JP2000300295A - エストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型検出用試薬および検出法 - Google Patents
エストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型検出用試薬および検出法Info
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- JP2000300295A JP2000300295A JP11111800A JP11180099A JP2000300295A JP 2000300295 A JP2000300295 A JP 2000300295A JP 11111800 A JP11111800 A JP 11111800A JP 11180099 A JP11180099 A JP 11180099A JP 2000300295 A JP2000300295 A JP 2000300295A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 エストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型を簡
便に検出する試薬を提供する。 【解決手段】 エストロゲン受容体遺伝子のイントロン
１上における制限酵素XbaIで認識される部位の変異を検
出する、下記配列番号１または２に示される塩基配列の
一部／または全てを含む検出プローブ、該検出プローブ
を含むエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子検出用試薬お
よび該検出プローブを使用する該遺伝子多型検出法なら
びに骨粗鬆症薬剤の感受性を予測する方法。 配列番号：１ gtttccagag accctgagtg tggtctagag ttgggatgag cattggtctc taatggttct 60 配列番号：２ gtttccagag accctgagtg tggtctggag ttgggatgag cattggtctc taatggttct 60
便に検出する試薬を提供する。 【解決手段】 エストロゲン受容体遺伝子のイントロン
１上における制限酵素XbaIで認識される部位の変異を検
出する、下記配列番号１または２に示される塩基配列の
一部／または全てを含む検出プローブ、該検出プローブ
を含むエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子検出用試薬お
よび該検出プローブを使用する該遺伝子多型検出法なら
びに骨粗鬆症薬剤の感受性を予測する方法。 配列番号：１ gtttccagag accctgagtg tggtctagag ttgggatgag cattggtctc taatggttct 60 配列番号：２ gtttccagag accctgagtg tggtctggag ttgggatgag cattggtctc taatggttct 60
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はエストロゲン受容体
遺伝子の検出プローブ、該遺伝子多型検出用試薬、およ
び検出方法、ならびに該遺伝子多型から骨疾患治療薬の
感受性を予測する方法に関する。
遺伝子の検出プローブ、該遺伝子多型検出用試薬、およ
び検出方法、ならびに該遺伝子多型から骨疾患治療薬の
感受性を予測する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】1994年にMorrison N,Aらによるビタミン
Ｄ受容体遺伝子の遺伝子多型と骨密度の関係に関する発
表(Prediction of bone density from vitamin D recep
tor alleles. Nature,367:284-287,1994)がなされて以
来、種々の遺伝子と骨粗鬆症の関連が発表されている。
骨粗鬆症と関係の深いエストロゲンに関わるエストロゲ
ン受容体の遺伝子に関しても、様々な研究が行われてい
る。
Ｄ受容体遺伝子の遺伝子多型と骨密度の関係に関する発
表(Prediction of bone density from vitamin D recep
tor alleles. Nature,367:284-287,1994)がなされて以
来、種々の遺伝子と骨粗鬆症の関連が発表されている。
骨粗鬆症と関係の深いエストロゲンに関わるエストロゲ
ン受容体の遺伝子に関しても、様々な研究が行われてい
る。
【０００３】エストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型に
関しては、エストロゲン受容体遺伝子のイントロン１上
に存在するPvuII制限酵素断片長多型と、XbaI制限酵素
断片長多型が最も研究が進んでいる（J.Bone Miner Re
s. 11:306-311,1996など)。また、制限酵素PvuIIで切断
されない遺伝子型Ｐおよび同部で切断される遺伝子型ｐ
との組み合わせで決定される遺伝子多型ＰＰ、Ｐｐまた
はｐｐ、および制限酵素XbaIで切断されない遺伝子型Ｘ
および同部において切断される遺伝子型ｘとの組み合わ
せで決定される遺伝子多型ＸＸ、Ｘｘまたはｘｘのそれ
ぞれの組み合わせについて検出し、その結果から骨密度
の高低および／または骨疾患とを結び付けることが知ら
れている（特開平8-214899号公報）。
関しては、エストロゲン受容体遺伝子のイントロン１上
に存在するPvuII制限酵素断片長多型と、XbaI制限酵素
断片長多型が最も研究が進んでいる（J.Bone Miner Re
s. 11:306-311,1996など)。また、制限酵素PvuIIで切断
されない遺伝子型Ｐおよび同部で切断される遺伝子型ｐ
との組み合わせで決定される遺伝子多型ＰＰ、Ｐｐまた
