JP2000304698A - 蛍光測定方法と装置及びそれに適した基板 - Google Patents

蛍光測定方法と装置及びそれに適した基板

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JP2000304698A JP11110048A JP11004899A JP2000304698A JP 2000304698 A JP2000304698 A JP 2000304698A JP 11110048 A JP11110048 A JP 11110048A JP 11004899 A JP11004899 A JP 11004899A JP 2000304698 A JP2000304698 A JP 2000304698A
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Tomohiro Suzuki
智博 鈴木
Hisashi Okamoto
尚志 岡本
Nobuko Yamamoto
伸子 山本
Kazuhiro Matsumoto
和浩 松本
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 基板の測定面上の検体に対し励起光を照射
し、該検体より発せられた蛍光を測定する装置におい
て、励起光の効率的な除去を行なう方法を提供する。 【解決手段】 該蛍光を測定する検光部への該励起光
の進入を防ぐことが可能なように、該励起光照射部と該
検光部を設置し、該検体に対し該励起光を照射した後
に、該基板の測定面上の検体を該励起光照射部から該検
光部へ相対的に移動させて該検体からの蛍光を測定する
ことを特徴とする蛍光測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、検体の蛍光を測定
する測定方法及び装置に関するものであり、特に、ディ
スク形状の基板の表面の蛍光測定に関するものである。
さらには、本発明による蛍光測定に適した基板に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】生体試料などの微少な物質の測定におい
ては、蛍光による測定は不可欠となっている。微少量の
物質を測定する手段は、ラジオアイソトープ、核磁気共
鳴など他にも存在するが、感度、標識物質の種類の多
さ、取り扱いの容易性、汎用性、検光感度の改良、など
の理由から、蛍光法による測定は広く応用されている。
【０００３】蛍光法による測定は、可視化を目的とした
細胞や組織の染色だけでなく、定量性を持たせた測定が
可能であることから、物質の定量などに応用されてい
る。特に微量物質の検出においては、生体分子の抗原抗
体反応や、特定の塩基配列を有するＤＮＡとのハイブリ
ダイゼーションなどの特異的反応と組み合わせ、感度と
特異性の高い検出システムを構成することが可能となっ
ている。
【０００４】ところで蛍光を測定する際に必要な要素と
して、励起光の分離が挙げられる。これは、励起光が検
光部に進入しないような工夫を施し、純粋に蛍光のみを
測定するということである。
【０００５】例えば通常の正立型の蛍光顕微鏡ではダイ
クロイックミラー及びフィルターを装着し、検体より反
射または散乱してくる励起光の検光部への進入を防いで
いる。蛍光寿命測定装置では蛍光測定時にパルス状の発
光光源を使用することによって行なっており、また蛍光
分光光度計では励起光と検光部の光軸を直角にすること
により励起光の進入を軽減させている。
【０００６】これらの方法で測定することにより、大部
分の励起光は検光部に進入せず、蛍光の測定を行なうこ
とが出来る。しかし、当然のことながら、１００％励起
光の進入を防ぐことは出来ず、励起光の強度と比較すれ
ば僅かではあるが励起光の検光部への漏れが生じている
事も事実である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】比較的検体量が多く蛍
光が容易に観察される場合や、蛍光強度が十分に強い蛍
光色素を多く含んでいる場合などには、少量の励起光の
