための対物光学系と、前記第１の光路に配置され、前記対物光学系の光軸に垂
直な面内で、前記試料と前記対物光学系による照射光と
を相対的に走査する走査手段と、前記第１の光路と前記第２の光路を合成する手段と、合成された光から前記周波数差の干渉信号を検出するた
めの干渉信号検出系と、蛍光励起光源と、前記蛍光励起光源からの励起光を前記第１の光路におい
て前記低コヒーレンス光と合成する励起光合成手段と、前記励起光により励起された試料からの蛍光を分岐する
蛍光分岐手段と、前記蛍光分岐手段により分岐された蛍光を検出するため
の蛍光検出系と、を有することを特徴とする走査型顕微
鏡。