はｐｐ、および制限酵素XbaIで切断されない遺伝子型Ｘ
および同部において切断される遺伝子型ｘとの組み合わ
せで決定される遺伝子多型ＸＸ、Ｘｘまたはｘｘのそれ
ぞれの組み合わせについて検出し、その結果から骨密度
の高低および／または骨疾患とを結び付けることが知ら
れている（特開平8-214899号公報）。
【０００４】
【発明が解決しようとしている課題】しかしながら、こ
れらの遺伝子多型を検出するには、これまで制限酵素、
PvuIおよびXbaIを用いた制限酵素断片長多型(RFLP)法に
よって検出している。この検出法は、制限酵素処理後、
電気泳動が必要であり、時間がかかり、複雑である。ま
た、結果の判定に熟練を要し、核酸ハイブリダイセーシ
ョン法と違って、自動化しにくく、複数の遺伝子を同時
に検出するのは困難である。さらに、エストロゲン受容
体遺伝子のイントロン１の塩基配列は、未だほとんど解
析されておらず、特に制限酵素XbaIによる遺伝子多型の
遺伝子近辺に関しての解析は行われていない。そのた
め、例えば検出プローブとなるＤＮＡ断片を利用した核
酸ハイブリダイゼーション法によるエストロゲン受容体
遺伝子のXbaI多型を検出することが困難であった。
れらの遺伝子多型を検出するには、これまで制限酵素、
PvuIおよびXbaIを用いた制限酵素断片長多型(RFLP)法に
よって検出している。この検出法は、制限酵素処理後、
電気泳動が必要であり、時間がかかり、複雑である。ま
た、結果の判定に熟練を要し、核酸ハイブリダイセーシ
ョン法と違って、自動化しにくく、複数の遺伝子を同時
に検出するのは困難である。さらに、エストロゲン受容
体遺伝子のイントロン１の塩基配列は、未だほとんど解
析されておらず、特に制限酵素XbaIによる遺伝子多型の
遺伝子近辺に関しての解析は行われていない。そのた
め、例えば検出プローブとなるＤＮＡ断片を利用した核
酸ハイブリダイゼーション法によるエストロゲン受容体
遺伝子のXbaI多型を検出することが困難であった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解消するために、エストロゲン受容体遺伝子のXbaI多
型領域の塩基配列の解析を行うことにより、エストロゲ
ン受容体遺伝子の遺伝子型を核酸ハイブリダイゼーショ
ン法によって検出することが可能であることを見いだ
し、本発明に到達した。
を解消するために、エストロゲン受容体遺伝子のXbaI多
型領域の塩基配列の解析を行うことにより、エストロゲ
ン受容体遺伝子の遺伝子型を核酸ハイブリダイゼーショ
ン法によって検出することが可能であることを見いだ
し、本発明に到達した。
【０００６】すなわち、本発明はエストロゲン受容体遺
伝子のイントロン１上における制限酵素XbaIで認識され
る部位の変異を検出する、下記配列番号１または２に示
される塩基配列の一部／または全てを含む検出プローブ
である。 配列番号：１ gtttccagag accctgagtg tggtctagag ttgggatgag cattggtctc taatggttct 60 配列番号：２ gtttccagag accctgagtg tggtctggag ttgggatgag cattggtctc taatggttct 60
伝子のイントロン１上における制限酵素XbaIで認識され
る部位の変異を検出する、下記配列番号１または２に示
される塩基配列の一部／または全てを含む検出プローブ
である。 配列番号：１ gtttccagag accctgagtg tggtctagag ttgggatgag cattggtctc taatggttct 60 配列番号：２ gtttccagag accctgagtg tggtctggag ttgggatgag cattggtctc taatggttct 60
【０００７】また、本発明はエストロゲン受容体遺伝子
における制限酵素XbaIで認識される部位の変異を検出す
る、下記配列番号３または４に示される塩基配列の一部
／または全てを含む検出プローブである。 配列番号：３ gtggtctaga gttggg 16 配列番号：４ gtgtggtctg gagttg 16
における制限酵素XbaIで認識される部位の変異を検出す
る、下記配列番号３または４に示される塩基配列の一部
／または全てを含む検出プローブである。 配列番号：３ gtggtctaga gttggg 16 配列番号：４ gtgtggtctg gagttg 16
【０００８】本発明は上記検出プローブを含むエストロ
ゲン受容体遺伝子の遺伝子多型検出用試薬である。
ゲン受容体遺伝子の遺伝子多型検出用試薬である。
【０００９】また、本発明は上記検出プローブおよびエ
ストロゲン受容体遺伝子に特異的な増幅プライマーを含
むエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型検出用試薬で
ある。
ストロゲン受容体遺伝子に特異的な増幅プライマーを含
むエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型検出用試薬で
ある。
【００１０】さらに、本発明は下記配列番号５および６
に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである
エストロゲン受容体遺伝子増幅プライマー、および下記
配列番号３または４に示される塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドであるエストロゲン受容体遺伝子多型の検
出プローブを含むストロゲン受容体遺伝子多型検出用試
薬である。 配列番号：５ gttccaaatg tcccagccgt 20 配列番号：６ cctgcaccag aatatgttacc 20 配列番号：３ gtggtctaga gttggg 16 配列番号：４ gtgtggtctg gagttg 16