進入(漏れ光)は問題にならず測定に大きな影響は及ぼさ
ない。すなわち、発せられる蛍光の強度が漏れ光に比べ
て圧倒的に強く、漏れ光が大勢に影響を及ぼさないから
である。
【０００８】しかし、僅かな微弱光を測定する時には、
漏れ光が測定に重大な影響を及ぼすこともあり得る。場
合によっては、発せられる蛍光よりも、漏れ光の方が多
くなってしまう場合もあり得る。
【０００９】その対策として、検光部の前にバンドパス
フィルターをはさむなどの対策を施すこともあるが、測
定する蛍光が微弱であるため、フィルターを通すことに
よって本来測定すべき蛍光の光量が不足してしまうなど
の弊害も出る場合がある。
【００１０】また多くの色素は励起光と蛍光との波長が
近接している場合が多く、蛍光の短波長側の一部と励起
光の長波長側の一部が重なってしまうこともあり、波長
による厳密な分離は原理的にも困難である。
【００１１】近年、カメラの感度が大幅に上昇しホトン
カウティングレベルでの測光も可能となってきており、
励起光をより効率的に除去し微弱な蛍光の測定が可能と
なれば応用価値の高いものとなる。
【００１２】本発明は上記のような問題を解決するこ
と、すなわち励起光の効率的な除去を行なうことを目的
とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、基
板の測定面上の検体に対し励起光を照射し、該検体より
発せられた蛍光を測定する方法であって、該蛍光を測定
する検光部への該励起光の進入を防ぐことが可能なよう
に、該励起光照射部と該検光部を設置し、該検体に対し
該励起光を照射した後に、該基板の測定面上の検体を該
励起光照射部から該検光部へ相対的に移動させて該検体
からの蛍光を測定することを特徴とする蛍光測定方法に
ついてのものである。
【００１４】好ましくは、前記相対的移動により、前記
測定面上に円軌道を形成している、、前記記載の蛍光測
定方法である。
【００１５】さらに、前記基板の測定面に垂直な方向に
伸びる軸を中心に該基板を回転させることで該測定面の
回転面を形成し、前記円軌道を形成し、とりわけ前記測
定面の回転面に対して前記励起光照射部と前記検光部を
相対的に移動させる前記記載の蛍光測定方法、あるい
は、前記励起光照射部と前記検光部を回転移動させるこ
とで前記測定領域の円軌道を形成する前記記載の蛍光測
定方法が好ましい。
【００１６】前記検体が前記基板上に形成されたセルに
満たされた液体であり、あるいは前記検体が前記基板上
に固定、吸着、または捕捉された物質であり、さらに
は、前記検体が、前記基板上に配置されているプローブ
に固定されていることが好ましい。
【００１７】また、前記プローブや、前記検体が、ＤＮ
Ａ、タンパク質、ペプチド核酸(ＰＮＡ)であることが好
ましい。
【００１８】また、前記励起光照射位置と前記検光部と
の距離が可変であり、あるいは、前記検体の移動速度が
可変であり速度を変えることによって、前記励起光照射
から検光までの時間を適宜調整可能であることが好まし
い。
【００１９】また、前記基板の測定面上の検体が、該基
板の中心軸と同心をなす半径が異なる複数の円上または
その弧上に配列され、該検体が前記中心軸からの距離ご
とに同一または類似の属性をもち、互いに区別可能な検
体群を構成することが好ましい。
【００２０】また、本発明は、測定面上に蛍光測定対象
となる検体を有する基板であって、該検体が該基板の中
心軸と同心をなす半径が異なる複数の円上またはその弧
上に配列され、該検体が前記中心軸からの距離ごとに同
一または類似の属性をもち、互いに区別可能な検体群を
構成する基板についてのものである。
【００２１】さらに、本発明は、基板の測定面上の検体
に対し、励起光を照射する励起光照射部と、該検体より
発せられた蛍光を測定する検光部を有する、蛍光測定装
置であって、該検光部への該励起光の進入を防ぐことが
可能なように、該励起光照射部と該検光部が設置されて
おり、該基板の測定面上の検体を該励起光照射部から該
検光部へ相対的に移動させる手段を有することを特徴と
する蛍光測定装置についてのものであり、前記相対的に
