JP2000304749A - 特異結合免疫分析容器 - Google Patents

特異結合免疫分析容器

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JP2000304749A
JP2000304749A JP11146799A JP11146799A JP2000304749A JP 2000304749 A JP2000304749 A JP 2000304749A JP 11146799 A JP11146799 A JP 11146799A JP 11146799 A JP11146799 A JP 11146799A JP 2000304749 A JP2000304749 A JP 2000304749A
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Japan
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functional group
adsorption
low
specific binding
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JP11146799A
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Hayao Tanaka
速雄 田中
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Sumitomo Bakelite Co Ltd
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Sumitomo Bakelite Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 感度、再現性、信頼性に優れた免疫測定を行
うことが出来る免疫測定用容器を提供する。 【解決手段】 分析に用いられる分子に対して低吸着性
である材料で成形され、及び/又は表面を覆われている
基材を使用し該表面に生成させた固相を行う分子との結
合が可能な官能基を官能基を利用して固相化させる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗原抗体反応を利
用して抗体、又は抗原を検出する免疫分析の内、抗原、
又は抗体等の分子を容器に固相化して測定を行う固相法
に用いる容器の材質及び表面処理に関するものである。
【0002】
【従来の技術】従来の固相法による免疫測定において
は、ポリスチレン等のプラスチック基材に非特異的吸着
を利用して抗体又は抗原等の分子を固相化し、固相化し
た分子に対して免疫反応を利用してサンプル溶液中の目
的の分子を捕捉させ、最終的にラジオアイソトープ、酵
素、蛍光物質等で標識した分子を目的の分子に特異的に
捕捉させて定量する方法が一般的に行われている。しか
し、そのように非特異的吸着を利用した方法では固相化
以降の分子も基材に吸着してしまうため、本来特異的な
抗原抗体反応で捕捉された分子の量だけをシグナルとし
てとらえるべきところが、非特異的吸着により基材に残
留した夾雑物の量がノイズとして出てきてしまう。
【0003】そこで、一般的にはブロッキングといっ
た、夾雑物の吸着を防止する作業が必要である。ブロッ
キングとは、固相化後の表面に、吸着し易く系に影響を
及ぼさない蛋白を接触させて固相化されていない部分を
マスキングする作業である。しかし、蛋白溶液の僅かな
pHの変動、気温、湿度の影響によりブロッキングの効
果は変化し、測定毎にバックグラウンドの値がばらつい
てしまい一定の結果が得られないこと、及びブロッキン
グに用いた蛋白に対する夾雑物の吸着が存在することか
ら結果的には完全にノイズを抑えることは出来ず、更に
再現性のあるデータを得ることも出来ない。また、従来
の非特異的吸着による固相化のもう一つの問題点は固相
分子の脱離によるシグナルの低減及びばらつきの発生で
ある。
【0004】特に、臨床検査用として用いる場合、検査
時に固相化から用事行うのではなく、固相化分子を基材
に固相した状態のものを一度に大量に作成し、保存して
おき、検査時にはすでに固相化している基材を取り出し
て使用されるのが一般的であるが、非特異的吸着により
固相化された分子は安定な状態で担体に保持されている
とは言えず、保存状況によっては担体から脱離してしま
い、経時的にばらつきを発生する事が多く、その結果得