に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである
エストロゲン受容体遺伝子増幅プライマー、および下記
配列番号３または４に示される塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドであるエストロゲン受容体遺伝子多型の検
出プローブを含むストロゲン受容体遺伝子多型検出用試
薬である。 配列番号：５ gttccaaatg tcccagccgt 20 配列番号：６ cctgcaccag aatatgttacc 20 配列番号：３ gtggtctaga gttggg 16 配列番号：４ gtgtggtctg gagttg 16
【００１１】本発明は上記エストロゲン受容体遺伝子の
遺伝子多型検出プローブを用いて、試料中のエストロゲ
ン受容体遺伝子の遺伝子多型、ＸＸ、Ｘｘまたはｘｘを
検出することを特徴とするエストロゲン受容体遺伝子の
遺伝子多型を検出する方法である。
遺伝子多型検出プローブを用いて、試料中のエストロゲ
ン受容体遺伝子の遺伝子多型、ＸＸ、Ｘｘまたはｘｘを
検出することを特徴とするエストロゲン受容体遺伝子の
遺伝子多型を検出する方法である。
【００１２】また、本発明は上記エストロゲン受容体遺
伝子の遺伝子多型検出プローブを用いて、試料中のエス
トロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型、ＸＸ、Ｘｘまたは
ｘｘを検出し、遺伝子多型がＸＸまたはＸｘである試料
は、エストロゲンに対する感受性が高いと予想すること
を特徴とする骨粗鬆症薬剤の感受性を予測する方法であ
る。
伝子の遺伝子多型検出プローブを用いて、試料中のエス
トロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型、ＸＸ、Ｘｘまたは
ｘｘを検出し、遺伝子多型がＸＸまたはＸｘである試料
は、エストロゲンに対する感受性が高いと予想すること
を特徴とする骨粗鬆症薬剤の感受性を予測する方法であ
る。
【００１３】
【発明の実施の態様】本発明においてエストロゲン受容
体とは、ヒト体内においてエストロゲンの効果発現系に
大きな役割を果たす、５９５個のアミノ酸残基からなる
分子量66,200の蛋白質である。閉経後、女性に骨粗鬆症
が多いことから、エストロゲンおよびエストロゲン受容
体との骨粗鬆症の関連が上記したように研究されてい
る。エストロゲン受容体をコードする遺伝子はヒト第６
染色体に存在していて、エストロゲン受容体遺伝子につ
いてはいくつかの多型が存在しており、例えばエストロ
ゲン受容体遺伝子イントロン１上に存在するXbaI制限酵
素断片長多型やPvuII制限酵素断片長多型などが知られ
ている。
体とは、ヒト体内においてエストロゲンの効果発現系に
大きな役割を果たす、５９５個のアミノ酸残基からなる
分子量66,200の蛋白質である。閉経後、女性に骨粗鬆症
が多いことから、エストロゲンおよびエストロゲン受容
体との骨粗鬆症の関連が上記したように研究されてい
る。エストロゲン受容体をコードする遺伝子はヒト第６
染色体に存在していて、エストロゲン受容体遺伝子につ
いてはいくつかの多型が存在しており、例えばエストロ
ゲン受容体遺伝子イントロン１上に存在するXbaI制限酵
素断片長多型やPvuII制限酵素断片長多型などが知られ
ている。
【００１４】本発明におけるエストロゲン受容体遺伝子
の遺伝子多型とは、上記XbaI制限酵素断片長多型であ
り、切断されないものをＸ型、XbaIで切断されるものを
x型とすることによる、ゲノムＤＮＡが２本鎖であるこ
とから、ＸＸ、Ｘｘおよびｘｘの３種類の遺伝子多型が
ある。本発明の検出試薬では、ＸＸ型、Ｘｘ型をＸ
（＋）型と称し、ｘｘ型をＸ（−）型と称する。
の遺伝子多型とは、上記XbaI制限酵素断片長多型であ
り、切断されないものをＸ型、XbaIで切断されるものを
x型とすることによる、ゲノムＤＮＡが２本鎖であるこ
とから、ＸＸ、Ｘｘおよびｘｘの３種類の遺伝子多型が
ある。本発明の検出試薬では、ＸＸ型、Ｘｘ型をＸ
（＋）型と称し、ｘｘ型をＸ（−）型と称する。
【００１５】本発明において使用するエストロゲン受容
体遺伝子に特異的な増幅プライマーとは、ポリメラーゼ
・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲ）法によっ
て、本発明の検出しようとするエストロゲン受容体のイ
ントロン１のXbaI制限酵素多型を含むようなエストロゲ
ン受容体遺伝子領域を増幅するように設計されたオリゴ
ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドの数は、好ま
しくは１０〜３０個である。具体的にはＰＣＲ時のアニ
ーリング温度が約５０℃のものとして、配列番号５およ
び６で示される増幅プライマーを例示することができ
る。
体遺伝子に特異的な増幅プライマーとは、ポリメラーゼ
・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲ）法によっ
て、本発明の検出しようとするエストロゲン受容体のイ
ントロン１のXbaI制限酵素多型を含むようなエストロゲ
ン受容体遺伝子領域を増幅するように設計されたオリゴ
ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドの数は、好ま
しくは１０〜３０個である。具体的にはＰＣＲ時のアニ
ーリング温度が約５０℃のものとして、配列番号５およ
び６で示される増幅プライマーを例示することができ
る。
【００１６】本発明において使用するエストロゲン受容
体遺伝子を検出するためのプローブとは、エストロゲン
受容体遺伝子のXbaI多型部分において、Ｘ型またはx型
と結合するオリゴヌクレオチドである。なお、天然型エ