移動させる手段として、前記検体を載せた基板を前記励
起光照射部及び検光部に対して、前記測定面上に相対的
に円軌道を形成しながら移動させる手段を有することが
好ましい。
【００２２】
【発明の実施の形態】本発明による蛍光測定手法及び装
置は、検光部を励起光が入らない場所に設置し、検体に
対し励起光を照射した後に検体を励起光照射部から検光
部に移動させることにより励起光の進入を防ぐ機構を備
えたことを特徴とする蛍光測定手法及び装置である。
【００２３】励起光の光軸と検光部の光軸は完全に異な
っており、これにより検光部への励起光の進入は原理的
に阻止可能である。しかし、基板内の反射等によるガラ
ス内伝播や散乱などの影響を考慮した場合、以下の対策
により励起光の進入阻止をより確実なものにすることが
できる。
【００２４】a)基板をガラスではなく、黒色のガラスに
する。
【００２５】b)励起光照射部と検光部を遮蔽し、空間的
に散乱光を遮る。
【００２６】c)基板表面の平面性を高め、励起光を基板
に対し垂直に照射し、基板表面の散乱を減少させる。
【００２７】また、当然のことながら、励起光照射部か
ら検光部への移動は、検体に含まれる蛍光色素等の発光
寿命の時間的範囲内に行なうことが望ましい。
【００２８】すなわち、励起光照射により励起された色
素は蛍光を発するが、時間経過に伴い蛍光強度は減少す
る。そのため、励起光照射終了後、少なくとも測定可能
な蛍光が発光している時間内に検体を検光部に移動させ
る。
【００２９】検体の移動は様々な方法がある。検体がデ
ィスクの表面に固定化された基板、あるいはディスク上
に形成されたセルに入った液状の検体などであれば、デ
ィスクを回転させる事によって容易に検体を移動でき
る。
【００３０】たとえば回転しているディスクの一ヶ所で
励起光を照射し、測定個所がディスクの回転によって移
動した後に通過する別の場所に検光部を設置し、そこで
測定を行なえば良い。検光部は励起された検体から蛍光
を発している時間内に通過する位置に設置する。ディス
クの回転を続ければ、検体は測定後に再び同じ励起光照
射場所において励起され、再度測定することが可能であ
るため、必要に応じて複数回測定を行ない結果を積算す
る事も出来る。
【００３１】検体を回転させる事が困難である場合に
は、検体をある一定の方向に直線的に移動させても良
い。この場合励起光照射部と検光部は適当な間隔をおい
て設置し、検体を回転させるときと同様に、励起光照射
後、検体が蛍光を発している時間内に検体が検光部に到
達するように移動させれば良い。
【００３２】通常は検体を移動させる方が装置の構造上
容易である事が多いが、それが困難である場合には、励
起光照射部と検光部を検体に対し移動させても良い。
【００３３】励起光照射部と検光部は複数設置すること
も可能である。例えば１箇所で励起光を照射し、複数の
場所で異なった条件で測定する事も可能であるし、測定
の時間的な効率を考えて、複数の場所で各々並列して測
定を行なう事も可能である。励起光を照射してから検体
が検光部を通過するまでの時間は、励起光照射部と検光
部の距離と検体の移動速度によって決まってくる。蛍光
を発する色素等の種類によって蛍光寿命は異なるため、
検体によって励起光照射部と検光部の距離と移動速度を
変えられるような装置であれば望ましい。
【００３４】本発明による蛍光測定方法は、近年注目さ
れている固相基板を用いた物質検出に応用出来る。固相
基板上にＤＮＡ、タンパク質等のプローブが存在する基
板を検体と作用させた後、蛍光によって検体の測定を行
なう場合には、基板上に存在する微量の蛍光物質の測定
を行なう必要がある。高感度蛍光測定を行なうために
は、励起光の効率的な除去も重要な要素であり、本発明
による測定方法によりそれも改善できる。
【００３５】また、本発明による蛍光測定装置を、上述
の基板を用いた微量測定に利用した場合、基板上の検光
部を同心円状にすることで容易に複数種のプローブによ
る測定が可能となる。すなわち、各プローブは回転中心
を中心とした円形のパターンをとり、プローブの種類に
より、異なる半径で同心円状にプローブを並べた基板を
