JP2000309532A - 抗リウマチ剤 - Google Patents
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Landscapes
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ヒトの免疫性疾患であるリウマチの改善、治
療、予防のために、経口摂取が可能でマクロファージや
単球等の酸化、還元状態を抑制し得る斬新な方法によ
り、リウマチの治療、改善、予防を目的とした抗リウマ
チ剤、特に医薬品や飲食品、栄養剤、輸液製剤等の形態
でも使用可能な抗リウマチ剤を開発する。 【解決手段】マクロファージ細胞内の還元型グルタチオ
ン量を減少させることによりＩＬ−１２産生、ＮＯ産生
及びＩＦＮγ産生を抑制し、遅延型過敏症反応を抑制す
る作用を有する物質をその成分として使用することによ
り上記課題を解決する。免疫性疾患である慢性関節リウ
マチ等リウマチの治療、改善、予防を目的とし、経口摂
取を可能とする抗リウマチ剤を提供することができ、医
薬品や飲食品、栄養剤、輸液製剤等の形態でも使用可能
である。特に、シスチン誘導体の様にジスルフィド結合
を分子内に有する化合物を上記成分として使用すること
が好ましい。
療、予防のために、経口摂取が可能でマクロファージや
単球等の酸化、還元状態を抑制し得る斬新な方法によ
り、リウマチの治療、改善、予防を目的とした抗リウマ
チ剤、特に医薬品や飲食品、栄養剤、輸液製剤等の形態
でも使用可能な抗リウマチ剤を開発する。 【解決手段】マクロファージ細胞内の還元型グルタチオ
ン量を減少させることによりＩＬ−１２産生、ＮＯ産生
及びＩＦＮγ産生を抑制し、遅延型過敏症反応を抑制す
る作用を有する物質をその成分として使用することによ
り上記課題を解決する。免疫性疾患である慢性関節リウ
マチ等リウマチの治療、改善、予防を目的とし、経口摂
取を可能とする抗リウマチ剤を提供することができ、医
薬品や飲食品、栄養剤、輸液製剤等の形態でも使用可能
である。特に、シスチン誘導体の様にジスルフィド結合
を分子内に有する化合物を上記成分として使用すること
が好ましい。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規抗リウマチ剤、詳
しくはマクロファージ（以下、Ｍφと略することもあ
る。）や、単球等の機能の斬新な制御作用を含み、リウ
マチ特に、ヒトのリウマチ性関節炎の治療、病態改善、
予防を目的とした経口摂取可能な特定の成分を含有する
抗リウマチ剤、特に医薬品、並びに飲食品（医療用飲食
品、健康食品、特定保健食品等を含む。）、栄養剤及び
輸液製剤等の形態にある抗リウマチ剤に関する。
しくはマクロファージ（以下、Ｍφと略することもあ
る。）や、単球等の機能の斬新な制御作用を含み、リウ
マチ特に、ヒトのリウマチ性関節炎の治療、病態改善、
予防を目的とした経口摂取可能な特定の成分を含有する
抗リウマチ剤、特に医薬品、並びに飲食品（医療用飲食
品、健康食品、特定保健食品等を含む。）、栄養剤及び
輸液製剤等の形態にある抗リウマチ剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫系は、ウイルス、細菌等の外部から
の感染、又は自己由来細胞が異常を来たすことで生成す
る細胞（癌細胞等）による生体侵襲から自己を防衛する
ためのシステムである。しかしながら、この免疫系が異
常を来たし、過剰に働いたり、自己成分を排除する方向
に免疫系が働いたりすると共に、逆に、排除機能が不全
状態に陥ることがある。このような状態を惹起する疾患
は総称して免疫性疾患と呼ばれる。例えばアトピー性皮
膚炎、花粉症、喘息、ザルコイドーシス等の急性並びに
慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患、慢性関節リウマ
チ、糖尿病（ＩＤＤＭ，ＮＩＤＤＭ）、ＳＬＥ、慢性疲
労性症候群（ＣＦＳ）等の自己免疫疾患や、肝炎、肝硬
変、潰瘍性大腸炎、クローン病等炎症性腸疾患（ＩＢ
Ｄ）、癌悪液質状態等数多くの疾患が含まれる。これら
免疫性疾患の原因は様々であるが、サイトカイン、炎症
性メディエーターの局所での産生を介して、特定の細胞
の増殖、分化、壊死を伴う炎症を引き起こすことを発端
として全身性の免疫不全、免疫異常、機能不全状態に至
る。
の感染、又は自己由来細胞が異常を来たすことで生成す
る細胞（癌細胞等）による生体侵襲から自己を防衛する
ためのシステムである。しかしながら、この免疫系が異
常を来たし、過剰に働いたり、自己成分を排除する方向
に免疫系が働いたりすると共に、逆に、排除機能が不全
状態に陥ることがある。このような状態を惹起する疾患
は総称して免疫性疾患と呼ばれる。例えばアトピー性皮
膚炎、花粉症、喘息、ザルコイドーシス等の急性並びに
慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患、慢性関節リウマ
チ、糖尿病（ＩＤＤＭ，ＮＩＤＤＭ）、ＳＬＥ、慢性疲
労性症候群（ＣＦＳ）等の自己免疫疾患や、肝炎、肝硬
変、潰瘍性大腸炎、クローン病等炎症性腸疾患（ＩＢ
Ｄ）、癌悪液質状態等数多くの疾患が含まれる。これら
免疫性疾患の原因は様々であるが、サイトカイン、炎症
性メディエーターの局所での産生を介して、特定の細胞
の増殖、分化、壊死を伴う炎症を引き起こすことを発端
として全身性の免疫不全、免疫異常、機能不全状態に至
る。
【０００３】免疫を担当する細胞としてはＴリンパ球、
Ｂリンパ球が良く知られ、各々細胞性免疫、液性免疫の
担い手として多彩な機能を発揮する。一方、マクロファ
ージ／単球等は細胞性免疫及び液性免疫に深く関与する
細胞で、アレルギー、リウマチ等の免疫性疾患、癌、細
菌感染等の非自己である異物排除に深く関わっている。
マクロファージ／単球等の機能は、分泌機能、抗原呈示
を中心とした免疫調節機能、異物、老廃物の処理、貪食
機能、標的細胞の障害処理機能の４種に大別され、ＴＮ
Ｆ、ＩＬ（インターロイキン）−１２、ＩＬ−１、ＩＬ
−６、ＴＧＦβ、ＩＬ−８、ＩＬ−１８等のサイトカイ
ン、ネオプテリン（ＮＰＴ）、ジハイドロキシエピアン
ドロステン（ＤＨＥＡ）等のホルモン様分子、ＰＧＥ２
やＬＴＢ４等のアラキドン酸代謝産物、Ｃ５ａ，Ｃ３等
の補体系分子、活性酸素、活性窒素等、炎症像を規定す
る種々の分子を産生することが知られている。これらの
多彩な機能が単一のマクロファージ／単球等によって担
われているのか、機能を異にするマクロファージ／単球
等集団によって担われているのかは不明であり、リンパ
球がその細胞表面マーカーによって分類されその機能と
の対応が明確になっているのに対し、マクロファージ／
単球等の機能の多様性と細胞亜集団の対応については全
く不明である。このため、上述のような炎症性、アレル
ギー性、免疫性疾患の発症と病態進展に、マクロファー
ジ／単球等は極めて重要な役割を有しているにも拘ら
ず、マクロファージ／単球等の細胞亜集団の存在を想定
しての機能分類のヒトの疾患の診断、治療、病態改善、
予防への応用は全く為されておらず、想定されたことす
らなかった。
Ｂリンパ球が良く知られ、各々細胞性免疫、液性免疫の
担い手として多彩な機能を発揮する。一方、マクロファ
ージ／単球等は細胞性免疫及び液性免疫に深く関与する
細胞で、アレルギー、リウマチ等の免疫性疾患、癌、細
菌感染等の非自己である異物排除に深く関わっている。
マクロファージ／単球等の機能は、分泌機能、抗原呈示
を中心とした免疫調節機能、異物、老廃物の処理、貪食
機能、標的細胞の障害処理機能の４種に大別され、ＴＮ
Ｆ、ＩＬ（インターロイキン）−１２、ＩＬ−１、ＩＬ
−６、ＴＧＦβ、ＩＬ−８、ＩＬ−１８等のサイトカイ
ン、ネオプテリン（ＮＰＴ）、ジハイドロキシエピアン
ドロステン（ＤＨＥＡ）等のホルモン様分子、ＰＧＥ２
やＬＴＢ４等のアラキドン酸代謝産物、Ｃ５ａ，Ｃ３等
の補体系分子、活性酸素、活性窒素等、炎症像を規定す
る種々の分子を産生することが知られている。これらの
多彩な機能が単一のマクロファージ／単球等によって担
われているのか、機能を異にするマクロファージ／単球
等集団によって担われているのかは不明であり、リンパ
球がその細胞表面マーカーによって分類されその機能と
の対応が明確になっているのに対し、マクロファージ／
単球等の機能の多様性と細胞亜集団の対応については全
く不明である。このため、上述のような炎症性、アレル
ギー性、免疫性疾患の発症と病態進展に、マクロファー
ジ／単球等は極めて重要な役割を有しているにも拘ら
ず、マクロファージ／単球等の細胞亜集団の存在を想定
しての機能分類のヒトの疾患の診断、治療、病態改善、
予防への応用は全く為されておらず、想定されたことす
らなかった。
【０００４】近年、アレルギー疾患、慢性関節リウマチ
等の自己免疫性疾患や悪性腫瘍患者において、末梢血中
のヘルパーＴ細胞亜集団のタイプの片寄りが疾患と対応
づけられつつあり、Ｔリンパ球中の亜集団であるヘルパ
ーＴリンパ球が更に２つの亜集団Ｔｈ１とＴｈ２に分類
され、その２種の存在比が生体の免疫機能の重要な指標
になることが立証されつつある。本指標を基に疾患の病
態を診断したり、その存在比を改善することにより、よ
り適切な治療法を樹立しようとの試みがなされつつあ
る。即ち、Ｂ細胞からのＩｇＥ産生を引き起こすＴｈ２
がＴｈ１より多い場合（Ｔｈ１＜Ｔｈ２）、アレルギー
性疾患が悪化することが分かってきており、Ｔｈ１／Ｔ
ｈ２を測定することにより、免疫の状態を検定したり、
Ｔｈ１＞Ｔｈ２にすることによりアレルギーを抑制しよ
うとする試みがなされつつある。逆に、Ｔｈ１が支配的
な状況で引き起こされる疾患の存在も次々に指摘されつ
つある。
等の自己免疫性疾患や悪性腫瘍患者において、末梢血中
のヘルパーＴ細胞亜集団のタイプの片寄りが疾患と対応
づけられつつあり、Ｔリンパ球中の亜集団であるヘルパ
ーＴリンパ球が更に２つの亜集団Ｔｈ１とＴｈ２に分類
され、その２種の存在比が生体の免疫機能の重要な指標
になることが立証されつつある。本指標を基に疾患の病
態を診断したり、その存在比を改善することにより、よ
り適切な治療法を樹立しようとの試みがなされつつあ
る。即ち、Ｂ細胞からのＩｇＥ産生を引き起こすＴｈ２
がＴｈ１より多い場合（Ｔｈ１＜Ｔｈ２）、アレルギー
性疾患が悪化することが分かってきており、Ｔｈ１／Ｔ
ｈ２を測定することにより、免疫の状態を検定したり、
Ｔｈ１＞Ｔｈ２にすることによりアレルギーを抑制しよ
うとする試みがなされつつある。逆に、Ｔｈ１が支配的
な状況で引き起こされる疾患の存在も次々に指摘されつ
つある。
【０００５】
【本発明が解決しようとする課題】生物材料を用いてＴ
ｈ１とＴｈ２のバランスを測定し、Ｔリンパ球を標的に
この２つの亜集団の機能を調節しようとしても、局所慢
性炎症やアレルギー性疾患の検定、診断に利用すること
には、現在のところ成功していない。最近、Ｔｈ１病や
Ｔｈ２病という用語も用いられるが、必ずしも２者に明
確に区別できないのが実態である。
ｈ１とＴｈ２のバランスを測定し、Ｔリンパ球を標的に
この２つの亜集団の機能を調節しようとしても、局所慢
性炎症やアレルギー性疾患の検定、診断に利用すること
には、現在のところ成功していない。最近、Ｔｈ１病や
Ｔｈ２病という用語も用いられるが、必ずしも２者に明
確に区別できないのが実態である。
【０００６】Ｔｈ１／Ｔｈ２の存在比は、リンパ球亜集
団の指標でしかなく、リンパ球亜集団の生体内での動態
は本発明で取り扱うマクロファージや樹状細胞、クッパ
ー細胞を始めとするアクセソリー細胞と呼ばれる細胞群
の機能と実際には複雑に関わっているため、Ｔｈ１／Ｔ
ｈ２の存在比だけで疾患の病態を適切に診断し、その情
報を基に治療することは困難である。後述するが、マク
ロファージ／単球等の機能状態によってＴｈ１／Ｔｈ２
のバランスは制御されているのである。治療のためにＴ
ｈ１＞Ｔｈ２に傾斜させることを意図しても、それだけ
では複雑なサイトカインネットワークにおいては効果が
得難く、新たな診断、治療のための指標が待ち望まれて
いる。
団の指標でしかなく、リンパ球亜集団の生体内での動態
は本発明で取り扱うマクロファージや樹状細胞、クッパ
ー細胞を始めとするアクセソリー細胞と呼ばれる細胞群
の機能と実際には複雑に関わっているため、Ｔｈ１／Ｔ
ｈ２の存在比だけで疾患の病態を適切に診断し、その情
報を基に治療することは困難である。後述するが、マク
ロファージ／単球等の機能状態によってＴｈ１／Ｔｈ２
のバランスは制御されているのである。治療のためにＴ
ｈ１＞Ｔｈ２に傾斜させることを意図しても、それだけ
では複雑なサイトカインネットワークにおいては効果が
得難く、新たな診断、治療のための指標が待ち望まれて
いる。
【０００７】炎症反応に深く関与しているマクロファー
ジにおいて、酸化ストレス、サイトカイン刺激、ウイル
ス、細菌感染等の環境因子により細胞の機能が変化する
ことが判明しているが、その機能とマクロファージの細
胞亜集団分類の対応については全く不明である。それら
機能、分類において新たな知見が必要であり、それらの
知見が得られることにより、飛躍的に有用な新たな治療
方法の開発に繋がる。この様な情況下に、免疫を調整す
る優れた薬剤、即ち免疫調整剤の開発が望まれ、本発明
者等は既にこの考えに沿って課題を一部解決し、特許出
願を行っている（特願平９−３０３４２６号及び特願平
１０−３０８３００号。）。
ジにおいて、酸化ストレス、サイトカイン刺激、ウイル
ス、細菌感染等の環境因子により細胞の機能が変化する
ことが判明しているが、その機能とマクロファージの細
胞亜集団分類の対応については全く不明である。それら
機能、分類において新たな知見が必要であり、それらの
知見が得られることにより、飛躍的に有用な新たな治療
方法の開発に繋がる。この様な情況下に、免疫を調整す
る優れた薬剤、即ち免疫調整剤の開発が望まれ、本発明
者等は既にこの考えに沿って課題を一部解決し、特許出
願を行っている（特願平９−３０３４２６号及び特願平
１０−３０８３００号。）。
【０００８】本発明においては、免疫性疾患であるリウ
マチについて研究を進めて病態動物なかんずくリウマチ
発症動物を用いて発症抑制剤，病態改善剤を提供するこ
とを課題としている。即ち、本発明の目的は、医薬品は
もとより、医療用飲食品、健康食品、特定保健食品等各
種の飲食品形態や、栄養剤や輸液製剤にも適用可能な抗
リウマチ剤の開発にある。
マチについて研究を進めて病態動物なかんずくリウマチ
発症動物を用いて発症抑制剤，病態改善剤を提供するこ
とを課題としている。即ち、本発明の目的は、医薬品は
もとより、医療用飲食品、健康食品、特定保健食品等各
種の飲食品形態や、栄養剤や輸液製剤にも適用可能な抗
リウマチ剤の開発にある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記課題
解決に向けて鋭意検討した結果、炎症の遷延化作用の強
いマクロファージ（単球、クッパー細胞及び樹状細胞等
を含む）と、免疫調整性のマクロファージとの区別を、
マクロファージのレドックス状態（ポテンシャル）の相
違から試み、リウマチ発症動物において病態の進展とと
もにマクロファージのレドックス状態が変化することを
見出し、本発明の課題解決を可能とした。マクロファー
ジのレドックス状態の指標としてはマクロファージ細胞
内の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）含量を採用する。
解決に向けて鋭意検討した結果、炎症の遷延化作用の強
いマクロファージ（単球、クッパー細胞及び樹状細胞等
を含む）と、免疫調整性のマクロファージとの区別を、
マクロファージのレドックス状態（ポテンシャル）の相
違から試み、リウマチ発症動物において病態の進展とと
もにマクロファージのレドックス状態が変化することを
見出し、本発明の課題解決を可能とした。マクロファー
ジのレドックス状態の指標としてはマクロファージ細胞
内の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）含量を採用する。
【００１０】グルタチオンは、ほ乳類のあらゆる細胞に
存在し、内因性の抗酸化物質として良く知られ、細胞内
においてラジカルや過酸化物の除去、プロスタグランジ
ン等のエイコサノイドの代謝、生体異物の解毒、アミノ
酸輸送等多様な機能を有しているトリペプチドである。
還元型（ＧＳＨ）と酸化型（ＧＳＳＧ）が存在し、両者
間で共役サイクルを形成する。通常の細胞では、ＧＳＨ
の濃度は還元状態の方が圧倒的に多く、酸化ストレス、
特にＨ2Ｏ2に対して防御的に作用する。
存在し、内因性の抗酸化物質として良く知られ、細胞内
においてラジカルや過酸化物の除去、プロスタグランジ
ン等のエイコサノイドの代謝、生体異物の解毒、アミノ
酸輸送等多様な機能を有しているトリペプチドである。
還元型（ＧＳＨ）と酸化型（ＧＳＳＧ）が存在し、両者
間で共役サイクルを形成する。通常の細胞では、ＧＳＨ
の濃度は還元状態の方が圧倒的に多く、酸化ストレス、
特にＨ2Ｏ2に対して防御的に作用する。
【００１１】本発明者等は、マクロファージ中の還元型
ＧＳＨ含量を測定すると共に、ＧＳＨ含量を異にするマ
クロファージの免疫機能に及ぼす効果に大きな差のある
こと、本測定法で生体の免疫能を検定できること、その
酸化還元状態を経口投与可能な低分子物質で人為的に調
整できること、及び本法が疾患の治療に広範に応用でき
ること、並びに飲食品として活用できる可能性を見出
し、前記のとおり特許を出願している（特願平９−３０
３４２６号及び特願平１０−３０８３００号）。本概念
に基づき、更にリウマチ発症マウスのマクロフアージの
レドックス状態について鋭意研究を進めた結果、本発明
を完成するに至った。
ＧＳＨ含量を測定すると共に、ＧＳＨ含量を異にするマ
クロファージの免疫機能に及ぼす効果に大きな差のある
こと、本測定法で生体の免疫能を検定できること、その
酸化還元状態を経口投与可能な低分子物質で人為的に調
整できること、及び本法が疾患の治療に広範に応用でき
ること、並びに飲食品として活用できる可能性を見出
し、前記のとおり特許を出願している（特願平９−３０
３４２６号及び特願平１０−３０８３００号）。本概念
に基づき、更にリウマチ発症マウスのマクロフアージの
レドックス状態について鋭意研究を進めた結果、本発明
を完成するに至った。
【００１２】図１は、本発明と同一発明者等により成る
先発明により見出された知見に基づき、マクロファージ