ストロゲン受容体遺伝子は、配列番号１または２に示さ
れる塩基配列およびその相補的な塩基配列を含む。検出
プローブとしては配列番号１または２に示される塩基配
列の第２７番目の塩基がａまたはｇである塩基配列を含
むオリゴヌクレオチドである。その塩基数は１０〜３０
であることが好ましい。検出プローブには、その両末端
にさらにＴを付加してもよい。その数は好ましくは３０
０〜６００である。具体的にはハイブリダイゼーション
時の温度が約４５℃の場合のものとして、検出用プロー
ブ（配列番号３または４）を例示することができる。
体遺伝子を検出するためのプローブとは、エストロゲン
受容体遺伝子のXbaI多型部分において、Ｘ型またはx型
と結合するオリゴヌクレオチドである。なお、天然型エ
ストロゲン受容体遺伝子は、配列番号１または２に示さ
れる塩基配列およびその相補的な塩基配列を含む。検出
プローブとしては配列番号１または２に示される塩基配
列の第２７番目の塩基がａまたはｇである塩基配列を含
むオリゴヌクレオチドである。その塩基数は１０〜３０
であることが好ましい。検出プローブには、その両末端
にさらにＴを付加してもよい。その数は好ましくは３０
０〜６００である。具体的にはハイブリダイゼーション
時の温度が約４５℃の場合のものとして、検出用プロー
ブ（配列番号３または４）を例示することができる。
【００１７】本発明の増幅試薬は、上記増幅プライマー
に、さらに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、dNTPsおよび緩
衝液を含む。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Taq
ＤＮＡポリメラーゼ、TthＤＮＡポリメラーゼ、PfuＤＮ
Ａポリメラーゼ、VentＤＮＡポリメラーゼなどが例示さ
れる。dNTPsとは、dATP,dCTP,dGTP,dTTPの混合物をい
う。さらに緩衝液としては、使用する耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼに応じて選ばれる。例えばTaqＤＮＡポリメラ
ーゼではマグネシウムイオン、グリセロールを含むトリ
ス緩衝液などを使用する。
に、さらに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、dNTPsおよび緩
衝液を含む。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Taq
ＤＮＡポリメラーゼ、TthＤＮＡポリメラーゼ、PfuＤＮ
Ａポリメラーゼ、VentＤＮＡポリメラーゼなどが例示さ
れる。dNTPsとは、dATP,dCTP,dGTP,dTTPの混合物をい
う。さらに緩衝液としては、使用する耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼに応じて選ばれる。例えばTaqＤＮＡポリメラ
ーゼではマグネシウムイオン、グリセロールを含むトリ
ス緩衝液などを使用する。
【００１８】増幅プライマーまたは検出プローブは、い
ずれか一方に標識物質を結合してもよい。標識物質とし
ては放射性物質、酵素、蛍光性物質またはビオチンなど
が例示される。標識の結合法は特に制限されない。
ずれか一方に標識物質を結合してもよい。標識物質とし
ては放射性物質、酵素、蛍光性物質またはビオチンなど
が例示される。標識の結合法は特に制限されない。
【００１９】上記増幅試薬において、増幅プライマーは
ＰＣＲ最終組成物中、0.1〜1.0μMであることが好まし
い。また上記検出試薬において、検出プローブは0.1〜
1.0pmol/μLであることが好ましい。
ＰＣＲ最終組成物中、0.1〜1.0μMであることが好まし
い。また上記検出試薬において、検出プローブは0.1〜
1.0pmol/μLであることが好ましい。
【００２０】本発明のエストロゲン受容体遺伝子の遺伝
子多型検出方法とは、試料中のＤＮＡをエストロゲン受
容体遺伝子に特異的な増幅プライマーを含む増幅試薬を
用いて増幅し、次いでエストロゲン受容体遺伝子多型を
検出するための検出プローブを含む検出用試薬を用い
て、試料中のエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型を
検出する方法である。
子多型検出方法とは、試料中のＤＮＡをエストロゲン受
容体遺伝子に特異的な増幅プライマーを含む増幅試薬を
用いて増幅し、次いでエストロゲン受容体遺伝子多型を
検出するための検出プローブを含む検出用試薬を用い
て、試料中のエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型を
検出する方法である。
【００２１】具体的には、試料中のＤＮＡ、例えばヒト
血液から精製したＤＮＡを上記増幅プライマーを含む増
幅試薬を用いて増幅し、増幅された試料を上記検出用プ
ローブを含む検出用試薬を用いて、試料中のエストロゲ
ン受容体遺伝子の遺伝子多型を検出する方法である。
血液から精製したＤＮＡを上記増幅プライマーを含む増
幅試薬を用いて増幅し、増幅された試料を上記検出用プ
ローブを含む検出用試薬を用いて、試料中のエストロゲ
ン受容体遺伝子の遺伝子多型を検出する方法である。
【００２２】増幅方法は、一般に使用されるＰＣＲ法が
好ましい。該方法は例えば２本鎖の試料ＤＮＡを加熱し
て１本鎖としてから、該１本鎖を鋳型として少なくとも
２種の増幅プライマーをアニールさせ、次いで加温して
ＤＮＡポリメラーゼを使用して鋳型上にdNTPsを伸張さ
せる。得られた２本鎖を加熱および冷却の上記反応を繰
り返すことにより、効率的に目標領域を増幅することが
できる。一般に反応温度は92〜95℃を30秒間〜1分間、5
0〜65℃を20秒〜1分間、70〜75℃を20秒から５分間の各
工程を20〜40回繰り返す。一般に50〜65℃で上記アニー