用いればよいのである。測定に際しては、回転している
基板に対し検光部(通常は対物レンズ)を合わせ測定を行
なうが、回転中心からの半径の長さを順に変更すること
で各プローブに対応した検体の測定を行なうことが出来
る。
【００３６】
【実施例】(実施例１) (１)基板作製 直径が３０ｍｍ、厚さ０.５ｍｍの石英ガラス基板を準
備した。基板を回転できるようにするため、基板中央部
の直径１０ｍｍの部分は回転駆動の伝達ができるように
した。
【００３７】石英ガラス基板を水で軽く洗浄した後、基
板洗浄専用液に浸し２０分間超音波洗浄を行なった後、
一昼夜そのまま放置した。基板を取り出し、水及び超純
水にて洗浄液を洗い流した後、６０℃にあらかじめ加熱
した１ＭのＮaＯＨ水溶液に２０分間浸した。基板を取
り出し、水及び超純水でＮaＯＨ水溶液を洗い流し、超
純水中で２０分間超音波洗浄を行なった。
【００３８】続いて、あらかじめ１％の濃度となるよう
に水に溶解し、約１時間加水分解したシランカップリン
グ剤(信越化学工業社製、商品名ＫＢＭ６０３)に基板を
１時間浸した。超純水にて軽く洗浄した後、表面に残っ
た水滴を窒素ガスにて飛ばし乾燥させ、１２０℃のオー
ブンにて２時間ベークした。このシランカップリング剤
をガラス表面に結合させたことでガラス表面にアミノ基
が導入された。
【００３９】(２)色素の結合 続いてフナコシ製タンパク質標識用色素、eosin-5-isot
hiocyanateの１Ｍ ＮaＣl/５０ｍＭリン酸緩衝液(pＨ
７.０)溶液(濃度５０μＭ)２ｍlを用意し、ハイブリパ
ック中で基板と１０時間反応させた。反応終了後、１Ｍ
ＮaＣl/５０ｍＭリン酸緩衝液(pＨ７.０)溶液にて基
板を洗い、未反応のeosin-5-isothiocyanateを完全に洗
い流しeosinが結合した基板１を得た。
【００４０】(３)装置構成 ニコン製蛍光顕微鏡のステージ部分を改造し図１のよう
な測定装置を作製した。ステージ付近の拡大図を図２に
示す。励起光照射部分１３aと、検光部１５である顕微
鏡の対物レンズ７はディスクの中心軸をはさみ反対側に
設置してあり、中心部には基板を回転させるための回転
駆動装置を設置した。励起光照射部と検光部１５の中心
軸からの距離は可変であるが、それぞれ１２.５ｍｍと
なるように固定し、中心軸を挟んで反対側に設置した。
すなわち、励起光が照射された部分はディスクが１８０
度回転することによって検光部１５へ移動するように設
置した。(図３参照) 検光部１５である対物レンズ７から得られた光は、顕微
鏡５から延ばされた光ファイバー１１を経由して、蛍光
測定装置１２に送られ、そこで解析できるようにした。
この蛍光測定装置１２はデータの積算が可能であり、得
られる蛍光が微弱な場合には積算することで感度を高め
ることが出来る。
【００４１】(４)基板測定 先に作製した、eosinの結合した基板１を改造ステージ
に取り付けた。ディスクの回転速度を30000rpｍに設定
し、励起光は５２２nｍに設定した。
【００４２】励起光を照射した状態で測定を行ない、十
分な感度が得られるまで１０秒間測定を続け、基板から
の蛍光を積算した。その結果、図４に示すようなスペク
トルが得られた。
【００４３】励起光の波長である５２２nｍ付近には、
目立ったピークはなく、純粋にeosin由来の蛍光のみが
測定された。
【００４４】従って、本発明による蛍光測定方法により
励起光を除去して検体の蛍光測定が出来た。
【００４５】(実施例２) (１)基板作製 直径が３０ｍｍ、厚さ１ｍｍの石英ガラス基板を準備し
た。基板を回転できるようにするため、基板中央部の直
径１０ｍｍの部分は回転駆動の伝達ができるようにし
た。
【００４６】石英ガラス基板を水で軽く洗浄した後、基
板洗浄専用液に浸し２０分間超音波洗浄を行なった後、
一昼夜そのまま放置した。基板を取り出し、水及び超純
水にて洗浄液を洗い流した後、６０℃にあらかじめ加熱
した１ＭのＮaＯＨ水溶液に２０分間浸した。基板を取
り出し、水及び超純水でＮaＯＨ水溶液を洗い流し、超
純水中で２０分間超音波洗浄を行なった。
【００４７】続いて、あらかじめ１％の濃度となるよう