又は単球、クッパー細胞及び樹状細胞等（本発明ではこ
れらを併せてマクロファージと称する。）の機能の相
違、並びに、Ｔｈ１及びＴｈ２バランスに及ぼす効果、
更にはマクロファージの機能の相違によって引き起こさ
れる免疫抑制、悪液質状態、癌細胞の悪性化誘導の機
序、局所炎症等との関係の仮説模式図を示したもので、
例えば、担癌進行に従い、局所のＴｈ１／Ｔｈ２バラン
スが崩れ、液性免疫に傾き、サイトカインレセプター複
合体構成と機能が変化し、ＧＳＨ含量の少ない酸化型マ
クロファージが増加し、活性酸素や、ＰＧＥ２、ＩＬ−
６、ＩＬ−１０，ＩＬ−８等の炎症伝達因子の産生が高
まり、全身性の免疫抑制、悪液質状態となる。
先発明により見出された知見に基づき、マクロファージ
又は単球、クッパー細胞及び樹状細胞等（本発明ではこ
れらを併せてマクロファージと称する。）の機能の相
違、並びに、Ｔｈ１及びＴｈ２バランスに及ぼす効果、
更にはマクロファージの機能の相違によって引き起こさ
れる免疫抑制、悪液質状態、癌細胞の悪性化誘導の機
序、局所炎症等との関係の仮説模式図を示したもので、
例えば、担癌進行に従い、局所のＴｈ１／Ｔｈ２バラン
スが崩れ、液性免疫に傾き、サイトカインレセプター複
合体構成と機能が変化し、ＧＳＨ含量の少ない酸化型マ
クロファージが増加し、活性酸素や、ＰＧＥ２、ＩＬ−
６、ＩＬ−１０，ＩＬ−８等の炎症伝達因子の産生が高
まり、全身性の免疫抑制、悪液質状態となる。
【００１３】本発明者等は上記知見に基づき、更に研究
を重ねた結果、炎症反応に重要な役割を果たしているマ
クロファージ細胞中の酸化型グルタチオンと還元型グル
タチオンの含量を検定することにより、不均一なマクロ
ファージ集団が２つのタイプ即ち酸化型マクロファージ
と還元型マクロファージとに分類することができ、酸化
型マクロファージが免疫疾患に伴う局所慢性炎症やアレ
ルギー反応を引き起こし、液性免疫と細胞性免疫のバラ
ンスに関与するＴｈ１／Ｔｈ２バランスはマクロファー
ジの酸化／還元状態によって制御されていること、当該
マクロファージの酸化還元状態が免疫性疾患の病態に重
要な役割を果たしており当該酸化還元状態を検定し、そ
の状態を人為的に制御、修飾することにより当該疾患の
診断及び治療に役立つこと、しかもその制御が経口摂取
可能な低分子物質によって簡便に行えることを見出し
た。
を重ねた結果、炎症反応に重要な役割を果たしているマ
クロファージ細胞中の酸化型グルタチオンと還元型グル
タチオンの含量を検定することにより、不均一なマクロ
ファージ集団が２つのタイプ即ち酸化型マクロファージ
と還元型マクロファージとに分類することができ、酸化
型マクロファージが免疫疾患に伴う局所慢性炎症やアレ
ルギー反応を引き起こし、液性免疫と細胞性免疫のバラ
ンスに関与するＴｈ１／Ｔｈ２バランスはマクロファー
ジの酸化／還元状態によって制御されていること、当該
マクロファージの酸化還元状態が免疫性疾患の病態に重
要な役割を果たしており当該酸化還元状態を検定し、そ
の状態を人為的に制御、修飾することにより当該疾患の
診断及び治療に役立つこと、しかもその制御が経口摂取
可能な低分子物質によって簡便に行えることを見出し
た。
【００１４】本発明での酸化型マクロファージ及び還元
型マクロファージの定義は、還元型グルタチオン（ＧＳ
Ｈ）に特異的な化学試薬モノクロロバイメイン（ＭＯＮ
ＯＣＨＬＯＲＯＢＩＭＡＮＥ）と反応させることで細胞
内ＧＳＨ量を定量し、無刺激のマクロファージに比較し
てＧＳＨ含量が増加しているものを還元型マクロファー
ジ、逆に含量の低下しているものを酸化型マクロファー
ジとするものである。
型マクロファージの定義は、還元型グルタチオン（ＧＳ
Ｈ）に特異的な化学試薬モノクロロバイメイン（ＭＯＮ
ＯＣＨＬＯＲＯＢＩＭＡＮＥ）と反応させることで細胞
内ＧＳＨ量を定量し、無刺激のマクロファージに比較し
てＧＳＨ含量が増加しているものを還元型マクロファー
ジ、逆に含量の低下しているものを酸化型マクロファー
ジとするものである。
【００１５】更に、経口摂取可能な低分子物質をマクロ
ファージと２〜２４時間接触させることで、ＧＳＨ含量
が２ｎｍｏｌｅｓ／５×１０5マクロファージ細胞以上
のものを還元型マクロファージ（又は単球等）、０．１
ｎｍｏｌｅｓ／５×１０5マクロファージ細胞以下のも
のを酸化型マクロファージとすることが好ましい。
ファージと２〜２４時間接触させることで、ＧＳＨ含量
が２ｎｍｏｌｅｓ／５×１０5マクロファージ細胞以上
のものを還元型マクロファージ（又は単球等）、０．１
ｎｍｏｌｅｓ／５×１０5マクロファージ細胞以下のも
のを酸化型マクロファージとすることが好ましい。
【００１６】或いは、無刺激のマクロファージのＧＳＨ
含量に比較してＧＳＨ量が２倍以上になっているのを還
元型マクロファージ、１／５以下になっているものを酸
化型マクロファージとすることもできる。
含量に比較してＧＳＨ量が２倍以上になっているのを還
元型マクロファージ、１／５以下になっているものを酸
化型マクロファージとすることもできる。
【００１７】現在、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスはＩＬ−
６、ＩＬ−１０若しくはＩＬ−４と、ＩＬ−１２が生体
内でどのような割合で産生されるかによって規定される
とされている。前者によって液性免疫に関与するＴｈ２
が、ＩＬ−１２によってＴｈ１が誘導されることが既に
知られている。しかしながら、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、
ＩＬ−１２がマクロファージから産生されることは判明
しているが、同一のマクロファージ細胞がＩＬ−６、Ｉ
Ｌ−１０及びＩＬ−１２の全てを産生すると仮定する
と、Ｔｈ１誘導にもＴｈ２誘導にも関与する１種のマク
ロファージが存在することとなり、生体の免疫応答を考
えるに当り大きな矛盾にぶつかる。
６、ＩＬ−１０若しくはＩＬ−４と、ＩＬ−１２が生体
内でどのような割合で産生されるかによって規定される
とされている。前者によって液性免疫に関与するＴｈ２
が、ＩＬ−１２によってＴｈ１が誘導されることが既に
知られている。しかしながら、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、
ＩＬ−１２がマクロファージから産生されることは判明
しているが、同一のマクロファージ細胞がＩＬ−６、Ｉ
Ｌ−１０及びＩＬ−１２の全てを産生すると仮定する
と、Ｔｈ１誘導にもＴｈ２誘導にも関与する１種のマク
ロファージが存在することとなり、生体の免疫応答を考
えるに当り大きな矛盾にぶつかる。
【００１８】本発明者等はＧＳＨ含量の高い還元型マク
ロファージによってのみＩＬ−１２が産生されＴｈ１誘
導に働き、酸化型マクロファージによってはＩＬ−６の
産生が亢進し、Ｔｈ２が誘導されることを見出した。ま
た、Ｔｈ１サイトカインの代表であるＩＦＮγ（ＩＦＮ
ガンマ）が産生されてもマクロファージが酸化型に傾斜
していると、ＩＦＮγの作用でＴｈ２を誘導するＩＬ−
６が大量に産生されることも見出された。逆に、還元型
マクロファージが存在するとＴｈ１サイトカインの代表
であるＩＦＮγによってマクロファージの還元型形質が
一層増強されることも判明した。
ロファージによってのみＩＬ−１２が産生されＴｈ１誘
導に働き、酸化型マクロファージによってはＩＬ−６の
産生が亢進し、Ｔｈ２が誘導されることを見出した。ま
た、Ｔｈ１サイトカインの代表であるＩＦＮγ（ＩＦＮ
ガンマ）が産生されてもマクロファージが酸化型に傾斜
していると、ＩＦＮγの作用でＴｈ２を誘導するＩＬ−
６が大量に産生されることも見出された。逆に、還元型
マクロファージが存在するとＴｈ１サイトカインの代表
であるＩＦＮγによってマクロファージの還元型形質が
一層増強されることも判明した。
【００１９】酸化型マクロファージが誘導されていると
ころにＴｈ２サイトカインの代表であるＩＬ−４が作用
すると酸化型マクロファージの形質が更に増強される。
これらの知見は液性免疫と細胞性免疫という対局にある
免疫応答がマクロファージの酸化還元状態によって一義
的に規定されていることを示すもので、免疫学の根幹に
関わる重要な知見である（図２参照）。この知見により
免疫系疾患の病態診断と治療法について、従来の混沌と
した免疫性疾患治療法に代わる頗る有用で独創的な発明
を既に完成しており、この発明に基づき、リウマチ関節
炎発症動物について鋭意検討した結果、新しく本発明を
完成するに至った。
ころにＴｈ２サイトカインの代表であるＩＬ−４が作用
すると酸化型マクロファージの形質が更に増強される。
これらの知見は液性免疫と細胞性免疫という対局にある
免疫応答がマクロファージの酸化還元状態によって一義
的に規定されていることを示すもので、免疫学の根幹に
関わる重要な知見である（図２参照）。この知見により
免疫系疾患の病態診断と治療法について、従来の混沌と
した免疫性疾患治療法に代わる頗る有用で独創的な発明
を既に完成しており、この発明に基づき、リウマチ関節
炎発症動物について鋭意検討した結果、新しく本発明を
完成するに至った。
【００２０】即ち本発明は、マクロフアージ細胞内の還
元型グルタチオン量を減少させることでＩＬ−１２（イ
ンターロイキン−１２）産生、ＮＯ（一酸化窒素）産
生、ＩＦＮγ（インターフェロンガンマ）産生を抑制
し、遅延型過敏症反応を抑制する作用を有する物質を含
有することに特徴を有する抗リウマチ剤に存し、このよ
うな抗リウマチ剤の提供を可能にする。本発明において
マクロファージは広義のマクロファージを意味し、この
「マクロファージ」には単球、クッパー細胞及び樹状細
胞等も含められる。本発明者等は前記知見に基づき更に
研究を抗リウマチ剤に特化し、マクロファージ細胞内の
還元型グルタチオン量を減少させたり、増加させる物質
を探索し、その効果を発揮する物質を見出し、ヒトのリ
ウマチ関節炎に類似する病態を発症する動物モデルを作
製し、医薬品としての抗リウマチ関節炎薬、医療用飲食
品、健康食品、特定保健食品等に用いるリウマチ関節炎
の治療、予防、病態改善効果を有する飲食品、栄養剤及
び輸液製剤の開発に研究を深化発展させ、その物質とし
て下記の化合物を用いて、試験管内の免疫活性の抑制効
果、動物投与下における免疫抑制効果を広く検定し、更
にはコラーゲン誘発性に、若しくは自発的にリウマチを
発症するマウスを用いて候補物質の薬効を検討し、マク
ロファージ及び単球等の細胞内の還元型グルタチオン量
を低下させる物質として下記に示す化合物がリウマチ関
節炎の治療、予防、病態改善に有効であることも見出し
た。
元型グルタチオン量を減少させることでＩＬ−１２（イ
ンターロイキン−１２）産生、ＮＯ（一酸化窒素）産
生、ＩＦＮγ（インターフェロンガンマ）産生を抑制
し、遅延型過敏症反応を抑制する作用を有する物質を含
有することに特徴を有する抗リウマチ剤に存し、このよ
うな抗リウマチ剤の提供を可能にする。本発明において
マクロファージは広義のマクロファージを意味し、この
「マクロファージ」には単球、クッパー細胞及び樹状細
胞等も含められる。本発明者等は前記知見に基づき更に
研究を抗リウマチ剤に特化し、マクロファージ細胞内の
還元型グルタチオン量を減少させたり、増加させる物質
を探索し、その効果を発揮する物質を見出し、ヒトのリ
ウマチ関節炎に類似する病態を発症する動物モデルを作
製し、医薬品としての抗リウマチ関節炎薬、医療用飲食
品、健康食品、特定保健食品等に用いるリウマチ関節炎
の治療、予防、病態改善効果を有する飲食品、栄養剤及
び輸液製剤の開発に研究を深化発展させ、その物質とし
て下記の化合物を用いて、試験管内の免疫活性の抑制効
果、動物投与下における免疫抑制効果を広く検定し、更
にはコラーゲン誘発性に、若しくは自発的にリウマチを
発症するマウスを用いて候補物質の薬効を検討し、マク
ロファージ及び単球等の細胞内の還元型グルタチオン量
を低下させる物質として下記に示す化合物がリウマチ関
節炎の治療、予防、病態改善に有効であることも見出し
た。
【００２１】当該物質としては、分子内にジスルフイド
（−Ｓ−Ｓ−）結合を有する化合物で、マクロファージ
細胞内の還元型グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏
症反応を抑制し、ＩＬ−１２，ＩＦＮγ産生を抑制する
作用を有する化合物が含まれる。なかんずくジスルフイ
ド結合を有する化合物として好ましくはシスチン誘導体
を挙げることができ、特に下記構造式（１）で示される
化合物から選択するのが好ましい。
（−Ｓ−Ｓ−）結合を有する化合物で、マクロファージ
細胞内の還元型グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏
症反応を抑制し、ＩＬ−１２，ＩＦＮγ産生を抑制する
作用を有する化合物が含まれる。なかんずくジスルフイ
ド結合を有する化合物として好ましくはシスチン誘導体
を挙げることができ、特に下記構造式（１）で示される
化合物から選択するのが好ましい。
【００２２】
【化２】
【００２３】但し、上記式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独
立していて、アルキル基（未置換）及びニトロキシブチ
ル等置換基を有するアルキル基を、Ｒ3及びＲ4はそれぞ
れ独立していて、アシル基及びペプチジル基の何れか
を、それぞれ表す。
立していて、アルキル基（未置換）及びニトロキシブチ
ル等置換基を有するアルキル基を、Ｒ3及びＲ4はそれぞ
れ独立していて、アシル基及びペプチジル基の何れか
を、それぞれ表す。
【００２４】これらの物質は１又は２以上含有すること
が可能であり、低分子の経口可能な本発明になる若しく
は現在用いられている抗リウマチ剤と併用することも可
能であり、また、高分子の静脈投与に適した免疫調整剤
を併用することでより高い効果が期待される。
が可能であり、低分子の経口可能な本発明になる若しく
は現在用いられている抗リウマチ剤と併用することも可
能であり、また、高分子の静脈投与に適した免疫調整剤
を併用することでより高い効果が期待される。
【００２５】マクロフアージ細胞内の還元型グルタチオ
ン量を減少させることでＩＬ−１２産生、ＮＯ産生、Ｉ
ＦＮγ産生を抑制する作用を有する物質を実際の患者に
適用するにあたっては、患者のマクロフアージのレドッ
クス状態を診断することで適切に用いることができる。
ン量を減少させることでＩＬ−１２産生、ＮＯ産生、Ｉ
ＦＮγ産生を抑制する作用を有する物質を実際の患者に
適用するにあたっては、患者のマクロフアージのレドッ
クス状態を診断することで適切に用いることができる。
【００２６】細胞内の還元型グルタチオン量の多い還元
型マクロファージを選択的に除去し得る物質を含有する
ことを特徴とする抗リウマチ剤も本発明に含まれる。当
該物質としては、例えば、還元型マクロファージ特異的
抗体とマクロファージに細胞毒性を有する低分子化合物
並びにマクロファージに取り込まれた後に細胞毒性を示
す物質とを直接又はリンカーを介して結合させた物質等
がある。特に、当該物質として、細胞毒性を有するＤＮ
Ａアルキル化剤にグルタチオンを共役させた物質及び前
駆体としてマクロファージに取り込まれた後に細胞毒性
を示す物質を挙げることができる。当該アルキル化剤と
しては、例えばサイクロフォスファミド、ニムスチン
（ＡＣＮＵ）、マイトマイシンＣ、メルファラン等があ
る。また、インビトロでは、殺細胞性が無いものの還元
型マクロファージ中で増大している酵素の作用により、
殺細胞性を示すようになる物質をプロドラッグとして用
いることもできる。
型マクロファージを選択的に除去し得る物質を含有する
ことを特徴とする抗リウマチ剤も本発明に含まれる。当
該物質としては、例えば、還元型マクロファージ特異的
抗体とマクロファージに細胞毒性を有する低分子化合物
並びにマクロファージに取り込まれた後に細胞毒性を示
す物質とを直接又はリンカーを介して結合させた物質等
がある。特に、当該物質として、細胞毒性を有するＤＮ
Ａアルキル化剤にグルタチオンを共役させた物質及び前
駆体としてマクロファージに取り込まれた後に細胞毒性
を示す物質を挙げることができる。当該アルキル化剤と
しては、例えばサイクロフォスファミド、ニムスチン
（ＡＣＮＵ）、マイトマイシンＣ、メルファラン等があ
る。また、インビトロでは、殺細胞性が無いものの還元
型マクロファージ中で増大している酵素の作用により、
殺細胞性を示すようになる物質をプロドラッグとして用
いることもできる。
【００２７】更に、本発明には、前記抗リウマチ関節炎
薬としての医薬品を含むが、前記、治療、予防、病態改
善効果を含有する飲食品（医療用飲食品、健康食品、特
定保健食品等を含む。）、栄養剤又は輸液製剤の形態に
あるものも含まれる。飲食品の形態としては、通常の飲
食品や、歯磨きやチューインガム等口の中に運ばれるも
のも含まれ、特に健康志向の飲食品に含有されるのが好
ましい。また、飲食品に添加する添加剤の形で用いられ
てもよい。栄養剤としては、例えばビタミン剤、カルシ
ウム剤等の何れの栄養剤でもよい。輸液製剤としては、
例えば高カロリー輸液、生理食塩水、血液製剤等の通常
用いられる輸液製剤に含有することができる。
薬としての医薬品を含むが、前記、治療、予防、病態改
善効果を含有する飲食品（医療用飲食品、健康食品、特
定保健食品等を含む。）、栄養剤又は輸液製剤の形態に
あるものも含まれる。飲食品の形態としては、通常の飲
食品や、歯磨きやチューインガム等口の中に運ばれるも
のも含まれ、特に健康志向の飲食品に含有されるのが好
ましい。また、飲食品に添加する添加剤の形で用いられ
てもよい。栄養剤としては、例えばビタミン剤、カルシ
ウム剤等の何れの栄養剤でもよい。輸液製剤としては、
例えば高カロリー輸液、生理食塩水、血液製剤等の通常
用いられる輸液製剤に含有することができる。
【００２８】更に詳細に述べると、本発明は次の通りで
ある。
ある。
【００２９】ヒトから分離・採取した体液／細胞試料を
用いて、マクロファージ細胞内の酸化型及び／又は還元
型グルタチオン量を検定することにより、マクロファー
ジをそれぞれ異なった機能を有する酸化型マクロファー
ジと還元型マクロファージとに分類し、その存在割合を
経口摂取できる物質で人為的に制御したり、還元型のマ
クロファージを人為的に除去することでリウマチ関節炎
患者治療に有用な薬剤や病態改善、予防に役に立つ飲食
品、栄養剤、輸液を提供することができる。ヒトからの