ル反応が生じるが、該反応を成功させるためのアニール
温度は、主にプライマーの組成によって選択される。ま
た、一般に70〜75℃でＤＮＡ伸張がおこるが、該反応を
成功させるための伸張時間は、増幅する目標領域の長さ
によって選択される。
好ましい。該方法は例えば２本鎖の試料ＤＮＡを加熱し
て１本鎖としてから、該１本鎖を鋳型として少なくとも
２種の増幅プライマーをアニールさせ、次いで加温して
ＤＮＡポリメラーゼを使用して鋳型上にdNTPsを伸張さ
せる。得られた２本鎖を加熱および冷却の上記反応を繰
り返すことにより、効率的に目標領域を増幅することが
できる。一般に反応温度は92〜95℃を30秒間〜1分間、5
0〜65℃を20秒〜1分間、70〜75℃を20秒から５分間の各
工程を20〜40回繰り返す。一般に50〜65℃で上記アニー
ル反応が生じるが、該反応を成功させるためのアニール
温度は、主にプライマーの組成によって選択される。ま
た、一般に70〜75℃でＤＮＡ伸張がおこるが、該反応を
成功させるための伸張時間は、増幅する目標領域の長さ
によって選択される。
【００２３】本発明における検出方法とは、上記増幅方
法により増幅したＤＮＡを検出プローブによって検出す
る方法である。サザン・ハイブリダイゼーション法で行
うものであれば、検出プローブが標識されるか、リバー
ス・ハイブリダイゼーション法であれば、増幅プライマ
ーが標識されることが好ましい。また、複数の標識物質
がプライマーまたはプローブに結合していてもよい。標
識物質としては、遺伝子分析法、免疫測定法などに通
常、使用される標識物質を使用することができる。標識
物質が放射性物質であれば、その放射能を計測する。ま
た、標識物質がビオチンであれば、酵素結合アビジンを
結合させ、該酵素を発色または発光させ、その強度を測
定する。酵素が、例えばアルカリホスファターゼであれ
ば、その基質である5-ブロモ-4-クロロ-3-インドールリ
ン酸-p-トルイジン塩（BCIP）、ニトロ・ブルー・テト
ラゾリウム（NBT）を作用させ、その生成物の発色を測
定する。また、アルカリホスファターゼには、1,2-ジオ
キセタン化合物を作用させ、該化合物が分解する際に生
じる発光量を測定することも可能である。
法により増幅したＤＮＡを検出プローブによって検出す
る方法である。サザン・ハイブリダイゼーション法で行
うものであれば、検出プローブが標識されるか、リバー
ス・ハイブリダイゼーション法であれば、増幅プライマ
ーが標識されることが好ましい。また、複数の標識物質
がプライマーまたはプローブに結合していてもよい。標
識物質としては、遺伝子分析法、免疫測定法などに通
常、使用される標識物質を使用することができる。標識
物質が放射性物質であれば、その放射能を計測する。ま
た、標識物質がビオチンであれば、酵素結合アビジンを
結合させ、該酵素を発色または発光させ、その強度を測
定する。酵素が、例えばアルカリホスファターゼであれ
ば、その基質である5-ブロモ-4-クロロ-3-インドールリ
ン酸-p-トルイジン塩（BCIP）、ニトロ・ブルー・テト
ラゾリウム（NBT）を作用させ、その生成物の発色を測
定する。また、アルカリホスファターゼには、1,2-ジオ
キセタン化合物を作用させ、該化合物が分解する際に生
じる発光量を測定することも可能である。
【００２４】本発明では固相担体に検出プローブを固定
化し、該検出プローブに増幅した試料ＤＮＡを結合させ
ることにより、固相担体上でエストロゲン受容体遺伝子
の遺伝子多型を検出することが可能である。固相担体と
しては、ナイロン膜、マイクロタイタープレートなどが
使用できる。検出プローブを固相担体へ固定化するに
は、例えば、該検出プローブの末端に、ターミナル・デ
オキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（TdT）に
よってdTTPを鎖状に付加（polyＴ付加）し、上記担体へ
物理的吸着させる方法がある。１つの担体の別々の部位
にエストロゲン受容体遺伝子の検出プローブを固定化す
ることにより、１つの増幅試料中の遺伝子多型を同時に
判定することができる。
化し、該検出プローブに増幅した試料ＤＮＡを結合させ
ることにより、固相担体上でエストロゲン受容体遺伝子
の遺伝子多型を検出することが可能である。固相担体と
しては、ナイロン膜、マイクロタイタープレートなどが
使用できる。検出プローブを固相担体へ固定化するに
は、例えば、該検出プローブの末端に、ターミナル・デ
オキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（TdT）に
よってdTTPを鎖状に付加（polyＴ付加）し、上記担体へ
物理的吸着させる方法がある。１つの担体の別々の部位
にエストロゲン受容体遺伝子の検出プローブを固定化す
ることにより、１つの増幅試料中の遺伝子多型を同時に
判定することができる。
【００２５】固相担体上で検出プローブにハイブリダイ
ズした増幅ＤＮＡは、結合する標識物質を測定すること
により検出できる。例えば、図1に示すように、検出プ
ローブに対して反応する試料をエストロゲン受容体Ｘ
型、検出プローブに対して反応する試料をエストロゲン
受容体ｘ型と判定する。これらの組み合わせにより、試
料中のエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型を検出す
ることができる。
ズした増幅ＤＮＡは、結合する標識物質を測定すること
により検出できる。例えば、図1に示すように、検出プ
ローブに対して反応する試料をエストロゲン受容体Ｘ
型、検出プローブに対して反応する試料をエストロゲン
受容体ｘ型と判定する。これらの組み合わせにより、試
料中のエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型を検出す
ることができる。
【００２６】本発明により検出された遺伝子多型から、