られたデータの再現性及び信頼性が問題となってしま
う。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述のよう
な従来の問題点を解決すべく鋭意検討の結果なされたも
ので、高いシグナル/ノイズ比が得られ、且つ固相化抗
体の脱離によるばらつきの発生が無い、精度及び信頼性
の高い測定を行うことがる出来る免疫分析容器の提供を
目的とするものである。
【0006】
【課題を解決するための手段】即ち本発明は、分析に用
いられる分子に対して低吸着性である材料で成形され、
及び/又は表面を覆われている基材表面は固相を行う分
子との結合が可能な官能基を有することを特徴とする特
異結合免疫分析容器に関するものである。
【0007】
【発明の実施の形態】本発明の免疫測定用基材は、分析
に用いられる分子に対して低吸着性である材料で成形さ
れ、及び/又は表面を覆われている基材表面に固相を行
う分子との結合が可能な官能基を生成させている点が特
徴であり、最初に固相化分子を官能基と結合させた後
は、分子が基材表面に非特異的により多量に吸着するこ
とは無く目的の分子のみが特異的な免疫反応により基材
表面に捕捉され、結果として高感度で安定した結果を得
ることが出来る。
【0008】よって本発明においては従来のブロッキン
グと言った工程も不要である。ここで、感度、安定性に
最も優れているのは、目的以外の分子の非特異的吸着が
全く起こらない表面であるが、実際には測定可能なシグ
ナル/ノイズ比が得られれば問題は無く、そのためには
ノイズとなる分子の吸着がシグナル分子の1/5乃至1
/10以下であれば良い、一般的には固相化法による免
疫測定を行う場合、固相化分子の固相化量は、5×10
-3nmol/cm2程度であるため、分子の非特異的な
吸着は1×10-1pmol/cm2以下で有れば問題は
ない。
【0009】分析に用いる分子に対して低吸着性である
表面を得るために使用する材料としては、親水性の高分
子であるポリヒドロキシエチルメタクリレート(PHE
MA)、プロピオン酸エステルポリマー又はポリテトラ
フルオロエチレン(PTFE)等の高分子が挙げられる
又、ポリスチレンの様に非特異的吸着の起こりやすい材
料を使用する場合には、プラズマ暴露によるカルボキシ
ル基及び/または水酸基の導入、ポリメチルメタクリレ
ートを使用する場合であればアルカリによる表面部分加
水分解でカルボキシル基を導入する等の表面改質による
親水化で低吸着性である表面を得ることが出来る。また
低吸着性である材料を基材の表面にコーティングしても
良い。基材表面に有する固相を行う分子との結合が可能
な官能基は特に限定するものではないが、基材表面に有
する官能基がアミノ基である場合は、分子内にアミノ基
を有する固相化分子であればグルタルアルデヒドを介し
て固相化する事が出来、又、分子内にカルボキシル基を
有する固相化分子であればカルボジイミドを利用して固
相化する事が出来る。
【0010】基材表面に有する官能基がカルボキシル基
である場合は、分子内にアミノ基を有する固相化分子で
あれば、カルボジイミドを利用して固相化する事が出来
る。基材表面に官能基を付与する方法としては、一般的
に行われているプラズマ暴露による官能基付与の方法を
用いることが出来る。例えば、アンモニアプラズマ又は
窒素と酸素の混合プラズマによってアミノ基を付与する
ことが出来、アルゴン、ヘリウム等の不活性ガスのプラ
ズマ又は、酸素プラズマによってカルボキシル基を導入
することが出来る。以下、実施例によって本発明を更に
具体的に説明する。
【0011】
【実施例】(実施例1)市販のポリスチレン製96穴E
LISA用プレート(住友ベークライト製 MS−84
96F)表面にポリヒドロキシエチルメタクリレートを
コーティングした後、窒素と酸素の混合プラズマで15
分処理を行い、基材表面に水酸基とアミノ基を生成させ
たものを実施例1とした。 (実施例2)96穴マイクロプレートをポリメチルメタ
クリレートで成形、成形後ウェルに2Nの水酸化ナトリ
ウムを分注、50℃で10時間処理して表面部分加水分
解を行い、親水化した後更に酸素プラズマ処理により表
面にカルボキシル基を生成させたものを実施例2とし
た。
【0012】(比較例1)市販のポリスチレン製96穴
ELISA用プレート(住友ベークライト製 MS−8
496F)を比較例1として用いた。 (非特異的吸着性の比較)非特異的吸着性を比較するた
め、酵素で標識した抗ヒトIgG抗体(コスモバイオ