分離・採取した体液／細胞試料としては、例えば末梢血
や腹腔、胸腔、関節腔、各種臓器より分離した細胞等が
採用可能である。
用いて、マクロファージ細胞内の酸化型及び／又は還元
型グルタチオン量を検定することにより、マクロファー
ジをそれぞれ異なった機能を有する酸化型マクロファー
ジと還元型マクロファージとに分類し、その存在割合を
経口摂取できる物質で人為的に制御したり、還元型のマ
クロファージを人為的に除去することでリウマチ関節炎
患者治療に有用な薬剤や病態改善、予防に役に立つ飲食
品、栄養剤、輸液を提供することができる。ヒトからの
分離・採取した体液／細胞試料としては、例えば末梢血
や腹腔、胸腔、関節腔、各種臓器より分離した細胞等が
採用可能である。
【００３０】グルタチオンの測定方法としては、直接的
に酵素リサイクリング法で生化学的に酸化型又は還元型
グルタチオン含量を測定する（活性酵素実験プロトコー
ル（細胞工学別冊）、秀潤社、頁84-88, 1994年、ANALY
TICAL CHEMISTRY, VOL. 106,PP207-212, 1980; CELLULA
R IMMUNOLOGY, VOL. 164, PP73-80, 1995等参照。）の
みならず、間接的な測定、例えば酸化型又は還元型マク
ロファージに対する特異的なモノクローナル抗体又はポ
リクローナル抗体を用いて測定したり、モノクロロバイ
メインのようにＧＳＨに特異的に反応し、錯体を形成
し、レーザー光励起により蛍光を発するような試薬を用
いればよい。更には高速液体クロマトグラフイー（ＨＰ
ＬＣ）、ガスクロマトグラフイーを用いることも可能で
ある。
に酵素リサイクリング法で生化学的に酸化型又は還元型
グルタチオン含量を測定する（活性酵素実験プロトコー
ル（細胞工学別冊）、秀潤社、頁84-88, 1994年、ANALY
TICAL CHEMISTRY, VOL. 106,PP207-212, 1980; CELLULA
R IMMUNOLOGY, VOL. 164, PP73-80, 1995等参照。）の
みならず、間接的な測定、例えば酸化型又は還元型マク
ロファージに対する特異的なモノクローナル抗体又はポ
リクローナル抗体を用いて測定したり、モノクロロバイ
メインのようにＧＳＨに特異的に反応し、錯体を形成
し、レーザー光励起により蛍光を発するような試薬を用
いればよい。更には高速液体クロマトグラフイー（ＨＰ
ＬＣ）、ガスクロマトグラフイーを用いることも可能で
ある。
【００３１】
【発明の実施の形態】次に、本発明の実施の形態につい
て説明する。
て説明する。
【００３２】本発明におけるグルタチオンとは、別名５
−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシンであり、
生体内に最も多く存在するＳＨ化合物で、一般にＧＳＨ
と記述される。グルタチオンは、その分子の酸化状態に
より還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンに分類さ
れる。還元型グルタチオンとは、前記のグルタチオン
（ＧＳＨ）のことであり、酸化型グルタチオンは、別名
グルタチオンジスルフィドと呼ばれるもので、ＧＳＳＧ
と記述される。
−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシンであり、
生体内に最も多く存在するＳＨ化合物で、一般にＧＳＨ
と記述される。グルタチオンは、その分子の酸化状態に
より還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンに分類さ
れる。還元型グルタチオンとは、前記のグルタチオン
（ＧＳＨ）のことであり、酸化型グルタチオンは、別名
グルタチオンジスルフィドと呼ばれるもので、ＧＳＳＧ
と記述される。
【００３３】本発明におけるマクロファージには、前述
の通り単球も含まれる。同時に、樹状細胞やクッパー細
胞と呼ばれるマクロファージの類縁細胞も含まれる。マ
クロファージは、様々なサイトカインや炎症性メディエ
ーター等の情報伝達物質をその細胞から遊離、放出する
ことが知られているが、その活性化状態、分化状態によ
り、放出されるか否か、また、放出される量が異なる。
本発明によれば、例えばマクロファージ細胞内の酸化型
グルタチオンと還元型グルタチオンとの量に着目し、酸
化型マクロファージと還元型マクロファージに分類後、
生体の免疫状態を確認して、本発明の抗リウマチ関節炎
剤等により、これらマクロファージの酸化還元状態のバ
ランスを調整することにより、生体内の免疫状態を改善
し、リウマチ様関節炎疾患の治療、病態改善や予防に役
立てられる。
の通り単球も含まれる。同時に、樹状細胞やクッパー細
胞と呼ばれるマクロファージの類縁細胞も含まれる。マ
クロファージは、様々なサイトカインや炎症性メディエ
ーター等の情報伝達物質をその細胞から遊離、放出する
ことが知られているが、その活性化状態、分化状態によ
り、放出されるか否か、また、放出される量が異なる。
本発明によれば、例えばマクロファージ細胞内の酸化型
グルタチオンと還元型グルタチオンとの量に着目し、酸
化型マクロファージと還元型マクロファージに分類後、
生体の免疫状態を確認して、本発明の抗リウマチ関節炎
剤等により、これらマクロファージの酸化還元状態のバ
ランスを調整することにより、生体内の免疫状態を改善
し、リウマチ様関節炎疾患の治療、病態改善や予防に役
立てられる。
【００３４】還元型マクロファージでは、細胞内の還元
型グルタチオンが酸化型マクロファージより相対的に多
いのに対して、酸化型マクロファージでは、還元型グル
タチオンが還元型マクロフアージより相対的に少ない。
また、還元型マクロファージと酸化型マクロファージで
は、還元型ＧＳＨ含量の違いのために転写制御因子の活
性化に違いが生じ、サイトカインや炎症伝達因子の遺伝
子発現に違いが起こり、産生される炎症性サイトカイン
や炎症性メディエーターの種類や量が変化し、炎症の質
が変化する。
型グルタチオンが酸化型マクロファージより相対的に多
いのに対して、酸化型マクロファージでは、還元型グル
タチオンが還元型マクロフアージより相対的に少ない。
また、還元型マクロファージと酸化型マクロファージで
は、還元型ＧＳＨ含量の違いのために転写制御因子の活
性化に違いが生じ、サイトカインや炎症伝達因子の遺伝
子発現に違いが起こり、産生される炎症性サイトカイン
や炎症性メディエーターの種類や量が変化し、炎症の質
が変化する。
【００３５】酸化型マクロファージでは、ＩＬ−６、Ｉ
Ｌ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ、過酸化水素、
スーパーオキシド、ＰＧＥ２等の炎症性サイトカイン及
びメディエータが産生されるのに対して、還元型マクロ
ファージでは、一酸化窒素（ＮＯ）、ＩＬ−１２、ＬＴ
Ｂ４等が産生される。更に、酸化型マクロファージ及び
還元型マクロファージは、刺激等により変換する。例え
ば、炎症や敗血症性シヨックを誘導するＬＰＳやＰＭＡ
や、ＩＬ−４、ＴＧＦβ等のサイトカンイにより人為的
に刺激することにより、還元型マクロファージは酸化型
に変換され、逆に、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、抗腫瘍性多糖
であるレンチナン（ＬＮＴ）等のβ（１−３）グルカン
やリポ酸等の抗酸化剤を添加することにより、酸化型マ
クロファージを還元型に変換することができる。リウマ
チ関節炎の治療には様々な治療薬が提供されている。ス
テロイド剤、非ステロイド性抗炎症剤、ペニシラミン、
ブシラミン等のＤＭＡＲＤＳと呼称される一群の化合物
をその代表として挙げることができる。また、最近では
抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−６抗体等サイトカインに対する人型
化モノクローナル抗体も臨床実験が進み、その有効性が
確認されつつある。
Ｌ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ、過酸化水素、
スーパーオキシド、ＰＧＥ２等の炎症性サイトカイン及
びメディエータが産生されるのに対して、還元型マクロ
ファージでは、一酸化窒素（ＮＯ）、ＩＬ−１２、ＬＴ
Ｂ４等が産生される。更に、酸化型マクロファージ及び
還元型マクロファージは、刺激等により変換する。例え
ば、炎症や敗血症性シヨックを誘導するＬＰＳやＰＭＡ
や、ＩＬ−４、ＴＧＦβ等のサイトカンイにより人為的
に刺激することにより、還元型マクロファージは酸化型
に変換され、逆に、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、抗腫瘍性多糖
であるレンチナン（ＬＮＴ）等のβ（１−３）グルカン
やリポ酸等の抗酸化剤を添加することにより、酸化型マ
クロファージを還元型に変換することができる。リウマ
チ関節炎の治療には様々な治療薬が提供されている。ス
テロイド剤、非ステロイド性抗炎症剤、ペニシラミン、
ブシラミン等のＤＭＡＲＤＳと呼称される一群の化合物
をその代表として挙げることができる。また、最近では
抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−６抗体等サイトカインに対する人型
化モノクローナル抗体も臨床実験が進み、その有効性が
確認されつつある。
【００３６】リウマチ性関節炎病態動物においては、マ
クロフアージを中心とする炎症性細胞の関節腔浸潤、繊
維芽細胞の以上増殖によるパンヌス形成と血管新生の異
常亢進の起こることが病態の特徴とされている。抗原特
異的なＴリンパ球免疫応答の関与も強く示唆されている
が、関与を否定する見解もある。機構の如何に拘らず、
最終的にはメタロプロテアーゼ、アラキドン酸代謝産
物、活性酸素、活性窒素等多様な炎症メデイーターの局
所産生を介して骨破壊に至る。骨破壊に至るまでの病態
進展に伴い、酸化型マクロファージ及び還元型マクロフ
ァージの含まれる量が異なることが本発明において始め
て見出された。
クロフアージを中心とする炎症性細胞の関節腔浸潤、繊
維芽細胞の以上増殖によるパンヌス形成と血管新生の異
常亢進の起こることが病態の特徴とされている。抗原特
異的なＴリンパ球免疫応答の関与も強く示唆されている
が、関与を否定する見解もある。機構の如何に拘らず、
最終的にはメタロプロテアーゼ、アラキドン酸代謝産
物、活性酸素、活性窒素等多様な炎症メデイーターの局
所産生を介して骨破壊に至る。骨破壊に至るまでの病態
進展に伴い、酸化型マクロファージ及び還元型マクロフ
ァージの含まれる量が異なることが本発明において始め
て見出された。
【００３７】他の疾患においても病態によって酸化型マ
クロファージ及び還元型マクロファージの含まれる量が
異なることを本発明者等は見出している。消化管炎症疾
患モデル動物（肝炎、クローン病、潰瘍性大腸炎）より
採取したマクロファージ中の還元型グルタチオン量は、
正常動物より相対的に減少していることが、Adherentce
ll analysing system (ACAS)を用いる画像解析や酵素リ
サイクリング法を用いる生化学的定量により判明した。
これに対して、糖尿病を自然発症するＮＯＤマウスにお
いてはマクロフアージ等の炎症性細胞の膵島浸潤時期に
は腹腔内マクロフアージ中の還元型グルタチオン量は、
正常動物より相対的に減少しており（酸化型クロフアー
ジ優位）、ランゲルハンス島破壊による糖尿病発症時期
には、逆に腹腔内マクロフアージ中の還元型グルタチオ
ン量は、正常動物より相対的に増加して（還元型クロフ
アージ優位）いる。リウマチ性関節炎病態動物において
は病態進展と共にマクロフアージの酸化還元状態なかん
ずく還元型ＧＳＨ含量がどのように変化するかの知見は
絶無であり、ましてマクロフアージ中のＧＳＨ量を人為
的に修飾しての治療、予防、病態改善の試みも、提案も
絶無である。本発明者等は既に、酸化型マクロファージ
では、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、Ｔ
ＮＦ、過酸化水素、スーパーオキシド、ＰＧＥ２等の炎
症性サイトカイン及びメディエータが産生されるのに対
して、還元型マクロファージでは、一酸化窒素（Ｎ
Ｏ）、ＩＬ−１２、ＬＴＢ４等が産生されることを見出
している。本知見と前述の抗ＩＬ−６抗体のリウマチ患
者に対する有効性の情報からは、酸化型マクロフアージ
の除去が治療手段になるのではないかと推測されるが、
実際のリウマチ性関節炎病態動物では、治療、病態改善
手段としてマクロファージ中の還元型グルタチオン量を
減少させ、酸化型マクロフアージを誘導することが有益
であることを始めて見出し、本発明を完成したものであ
る。本発明になるこの知見を無視して治療を行うこと
は、逆に病態を悪化させる危険性をも示唆する重要な知
見である。
クロファージ及び還元型マクロファージの含まれる量が
異なることを本発明者等は見出している。消化管炎症疾
患モデル動物（肝炎、クローン病、潰瘍性大腸炎）より
採取したマクロファージ中の還元型グルタチオン量は、
正常動物より相対的に減少していることが、Adherentce
ll analysing system (ACAS)を用いる画像解析や酵素リ
サイクリング法を用いる生化学的定量により判明した。
これに対して、糖尿病を自然発症するＮＯＤマウスにお
いてはマクロフアージ等の炎症性細胞の膵島浸潤時期に
は腹腔内マクロフアージ中の還元型グルタチオン量は、
正常動物より相対的に減少しており（酸化型クロフアー
ジ優位）、ランゲルハンス島破壊による糖尿病発症時期
には、逆に腹腔内マクロフアージ中の還元型グルタチオ
ン量は、正常動物より相対的に増加して（還元型クロフ
アージ優位）いる。リウマチ性関節炎病態動物において
は病態進展と共にマクロフアージの酸化還元状態なかん
ずく還元型ＧＳＨ含量がどのように変化するかの知見は
絶無であり、ましてマクロフアージ中のＧＳＨ量を人為
的に修飾しての治療、予防、病態改善の試みも、提案も
絶無である。本発明者等は既に、酸化型マクロファージ
では、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、Ｔ
ＮＦ、過酸化水素、スーパーオキシド、ＰＧＥ２等の炎
症性サイトカイン及びメディエータが産生されるのに対
して、還元型マクロファージでは、一酸化窒素（Ｎ
Ｏ）、ＩＬ−１２、ＬＴＢ４等が産生されることを見出
している。本知見と前述の抗ＩＬ−６抗体のリウマチ患
者に対する有効性の情報からは、酸化型マクロフアージ
の除去が治療手段になるのではないかと推測されるが、
実際のリウマチ性関節炎病態動物では、治療、病態改善
手段としてマクロファージ中の還元型グルタチオン量を
減少させ、酸化型マクロフアージを誘導することが有益
であることを始めて見出し、本発明を完成したものであ
る。本発明になるこの知見を無視して治療を行うこと
は、逆に病態を悪化させる危険性をも示唆する重要な知
見である。
【００３８】本発明に従えば、マクロファージの細胞内
の還元型グルタチオン量を上記方法で測定した後に、当
該マクロファージの細胞内の還元型グルタチオン量を減
少させる作用を有する低分子化合物で、経口摂取でも活
性が保持されるものを医薬品として通常の製剤化を行
い、病態をモニターしつつ連日若しくは一定の期間をあ
け患者に摂取させれば良い。
の還元型グルタチオン量を上記方法で測定した後に、当
該マクロファージの細胞内の還元型グルタチオン量を減
少させる作用を有する低分子化合物で、経口摂取でも活
性が保持されるものを医薬品として通常の製剤化を行
い、病態をモニターしつつ連日若しくは一定の期間をあ
け患者に摂取させれば良い。
【００３９】本発明での酸化型マクロファージ及び還元
型マクロファージの定義は、還元型グルタチオン（ＧＳ
Ｈ）に特異的な化学試薬モノクロロバイメインと反応さ
せることで細胞内ＧＳＨ量を定量し、無刺激のマクロフ
ァージに比較してＧＳＨ含量が増加しているものを還元
型マクロファージ、逆に含量の低下しているものを酸化
型マクロファージとするものである。更に、経口摂取可
能な低分子物質をマクロファージと２〜２４時間接触さ
せることで、ＧＳＨ含量が２ｎｍｏｌｅｓ／５×１０5
マクロファージ細胞以上のものを還元型マクロファー
ジ、０．１ｎｍｏｌｅｓ／５×１０5マクロファージ細
胞以下のものを酸化型マクロファージとすることが好ま
しい。或いは、無刺激のマクロファージのＧＳＨ含量に
比較してＧＳＨ量が２倍以上になっているのを還元型マ
クロファージ、１／５以下になっているものを酸化型マ
クロファージとすることもできる。
型マクロファージの定義は、還元型グルタチオン（ＧＳ
Ｈ）に特異的な化学試薬モノクロロバイメインと反応さ
せることで細胞内ＧＳＨ量を定量し、無刺激のマクロフ
ァージに比較してＧＳＨ含量が増加しているものを還元
型マクロファージ、逆に含量の低下しているものを酸化
型マクロファージとするものである。更に、経口摂取可
能な低分子物質をマクロファージと２〜２４時間接触さ
せることで、ＧＳＨ含量が２ｎｍｏｌｅｓ／５×１０5
マクロファージ細胞以上のものを還元型マクロファー
ジ、０．１ｎｍｏｌｅｓ／５×１０5マクロファージ細
胞以下のものを酸化型マクロファージとすることが好ま
しい。或いは、無刺激のマクロファージのＧＳＨ含量に
比較してＧＳＨ量が２倍以上になっているのを還元型マ
クロファージ、１／５以下になっているものを酸化型マ
クロファージとすることもできる。
【００４０】マクロフアージ内のＧＳＨ量を減少させる
ものとして好ましくは、分子内にジスルフイド（−Ｓ−
Ｓ−）結合を有する化合物で、マクロファージ細胞内の
還元型グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏症反応を
抑制し、ＩＬ−１２，ＩＦＮγ産生を抑制する作用を有
する化合物が用いることができる。グリオトキシン誘導
体もこの中に含まれる。ジスルフイド結合を有する化合
物として、前記の通りシスチン誘導体を使用することが
でき、好ましくは下記構造式（１）で示される化合物の
中から選択することができる。
ものとして好ましくは、分子内にジスルフイド（−Ｓ−
Ｓ−）結合を有する化合物で、マクロファージ細胞内の
還元型グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏症反応を
抑制し、ＩＬ−１２，ＩＦＮγ産生を抑制する作用を有