骨粗鬆症薬剤の１種であるエストロゲンに対して、感受
性が高いか否かを予測することができる。
骨粗鬆症薬剤の１種であるエストロゲンに対して、感受
性が高いか否かを予測することができる。
【００２７】
【実施例】次に本発明を実施例を用いて詳細に説明す
る。実施例１ 下記4種の試薬〜を調製した。 試薬 50% グリセロール 試薬 5mM 塩化マグネシウム 試薬 0.25M 塩化ナトリウム 0.05M トリス−塩酸緩衝液 0.05% ゼラチン 1mM dNTPs 試薬 3pM 5'末端にビオチンを付加したエストロゲン受容体プライマー（ 配列番号５） 3pM エストロゲン受容体プライマー（配列番号６）
る。実施例１ 下記4種の試薬〜を調製した。 試薬 50% グリセロール 試薬 5mM 塩化マグネシウム 試薬 0.25M 塩化ナトリウム 0.05M トリス−塩酸緩衝液 0.05% ゼラチン 1mM dNTPs 試薬 3pM 5'末端にビオチンを付加したエストロゲン受容体プライマー（ 配列番号５） 3pM エストロゲン受容体プライマー（配列番号６）
【００２８】ヒト血液から精製したＤＮＡ5μL(n=3+Bla
nk1）に、試薬〜をそれぞれ10μL添加し、さらに滅
菌済み精製水4.8μLおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（ToYoBo Taq Polymerase）0.2μLを加えた。得られた
溶液を95℃、５分、［95℃ 30秒、50℃ 20秒、72℃ 20
秒］30回繰り返し、72℃ 10分間の条件でＰＣＲを行っ
た。増幅産物をアガロース・ゲル電気泳動にかけた。そ
の結果を図2に示す。ブランクを除く３つの試料のいず
れからもエストロゲン受容体遺伝子のものと考えられる
バンドが検出された。
nk1）に、試薬〜をそれぞれ10μL添加し、さらに滅
菌済み精製水4.8μLおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（ToYoBo Taq Polymerase）0.2μLを加えた。得られた
溶液を95℃、５分、［95℃ 30秒、50℃ 20秒、72℃ 20
秒］30回繰り返し、72℃ 10分間の条件でＰＣＲを行っ
た。増幅産物をアガロース・ゲル電気泳動にかけた。そ
の結果を図2に示す。ブランクを除く３つの試料のいず
れからもエストロゲン受容体遺伝子のものと考えられる
バンドが検出された。
【００２９】実施例２ 検出用プローブ（配列番号３および４)に対して、TaKaR
a ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェ
ラーゼとdTTpを使用して、polyＴ付加を行い、得られた
polyＴ付加プローブを１枚のナイロン膜上の別々の場所
にそれぞれ0.25μLずつ塗布し、312nmの紫外線を2分間
照射して固定し、検出ストリップを作成した。
a ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェ
ラーゼとdTTpを使用して、polyＴ付加を行い、得られた
polyＴ付加プローブを１枚のナイロン膜上の別々の場所
にそれぞれ0.25μLずつ塗布し、312nmの紫外線を2分間
照射して固定し、検出ストリップを作成した。
【００３０】下記２種類の試薬を調製した。
【００３１】実施例1で増幅した試料10μLに、試薬10
μLを加えてよく攪拌し、5分間放置した。この試料溶液
中に試薬１mLおよび上記検出ストリップ1枚を加え、
反応温度45℃のもとで、30分間振とうして反応させた。
その後、ストレプトアビジンに結合したアルカリホスフ
ァターゼを加え、さらにBCIPおよびNBTを加えて、検出
ストリップ上の各プローブと結合した試料に、さらに結
合したアルカリホスファターゼを発色させた。その結果
を図3に示す。
μLを加えてよく攪拌し、5分間放置した。この試料溶液
中に試薬１mLおよび上記検出ストリップ1枚を加え、
反応温度45℃のもとで、30分間振とうして反応させた。
その後、ストレプトアビジンに結合したアルカリホスフ
ァターゼを加え、さらにBCIPおよびNBTを加えて、検出
ストリップ上の各プローブと結合した試料に、さらに結
合したアルカリホスファターゼを発色させた。その結果
を図3に示す。
【００３２】図３から、試料No.１〜３は下記表１に示
す遺伝子多型を有すると判定した。
す遺伝子多型を有すると判定した。
【００３３】
【表１】
【００３４】参考のために、制限酵素XbaIによる制限酵
素断片長によって、同一検体のエストロゲン受容体遺伝
子型を判定した。その結果を図４および表２に示す。
素断片長によって、同一検体のエストロゲン受容体遺伝
子型を判定した。その結果を図４および表２に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】表１および表２から明らかなように、両者
の結果は一致した。
の結果は一致した。
【００３７】
【発明の効果】本発明ではエストロゲン受容体遺伝子を
増幅し、その増幅産物を用いてエストロゲン受容体遺伝
子多型を検出できる試薬を提供する。また、エストロゲ
ン受容体遺伝子が骨粗鬆症に関わっていることから、該
検出試薬によりヒト検体中のこれらの遺伝子の遺伝子多
型を検出し、その結果から、有効な骨粗鬆症治療薬の感
受性を予測することが可能となる。
増幅し、その増幅産物を用いてエストロゲン受容体遺伝
子多型を検出できる試薬を提供する。また、エストロゲ
ン受容体遺伝子が骨粗鬆症に関わっていることから、該
検出試薬によりヒト検体中のこれらの遺伝子の遺伝子多
型を検出し、その結果から、有効な骨粗鬆症治療薬の感
受性を予測することが可能となる。
【００３８】
【配列表】 ＜１１０＞ 株式会社ニッショー ＜１２０＞ エストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型検出用試薬および検出法 ＜１３０＞ １１−０１９ ＜１６０＞ ８