に水に溶解し、約１時間加水分解したシランカップリン
グ剤(信越化学工業社製、商品名ＫＢＭ６０３)に基板を
１時間浸した。超純水にて軽く洗浄した後、表面に残っ
た水滴を窒素ガスにて飛ばし乾燥させ、１２０℃のオー
ブンにて２時間ベークした。このシランカップリング剤
をガラス表面に結合させたことでガラス表面にアミノ基
が導入されたことになる。
【００４８】続いて同仁化学社製の架橋剤であるＥＭＣ
Ｓ(Ｎ-(６-Ｍaleiｍidocaproyloxy)succiniｍide)を混
合溶媒(エタノール:ＤＭＳＯ １:１)に１０ｍlあたり
３ｍgの割合で溶解させた。得られたＥＭＣＳ溶液に先
にベークしたガラス基板を浸し、２時間放置した。ＥＭ
ＣＳ溶液より基板を出し、先程と同じ混合溶媒にて軽く
洗浄を行なった後、表面の液滴をエタノールに置換し、
窒素ガスにて液滴を飛ばし乾燥した。これによりＥＭＣ
Ｓが基板全面(両面)に結合された基板(ＥＭＣＳ基板)を
得た。ＥＭＣＳはスクシイミド基とマレイミド基を有
し、スクシイミド基が基板表面のアミノ基と結合するた
め、基板表面にはマレイミド基が導入されたことにな
る。
【００４９】(２)ＤＮＡ結合 末端にチオール基(ＳＨ基)を結合させた１８ｍerの修飾
ＤＮＡ(プローブ)を、ＢＥＸ社に依頼して合成した。塩
基配列は下記に示す配列で、５'末端にＳＨ基を結合さ
せた。
【００５０】5' HS-ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ3' (配列番号１) 上記ＤＮＡを水に溶かし濃度が３０μＭになるよう調整
した。得られたＤＮＡ水溶液２ｍlを先に作製したＥＭ
ＣＳ基板とともにハイブリパックに封入し、２時間反応
を行なった。反応終了後、１Ｍ ＮaＣl/５０ｍＭリン
酸緩衝液(pＨ７.０)溶液にて基板を洗い、ガラス表面の
ＤＮＡ溶液を完全に洗い流した。その後、２％ウシ血清
アルブミン水溶液中に浸し、２時間放置し、ブロッキン
グ反応を行なった。ブロッキング反応終了後、再び、１
Ｍ ＮaＣl/５０ｍＭリン酸緩衝液(pＨ７.０)を用いて
基板を洗浄し、ＤＮＡが結合した基板を得た。
【００５１】(３)ＥＯＳIＮ標識ＤＮＡの合成 基板に結合させたＤＮＡと相補的な配列を持つ、１８ｍ
erのアミノリンクＤＮＡをＢＥＸ社に依頼して合成し
た。アミノ基は一般的な５'末端ヘキサメチレンタイプ
のアミノリンカーを用いた。
【００５２】アミノリンクＤＮＡにフナコシ製タンパク
質標識用色素、eosin-5-isothiocyanateを作用させ５'
末端にeosinが結合した標識ＤＮＡを得た。標識反応は
定法に従って行なった。
【００５３】(４)ハイブリダイゼーション eosin標識ＤＮＡを１Ｍ ＮaＣl/５０ｍＭリン酸緩衝液
(pＨ７.０)に最終濃度１μＭとなるように溶解し、得ら
れた溶液２ｍlを基板とともにハイブリパックに封入
し、ハイブリダイゼーション反応を３時間行なった。
【００５４】その後、基板を１Ｍ ＮaＣl/５０ｍＭリ
ン酸緩衝液(pＨ７.０)溶液にて洗い流し測定対象である
基板１を得た。
【００５５】(５)基板測定 実施例１で用いた測定装置を用いて、得られた基板１の
測定を行なった。ディスクの回転速度は実施例１と同様
30000rpｍにセットし、励起光は５２２nｍに設定した。
【００５６】励起光を照射した状態で測定を行ない、十
分な感度が得られるまで１０秒間測定を続け、基板から
の蛍光を積算した。その結果、実施例１で得られたスペ
クトル(図４)と同じ結果が得られた。
【００５７】実施例１と同様、励起光の波長である５２
２nｍ付近には、目立ったピークはなく、純粋にeosin由
来の蛍光のみが測定された。本発明による蛍光測定方法
により励起光を除去して検体の蛍光測定が出来た。
【００５８】(実施例３) (１)基板作製 ＥＭＣＳが基板全面に塗布されたＥＭＣＳ基板の作製ま
では、実施例２の(１)と同様に行ない、直径３０ｍｍの
基板を得た。
【００５９】(２)ＤＮＡ結合 末端にチオール基(ＳＨ基)を結合させた１８ｍerの修飾
ＤＮＡ(プローブ)を、ＢＥＸ社に依頼して合成した。塩