する化合物が用いることができる。グリオトキシン誘導
体もこの中に含まれる。ジスルフイド結合を有する化合
物として、前記の通りシスチン誘導体を使用することが
でき、好ましくは下記構造式（１）で示される化合物の
中から選択することができる。
【００４１】
【化３】
【００４２】但し、上記式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独
立していて、アルキル基及びニトロキシブチル等の置換
基を有するアルキル基を、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立し
ていて、アシル基及びペプチジル基の何れかを、それぞ
れ表す。
立していて、アルキル基及びニトロキシブチル等の置換
基を有するアルキル基を、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立し
ていて、アシル基及びペプチジル基の何れかを、それぞ
れ表す。
【００４３】以下に、特に本発明の抗リウマチ剤、特に
抗リウマチ様関節炎剤として分子内にジスルフィド結合
を有する化合物を使用する場合について説明する。還元
型グルタチオン量を減少させる作用を有する物質につい
ては、前記の通りジスルフイド結合を含有する化合物群
より選択され、ＩＬ−１２産生、ＮＯ産生、ＩＦＮγ産
生を抑制し、遅延型過敏症反応を抑制する作用を有する
物質を本発明においては用いることができるのである
が、前記シスチン誘導体の例としては、Ｎ，Ｎ’−ジア
セチルシスチン（(NAC)2）、Ｎ，Ｎ’−ジプロピルシス
チン（(NPC)2）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチ
ルエステル（(NAC-OMe)2）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシス
チンジイソプロピルエステル(（NAC-OiPr）2）、Ｎ，
Ｎ’−ジ−Ｌ−アラニルシスチンジメチルエステル（(N
AlaC-OMe)2）、これらのニトロキシブチルエステル体
等、前記構造式（１）に示され、マクロファージ細胞内
の還元型グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏症反応
を抑制し、ＩＬ−１２産生、ＮＯ産生、ＩＦＮγを抑制
する作用を有する化合物であれば全て本発明に使用可能
な前記シスチン誘導体に含まれる。
抗リウマチ様関節炎剤として分子内にジスルフィド結合
を有する化合物を使用する場合について説明する。還元
型グルタチオン量を減少させる作用を有する物質につい
ては、前記の通りジスルフイド結合を含有する化合物群
より選択され、ＩＬ−１２産生、ＮＯ産生、ＩＦＮγ産
生を抑制し、遅延型過敏症反応を抑制する作用を有する
物質を本発明においては用いることができるのである
が、前記シスチン誘導体の例としては、Ｎ，Ｎ’−ジア
セチルシスチン（(NAC)2）、Ｎ，Ｎ’−ジプロピルシス
チン（(NPC)2）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチ
ルエステル（(NAC-OMe)2）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシス
チンジイソプロピルエステル(（NAC-OiPr）2）、Ｎ，
Ｎ’−ジ−Ｌ−アラニルシスチンジメチルエステル（(N
AlaC-OMe)2）、これらのニトロキシブチルエステル体
等、前記構造式（１）に示され、マクロファージ細胞内
の還元型グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏症反応
を抑制し、ＩＬ−１２産生、ＮＯ産生、ＩＦＮγを抑制
する作用を有する化合物であれば全て本発明に使用可能
な前記シスチン誘導体に含まれる。
【００４４】この化合物の骨子としては、ジスルフイド
結合によりマクロフアージ細胞内の還元型グルタチオン
が酸化されて酸化型マクロフアージに誘導されるもので
あれば、Ｒ1−Ｒ4を表す置換基には、広範な範囲のもの
が許容される。例えば、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して
いて、炭素数１−１２のアルキル基、ニトロキシブチル
基等の置換基を有するアルキル基を、Ｒ3及びＲ4はそれ
ぞれ独立していて、炭素数１−１２のアシル基、及びペ
プチジル基の何れかを、それぞれ表す。尚、ペプチジル
基はアミノ酸残基又は複数のアミノ酸で構成されるペプ
チド残基でそのカルボキシル基を介して結合する残基を
意味し、またニトロキシ基は式：−ＯＮＯ2で示される
置換基である。
結合によりマクロフアージ細胞内の還元型グルタチオン
が酸化されて酸化型マクロフアージに誘導されるもので
あれば、Ｒ1−Ｒ4を表す置換基には、広範な範囲のもの
が許容される。例えば、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して
いて、炭素数１−１２のアルキル基、ニトロキシブチル
基等の置換基を有するアルキル基を、Ｒ3及びＲ4はそれ
ぞれ独立していて、炭素数１−１２のアシル基、及びペ
プチジル基の何れかを、それぞれ表す。尚、ペプチジル
基はアミノ酸残基又は複数のアミノ酸で構成されるペプ
チド残基でそのカルボキシル基を介して結合する残基を
意味し、またニトロキシ基は式：−ＯＮＯ2で示される
置換基である。
【００４５】また、ジスルフイド結合を有しなくても分
子内にＳＨ基（メルカプト基）を２個以上含有する化合
物で、生体内投与によって、ジスルフィド結合を含有す
る化合物に変換できる化合物で、マクロファージ細胞内
の還元型グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏症反応
を抑制し、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２産生を抑制する作用を
有する化合物であれば全て本発明に使用できる。この反
応性はＧＳＨ←ＧＳＳＧ、ＧＳＨ→ＧＳＳＧの平衡反応
と当該化合物の−ＳＨ，−Ｓ−Ｓ−交換反応のカップリ
ングの様式により決定されるものである。
子内にＳＨ基（メルカプト基）を２個以上含有する化合
物で、生体内投与によって、ジスルフィド結合を含有す
る化合物に変換できる化合物で、マクロファージ細胞内
の還元型グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏症反応
を抑制し、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２産生を抑制する作用を
有する化合物であれば全て本発明に使用できる。この反
応性はＧＳＨ←ＧＳＳＧ、ＧＳＨ→ＧＳＳＧの平衡反応
と当該化合物の−ＳＨ，−Ｓ−Ｓ−交換反応のカップリ
ングの様式により決定されるものである。
【００４６】マクロファージ（又は単球等）を９６穴マ
イクロプレートで、５×１０5細胞／２００μｌ／穴宛
培養し、被験物質を０．０１μＭ〜５ｍＭ添加し、３７
℃で５％ＣＯ2インキュベーターで培養し、２〜２４時
間後に対照群に対し還元型ＧＳＨ量を減少させるものな
らば何れも用いることができる。０．１ｎｍｏｌｅｓ／
５×１０5マクロファージ細胞以下に減少させることの
できるものが望ましい。これらの薬剤は単独若しくはそ
れらの混合物として用いることができる。その効果は摂
取若しくは投与後炎症局所や末梢血から単核球を採取
し、前述の方法で細胞内還元型グルタチオン量の治療前
に対する変化を検定することで判定できる。このことで
抗リウマチ剤としての有用性は明確に判定され、疾患に
対して効果を有する。
イクロプレートで、５×１０5細胞／２００μｌ／穴宛
培養し、被験物質を０．０１μＭ〜５ｍＭ添加し、３７
℃で５％ＣＯ2インキュベーターで培養し、２〜２４時
間後に対照群に対し還元型ＧＳＨ量を減少させるものな
らば何れも用いることができる。０．１ｎｍｏｌｅｓ／
５×１０5マクロファージ細胞以下に減少させることの
できるものが望ましい。これらの薬剤は単独若しくはそ
れらの混合物として用いることができる。その効果は摂
取若しくは投与後炎症局所や末梢血から単核球を採取
し、前述の方法で細胞内還元型グルタチオン量の治療前
に対する変化を検定することで判定できる。このことで
抗リウマチ剤としての有用性は明確に判定され、疾患に
対して効果を有する。
【００４７】対象として用いることのできる疾患として
は、リウマチ様関節炎やそのハイリスクの健康状態を挙
げることができる。
は、リウマチ様関節炎やそのハイリスクの健康状態を挙
げることができる。
【００４８】本発明で取扱う抗リウマチ剤は実際の医療
現場では単独で投与することもできるが、本発明に含ま
れる経口摂取可能な抗リウマチ剤同士、若しくは経口摂
取不可能であるが異なる作用機転でマクロファージの細
胞内の還元型グルタチオン量を減少させる他の免疫調整
剤、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）を代表と
するサイトカイン等生体外由来並びに生体内由来の物質
と混合若しくは併用することもできる。特に、細胞性免
疫を減弱することで治療効果を意図する場合にはインタ
ーロイキン−４（ＩＬ−４）やＴＧＦβと併用するとＩ
Ｌ−１２の産生が減弱し効果を増強する。これらサイト
カインはそれ自体がマクロファージの細胞内の還元型グ
ルタチオン量を変化させることも本発明者等により見出
され、本発明の有用性とその範囲を補強するものであ
る。生体外由来の物質としては抗体以外にもステロイド
剤、非ステロイド性酸性抗炎症剤や、ＤＭＡＲＤＳ等か
ら選択され、ＩＬ−１２の産生や機能を阻害する物質で
あれば、併用することにより更なる相乗効果が期待され
る。
現場では単独で投与することもできるが、本発明に含ま
れる経口摂取可能な抗リウマチ剤同士、若しくは経口摂
取不可能であるが異なる作用機転でマクロファージの細
胞内の還元型グルタチオン量を減少させる他の免疫調整
剤、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）を代表と
するサイトカイン等生体外由来並びに生体内由来の物質
と混合若しくは併用することもできる。特に、細胞性免
疫を減弱することで治療効果を意図する場合にはインタ
ーロイキン−４（ＩＬ−４）やＴＧＦβと併用するとＩ
Ｌ−１２の産生が減弱し効果を増強する。これらサイト
カインはそれ自体がマクロファージの細胞内の還元型グ
ルタチオン量を変化させることも本発明者等により見出
され、本発明の有用性とその範囲を補強するものであ
る。生体外由来の物質としては抗体以外にもステロイド
剤、非ステロイド性酸性抗炎症剤や、ＤＭＡＲＤＳ等か
ら選択され、ＩＬ−１２の産生や機能を阻害する物質で
あれば、併用することにより更なる相乗効果が期待され
る。
【００４９】細胞内の還元型グルタチオン量が多い、即
ち還元型ＧＳＨ含量の高いマクロファージ（還元型マク
ロファージ）を選択的に除去する物質を使用することも
本発明の抗リウマチ剤に含まれる。その際に用いられる
物質としては、低分子化合物、高分子化合物の何れでも
良く、中でも抗体及びその誘導体は特に有効である。
ち還元型ＧＳＨ含量の高いマクロファージ（還元型マク
ロファージ）を選択的に除去する物質を使用することも
本発明の抗リウマチ剤に含まれる。その際に用いられる
物質としては、低分子化合物、高分子化合物の何れでも
良く、中でも抗体及びその誘導体は特に有効である。
【００５０】既に述べた通り、マクロファージ／単球等
の機能の多様性と細胞亜集団の対応については今まで全
く不明であった。このため、炎症性、アレルギー性、免
疫性疾患の発症と病態進展に、マクロファージ／単球等
は極めて重要な役割を有しているにも拘らず、マクロフ
ァージ／単球等細胞亜集団の存在を想定しての機能分類
のヒトの疾患の治療、改善、予防への応用は全く為され
ておらず、想定されたことすら無かった。本発明完成の
前段階として、マクロファージの還元型ＧＳＨ含量を測
定すると共に、世界で始めて、ＧＳＨ含量を異にするマ
クロファージの免疫機能に及ぼす効果に大きな差のある
ことを見出し、炎症反応に重要な役割を果たしているマ
クロファージ細胞中の酸化型グルタチオンと還元型グル
タチオンの含量を検定することにより、不均一なマクロ
ファージ集団が２つのタイプ即ち酸化型マクロファージ
と還元型マクロファージとに分類され、酸化型マクロフ
ァージが免疫疾患に伴う局所慢性炎症やアレルギー反応
を引き起こし、液性免疫と細胞性免疫のバランスに関与
するＴｈ１／Ｔｈ２バランスはマクロファージの酸化／
還元状態によって制御されていること、当該マクロファ
ージの酸化還元状態が免疫性疾患の病態に重要な役割を
果たしていることが見出された。この２種のマクロファ
ージの存在割合を人為的に制御するには前記の経口摂取
可能な低分子物質を医薬品として用いる以外に、何れか
片方のマクロファージを選択的に除去することも頗る有
用な方法である。このことはリンパ球に対する各種モノ
クローナル抗体が免疫抑制剤として上市されている事実
からも明らかである。片方のマクロファージにのみ若し
くは多量に発現されているマーカーに対する抗体を用い
ればよいことは当該業者には容易に想定できるところで
ある。
の機能の多様性と細胞亜集団の対応については今まで全
く不明であった。このため、炎症性、アレルギー性、免
疫性疾患の発症と病態進展に、マクロファージ／単球等
は極めて重要な役割を有しているにも拘らず、マクロフ
ァージ／単球等細胞亜集団の存在を想定しての機能分類
のヒトの疾患の治療、改善、予防への応用は全く為され
ておらず、想定されたことすら無かった。本発明完成の
前段階として、マクロファージの還元型ＧＳＨ含量を測
定すると共に、世界で始めて、ＧＳＨ含量を異にするマ
クロファージの免疫機能に及ぼす効果に大きな差のある
ことを見出し、炎症反応に重要な役割を果たしているマ
クロファージ細胞中の酸化型グルタチオンと還元型グル
タチオンの含量を検定することにより、不均一なマクロ
ファージ集団が２つのタイプ即ち酸化型マクロファージ
と還元型マクロファージとに分類され、酸化型マクロフ
ァージが免疫疾患に伴う局所慢性炎症やアレルギー反応
を引き起こし、液性免疫と細胞性免疫のバランスに関与
するＴｈ１／Ｔｈ２バランスはマクロファージの酸化／
還元状態によって制御されていること、当該マクロファ
ージの酸化還元状態が免疫性疾患の病態に重要な役割を
果たしていることが見出された。この２種のマクロファ
ージの存在割合を人為的に制御するには前記の経口摂取
可能な低分子物質を医薬品として用いる以外に、何れか
片方のマクロファージを選択的に除去することも頗る有
用な方法である。このことはリンパ球に対する各種モノ
クローナル抗体が免疫抑制剤として上市されている事実
からも明らかである。片方のマクロファージにのみ若し
くは多量に発現されているマーカーに対する抗体を用い
ればよいことは当該業者には容易に想定できるところで
ある。
【００５１】また、細胞に対して毒性を有する物質やそ
の誘導体を用いることができるが、還元型マクロファー
ジと酸化型マクロファージの間には細胞内の各種酵素活
性に大きな違いがあるのでプロドラッグの形のもので酸
化型マクロファージの細胞内で選択的に細胞毒性を有す
る物質に変換できるもの等は、本発明も抗リウマチ剤に
最も叶うものである。
の誘導体を用いることができるが、還元型マクロファー
ジと酸化型マクロファージの間には細胞内の各種酵素活
性に大きな違いがあるのでプロドラッグの形のもので酸
化型マクロファージの細胞内で選択的に細胞毒性を有す
る物質に変換できるもの等は、本発明も抗リウマチ剤に
最も叶うものである。
【００５２】本発明の抗リウマチ剤、特に抗リウマチ関
節炎剤がリウマチ性疾患及び同疾患に伴う合併症に広く
適用できることは、マクロファージからの炎症性伝達因
子の分泌を基本的なところで制御することから明白であ
る。例えば、非ステロイド性酸性抗炎症剤（アスピリン
等）は、プロスタグランジン産生、遊離を抑制すること
でその薬効を発揮すると言われている。一方、ビタミン
Ｅ等の抗酸化剤は活性酸素の産生を抑制することで薬効
を発揮する等、その作用が図１に示す炎症性細胞たるマ
クロファージの多彩な機能の１局面を制御するのみであ
る。そのため、その効果も顕著ではなく、特に慢性炎症
には効果は殆ど認められない。それに対して本発明にな
る抗リウマチ関節炎剤はマクロファージの酸化／還元状
態を制御することを基本とするもので、有害な炎症伝達
因子の産生を一度に多数抑制できるものである。従来の
リウマチ治療剤の概念を基本から変革するものといえ
る。
節炎剤がリウマチ性疾患及び同疾患に伴う合併症に広く
適用できることは、マクロファージからの炎症性伝達因
子の分泌を基本的なところで制御することから明白であ
る。例えば、非ステロイド性酸性抗炎症剤（アスピリン
等）は、プロスタグランジン産生、遊離を抑制すること
でその薬効を発揮すると言われている。一方、ビタミン
Ｅ等の抗酸化剤は活性酸素の産生を抑制することで薬効
を発揮する等、その作用が図１に示す炎症性細胞たるマ
クロファージの多彩な機能の１局面を制御するのみであ
る。そのため、その効果も顕著ではなく、特に慢性炎症
には効果は殆ど認められない。それに対して本発明にな
る抗リウマチ関節炎剤はマクロファージの酸化／還元状
態を制御することを基本とするもので、有害な炎症伝達
因子の産生を一度に多数抑制できるものである。従来の
リウマチ治療剤の概念を基本から変革するものといえ
る。
【００５３】以上のように、本発明の抗リウマチ剤の医
療現場における有用な薬効は、その有用な薬理活性から
して自明であり、疾患の急性期、慢性期の何れにも、ま
たリウマチ性疾患に随伴する合併症の予防、治療、病態
改善にも有用である。
療現場における有用な薬効は、その有用な薬理活性から
して自明であり、疾患の急性期、慢性期の何れにも、ま
たリウマチ性疾患に随伴する合併症の予防、治療、病態
改善にも有用である。
【００５４】これらの薬剤は単独若しくはそれらの混合
物として用いることができる。その効果は摂取若しくは
投与後炎症局所や末梢血から単核球を採取し、前述の方
法で細胞内還元型グルタチオン量の治療前に対する変化
を検定し、生体の免疫活性の変動を測定することで判定
できる。
物として用いることができる。その効果は摂取若しくは