【００３９】 ＜２１０＞ 配列番号１ ＜２１１＞ 60 ＜２１２＞ 核酸 ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第６染色体 ＜２２３＞ エストロゲン受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ gtttccagag accctgagtg tggtctagag ttgggatgag cattggtctc taatggttct 60
【００４０】 ＜２１０＞ 配列番号２ ＜２１１＞ 60 ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第６染色体 ＜２２３＞ エストロゲン受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ gtttccagag accctgagtg tggtctggag ttgggatgag cattggtctc taatggttct 60
【００４１】 ＜２１０＞ 配列番号３ ＜２１１＞ 16 ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第６染色体 ＜２２３＞ エストロゲン受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ gtggtctaga gttggg 16
【００４２】 ＜２１０＞ 配列番号４ ＜２１１＞ 16 ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第６染色体 ＜２２３＞ エストロゲン受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ gtgtggtctg gagttg 16
【００４３】 ＜２１０＞ 配列番号５ ＜２１１＞ 20 ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第６染色体 ＜２２３＞ エストロゲン受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ gttccaaatg tcccagccgt 20
【００４４】 ＜２１０＞ 配列番号６ ＜２１１＞ 20 ＜２１３＞ ヒト ＜２２２＞ 第６染色体 ＜２２３＞ エストロゲン受容体遺伝子の塩基配列の一部 ＜４００＞ cctgcaccag aatatgttacc 20
【図１】固相担体上でエストロゲン受容体遺伝子を検出
した結果と各遺伝子の遺伝子多型を示す模式図である。
した結果と各遺伝子の遺伝子多型を示す模式図である。
【図２】本発明の増幅プライマーにより、実施例1で増
幅した遺伝子の電気泳動の結果を示す図面に代わる写真
である。
幅した遺伝子の電気泳動の結果を示す図面に代わる写真
である。
【図３】実施例1で増幅した試料を用いて、固相担体上
で検出プローブによりエストロゲン受容体遺伝子多型を
検出した結果を示す図である。
で検出プローブによりエストロゲン受容体遺伝子多型を
検出した結果を示す図である。
【図４】実施例1の試料について、エストロゲン受容体
遺伝子について、ＰＣＲで増幅し、制限酵素XbaIを用い
た制限酵素断片長から、エストロゲン受容体遺伝子の遺
伝子多型を判別した、電気泳動の結果を示す図面に変わ
る写真である。
遺伝子について、ＰＣＲで増幅し、制限酵素XbaIを用い
た制限酵素断片長から、エストロゲン受容体遺伝子の遺
伝子多型を判別した、電気泳動の結果を示す図面に変わ
る写真である。
フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA02 CA09 DA03 HA08 HA09 4B063 QA01 QA06 QA12 QA17 QQ03 QQ43 QR08 QR14 QR32 QR42 QR55 QR56 QR62 QS25 QX01
Claims (10)
- 【請求項１】 エストロゲン受容体遺伝子のイントロン
１上における制限酵素XbaIで認識される部位の変異を検
出する、下記配列番号１または２に示される塩基配列の
一部／または全てを含む検出プローブ。 配列番号：１ gtttccagag accctgagtg tggtctagag ttgggatgag cattggtctc taatggttct 60 配列番号：２ gtttccagag accctgagtg tggtctggag ttgggatgag cattggtctc taatggttct 60 - 【請求項２】 配列番号１または２に示される塩基配列
の第２７番目の塩基、ａまたはｇを含む、少なくとも１
０〜３０個のオリゴヌクレオチドである請求項１記載の
検出プローブ。 - 【請求項３】 エストロゲン受容体遺伝子における制限
酵素XbaIで認識される部位の変異を検出する、下記配列
番号３または４に示される塩基配列の一部／または全て
を含む検出プローブ。 配列番号：３ gtggtctaga gttggg 16 配列番号：４ gtgtggtctg gagttg 16 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項記載の検出
プローブを含むエストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型
検出用試薬。 - 【請求項５】 請求項１〜３のいずれか１項記載の検出
プローブおよびエストロゲン受容体遺伝子に特異的な増
幅プライマーを含むストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多
型検出用試薬。 - 【請求項６】 エストロゲン受容体遺伝子に特異的な増
幅プライマーが、下記配列番号５および６に示される塩