基配列は下記に示す配列で、５'末端にＳＨ基を結合さ
せた。 No.1:5'HS-ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ3' (配列番号１) No.2:5'HS-ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＴＧＴＴＴＴＡＣＡ3' (配列番号２) No.3:5'HS-ＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＡＣＡ3' (配列番号３) No.4:5'HS-ＡＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＧＴＴＴＡＣＡ3' (配列番号４) 上記ＤＮＡをＢＪプリンター用溶媒であるＳＧクリア
(グリセリン７.５％、尿素７.５％、チオジグリコール
７.５％、アセチレノールＥＨ１％を含む水溶液)に溶解
し、最終濃度８μＭになるよう調整してＢＪプリンター
用カートリッジに充填した。ＢＪプリンターを使用し４
種のプローブ１６は図５に示すようなパターンで配置し
た。すなわち、半径１４ｍｍの円周上にＮo.１プローブ
を並べ、半径１３ｍｍの円周上にはＮo.２、１２ｍｍに
はＮo.３、１１ｍｍにはＮo.４を並べた。
【００６０】その後、ＤＮＡ溶液がのった状態で基板を
３０分間加湿チャンバー中に放置し、基板とＤＮＡとの
反応を行なった。
【００６１】なお、ＢＪプリンターは平板印刷が可能な
キヤノン製ＢＪプリンターＢＪＣ-６００の改造機を使
用した。
【００６２】反応終了後、１Ｍ ＮaＣl/５０ｍＭリン
酸緩衝液(pＨ７.０)溶液にて基板を洗い、ガラス表面の
ＤＮＡ溶液を完全に洗い流した。その後、２％ウシ血清
アルブミン水溶液中に浸し、２時間放置し、ブロッキン
グ反応を行なった。ブロッキング反応終了後、再び、１
Ｍ ＮaＣl/５０ｍＭリン酸緩衝液(pＨ７.０)を用いて
基板を洗浄し、４種のＤＮＡが同心円状に結合した基板
を得た。
【００６３】(３)eosin標識ＤＮＡの合成 基板に結合させたＮo.１のプローブＤＮＡと相補的な配
列を持つ、１８ｍerのアミノリンクＤＮＡをＢＥＸ社に
依頼して合成した。アミノ基は通常の５'末端ヘキサメ
チレンタイプのアミノリンカーを用いた。
【００６４】アミノリンクＤＮＡにフナコシ製タンパク
質標識用色素、eosin-5-isothiocyanateを作用させ５'
末端にeosinが結合した標識ＤＮＡを得た。標識反応は
定法に従って行なった。
【００６５】(４)ハイブリダイゼーション 実施例２の(４)と同様に行なった。
【００６６】(５)基板測定 実施例１で用いた測定装置を用いて、得られた基板１の
測定を行なった。ディスクの回転速度は実施例１と同様
30000rpｍにセットし、励起光は５２２nｍに設定した。
【００６７】ディスクを回転させた状態で励起光照射位
置１３aと対物レンズ７の位置を適宜設定し、プローブ
１６を結合させた部分の蛍光スペクトルを、各プローブ
ごとに順に測定した。その結果、Ｎo.４を除く３つのプ
ローブから蛍光スペクトルが測定された。
【００６８】極大である５６０nｍの蛍光強度を測定す
ると、Ｎo.１が２３００、Ｎo.２が１４００、Ｎo.３が
１０００の蛍光強度であった。
【００６９】この結果は塩基配列が一致しているものほ
ど傾向が強くなるという結果となっており、本発明によ
る蛍光測定装置と、プローブを同心円状に並べた基板に
よって核酸の塩基配列の解析が出来ることが示された。
【００７０】
【発明の効果】本発明による蛍光測定方法は、複雑な装
置構成を必要とせずに励起光の除去が出来るという利点
を持つ。検光部は励起光の進入し得ない場所に設置され
ているため、完全な励起光の除去が可能となる。
【００７１】また本発明の蛍光測定装置に供する検体の
形態としてディスク状の基板があるが、基板上に複数の
プローブを並べる方式として、回転の中心軸を中心とし
た半径の異なる同心円状に並べることで、容易に複数の
プローブによる検体の測定が可能となった。
【００７２】