製)を100ng/ml、1μg/ml、10μg/m
l、100μg/mlの濃度系列で、各濃度を24ウェ
ルづつ分注し、3時間吸着させた。尚、実施例1及び実
施例2のプレートについては、予めアミノ基又はカルボ
キシル基を失活させてから検討に用いた。標識酵素は、
ペルオキシターゼを用いて、吸光度から吸着量を求め、
ウェルと溶液の接触面積から密度として算出した。結果
は、図1の通りで、実施例1、実施例2のプレートとも
に比較例に比べ非特異的吸着性が低下していることを確
認した。
【0013】
【図1】
【0014】(免疫測定感度の比較)免疫測定感度の比
較として、固相化抗体として抗ラットアルブミン抗体、
測定抗原としてラットアルブミン、標識抗体としてペル
オキシターゼ標識抗ラットアルブミン抗体を用いて免疫
測定を行った。各プレートの測定法は下記の通り。
【0015】(実施例3)プレートの各ウェルに、pH
7.4のリン酸緩衝液で2%に希釈したグルタルアルデ
ヒド(電子顕微鏡用20% 和光純薬製)を200μL
/ウェルで分注し、37℃で2時間静置した。次に、洗
浄液(0.05%Tween20入りpH7.4のリン
酸緩衝液)300μL/ウェルで3回洗浄した後に、p
H7.4のリン酸緩衝液で5μg/mlに希釈した抗ラ
ットアルブミン抗体(コスモバイオ製)を200μL/
ウェルで分注し37℃で2時間静置した。次に、洗浄液
300μL/ウェルで3回洗浄した後に、ラットアルブ
ミン(コスモバイオ製)を1μg/ml、0.5μg/
ml、0.25μg/ml、0.125μg/mlの濃
度系列で各濃度24ウェルづつ100μL/ウェルで分
注し、室温で1時間静置した。次に洗浄液300μL/
ウェルで3回洗浄した後に、pH7.4のリン酸緩衝液
で2μg/mlに希釈したペルオキシターゼ標識抗ラッ
トアルブミン抗体(コスモバイオ製)を200μL/ウ
ェルで分注し、室温で1時間静置した。次に洗浄液30
0μL/ウェルで3回洗浄した後に、発色キット(ペル
オキシターゼ用発色キットT 住友ベークライト製)を
使用して発色、プレートリーダーで450nmの波長の
吸光度を測定した。
【0016】(実施例4)プレートの各ウェルに、pH
5.8のリン酸緩衝液で10%に調製した水溶性カルボ
ジイミド(和光純薬製)を200μL/ウェルで分注
し、37℃で1時間静置した。以降、抗体分注から発色
まで前記実施例3と同条件にて実施。 (比較例2)pH7.4のリン酸緩衝液で5μg/ml
に希釈した抗ラットアルブミン抗体(コスモバイオ製)
を200μL/ウェルで分注し、4℃で20時間静置し
た。次に、洗浄液300μL/ウェルで3回洗浄した後
に、ブロッキング剤(スキムミルクをpH7.4のリン
酸緩衝液で5%に調製)200μL/ウェルで分注し、
室温で2時間静置した。以降アルブミン分注から発色ま
で前記実施例3と同条件にて実施した。結果は図2の通
りで、実施例3及び4共に比較例2と比べてアルブミン
濃度に対する吸光度値に直線性が得られ、各濃度におけ
る24ウェルのデータの変動係数(CV%)も低く、安
定していた。
【0017】
【図2】
【0018】
【発明の効果】本発明の免疫測定用基材は、分析に用い
られる分子に対して低吸着性である材料で成形され、及
び/又は表面を覆われている基材表面に固相を行う分子
との結合が可能な官能基を有することにより、目的以外
の分子が測定系に残留して結果に影響を及ぼすことな
く、高感度、安定な免疫測定が可能になる。また、固相
化分子は共有結合により固相化されるため、固相化後も
安定であり、分子を固相化した状態で保存した基材を用
いても優れた再現性が得られる。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 分析に用いられる分子に対して低吸着性
    である材料で成形され、及び/又は表面を覆われている
    基材表面は固相を行う分子との結合が可能な官能基を有
    することを特徴とする特異結合免疫分析容器。
  2. 【請求項2】 低吸着性である基材表面と官能基を繋ぐ
    分子鎖が加水分解を受けない請求項1記載の特異結合免
    疫分析容器。
  3. 【請求項3】 低吸着性である材料の吸着が1×10-1
    pmol/cm2以下である請求項1又は2記載の特異
    結合免疫分析容器。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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