投与後炎症局所や末梢血から単核球を採取し、前述の方
法で細胞内還元型グルタチオン量の治療前に対する変化
を検定し、生体の免疫活性の変動を測定することで判定
できる。
【００５５】投与形態としては、注射投与、経口投与、
経皮的投与等特に制限はないが、経口投与可能というこ
とで特に有利である。有効成分である還元型グルタチオ
ン量を減少させる作用を有する物質の投与量は、患者等
投与対象者の症状や使用目的に応じて選択されるが、１
日当たり１ｍｇ〜５０００ｍｇ（経口剤）程度、好まし
くは１０〜５００ｍｇ程度である。製剤を製造する場合
は特に困難はなく、経口剤、注射剤、経皮剤等所望の剤
型において、それぞれ公知の方法を利用して製造するこ
とができる。
経皮的投与等特に制限はないが、経口投与可能というこ
とで特に有利である。有効成分である還元型グルタチオ
ン量を減少させる作用を有する物質の投与量は、患者等
投与対象者の症状や使用目的に応じて選択されるが、１
日当たり１ｍｇ〜５０００ｍｇ（経口剤）程度、好まし
くは１０〜５００ｍｇ程度である。製剤を製造する場合
は特に困難はなく、経口剤、注射剤、経皮剤等所望の剤
型において、それぞれ公知の方法を利用して製造するこ
とができる。
【００５６】以上、本発明の抗リウマチ剤が狭義の医薬
品として如何に有用で、優れているるかを説明した。本
発明による抗リウマチ剤は経口摂取可能な物質をその主
要成分とするため、その用途は、医療現場における医薬
品に限られない。即ち、ヒトマクロファージ（単球、ク
ッパー細胞及び樹状細胞等を含む）細胞内の還元型グル
タチオン量を減少させる作用を有する物質を単独若しく
は混合物として含有する医療用飲食品、健康食品、特定
保健食品等として飲食品（チューインガムや歯磨き等の
口に入れるものは全て含まれる）並びに栄養剤、輸液製
剤の形態で提供することも可能で有り、当然これ等も発
明に含まれる。更に、液体成分に含有させることも、固
形の飲食品の形をとることも可能である。
品として如何に有用で、優れているるかを説明した。本
発明による抗リウマチ剤は経口摂取可能な物質をその主
要成分とするため、その用途は、医療現場における医薬
品に限られない。即ち、ヒトマクロファージ（単球、ク
ッパー細胞及び樹状細胞等を含む）細胞内の還元型グル
タチオン量を減少させる作用を有する物質を単独若しく
は混合物として含有する医療用飲食品、健康食品、特定
保健食品等として飲食品（チューインガムや歯磨き等の
口に入れるものは全て含まれる）並びに栄養剤、輸液製
剤の形態で提供することも可能で有り、当然これ等も発
明に含まれる。更に、液体成分に含有させることも、固
形の飲食品の形をとることも可能である。
【００５７】適用対象としては医薬品として提供する場
合と同じである。
合と同じである。
【００５８】リウマチ性疾患および同疾患に伴う合併症
に広く適用でき、抗リウマチ関節炎作用を有する飲食品
並びに栄養剤、輸液製剤の形態で提供することのできる
ものである。有効成分の使用量については、前記医薬品
の場合に説明した内容に準じて行うとよい。
に広く適用でき、抗リウマチ関節炎作用を有する飲食品
並びに栄養剤、輸液製剤の形態で提供することのできる
ものである。有効成分の使用量については、前記医薬品
の場合に説明した内容に準じて行うとよい。
【００５９】尚、本発明において抗リウマチ剤は、その
予防を含めて各種のリウマチ（軽度もものから重度のの
まで）に適用可能であり、従って発症、慢性化したリウ
マチ性疾患だけでなく、リウマチ性疾患のハイリスクの
人に予防的に摂取させることを可能にする。
予防を含めて各種のリウマチ（軽度もものから重度のの
まで）に適用可能であり、従って発症、慢性化したリウ
マチ性疾患だけでなく、リウマチ性疾患のハイリスクの
人に予防的に摂取させることを可能にする。
【００６０】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。
【００６１】（実施例１） ＜酸化型マクロファージ及び還元型マクロファージの機
能の検定＞ （方法）酸化型マクロファージは、ＬＰＳ（リポポリサ
ッカライド）２０μｇをマウス腹腔内に投与して誘導さ
れること、還元型マクロファージはレンチナン１００μ
ｇを同じく腹腔内に１日おきに３回投与することにより
誘導されていることが、腹腔浸出細胞をプラスチック表
面に付着させた後、モノクロロバイメイン１０μＭと３
７℃、３０分間反応させ、ＡＣＡＳで解析することで判
明した。酸化型の増量は反応産物が殆ど認められないこ
と、即ちネズミ色や青色の画像になること、還元型の増
量は赤色や黄色の画像が得られることから肉眼的に容易
に検定できる。
能の検定＞ （方法）酸化型マクロファージは、ＬＰＳ（リポポリサ
ッカライド）２０μｇをマウス腹腔内に投与して誘導さ
れること、還元型マクロファージはレンチナン１００μ
ｇを同じく腹腔内に１日おきに３回投与することにより
誘導されていることが、腹腔浸出細胞をプラスチック表
面に付着させた後、モノクロロバイメイン１０μＭと３
７℃、３０分間反応させ、ＡＣＡＳで解析することで判
明した。酸化型の増量は反応産物が殆ど認められないこ
と、即ちネズミ色や青色の画像になること、還元型の増
量は赤色や黄色の画像が得られることから肉眼的に容易
に検定できる。
【００６２】そこで、腹腔浸出付着細胞を以下のように
して酸化型及び還元型に誘導して産生されるＮＯ、ＩＬ
−６及びＰＧＥ２を測定した。
して酸化型及び還元型に誘導して産生されるＮＯ、ＩＬ
−６及びＰＧＥ２を測定した。
【００６３】（１）材料 細胞：上記のように刺激して得られた腹腔浸出付着細
胞、即ちマクロファージを９６穴マイクロプレートに１
×１０5細胞／２００μｌ宛添加。
胞、即ちマクロファージを９６穴マイクロプレートに１
×１０5細胞／２００μｌ宛添加。
【００６４】培地：フエノールレッドフリーのＲＰＭＩ
１６４０：２００μｌ／穴。
１６４０：２００μｌ／穴。
【００６５】ＬＰＳ：リポポリサッカライド（シグマ社
製）（由来：Ｅ．ｃｏｌｉ）１００ｎｇ／ｍｌ。 ＩＦＮγ：１００単位／ｍｌ。
製）（由来：Ｅ．ｃｏｌｉ）１００ｎｇ／ｍｌ。 ＩＦＮγ：１００単位／ｍｌ。
【００６６】（２）培養方法 ５％ ＣＯ2インキュベーター中３７℃で、４８時間培
養。
養。
【００６７】（３）測定方法 上記培養終了後、培養上清を回収し、ＩＬ−６はＩＬ−
６依存性の細胞株のＭＨ６０を用いて増殖反応で、ＰＧ
Ｅ２はエライザキットを用いて、ＮＯはグリースロイミ
ン試薬を用いて、何れも当該業者が日常に行う方法で各
々の産生量を測定した。
６依存性の細胞株のＭＨ６０を用いて増殖反応で、ＰＧ
Ｅ２はエライザキットを用いて、ＮＯはグリースロイミ
ン試薬を用いて、何れも当該業者が日常に行う方法で各
々の産生量を測定した。
【００６８】（結果）結果を図３に示した。図３から明
らかなように、酸化型マクロファージと還元型マクロフ
ァージとでは、産生する炎症性サイトカインＩＬ−６、
炎症性メディエーターＰＧＥ２、ＮＯの産生強度、種類
が異なることが明らかである。即ち、酸化型マクロファ
ージではＴｈ２サイトカインであるＩＬ−６の産生と免
疫抑制性でＴｈ１誘導を抑制するＰＧＥ２産生が上昇
し、ＮＯ産生は低下する。これとは対照的に還元型マク
ロファージからはＮＯの産生が上昇し、ＰＧＥ２産生や
ＩＬ−６産生は抑制される。両マクロファージの間に機
能的な差異が存在することが明確である。
らかなように、酸化型マクロファージと還元型マクロフ
ァージとでは、産生する炎症性サイトカインＩＬ−６、
炎症性メディエーターＰＧＥ２、ＮＯの産生強度、種類
が異なることが明らかである。即ち、酸化型マクロファ
ージではＴｈ２サイトカインであるＩＬ−６の産生と免
疫抑制性でＴｈ１誘導を抑制するＰＧＥ２産生が上昇
し、ＮＯ産生は低下する。これとは対照的に還元型マク
ロファージからはＮＯの産生が上昇し、ＰＧＥ２産生や
ＩＬ−６産生は抑制される。両マクロファージの間に機
能的な差異が存在することが明確である。
【００６９】（実施例２） ＜リウマチ患者滑膜細胞を用いた検定＞酸化型Ｍφと還
元型Ｍφにおいて、何故炎症メディエーターやサイトカ
インの産生に違いが生じるのかを物質レベルで解析する
ことは、炎症の慢性化、増悪のメカニズムを解明するた
めに重要である。一般に、外からの刺激（リガンド等）
は、細胞表面上に存在する受容体（レセプター）を介し
て細胞内に伝達する。レセプターからの信号により、種
々のキナーゼが活性化され、更に転写因子が活性化さ
れ、転写因子が核内に移行し、標的となる遺伝子に結合
して発現する。最近の研究により、細胞内の酸化還元系
は、転写因子の活性化、核内への移行、遺伝子との結合
に関与していることが明らかとなりつつある（ANNUAL R
EV. IMMUNOLOGY, VOL.8, PP453-475,1990, EMBO J.,10,
2247-2251, 1991))。Ｍφにおける炎症メデイーターや
サイトカインのレセプターを介した遺伝子発現系に、細
胞内の酸化還元系がどのように関与しているかは現在の
ところ明らかではない。
元型Ｍφにおいて、何故炎症メディエーターやサイトカ
インの産生に違いが生じるのかを物質レベルで解析する
ことは、炎症の慢性化、増悪のメカニズムを解明するた
めに重要である。一般に、外からの刺激（リガンド等）
は、細胞表面上に存在する受容体（レセプター）を介し
て細胞内に伝達する。レセプターからの信号により、種
々のキナーゼが活性化され、更に転写因子が活性化さ
れ、転写因子が核内に移行し、標的となる遺伝子に結合
して発現する。最近の研究により、細胞内の酸化還元系
は、転写因子の活性化、核内への移行、遺伝子との結合
に関与していることが明らかとなりつつある（ANNUAL R
EV. IMMUNOLOGY, VOL.8, PP453-475,1990, EMBO J.,10,
2247-2251, 1991))。Ｍφにおける炎症メデイーターや
サイトカインのレセプターを介した遺伝子発現系に、細
胞内の酸化還元系がどのように関与しているかは現在の
ところ明らかではない。
【００７０】（サイトカイン、刺激剤）マウスＩＦＮγ
には、ゲンザイム社製のリコンビナント体を用いた。ヒ
トＩＬ−２及びヒトＩＬ−６には、味の素社の作製した
リコンビナント体を用いた。ヒトＩＬ−１２には、ファ
ーミンジェン社製のリコンビナント体を用いた。
には、ゲンザイム社製のリコンビナント体を用いた。ヒ
トＩＬ−２及びヒトＩＬ−６には、味の素社の作製した
リコンビナント体を用いた。ヒトＩＬ−１２には、ファ
ーミンジェン社製のリコンビナント体を用いた。
【００７１】ＬＰＳには、ディフコ社製のＥ．Ｃｏｌ
ｉ．０５５；Ｂ５由来のものを用いた。レンチナンとし
ては、味の素社で製造した製剤品を用いた。
ｉ．０５５；Ｂ５由来のものを用いた。レンチナンとし
ては、味の素社で製造した製剤品を用いた。
【００７２】（関節由来マクロフアージ）滑膜組織は関
節手術の際に得られるものから無菌的に採取した。採取
した滑膜組織を燐酸緩衝液で洗浄した後、同緩衝液の入
ったシヤーレ中でその表面を剥離後、はさみで細切し、
シグマ社製のヒアウウロニダーゼ（２％）、ＤＮａｓｅ
（０．２％，ウシすい臓由来）及び５％コラゲナーゼを
添加し、３７℃において２時間酵素処理した。デブリス
を除去した後に、細胞を遠心分離して１０％ ＦＣＳ含
有フェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地（日研生物社
製）で５×１０5個／ｍｌに調製し、３時間プラスチッ
ク表面に付着させた。付着性のマクロフアージ様細胞を
ラバーポリースマンで回収し、氷冷した上記培地で３回
洗浄遠沈の後、滑膜組織由来のマクロフアージとして下
記実験に供した。
節手術の際に得られるものから無菌的に採取した。採取
した滑膜組織を燐酸緩衝液で洗浄した後、同緩衝液の入
ったシヤーレ中でその表面を剥離後、はさみで細切し、
シグマ社製のヒアウウロニダーゼ（２％）、ＤＮａｓｅ
（０．２％，ウシすい臓由来）及び５％コラゲナーゼを
添加し、３７℃において２時間酵素処理した。デブリス
を除去した後に、細胞を遠心分離して１０％ ＦＣＳ含
有フェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地（日研生物社
製）で５×１０5個／ｍｌに調製し、３時間プラスチッ
ク表面に付着させた。付着性のマクロフアージ様細胞を
ラバーポリースマンで回収し、氷冷した上記培地で３回
洗浄遠沈の後、滑膜組織由来のマクロフアージとして下
記実験に供した。
【００７３】（ＩＬ−６の定量）１×１０6個のＭφに
刺激剤を添加し、３７℃のＣＯ2インキュベーターにて
２日間培養した。遠心後培養上清を採取した。
刺激剤を添加し、３７℃のＣＯ2インキュベーターにて
２日間培養した。遠心後培養上清を採取した。
【００７４】ＩＬ−６の定量は、ＩＬ−６に依存的に増
殖するマウスハイブリドーマＭＨ６０細胞を用いて行っ
た（EUR. J. IMMUNOL., VOL. 18, PP 951, 1988)。１０
％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で１×１０5個／ｍｌに調製
したＭＨ６０細胞液１００μｌに、培養上清１００μｌ
を添加し、３７℃のＣＯ2インキュベーターにて、２日
間培養した。その後、同培地にて５ｍｇ／ｍｌの濃度に
調製したＭＴＴ（シグマ社製）を１０μｌ加え、３７℃
にて５時間反応させた。反応終了後遠心し、上清を１６
０μｌ取り除き、塩酸−プロパノールを１００μｌ加え
て、ピペットマンで懸濁することにより細胞を溶解し
た。溶解後直ちに５７０ｎｍの吸光度をイムノメーター
（バイオラッド社製）により測定した。
殖するマウスハイブリドーマＭＨ６０細胞を用いて行っ
た（EUR. J. IMMUNOL., VOL. 18, PP 951, 1988)。１０
％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地で１×１０5個／ｍｌに調製
したＭＨ６０細胞液１００μｌに、培養上清１００μｌ
を添加し、３７℃のＣＯ2インキュベーターにて、２日
間培養した。その後、同培地にて５ｍｇ／ｍｌの濃度に
調製したＭＴＴ（シグマ社製）を１０μｌ加え、３７℃
にて５時間反応させた。反応終了後遠心し、上清を１６
０μｌ取り除き、塩酸−プロパノールを１００μｌ加え
て、ピペットマンで懸濁することにより細胞を溶解し
た。溶解後直ちに５７０ｎｍの吸光度をイムノメーター
（バイオラッド社製）により測定した。
【００７５】（ＮＯ2−濃度の測定）１×１０6個のＭφ
に刺激剤を添加し、３７℃のＣＯ2インキュベーターに
て２日間培養した。遠心後培養上清を採取した。
に刺激剤を添加し、３７℃のＣＯ2インキュベーターに
て２日間培養した。遠心後培養上清を採取した。
【００７６】１００μｌの培養上清に、５０ｍｇ／ｍｌ
の濃度に蒸留水で調製したグリースロイミン試薬（和光
純薬社製）を１００μｌ加えて室温で１５分間反応させ
た。反応終了後、５４０ｎｍの吸光度を測定した。尚、
スタンダードとして、ＮａＮＯ2を用いた。
の濃度に蒸留水で調製したグリースロイミン試薬（和光
純薬社製）を１００μｌ加えて室温で１５分間反応させ
た。反応終了後、５４０ｎｍの吸光度を測定した。尚、
スタンダードとして、ＮａＮＯ2を用いた。
【００７７】（ＡＣＡＳによる細胞内ＧＳＨの検出）Ｃ
ｈａｍｂｅｒｅｄ ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ（Ｎｕｎｃ社
製、＃１３６４３９）に、ＲＰＭＩ１６４０培地（フェ
ノールレッドフリー）にて調製した３×１０ 5個／ｍｌ
の細胞懸濁液を３００μｌ入れ、３７℃のＣＯ2インキ
ュベーターにて２時間培養した。同培地にて洗浄後、同
培地にて調製した１０μＭのモノクロロバイメイン（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｌｏｂｅ社製）を３００μｌ添加
し、３７℃のＣＯ2インキュベーターに入れ、３０分反
応させた後、ＡＣＡＳにて蛍光 強度を測定した。尚、
ＡＣＡＳではＵＶレーザーを用いた。
ｈａｍｂｅｒｅｄ ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ（Ｎｕｎｃ社
製、＃１３６４３９）に、ＲＰＭＩ１６４０培地（フェ
ノールレッドフリー）にて調製した３×１０ 5個／ｍｌ
の細胞懸濁液を３００μｌ入れ、３７℃のＣＯ2インキ
ュベーターにて２時間培養した。同培地にて洗浄後、同
培地にて調製した１０μＭのモノクロロバイメイン（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｌｏｂｅ社製）を３００μｌ添加
し、３７℃のＣＯ2インキュベーターに入れ、３０分反
応させた後、ＡＣＡＳにて蛍光 強度を測定した。尚、
ＡＣＡＳではＵＶレーザーを用いた。
【００７８】（ＩＬ−１２の定量）ＩＬ−１２定量は、
ヒトＴ細胞株２Ｄ６細胞を用いたバイオアッセイで行っ
た(J. LEUKOCYTE BIOLOGY, VOL 61, PP346, 1997)。
ヒトＴ細胞株２Ｄ６細胞を用いたバイオアッセイで行っ
た(J. LEUKOCYTE BIOLOGY, VOL 61, PP346, 1997)。
【００７９】５００ｐｇ／ｍｌのリコンビナントヒトＩ
Ｌ−１２、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１０
％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に
て培養しておいた２Ｄ６細胞をチューブに移し、ＩＬ−
１２を除いた同培地にて３回遠心洗浄し、細胞濃度を１
×１０5／ｍｌに調製した。予め５０μＭの２−メルカ
プトエタノール、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０
培地により系列希釈したサンプルを１００μｌづつ入れ
た９６穴平底プレートに、細胞懸濁液を１００μｌづつ
加えた。その後、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター
に入れ、４８時間培養した。最後の６時間で、3Ｈ−Ｔ
ｄＲをパルスした（５０μＭの２−メルカプトエタノー
ル、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地により、