【配列表】 配列番号:１ 配列の長さ:１８ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACTGGCCGTC GTTTTACA 18
【００７３】 配列番号:２ 配列の長さ:１８ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACTGGCCGTT GTTTTACA 18
【００７４】 配列番号:３ 配列の長さ:１８ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACTGGCCGCT TTTTTACA 18
【００７５】 配列番号:４ 配列の長さ:１８ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACTGGCATCT TGTTTACA 18
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明により提供された蛍光測定装置の図であ
る。
【図２】ステージ部分の拡大図である。
【図３】励起光照射部と検光部との位置関係を示した図
である。
【図４】蛍光測定装置より得られた検体の蛍光スペクト
ル。
【図５】４種のプローブが同心円状にならんだ基板を示
す図である。
【符号の説明】
１ 基板 １a 回転駆動伝達部 ５ 顕微鏡 ７ 対物レンズ １１ 光ファイバーケーブル １２ 蛍光測定装置 １３ 光源及びステージ １３a 励起光照射部 １３b 水平駆動ステージ １４ ディスク駆動ステージ １４a 回転駆動ステージ １４b 水平駆動ステージ １５ 検光部 １６ プローブ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山本 伸子 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 松本 和浩 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 CA07 DA02 DA05 EA01 FA01 FA02 FA03 GA04 GA07 GB01 GB19 HA01 HA05 LA01 MA01 MA11 2G045 DA12 DA13 DA14 DA36 FA11 FB02 FB12 GC15 HA14 JA07

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 基板の測定面上の検体に対し励起光を照
    射し、該検体より発せられた蛍光を測定する方法であっ
    て、 該蛍光を測定する検光部への該励起光の進入を防ぐこと
    が可能なように、該励起光照射部と該検光部を設置し、 該検体に対し該励起光を照射した後に、該基板の測定面
    上の検体を該励起光照射部から該検光部へ相対的に移動
    させて該検体からの蛍光を測定することを特徴とする蛍
    光測定方法。
  2. 【請求項２】 前記相対的移動により、前記測定面上に
    円軌道を形成している、請求項１記載の蛍光測定方法。
  3. 【請求項３】 前記基板の測定面に垂直な方向に伸びる
    軸を中心に該基板を回転させることで該測定面の回転面
    を形成し、前記円軌道を形成する請求項２に記載の測定
    方法。
  4. 【請求項４】 前記測定面の回転面に対して前記励起光
    照射部と前記検光部を相対的に移動させる請求項３に記
    載の測定方法。
  5. 【請求項５】 前記励起光照射部と前記検光部を回転移
    動させることで前記測定領域の円軌道を形成する請求項
    ２に記載の測定方法。
  6. 【請求項６】 前記検体が前記基板上に形成されたセル
    に満たされた液体である請求項２〜５のいずれかに記載
    の蛍光測定方法。
  7. 【請求項７】 前記検体が前記基板上に固定、吸着、ま
    たは捕捉された物質である請求項２〜５のいずれかに記
    載の蛍光測定方法。
  8. 【請求項８】 前記検体がＤＮＡである請求項２〜７の
    いずれかに記載の蛍光測定方法。