基配列を有する、少なくとも２種のオリゴヌクレオチド
である請求項４または５記載のエストロゲン受容体遺伝
子の遺伝子多型検出用試薬。 配列番号：５ gttccaaatg tcccagccgt 20 配列番号：６ cctgcaccag aatatgttacc 20 - 【請求項７】 下記配列番号５および６に示される塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドであるエストロゲン受
容体遺伝子増幅プライマー、および下記配列番号３また
は４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで
あるエストロゲン受容体遺伝子多型の検出プローブを含
むストロゲン受容体遺伝子多型検出用試薬。 配列番号：５ gttccaaatg tcccagccgt 20 配列番号：６ cctgcaccag aatatgttacc 20 配列番号：３g tggtctaga gttggg 16 配列番号：４ gtgtggtctg gagttg 16 - 【請求項８】 エストロゲン受容体遺伝子多型が、エス
トロゲン受容体遺伝子のイントロン１上の制限酵素XbaI
断片で認識できる遺伝子多型、ＸＸ、Ｘｘまたはｘｘで
ある請求項４〜７記載の遺伝子多型検出用試薬。 - 【請求項９】 請求項１〜３記載のエストロゲン受容体
遺伝子の遺伝子多型検出プローブを用いて、試料中のエ
ストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型、ＸＸ、Ｘｘまた
はｘｘを検出することを特徴とするエストロゲン受容体
遺伝子の遺伝子多型を検出する方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜３記載のエストロゲン受容
体遺伝子の遺伝子多型検出プローブを用いて、試料中の
エストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型、ＸＸ、Ｘｘま
たはｘｘを検出し、遺伝子多型がＸＸまたはＸｘである
試料は、エストロゲンに対する感受性が高いと予想する
ことを特徴とする骨粗鬆症薬剤の感受性を予測する方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11111800A JP2000300295A (ja) | 1999-04-20 | 1999-04-20 | エストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型検出用試薬および検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11111800A JP2000300295A (ja) | 1999-04-20 | 1999-04-20 | エストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型検出用試薬および検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000300295A true JP2000300295A (ja) | 2000-10-31 |
Family
ID=14570483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11111800A Pending JP2000300295A (ja) | 1999-04-20 | 1999-04-20 | エストロゲン受容体遺伝子の遺伝子多型検出用試薬および検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000300295A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006520190A (ja) * | 2003-01-21 | 2006-09-07 | マイクロニクス， インコーポレイテッド | 流体の微小流体的な操作、増幅、および分析（例えば、細菌アッセイおよびアンチグロブリン試験）のための方法およびシステム |
| WO2008049953A1 (es) | 2006-10-23 | 2008-05-02 | Neocodex, S.L. | Método de pronóstico y/o diagnóstico in vitro de hipersensibilidad a estrógenos o a sustancias con actividad estrogénica |
-
1999
- 1999-04-20 JP JP11111800A patent/JP2000300295A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006520190A (ja) * | 2003-01-21 | 2006-09-07 | マイクロニクス， インコーポレイテッド | 流体の微小流体的な操作、増幅、および分析（例えば、細菌アッセイおよびアンチグロブリン試験）のための方法およびシステム |
| WO2008049953A1 (es) | 2006-10-23 | 2008-05-02 | Neocodex, S.L. | Método de pronóstico y/o diagnóstico in vitro de hipersensibilidad a estrógenos o a sustancias con actividad estrogénica |
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| A521 | Written amendment |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051129 |