３７０ｋＢｑ／ｍｌに調製したものを５０μｌづつ添
加）。細胞をハーベストし、βカウンター（マトリック
ス９６；パッカード社製）で放射活性を測定した。
Ｌ−１２、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１０
％ＦＣＳ（牛胎児血清）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に
て培養しておいた２Ｄ６細胞をチューブに移し、ＩＬ−
１２を除いた同培地にて３回遠心洗浄し、細胞濃度を１
×１０5／ｍｌに調製した。予め５０μＭの２−メルカ
プトエタノール、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０
培地により系列希釈したサンプルを１００μｌづつ入れ
た９６穴平底プレートに、細胞懸濁液を１００μｌづつ
加えた。その後、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター
に入れ、４８時間培養した。最後の６時間で、3Ｈ−Ｔ
ｄＲをパルスした（５０μＭの２−メルカプトエタノー
ル、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地により、
３７０ｋＢｑ／ｍｌに調製したものを５０μｌづつ添
加）。細胞をハーベストし、βカウンター（マトリック
ス９６；パッカード社製）で放射活性を測定した。
【００８０】（実施例３） （リウマチ患者滑膜組織より調製したＭφのＧＳＨ濃度
の測定）前述の方法でマクロフアージ様細胞を調製し、
ＭＣＢ試薬を用いたＡＣＡＳにより、細胞内ＧＳＨ量を
解析した。採取したマクロファージを３×１０6個／ｍ
ｌになるように１０％牛胎児血清含有フエノールレッド
フリーの ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１００μｌ
宛Ｌａｂ−ＴｅｋＣｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅ（ＮＵＮ
Ｃ社製、＃１３６４３９）に添加し、３７℃、５％ＣＯ
2条件下、３時間培養し、浮遊細胞を除去した後、血清
非含有の上記培地を２００μｌ添加し、次いでモノクロ
ロバイメイン（ＭＯＮＯＣＨＬＯＲＯＢＩＭＡＮＥ＝Ｍ
ＣＢ）を１０μＭになるように添加し、３０分間反応さ
せ、ＡＣＡＳ装置（ＭＥＲＩＤＩＥＮ社製）にてＵＶ吸
収を基に画像解析した。
の測定）前述の方法でマクロフアージ様細胞を調製し、
ＭＣＢ試薬を用いたＡＣＡＳにより、細胞内ＧＳＨ量を
解析した。採取したマクロファージを３×１０6個／ｍ
ｌになるように１０％牛胎児血清含有フエノールレッド
フリーの ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１００μｌ
宛Ｌａｂ−ＴｅｋＣｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅ（ＮＵＮ
Ｃ社製、＃１３６４３９）に添加し、３７℃、５％ＣＯ
2条件下、３時間培養し、浮遊細胞を除去した後、血清
非含有の上記培地を２００μｌ添加し、次いでモノクロ
ロバイメイン（ＭＯＮＯＣＨＬＯＲＯＢＩＭＡＮＥ＝Ｍ
ＣＢ）を１０μＭになるように添加し、３０分間反応さ
せ、ＡＣＡＳ装置（ＭＥＲＩＤＩＥＮ社製）にてＵＶ吸
収を基に画像解析した。
【００８１】（結果）ＡＣＡＳ法により、還元型グルタ
チオンを定量した結果、変形性関節炎患者組織由来のマ
クロフアージに比べ、活動期リウマチ患者組織由来のマ
クロフアージにおいては、還元型グルタチオン含量が減
少したマクロファージ、即ち酸化型マクロファージが相
対的に増量した。酸化型マクロファージが増量している
ため、上記マクロファージ培養上清中のＩＬ−６が顕著
に増量していた。数多くのパラメーターを測定しなくて
もマクロファージの酸化還元状態をグルタチオンの含量
を測定することで、リウマチ患者の病態、免疫機能診断
等のための検定を簡便且つ的確に行うことができること
を示す。このこのことにより、本発明の抗リウマチ剤の
使用に当たり、以上のマクロファージ分類方法により、
患者の病態、免疫機能診断等のための検定を行うことが
できる。
チオンを定量した結果、変形性関節炎患者組織由来のマ
クロフアージに比べ、活動期リウマチ患者組織由来のマ
クロフアージにおいては、還元型グルタチオン含量が減
少したマクロファージ、即ち酸化型マクロファージが相
対的に増量した。酸化型マクロファージが増量している
ため、上記マクロファージ培養上清中のＩＬ−６が顕著
に増量していた。数多くのパラメーターを測定しなくて
もマクロファージの酸化還元状態をグルタチオンの含量
を測定することで、リウマチ患者の病態、免疫機能診断
等のための検定を簡便且つ的確に行うことができること
を示す。このこのことにより、本発明の抗リウマチ剤の
使用に当たり、以上のマクロファージ分類方法により、
患者の病態、免疫機能診断等のための検定を行うことが
できる。
【００８２】（リウマチ患者関節腔より調製したＭφの
機能）変形性関節症および活動期のリウマチ患者滑膜由
来のマクロフアージ細胞を上記方法で調製し、ＬＰＳ、
ＩＬ−２、ＩＦＮγ及びその組み合わせにより刺激し、
ＮＯ産生及びＩＬ−１２産生能を測定した。ＩＬ−１２
産生に関しては、無刺激では何れでも殆ど産生が見られ
ず、ＬＰＳとＩＦＮγ刺激の組み合わせにおいても産生
は認められなかった。ＮＯ産生は活動期リウマチ関節炎
患者由来のマクロフアージにおいては、対照の２−４分
の１に低下した。このことは、活動期リウマチ患者では
酸化型マクロファージが優位でＴｈ２主流の液性免疫が
亢進し、Ｔｈ１によって担われる細胞性免疫が低下して
いることを示す。以上の知見はリウマチ患者において
も、本発明の抗リウマチ剤提供や適用に必要な疾患の病
態診断がマクロフアージのＧＳＨ含量の検定で可能なこ
とを示し、本発明が独創的で、有意義であることを明確
に示す例である。
機能）変形性関節症および活動期のリウマチ患者滑膜由
来のマクロフアージ細胞を上記方法で調製し、ＬＰＳ、
ＩＬ−２、ＩＦＮγ及びその組み合わせにより刺激し、
ＮＯ産生及びＩＬ−１２産生能を測定した。ＩＬ−１２
産生に関しては、無刺激では何れでも殆ど産生が見られ
ず、ＬＰＳとＩＦＮγ刺激の組み合わせにおいても産生
は認められなかった。ＮＯ産生は活動期リウマチ関節炎
患者由来のマクロフアージにおいては、対照の２−４分
の１に低下した。このことは、活動期リウマチ患者では
酸化型マクロファージが優位でＴｈ２主流の液性免疫が
亢進し、Ｔｈ１によって担われる細胞性免疫が低下して
いることを示す。以上の知見はリウマチ患者において
も、本発明の抗リウマチ剤提供や適用に必要な疾患の病
態診断がマクロフアージのＧＳＨ含量の検定で可能なこ
とを示し、本発明が独創的で、有意義であることを明確
に示す例である。
【００８３】（実施例４） ＜リウマチ患者組織由来のマクロフアージ様細胞培養系
への薬剤添加によるマクロファージのレドックス機能の
修飾＞実施例３と同様の方法でリウマチ患者組織由来マ
クロフアージ様細胞を採取し、３×１０6個／ｍｌにな
るように１０％牛胎児血清含有フ エノールレッドフリ
ーのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１００μｌ宛Ｌａ
ｂ−ＴｅｋＣｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅ（ＮＵＮＣ社
製、＃１３６４３９）に添加し、３７℃、５％ＣＯ 2条
件下、３時間培養し、浮遊細胞を除去した後、血清非含
有の上記培地に下記薬剤を含有させたものを２００μ
ｌ添加し、４時間反応させ、３回洗浄後、血清非含 有
の上記培地を２００μｌ添加し、モノクロロバイメイン
を１０μＭになるように添加し、３０分間反応させ、Ａ
ＣＡＳ装置（ＭＥＲＩＤＩＥＮ社製）にてＵＶ吸収を基
に画像解析した。
への薬剤添加によるマクロファージのレドックス機能の
修飾＞実施例３と同様の方法でリウマチ患者組織由来マ
クロフアージ様細胞を採取し、３×１０6個／ｍｌにな
るように１０％牛胎児血清含有フ エノールレッドフリ
ーのＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、１００μｌ宛Ｌａ
ｂ−ＴｅｋＣｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅ（ＮＵＮＣ社
製、＃１３６４３９）に添加し、３７℃、５％ＣＯ 2条
件下、３時間培養し、浮遊細胞を除去した後、血清非含
有の上記培地に下記薬剤を含有させたものを２００μ
ｌ添加し、４時間反応させ、３回洗浄後、血清非含 有
の上記培地を２００μｌ添加し、モノクロロバイメイン
を１０μＭになるように添加し、３０分間反応させ、Ａ
ＣＡＳ装置（ＭＥＲＩＤＩＥＮ社製）にてＵＶ吸収を基
に画像解析した。
【００８４】（結果）ＡＣＡＳ法により、還元型グルタ
チオンを定量した結果、対照生理食塩水添加群に比べ、
グルタチオンエチルエステル添加（２ｍＭ）の群では、
還元型グルタチオン含量が減少したマクロファージ、即
ち酸化型マクロファージが相対的に減量した。還元型マ
クロファージが増量しているため、上記マクロファージ
培養上清中のＩＬ−６が顕著に減量していた。同様の作
用はγ−グルタミルシステインジメチルエステル、Ｎ−
アセチルシステインニトロキシブチルエステル、グルタ
チオンモノエチルエステル、グルタチオンニトロキシブ
チルエステル及びグルタチオンジエチルエステル（何れ
も２ｍＭ添加）でも認められた。逆に還元型グルタチオ
ン含量の低い酸化型マクロフアージの誘導されること
は、シスチン誘導体（分子内にジスルフィド結合を有す
る化合物）である、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンニト
ロキシブチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチン
ジメチルエステル（(NAC-OMe)2）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチ
ルシスチンジイソプロピルエステル(（NAC-OiPr）2）、
Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｌ−アラニルシスチンジメチルエステル
（(NAlaC-OMe)2）〔何れも２μＭ〕の添加により確認さ
れた。
チオンを定量した結果、対照生理食塩水添加群に比べ、
グルタチオンエチルエステル添加（２ｍＭ）の群では、
還元型グルタチオン含量が減少したマクロファージ、即
ち酸化型マクロファージが相対的に減量した。還元型マ
クロファージが増量しているため、上記マクロファージ
培養上清中のＩＬ−６が顕著に減量していた。同様の作
用はγ−グルタミルシステインジメチルエステル、Ｎ−
アセチルシステインニトロキシブチルエステル、グルタ
チオンモノエチルエステル、グルタチオンニトロキシブ
チルエステル及びグルタチオンジエチルエステル（何れ
も２ｍＭ添加）でも認められた。逆に還元型グルタチオ
ン含量の低い酸化型マクロフアージの誘導されること
は、シスチン誘導体（分子内にジスルフィド結合を有す
る化合物）である、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンニト
ロキシブチルエステル、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチン
ジメチルエステル（(NAC-OMe)2）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチ
ルシスチンジイソプロピルエステル(（NAC-OiPr）2）、
Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｌ−アラニルシスチンジメチルエステル
（(NAlaC-OMe)2）〔何れも２μＭ〕の添加により確認さ
れた。
【００８５】（実施例５） ＜ザルコイドーシス疾患患者から採取したマクロファー
ジの検定とその酸化状態の還元状態への変換＞ザルコイ
ドーシス（類肉腫症）の疾患の患者の末梢血及び胸腔内
より常法により分離・採取した単核球中に含まれるマク
ロファージの酸化型及び還元型マクロファージの量を酵
素リサイクリング法により、還元型グルタチオン（ＧＳ
Ｈ）及び酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の量を生化学
的に測定することにより検定を行った。対照としては健
常人の末梢血を用いた。
ジの検定とその酸化状態の還元状態への変換＞ザルコイ
ドーシス（類肉腫症）の疾患の患者の末梢血及び胸腔内
より常法により分離・採取した単核球中に含まれるマク
ロファージの酸化型及び還元型マクロファージの量を酵
素リサイクリング法により、還元型グルタチオン（ＧＳ
Ｈ）及び酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の量を生化学
的に測定することにより検定を行った。対照としては健
常人の末梢血を用いた。
【００８６】（材料）健常人の末梢血及びザルコイドー
シス患者の末梢血をヘパリン採血或は患者の気管支に経
気管支鏡（ＢＲＯＮＣＨＯＦＩＢＥＲ）的に１５０ｍｌ
の生理食塩水を注入し、７５ｍｌを回収して、何れもフ
ィコールーハイペーク（ＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ）で分離
精製した単核球を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４
０倍地に懸濁し、３回洗浄後、ガラスシヤーレに３０分
間付着させたマクロファージ／単球画分を用いた。この
後、５ｍＭのＮーアセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加
して３時間培養する群及び培地成分のみの群を調製し
た。シャーレからの分離にはラバーポリースマンを用い
た。５×１０6個のマクロファージについて以下のよう
に検定を実施した。
シス患者の末梢血をヘパリン採血或は患者の気管支に経
気管支鏡（ＢＲＯＮＣＨＯＦＩＢＥＲ）的に１５０ｍｌ
の生理食塩水を注入し、７５ｍｌを回収して、何れもフ
ィコールーハイペーク（ＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ）で分離
精製した単核球を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４
０倍地に懸濁し、３回洗浄後、ガラスシヤーレに３０分
間付着させたマクロファージ／単球画分を用いた。この
後、５ｍＭのＮーアセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加
して３時間培養する群及び培地成分のみの群を調製し
た。シャーレからの分離にはラバーポリースマンを用い
た。５×１０6個のマクロファージについて以下のよう
に検定を実施した。
【００８７】（方法）還元型と酸化型のグルタチオンの
測定は前述の酵素リサイクリング法によった。
測定は前述の酵素リサイクリング法によった。
【００８８】（サンプル調製）ＰＢＳにて洗浄した細胞
のペレットに、冷やした５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍ
リン酸バッファー、ｐＨ７．５により調製したＴｒｉｔ
ｏｎＸ−１００を１００μｌ添加し、５分間室温に放置
して細胞を溶解した。０．１ＭのＨＣｌを１５μｌ添加
し、更に５０％ ｓｕｌｆｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃ
ｉｄ（ＳＳＡ）溶液を１５μｌ添加して混合後、１２，
０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を採取し［＊］、総
グルタチオン濃度（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）の測定サンプル
とした。
のペレットに、冷やした５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍ
リン酸バッファー、ｐＨ７．５により調製したＴｒｉｔ
ｏｎＸ−１００を１００μｌ添加し、５分間室温に放置
して細胞を溶解した。０．１ＭのＨＣｌを１５μｌ添加
し、更に５０％ ｓｕｌｆｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃ
ｉｄ（ＳＳＡ）溶液を１５μｌ添加して混合後、１２，
０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を採取し［＊］、総
グルタチオン濃度（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）の測定サンプル
とした。
【００８９】（測定法）０．５ｍＭＥＤＴＡを含む１０
ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５を５９０μｌ、６ｕ
／ｍｌの濃度に同バッファーで調製したグルタチオンリ
ダクターゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を１００μ
ｌ、５％ＮａＨＣＯ3にて調製した４ｍＭのＮＡＤＰＨ
（シグマ社製）を５０μｌ、サンプルを１０μｌ加え
て、３７℃にて５分間インキュベートし、５ｍＭＥＤＴ
Ａを含む０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．５により
調製した１０ｍＭの５，５’−ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ
（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＴＮ
Ｂ；シグマ社製）溶液を５０μｌ加えて、３７℃におけ
る４１２ｎｍの吸光度の経時的変化を分光光度計により
測定した。尚、標準サンプルとして、ＧＳＨ（シグマ社
製）をサンプルと同じ調製法で調製して用いた。別途、
酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）量のみを測定し−−上