  9. 【請求項９】 前記検体がタンパク質である請求項２〜
    ７のいずれかに記載の蛍光測定方法。
  10. 【請求項１０】 前記検体がペプチド核酸である請求項
    ２〜７のいずれかに記載の蛍光測定方法。
  11. 【請求項１１】 前記検体が、前記基板上に配置されて
    いるプローブに固定されている請求項２〜１０のいずれ
    かに記載の蛍光測定方法。
  12. 【請求項１２】 前記プローブがＤＮＡである請求項１
    １に記載の蛍光測定方法。
  13. 【請求項１３】 前記プローブがタンパク質である請求
    項１１に記載の蛍光測定方法。
  14. 【請求項１４】 前記プローブがペプチド核酸である請
    求項１１に記載の蛍光測定方法。
  15. 【請求項１５】 前記励起光照射位置と前記検光部との
    距離が可変であり、前記励起光照射から検光までの時間
    を適宜調整可能な請求項１〜１４のいずれかに記載の蛍
    光測定方法。
  16. 【請求項１６】 前記検体の移動速度が可変であり、速
    度を変えることによって前記励起光照射から前記検光ま
    での時間を適宜調整可能な請求項１〜１４のいずれかに
    記載の蛍光測定方法。
  17. 【請求項１７】 前記基板の測定面上の検体が、該基板
    の中心軸と同心をなす半径が異なる複数の円上またはそ
    の弧上に配列され、該検体が前記中心軸からの距離ごと
    に同一または類似の属性をもち、互いに区別可能な検体
    群を構成する、請求項２〜１６のいずれかに記載の蛍光
    測定方法。
  18. 【請求項１８】 測定面上に蛍光測定対象となる検体を
    有する基板であって、該検体が該基板の中心軸と同心を
    なす半径が異なる複数の円上またはその弧上に配列さ
    れ、該検体が前記中心軸からの距離ごとに同一または類
    似の属性をもち、互いに区別可能な検体群を構成する、
    請求項２〜１７のいずれかに記載の蛍光測定方法に適用
    される基板。
  19. 【請求項１９】 基板の測定面上の検体に対し、励起光
    を照射する励起光照射部と、該検体より発せられた蛍光
    を測定する検光部を有する、蛍光測定装置であって、 該検光部への該励起光の進入を防ぐことが可能なよう
    に、該励起光照射部と該検光部が設置されており、 該基板の測定面上の検体を該励起光照射部から該検光部
    へ相対的に移動させる手段を有することを特徴とする蛍
    光測定装置。
  20. 【請求項２０】 前記相対的に移動させる手段として、
    前記検体を載せた基板を前記励起光照射部及び検光部に
    対して、前記測定面上に相対的に円軌道を形成しながら
    移動させる手段を有する、請求項１９記載の蛍光測定装
    置。
  21. 【請求項２１】 前記測定面上に相対的に円軌道を形成
    しながら移動させる手段として、前記基板の測定面に垂
    直な方向に伸びる軸を中心に該基板を回転させることで
    該測定面の回転面を形成する手段を有する請求項２０に
    記載の測定装置。
  22. 【請求項２２】 前記測定面の回転面に対して前記励起
    光照射部及び検光部を相対的に移動させる手段を有する
    請求項２１に記載の測定装置。
  23. 【請求項２３】 前記測定面上に相対的に円軌道を形成
    しながら移動させる手段として、前記検出器を回転移動
    させる手段を有する請求項２０に記載の測定装置。
  24. 【請求項２４】 前記励起光照射位置と前記検光部との
    距離を変える手段を有し、それにより前記励起光照射か
    ら検光までの時間を適宜調整可能な請求項１９〜２３の
    いずれかに記載の蛍光測定装置。
  25. 【請求項２５】 前記検体の移動速度を変える手段を有
    し、それにより、前記励起光照射から前記検光までの時
    間を適宜調整可能な請求項１９〜２３のいずれかに記載
    の蛍光測定装置。
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