記＊印の後に、２μｌの２ービニルピリジン（東京化成
社製）を添加し、室温で１分間混和しｐＨを７．５に調
製後、室温に６０分間放置し、測定サンプルとし、同様
に測定する−−総グルタチオン量より差し引くことで還
元型グルタチオン（ＧＳＨ）量を求めた。
ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．５を５９０μｌ、６ｕ
／ｍｌの濃度に同バッファーで調製したグルタチオンリ
ダクターゼ（ベーリンガーマンハイム社製）を１００μ
ｌ、５％ＮａＨＣＯ3にて調製した４ｍＭのＮＡＤＰＨ
（シグマ社製）を５０μｌ、サンプルを１０μｌ加え
て、３７℃にて５分間インキュベートし、５ｍＭＥＤＴ
Ａを含む０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．５により
調製した１０ｍＭの５，５’−ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ
（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＴＮ
Ｂ；シグマ社製）溶液を５０μｌ加えて、３７℃におけ
る４１２ｎｍの吸光度の経時的変化を分光光度計により
測定した。尚、標準サンプルとして、ＧＳＨ（シグマ社
製）をサンプルと同じ調製法で調製して用いた。別途、
酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）量のみを測定し−−上
記＊印の後に、２μｌの２ービニルピリジン（東京化成
社製）を添加し、室温で１分間混和しｐＨを７．５に調
製後、室温に６０分間放置し、測定サンプルとし、同様
に測定する−−総グルタチオン量より差し引くことで還
元型グルタチオン（ＧＳＨ）量を求めた。
【００９０】（結果）患者の末梢血中の還元型と酸化型
グルタチオンの量はＧＳＳＧ ５．２９μＭ、ＧＳＨ
２０．４５μＭと還元型ＧＳＨが還元型が約８０％で、
依然として優位であるが（健常人においては９０％以上
が還元型ＧＳＨである）、胸腔内マクロファージでは還
元型ＧＳＨが１．４５μＭであり、酸化型ＧＳＳＧが１
５．８５μＭと酸化型が約８６％とその存在比が完全に
逆転することが判明した。ＮＡＣ添加群においては、還
元型ＧＳＨが２０．４５μＭであり、酸化型ＧＳＳＧが
４．３２μＭと酸化型が急激に減少し、還元型の比率が
８０％を越え、末梢血レベルに回復した。このことは、
本疾患において酸化型マクロファージが病態形成に大き
な位置を占めること、その病態がＮＡＣ投与で改善でき
ることを示し、本発明の効果は単に病態動物に留まら
ず、リウマチ患者やそのハイリスクの人においても本発
明の適用が有用であることを示唆するものである。
グルタチオンの量はＧＳＳＧ ５．２９μＭ、ＧＳＨ
２０．４５μＭと還元型ＧＳＨが還元型が約８０％で、
依然として優位であるが（健常人においては９０％以上
が還元型ＧＳＨである）、胸腔内マクロファージでは還
元型ＧＳＨが１．４５μＭであり、酸化型ＧＳＳＧが１
５．８５μＭと酸化型が約８６％とその存在比が完全に
逆転することが判明した。ＮＡＣ添加群においては、還
元型ＧＳＨが２０．４５μＭであり、酸化型ＧＳＳＧが
４．３２μＭと酸化型が急激に減少し、還元型の比率が
８０％を越え、末梢血レベルに回復した。このことは、
本疾患において酸化型マクロファージが病態形成に大き
な位置を占めること、その病態がＮＡＣ投与で改善でき
ることを示し、本発明の効果は単に病態動物に留まら
ず、リウマチ患者やそのハイリスクの人においても本発
明の適用が有用であることを示唆するものである。
【００９１】（実施例６） ＜還元型、酸化型マクロファージからのＩＬ−１２産生
の差異＞Ｔ細胞の分化過程、選択過程、機能発現過程に
異常があると、生体の免疫系が破綻することから、免疫
系の中心的役割は、Ｔ細胞により担われていると考えら
れる。Ｔ細胞の亜集団の一つであるヘルパーＴ細胞（Ｔ
ｈ）は、リンホカインを産生することにより、免疫担当
細胞や炎症性細胞を制御している細胞であるが、最近、
Ｔｈは、産生するリンホカインの種類により、更にＴｈ
１とＴｈ２の２種類に分けられ、それぞれが異なった免
疫機能を担っているという考えが提唱されている（J. I
MMUNOL., VOL. 136, PP 2348, 1986)。即ち、Ｔｈ１
は、ＩＬ−２やＩＦＮγを産生し、細胞性免疫の調節の
主体であり、Ｔｈ２はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６や
ＩＬ−１０を産生し、液性免疫の調節の主体であり、生
体内の免疫調節の恒常性は、Ｔｈ１とＴｈ２のバランス
により保たれているとする考えである。通常は、Ｔｈ１
／Ｔｈ２バランスがどちらかに傾くと、それを是正する
ことにより恒常性が維持されるが、何らかの原因により
バランスが是正されない状態が持続すると免疫病が発症
すると考えられている。Ｔｈ１とＴｈ２は、Ｔｈ０とい
う段階からそれぞれに分化するが、Ｔｈ０からＴｈ１へ
の分化にはＭφの産生するＩＬ−１２が重要であり(IMM
UNOLOGY TODAY, VOL. 335, PP 14, 1993)、Ｔｈ０から
Ｔｈ２への分化にはＮＫＴ細胞が産生するＩＬ−４が重
要である(J. EXP. MEDICINE, VOL. 179, PP 1285, 199
4)。
の差異＞Ｔ細胞の分化過程、選択過程、機能発現過程に
異常があると、生体の免疫系が破綻することから、免疫
系の中心的役割は、Ｔ細胞により担われていると考えら
れる。Ｔ細胞の亜集団の一つであるヘルパーＴ細胞（Ｔ
ｈ）は、リンホカインを産生することにより、免疫担当
細胞や炎症性細胞を制御している細胞であるが、最近、
Ｔｈは、産生するリンホカインの種類により、更にＴｈ
１とＴｈ２の２種類に分けられ、それぞれが異なった免
疫機能を担っているという考えが提唱されている（J. I
MMUNOL., VOL. 136, PP 2348, 1986)。即ち、Ｔｈ１
は、ＩＬ−２やＩＦＮγを産生し、細胞性免疫の調節の
主体であり、Ｔｈ２はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６や
ＩＬ−１０を産生し、液性免疫の調節の主体であり、生
体内の免疫調節の恒常性は、Ｔｈ１とＴｈ２のバランス
により保たれているとする考えである。通常は、Ｔｈ１
／Ｔｈ２バランスがどちらかに傾くと、それを是正する
ことにより恒常性が維持されるが、何らかの原因により
バランスが是正されない状態が持続すると免疫病が発症
すると考えられている。Ｔｈ１とＴｈ２は、Ｔｈ０とい
う段階からそれぞれに分化するが、Ｔｈ０からＴｈ１へ
の分化にはＭφの産生するＩＬ−１２が重要であり(IMM
UNOLOGY TODAY, VOL. 335, PP 14, 1993)、Ｔｈ０から
Ｔｈ２への分化にはＮＫＴ細胞が産生するＩＬ−４が重
要である(J. EXP. MEDICINE, VOL. 179, PP 1285, 199
4)。
【００９２】Ｍφのレドックス状態の相違によりＭφ機
能が異なることは前出の各実施例より明らかである。Ｍ
φには、ＧＳＨ量の相違から酸化型Ｍφと還元型Ｍφの
２種類のＭφが存在し、ＮＯやＩＬ−６産生パターンが
異なる。Ｔｈ０からＴｈ１への分化を誘導し、Ｔｈ１／
Ｔｈ２バランス制御の鍵の分子であるＩＬ−１２の主な
産生細胞はＭφと考えられるが、その詳細な解析はこれ
まで報告されていない。ＩＬ−１２の産生は、酸化型Ｍ
φと還元型Ｍφで異なるのか否かは、免疫病の発症メカ
ニズムの観点からも興味深い点である。本発明者等は、
ＩＬ−１２が還元型Ｍφからのみ産生することを見いだ
すとともに、ＩＬ−１２と同じくＴｈ１／Ｔｈ２バラン
ス制御を行っていると考えられているＩＬ−４が、酸化
型Ｍφ、還元型Ｍφに作用し、Ｔｈ２側へシフトさせて
いること見出した。本発明の完成に先立って得られたこ
れらの知見を基に、Ｍφのレドックス状態が、Ｔｈ１／
Ｔｈ２バランスを制御していることを示し、本発明を使
用する上で免疫系疾患の病態診断に如何に有用かを説明
する。
能が異なることは前出の各実施例より明らかである。Ｍ
φには、ＧＳＨ量の相違から酸化型Ｍφと還元型Ｍφの
２種類のＭφが存在し、ＮＯやＩＬ−６産生パターンが
異なる。Ｔｈ０からＴｈ１への分化を誘導し、Ｔｈ１／
Ｔｈ２バランス制御の鍵の分子であるＩＬ−１２の主な
産生細胞はＭφと考えられるが、その詳細な解析はこれ
まで報告されていない。ＩＬ−１２の産生は、酸化型Ｍ
φと還元型Ｍφで異なるのか否かは、免疫病の発症メカ
ニズムの観点からも興味深い点である。本発明者等は、
ＩＬ−１２が還元型Ｍφからのみ産生することを見いだ
すとともに、ＩＬ−１２と同じくＴｈ１／Ｔｈ２バラン
ス制御を行っていると考えられているＩＬ−４が、酸化
型Ｍφ、還元型Ｍφに作用し、Ｔｈ２側へシフトさせて
いること見出した。本発明の完成に先立って得られたこ
れらの知見を基に、Ｍφのレドックス状態が、Ｔｈ１／
Ｔｈ２バランスを制御していることを示し、本発明を使
用する上で免疫系疾患の病態診断に如何に有用かを説明
する。
【００９３】（ＩＬ−１２は還元型Ｍφから産生され
る）実施例１において、レンチナン（ＬＮＴ）を腹腔内
注射して調製したＭφは、ＧＳＨ量の高い還元型であ
り、ＬＰＳを腹腔内注射して調製したＭφは、ＧＳＨ量
の低い酸化型であることを示した。ＬＮＴ誘導ＭφとＬ
ＰＳ誘導Ｍφにおいて、ＩＬ−１２産生能が異なるか否
かを検討した。ＬＰＳとＩＦＮγの刺激により、ＬＮＴ
誘導Ｍφでは顕著なＩＬ−１２産生（１３１２ｐｇ／ｍ
ｌ）が見られたが、ＬＰＳ誘導Ｍφ及び対照のレジデン
トＭφでは産生がみられなかった（図４）。次に、細胞
内ＧＳＨ量を変化させる物質を腹腔内注射して調製した
Ｍφを用いて同様の解析を行った。細胞内ＧＳＨ量を増
加させる物質であるグルタチオンモノエチルエステル
（ＧＳＨ−ＯＥｔ）、低下させる物質であるマレイン酸
ヂエチルエステル（ＤＥＭ）をそれぞれ投与し調製した
Ｍφでは、ＧＳＨ−ＯＥｔ投与マウス由来Ｍφでのみ、
ＬＰＳとＩＦＮγ刺激によりＩＬ−１２が産生された
（３５７０ｐｇ／ｍｌ）。これらの結果は、細胞内のＧ
ＳＨ量の多い還元型Ｍφでのみ、ＩＬ−１２が産生され
ることを示す。
る）実施例１において、レンチナン（ＬＮＴ）を腹腔内
注射して調製したＭφは、ＧＳＨ量の高い還元型であ
り、ＬＰＳを腹腔内注射して調製したＭφは、ＧＳＨ量
の低い酸化型であることを示した。ＬＮＴ誘導ＭφとＬ
ＰＳ誘導Ｍφにおいて、ＩＬ−１２産生能が異なるか否
かを検討した。ＬＰＳとＩＦＮγの刺激により、ＬＮＴ
誘導Ｍφでは顕著なＩＬ−１２産生（１３１２ｐｇ／ｍ
ｌ）が見られたが、ＬＰＳ誘導Ｍφ及び対照のレジデン
トＭφでは産生がみられなかった（図４）。次に、細胞
内ＧＳＨ量を変化させる物質を腹腔内注射して調製した
Ｍφを用いて同様の解析を行った。細胞内ＧＳＨ量を増
加させる物質であるグルタチオンモノエチルエステル
（ＧＳＨ−ＯＥｔ）、低下させる物質であるマレイン酸
ヂエチルエステル（ＤＥＭ）をそれぞれ投与し調製した
Ｍφでは、ＧＳＨ−ＯＥｔ投与マウス由来Ｍφでのみ、
ＬＰＳとＩＦＮγ刺激によりＩＬ−１２が産生された
（３５７０ｐｇ／ｍｌ）。これらの結果は、細胞内のＧ
ＳＨ量の多い還元型Ｍφでのみ、ＩＬ−１２が産生され
ることを示す。
【００９４】（還元型ＭφからのＩＬ−１２産生は、細
胞内ＧＳＨ量を低下させることにより抑制される）細胞
内のＧＳＨ量の多い還元型Ｍφでのみ、ＩＬ−１２が産
生されることを示したが、この産生は、Ｍφを酸化型に
することにより抑制されるか否かを検討した。即ち、レ
ンチナン誘導Ｍφを、ＤＥＭ刺激することにより、ＩＬ
−１２の産生が抑制されるかを解析した。その結果、レ
ンチナン誘導ＭφからのＩＬ−１２産生（８２８ｐｇ／
ｍｌ）は、ＤＥＭを添加することにより、完全に抑制さ
れる（０ｐｇ／ｍｌ）ことが明らかとなった。即ち、Ｄ
ＥＭ処理により細胞内の還元型グルタチオンを枯渇さ
せ、還元型Ｍφを酸化型Ｍφへと変換することにより、
ＩＬ−１２産生は抑制されることが示唆された。
胞内ＧＳＨ量を低下させることにより抑制される）細胞
内のＧＳＨ量の多い還元型Ｍφでのみ、ＩＬ−１２が産
生されることを示したが、この産生は、Ｍφを酸化型に
することにより抑制されるか否かを検討した。即ち、レ
ンチナン誘導Ｍφを、ＤＥＭ刺激することにより、ＩＬ
−１２の産生が抑制されるかを解析した。その結果、レ
ンチナン誘導ＭφからのＩＬ−１２産生（８２８ｐｇ／
ｍｌ）は、ＤＥＭを添加することにより、完全に抑制さ
れる（０ｐｇ／ｍｌ）ことが明らかとなった。即ち、Ｄ
ＥＭ処理により細胞内の還元型グルタチオンを枯渇さ
せ、還元型Ｍφを酸化型Ｍφへと変換することにより、
ＩＬ−１２産生は抑制されることが示唆された。
【００９５】（ＩＬ−４は、還元型ＭφからのＩＬ−１
２産生を抑制する）ＩＬ−４は、Ｍφに作用し、抑制的
に働くとされているサイトカインである。ＩＬ−４は、
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの制御においても、ＩＬ−１２
と相対する作用を有していると考えられている。そこ
で、ＩＬ−４が、還元型ＭφからのＩＬ−１２産生に対
し、抑制的に作用するか否かを検討した。ＬＮＴ誘導Ｍ
φからのＩＬ−１２産生及びＧＳＨ投与マウス由来Ｍφ
からのＩＬ−１２産生ともに、ＩＬ−４で前処理するこ
とによりは顕著に抑制することが明らかとなった（各々
１５８０ｐｇ／ｍｌより３７０ｐｇ／ｍｌへ、４９０ｐ
ｇ／ｍｌより２５８ｐｇ／ｍｌへ）。即ち、ＩＬ−４は
Ｍφに作用し、ＩＬ−１２産生を抑制することにより、
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ２側にシフトしている可
能性が示唆された。この際、ＩＬ−４はＭφ中の還元型
グルタチオン量を顕著に減少させることがＡＣＡＳによ
る画像解析で判明した。
２産生を抑制する）ＩＬ−４は、Ｍφに作用し、抑制的
に働くとされているサイトカインである。ＩＬ−４は、
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの制御においても、ＩＬ−１２
と相対する作用を有していると考えられている。そこ
で、ＩＬ−４が、還元型ＭφからのＩＬ−１２産生に対
し、抑制的に作用するか否かを検討した。ＬＮＴ誘導Ｍ
φからのＩＬ−１２産生及びＧＳＨ投与マウス由来Ｍφ
からのＩＬ−１２産生ともに、ＩＬ−４で前処理するこ
とによりは顕著に抑制することが明らかとなった（各々
１５８０ｐｇ／ｍｌより３７０ｐｇ／ｍｌへ、４９０ｐ
ｇ／ｍｌより２５８ｐｇ／ｍｌへ）。即ち、ＩＬ−４は
Ｍφに作用し、ＩＬ−１２産生を抑制することにより、
Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ２側にシフトしている可
能性が示唆された。この際、ＩＬ−４はＭφ中の還元型
グルタチオン量を顕著に減少させることがＡＣＡＳによ
る画像解析で判明した。
【００９６】（ＩＬ−４は、ＮＯ産生を抑制し、ＩＬ−
６産生を亢進する）還元型Ｍφは、酸化型Ｍφに比較し
てＩＦＮγ刺激でのＮＯ産生が亢進し、逆にＩＬ−６産
生は抑制される。ＩＦＮγは、Ｔｈ１細胞から産生され
るサイトカインとして知られており、ＩＬ−４がＩＦＮ
γによるＮＯ産生及びＩＬ−６産生に対し、どのような
作用を示すか、それぞれのＭφを用いて解析した。ＩＬ
−４で前処理したＭφ（レジデント、ＬＰＳ誘導、ＬＮ
Ｔ誘導）にＩＦＮγを作用させ、ＮＯ産生量を測定した
ところ、ＩＬ−４で処理していないＭφに比較して、Ｉ
Ｌ−４処理したＭφからのＮＯ産生は有意に抑制され
た。また、ＧＳＨ−ＯＥｔ刺激により細胞内ＧＳＨ量を
増加させたＭφ及びＤＥＭ刺激により細胞内ＧＳＨ量を
低下させたＭφをＩＬ−４で前処理後、ＩＦＮγとＬＰ
Ｓを作用させてＮＯ産生量を測定したところ、ＩＬ−４
未処理に比較して、顕著にＮＯ産生が抑制された。
６産生を亢進する）還元型Ｍφは、酸化型Ｍφに比較し
てＩＦＮγ刺激でのＮＯ産生が亢進し、逆にＩＬ−６産
生は抑制される。ＩＦＮγは、Ｔｈ１細胞から産生され
るサイトカインとして知られており、ＩＬ−４がＩＦＮ
γによるＮＯ産生及びＩＬ−６産生に対し、どのような
作用を示すか、それぞれのＭφを用いて解析した。ＩＬ
−４で前処理したＭφ（レジデント、ＬＰＳ誘導、ＬＮ
Ｔ誘導）にＩＦＮγを作用させ、ＮＯ産生量を測定した
ところ、ＩＬ−４で処理していないＭφに比較して、Ｉ
Ｌ−４処理したＭφからのＮＯ産生は有意に抑制され
た。また、ＧＳＨ−ＯＥｔ刺激により細胞内ＧＳＨ量を
増加させたＭφ及びＤＥＭ刺激により細胞内ＧＳＨ量を
低下させたＭφをＩＬ−４で前処理後、ＩＦＮγとＬＰ
Ｓを作用させてＮＯ産生量を測定したところ、ＩＬ−４
未処理に比較して、顕著にＮＯ産生が抑制された。
【００９７】一方、ＩＬ−６産生は、レジデントＭφ、
ＬＰＳ誘導Ｍφ、ＬＮＴ誘導Ｍφ何れともＩＬ−４によ
り前処理することにより、ＩＦＮγでの産生が著しく亢
進した。更に、ＧＳＨ−ＯＥｔ刺激により細胞内ＧＳＨ
量を増加させたＭφ及びＤＥＭ刺激により細胞内ＧＳＨ
量を低下させたＭφをＩＬ−４で前処理後、ＩＦＮγを
作用させてＩＬ−６産生量を測定したところ、ＩＬ−４
未処理に比較して、顕著にＩＬ−６産生が亢進された。
これらの結果より、ＩＬ−４は、細胞内還元型グルタチ
オン量を減少させることにより、酸化型マクロファージ
を誘導し、ＩＦＮγ刺激によるＮＯ産生を抑制し、ＩＬ
−６産生を亢進することが明らかとなった。このこと
は、ＩＬ−４はＩＦＮγの作用、即ちＴｈ１型の作用と
考えられるＮＯ産生を抑制し、本来ＩＦＮγは弱い作用
であったＩＬ−６産生誘導を亢進させ、Ｔｈ２型の作用
を増強させる活性を有していることを示すものである。
本知見は本発明になる抗リウマチ剤の有用性を科学的に
証明するものである。
ＬＰＳ誘導Ｍφ、ＬＮＴ誘導Ｍφ何れともＩＬ−４によ
り前処理することにより、ＩＦＮγでの産生が著しく亢
進した。更に、ＧＳＨ−ＯＥｔ刺激により細胞内ＧＳＨ
量を増加させたＭφ及びＤＥＭ刺激により細胞内ＧＳＨ
量を低下させたＭφをＩＬ−４で前処理後、ＩＦＮγを
作用させてＩＬ−６産生量を測定したところ、ＩＬ−４
未処理に比較して、顕著にＩＬ−６産生が亢進された。
これらの結果より、ＩＬ−４は、細胞内還元型グルタチ
オン量を減少させることにより、酸化型マクロファージ
を誘導し、ＩＦＮγ刺激によるＮＯ産生を抑制し、ＩＬ
−６産生を亢進することが明らかとなった。このこと
は、ＩＬ−４はＩＦＮγの作用、即ちＴｈ１型の作用と
考えられるＮＯ産生を抑制し、本来ＩＦＮγは弱い作用
であったＩＬ−６産生誘導を亢進させ、Ｔｈ２型の作用
を増強させる活性を有していることを示すものである。
本知見は本発明になる抗リウマチ剤の有用性を科学的に
証明するものである。
【００９８】（実施例７） ＜経口摂取ＮＡＣとＩＬ−２の併用によるＩＬ−１２産
生の増強＞ＤＢＡ／２♀の８週令のマウスに実施例６同
様の方法で水道水を自由飲水させる群とＮＡＣ１ｍｇ／
ｍｌ濃度の水道水を自由飲水させる２群を作り、更に各
々の群にヒトリコンビナントＩＬ−２：２μｇ／０．５
ｍｌ／ｈを１日２回隔日に２週間腹腔内投与を併用する
群を設定した。１４日目に実施例６同様にＭφからのＩ
Ｌ−１２産生量を検定した。
生の増強＞ＤＢＡ／２♀の８週令のマウスに実施例６同
様の方法で水道水を自由飲水させる群とＮＡＣ１ｍｇ／
ｍｌ濃度の水道水を自由飲水させる２群を作り、更に各
々の群にヒトリコンビナントＩＬ−２：２μｇ／０．５
ｍｌ／ｈを１日２回隔日に２週間腹腔内投与を併用する
群を設定した。１４日目に実施例６同様にＭφからのＩ
Ｌ−１２産生量を検定した。
【００９９】（調製したＭφのＧＳＨ濃度の測定）それ
ぞれの処置を受けたマウスの腹腔細胞を調製し、ＭＣＢ
試薬を用いたＡＣＡＳにより、細胞内ＧＳＨ量を解析し
た。対照のマウス（水道水自由飲水群）に比べ、ＮＡＣ
溶解水道水自由飲水群及びＩＬ−２投与群において、還
元型グルタチオンの量は顕著に増加し、還元型Ｍφの画
像を示した。ＮＡＣ溶解水道水自由飲水にＩＬ−２投与
を併用する群においては何れの単独群よりも還元型グル
タチオンの量は更に増加し、還元型Ｍφの誘導における
併用効果がＡＣＡＳ画像解析で明瞭に認められた。併用
群では、全てのＭφ中に還元型グルタチオンの量の増加
が認められた（単独処置群の増量が４０−５０％のＭφ
に認められることと対照的で有る）。
ぞれの処置を受けたマウスの腹腔細胞を調製し、ＭＣＢ
試薬を用いたＡＣＡＳにより、細胞内ＧＳＨ量を解析し
た。対照のマウス（水道水自由飲水群）に比べ、ＮＡＣ
溶解水道水自由飲水群及びＩＬ−２投与群において、還
元型グルタチオンの量は顕著に増加し、還元型Ｍφの画
像を示した。ＮＡＣ溶解水道水自由飲水にＩＬ−２投与
を併用する群においては何れの単独群よりも還元型グル
タチオンの量は更に増加し、還元型Ｍφの誘導における
併用効果がＡＣＡＳ画像解析で明瞭に認められた。併用
群では、全てのＭφ中に還元型グルタチオンの量の増加
が認められた（単独処置群の増量が４０−５０％のＭφ
に認められることと対照的で有る）。
【０１００】（各群より調製したＭφの機能）４群、そ
れぞれのマウスより腹腔細胞を調製し、ＬＰＳ＋ＩＦＮ
γにより刺激し、ＮＯ産生、ＩＬ−６産生、及びＩＬ−
１２産生能を測定した。単独投与、併用群の３群何れも
対照群に対して還元型マクロファージが増量しているた
め、上記マクロファージ培養上清中のＩＬ−６量が減少
した（対照マウスの１２４０ｐｇ／ｍｌに対して、ＮＡ
Ｃ溶解水道水自由飲水群３２０ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−２投
与群５２０ｐｇ／ｍｌ、ＮＡＣ溶解水道水自由飲水にＩ
Ｌ−２投与を併用する群６７ｐｇ／ｍｌ）。ＩＬ−６が
Ｔｈ２を誘導する主たるサイトカインであること考える
と、これらのＮＡＣ経口摂取にＩＬ−２なるサイトカイ
ンの注射による併用で生体のＴｈ１／Ｔｈ２バランスが
より強力に制御できることを明確に示す。ＮＯ産生の増
強パターンはＩＬ−６産生と逆相関した。ＩＬ−１２産
生については、対照マウスの０ｐｇ／ｍｌに対して、Ｎ
ＡＣ溶解水道水自由飲水群６２０ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−２
投与群９４６ｐｇ／ｍｌ、ＮＡＣ溶解水道水自由飲水に
ＩＬ−２投与を併用する群２３８６ｐｇ／ｍｌと顕著な
併用効果が認められた。本発明が、サイトカイン類との
併用で、リウマチ様関節炎等の免疫系疾患の著しい病態
改善に有益な抗リウマチ剤として独創的で、有意義であ
ること示す。
れぞれのマウスより腹腔細胞を調製し、ＬＰＳ＋ＩＦＮ
γにより刺激し、ＮＯ産生、ＩＬ−６産生、及びＩＬ−
１２産生能を測定した。単独投与、併用群の３群何れも
対照群に対して還元型マクロファージが増量しているた
め、上記マクロファージ培養上清中のＩＬ−６量が減少
した（対照マウスの１２４０ｐｇ／ｍｌに対して、ＮＡ
Ｃ溶解水道水自由飲水群３２０ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−２投
与群５２０ｐｇ／ｍｌ、ＮＡＣ溶解水道水自由飲水にＩ
Ｌ−２投与を併用する群６７ｐｇ／ｍｌ）。ＩＬ−６が
Ｔｈ２を誘導する主たるサイトカインであること考える
と、これらのＮＡＣ経口摂取にＩＬ−２なるサイトカイ
ンの注射による併用で生体のＴｈ１／Ｔｈ２バランスが
より強力に制御できることを明確に示す。ＮＯ産生の増
強パターンはＩＬ−６産生と逆相関した。ＩＬ−１２産
生については、対照マウスの０ｐｇ／ｍｌに対して、Ｎ
ＡＣ溶解水道水自由飲水群６２０ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−２
投与群９４６ｐｇ／ｍｌ、ＮＡＣ溶解水道水自由飲水に
ＩＬ−２投与を併用する群２３８６ｐｇ／ｍｌと顕著な
併用効果が認められた。本発明が、サイトカイン類との
併用で、リウマチ様関節炎等の免疫系疾患の著しい病態
改善に有益な抗リウマチ剤として独創的で、有意義であ
ること示す。
【０１０１】（実施例８） ＜(NAC-OMe)2投与による酸化型マクロファージの誘導＞
酸化型マクロファージは(NAC-OMe)2２０μｇ／０．５ｍ
ｌ／ｈ、若しくはアセチルグリオトキシン１０μｇ／
０．５ｍｌ／ｈをd１、d２にＤＢＡ／２マウス腹腔内に
投与して誘導されること、還元型マクロファージはＮＡ
Ｃ ２ｍｇ／０．５ｍｌ／ｈを同じくＤＢＡ／２腹腔内
にd１、d２投与することにより誘導されていることが、
投与終了後２０時間後に腹腔浸出細胞を採取し、プラス
チック表面に付着させた後、モノクロロバイメイン１０
μＭと３７℃、３０分間反応させ、ＡＣＡＳで解析する
ことで判明した。酸化型の増量はモノクロロバイメイン
との反応産物が殆ど認められないこと、即ちネズミ色や
青色の画像になること、還元型の増量は赤色や黄色の画
像が得られることから肉眼的に容易に検定できる。免疫
抑制作用の良く知られるステロイド剤の代表であるデキ
サメサゾン４０μｇ／０．１ｍｌ／ｈをマウス背部皮下
にd１、d２に投与して２０時間後に誘導されるマクロフ
ァージは殆どネズミ色の画像になること、即ち酸化型マ
クロファージが強力に誘導されることが判明した。一
方、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）２ｍｇ投与後２
０時間目の腹腔浸出細胞を採取して同様に検定したとこ
ろ赤色や黄色の画像が得られ還元型マクロファージが誘
導されることが確認された。同様に、酸化型マクロフア
ージの誘導されることは、シスチン誘導体（分子内にジ
スルフィド結合を有する化合物）である、Ｎ，Ｎ’−ジ
アセチルシスチンニトロキシブチルエステル、Ｎ，Ｎ’
−ジアセチルシスチンジメチルエステル（(NAC-OM
e)2）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジイソプロピル
エステル(（NAC-OiPr）2）、Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｌ−アラニ
ルシスチンジメチルエステル（(NAlaC-OMe)2）の腹腔内
投与（各々２０μｇ／０．５ｍｌ／ｈ、週２回３週間投
与、週令９−１１）でもＡＣＡＳにより確認された。
酸化型マクロファージは(NAC-OMe)2２０μｇ／０．５ｍ
ｌ／ｈ、若しくはアセチルグリオトキシン１０μｇ／
０．５ｍｌ／ｈをd１、d２にＤＢＡ／２マウス腹腔内に
投与して誘導されること、還元型マクロファージはＮＡ
Ｃ ２ｍｇ／０．５ｍｌ／ｈを同じくＤＢＡ／２腹腔内
にd１、d２投与することにより誘導されていることが、
投与終了後２０時間後に腹腔浸出細胞を採取し、プラス
チック表面に付着させた後、モノクロロバイメイン１０
μＭと３７℃、３０分間反応させ、ＡＣＡＳで解析する
ことで判明した。酸化型の増量はモノクロロバイメイン
との反応産物が殆ど認められないこと、即ちネズミ色や
青色の画像になること、還元型の増量は赤色や黄色の画
像が得られることから肉眼的に容易に検定できる。免疫
抑制作用の良く知られるステロイド剤の代表であるデキ
サメサゾン４０μｇ／０．１ｍｌ／ｈをマウス背部皮下
にd１、d２に投与して２０時間後に誘導されるマクロフ
ァージは殆どネズミ色の画像になること、即ち酸化型マ
クロファージが強力に誘導されることが判明した。一
方、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）２ｍｇ投与後２
０時間目の腹腔浸出細胞を採取して同様に検定したとこ
ろ赤色や黄色の画像が得られ還元型マクロファージが誘
導されることが確認された。同様に、酸化型マクロフア
ージの誘導されることは、シスチン誘導体（分子内にジ
スルフィド結合を有する化合物）である、Ｎ，Ｎ’−ジ
アセチルシスチンニトロキシブチルエステル、Ｎ，Ｎ’
−ジアセチルシスチンジメチルエステル（(NAC-OM
e)2）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジイソプロピル
エステル(（NAC-OiPr）2）、Ｎ，Ｎ’−ジ−Ｌ−アラニ
ルシスチンジメチルエステル（(NAlaC-OMe)2）の腹腔内
投与（各々２０μｇ／０．５ｍｌ／ｈ、週２回３週間投
与、週令９−１１）でもＡＣＡＳにより確認された。
【０１０２】＜(NAC-OMe)2、アセチルグリオトキシン投
与によって誘導されたマクロフアージからのＮＯ、ＩＬ
−６産生＞そこで、腹腔浸出付着細胞を以下のように培
養し、培養上清に産生されるＮＯ、ＩＬ−１２を測定し
た。ＩＬ−６産生量は刺激剤不在下の自発産生量を測定
した。
与によって誘導されたマクロフアージからのＮＯ、ＩＬ
−６産生＞そこで、腹腔浸出付着細胞を以下のように培
養し、培養上清に産生されるＮＯ、ＩＬ−１２を測定し
た。ＩＬ−６産生量は刺激剤不在下の自発産生量を測定
した。
【０１０３】（１）材料 細胞：上記のように刺激して得られた腹腔浸出付着細胞
即ちマクロフアージを９６穴マイクロプレートに１Ｘ１
０5細胞／２００μｌ宛添加 培地：フエノールレッドフリーのRPMI1640 ２００μｌ
／穴 ＬＰＳ：リポポリサッカライド（シグマ社製）（由来：
E.coli）１００ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮγ：１００単位／ｍｌ
即ちマクロフアージを９６穴マイクロプレートに１Ｘ１
０5細胞／２００μｌ宛添加 培地：フエノールレッドフリーのRPMI1640 ２００μｌ
／穴 ＬＰＳ：リポポリサッカライド（シグマ社製）（由来：
E.coli）１００ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮγ：１００単位／ｍｌ
【０１０４】（２）測定方法 （腹腔Ｍφの採取）腹腔細胞の採取は、エーテルにより
犠牲死させたマウスの腹腔内に、氷冷した５ｍｌのフェ
ノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地（日研生物社製）を
２２ゲージの針をつけた注射筒により注入し、しごいた
後、培地を抜き取ることにより行った。
犠牲死させたマウスの腹腔内に、氷冷した５ｍｌのフェ
ノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地（日研生物社製）を
２２ゲージの針をつけた注射筒により注入し、しごいた
後、培地を抜き取ることにより行った。
【０１０５】（ＩＬ−６の定量）実施例２の場合と同様
に定量した。
に定量した。
【０１０６】(ＮＯ2−濃度の測定)実施例２の場合と同
様に測定した。
様に測定した。
【０１０７】(ＡＣＡＳによる細胞内ＧＳＨの検出)実施
例２の場合と同様に検出した。
例２の場合と同様に検出した。
【０１０８】(ＩＬ−１２の定量)実施例２の場合と同様
に定量した。
に定量した。
【０１０９】（結果）マクロフアージからのＮＯ、ＩＬ
−６、ＩＬ−１２産生の抑制効果についての結果を表１
に示す。
−６、ＩＬ−１２産生の抑制効果についての結果を表１
に示す。
【０１１０】
【表１】
【０１１１】表１から明らかなように、(NAC-OMe)2、ア
セチルグリオトキシン投与により誘導された酸化型マク
ロファージでは、産生される炎症性サイトカインＩＬ−
６、ＮＯ、ＩＬ−１２の産生量が変動することが明らか
である。即ち、薬剤投与で得られた酸化型マクロファー
ジではＩＬ−６の産生は増強され、臓器障害性に働くＮ
Ｏ産生も細胞性免疫を増強するＩＬ−１２産生も低下す
る。この効果は典型的免疫抑制剤であるステロイドのデ
キサメサゾンより強いか同等である。これと対照的にＮ
-アセチルシステイン（ＮＡＣ）により誘導される還元
型マクロファージからはＮＯの産生、ＩＬ−１２の産生
が上昇し、ＩＬ−６産生は抑制される。
セチルグリオトキシン投与により誘導された酸化型マク
ロファージでは、産生される炎症性サイトカインＩＬ−
６、ＮＯ、ＩＬ−１２の産生量が変動することが明らか
である。即ち、薬剤投与で得られた酸化型マクロファー
ジではＩＬ−６の産生は増強され、臓器障害性に働くＮ
Ｏ産生も細胞性免疫を増強するＩＬ−１２産生も低下す
る。この効果は典型的免疫抑制剤であるステロイドのデ
キサメサゾンより強いか同等である。これと対照的にＮ
-アセチルシステイン（ＮＡＣ）により誘導される還元
型マクロファージからはＮＯの産生、ＩＬ−１２の産生
が上昇し、ＩＬ−６産生は抑制される。
【０１１２】（実施例９） ＜卵白アルブミン抗原に対する遅延型過敏症反応の抑制
効果＞(NAC-OMe)2、(NAC)2２０μｇ／０．５ｍｌ／ｈ、
ＮＡＣ、デキサメサゾンを実施例８と同様にd１からd５
まで連日投与、抗原として卵白アルブミンとコンプリー
トＨ３７Ｒａアジュバント（ＤＩＦＣＯ）１：１懸濁液
１００μｌ（含む２５０μｇ卵白アルブミン）を感作抗
原としてd２に背部皮下に投与、惹起抗原としてd８に左
耳に皮下投与し２４時間の左耳の腫脹厚を右耳と比較し
た。
効果＞(NAC-OMe)2、(NAC)2２０μｇ／０．５ｍｌ／ｈ、
ＮＡＣ、デキサメサゾンを実施例８と同様にd１からd５
まで連日投与、抗原として卵白アルブミンとコンプリー
トＨ３７Ｒａアジュバント（ＤＩＦＣＯ）１：１懸濁液
１００μｌ（含む２５０μｇ卵白アルブミン）を感作抗
原としてd２に背部皮下に投与、惹起抗原としてd８に左
耳に皮下投与し２４時間の左耳の腫脹厚を右耳と比較し
た。
【０１１３】卵白アルブミン抗原に対する遅延型過敏症
反応の抑制効果についての結果は表２に示す通りであ
り、(NAC-OMe)2、(NAC)2投与によって卵白アルブミン抗
原に対する遅延型過敏症反応は顕著に抑制された。この
ことはこれらの物質の投与により細胞性免疫が抑制され
たことを示す。
反応の抑制効果についての結果は表２に示す通りであ
り、(NAC-OMe)2、(NAC)2投与によって卵白アルブミン抗
原に対する遅延型過敏症反応は顕著に抑制された。この
ことはこれらの物質の投与により細胞性免疫が抑制され
たことを示す。
【０１１４】
【表２】
【０１１５】（実施例１０） ＜アジユバント誘導関節炎（AA）ラットへの薬剤投与効
果＞Lewisラットを用いて定法によりアジユバンド誘発
関節炎を誘導し、薬剤効果を検討した。アジユバンド誘
発関節炎はラットに誘発できる実験的関節炎としてよく
知られている（Taurog et al, Meth. Enzymol. 162, 33
9-355, 1988）。本モデルは非ステロイド性酸性抗炎症
薬や免疫抑制剤サイクロスポリン、シクロホスフアミ
ド、メトトレキセート等の抗リウマチ剤としての臨床効
果を投影するとされている。ラット一匹あたり１ｍｇ/
０．１ｍｌのアジユバントを尾底部に投与する。浮腫は
アジユバント投与後約２−３週間でピークに達する。浮
腫は単核球の炎症性浸潤により惹起されるものである。
関節の腫脹を毎日マイクロメーターで測定し、アジユバ
ント投与前の関節の直径と投与、治療開始後のそれとを
比較して対照群に対する割合（％）で効果を測定した。
効果はアジユバント投与１５日目に判定した。薬剤はア
ジユバント投与後、翌日から３日おきに腹腔内投与し
た。結果を表３に示す。
果＞Lewisラットを用いて定法によりアジユバンド誘発
関節炎を誘導し、薬剤効果を検討した。アジユバンド誘
発関節炎はラットに誘発できる実験的関節炎としてよく
知られている（Taurog et al, Meth. Enzymol. 162, 33
9-355, 1988）。本モデルは非ステロイド性酸性抗炎症
薬や免疫抑制剤サイクロスポリン、シクロホスフアミ
ド、メトトレキセート等の抗リウマチ剤としての臨床効
果を投影するとされている。ラット一匹あたり１ｍｇ/
０．１ｍｌのアジユバントを尾底部に投与する。浮腫は
アジユバント投与後約２−３週間でピークに達する。浮
腫は単核球の炎症性浸潤により惹起されるものである。
関節の腫脹を毎日マイクロメーターで測定し、アジユバ
ント投与前の関節の直径と投与、治療開始後のそれとを
比較して対照群に対する割合（％）で効果を測定した。
効果はアジユバント投与１５日目に判定した。薬剤はア
ジユバント投与後、翌日から３日おきに腹腔内投与し
た。結果を表３に示す。
【０１１６】
【表３】
【０１１７】以上の結果は、酸化型マクロフアージを誘
導する物質の投与によりアジユバント誘発関節炎の抑制
されることを明白に示す薬効実験の結果である。一回投
与量については、（ＮＡＣ）2及び（ＮＡＣ−ＯＭｅ）2
は１ｍｇ／ｋｇで、ＮＡＣは１００ｍｇ／ｋｇ、レンチ
ナンは０．１ｍｇ／ｋｇである。
導する物質の投与によりアジユバント誘発関節炎の抑制
されることを明白に示す薬効実験の結果である。一回投
与量については、（ＮＡＣ）2及び（ＮＡＣ−ＯＭｅ）2
は１ｍｇ／ｋｇで、ＮＡＣは１００ｍｇ／ｋｇ、レンチ
ナンは０．１ｍｇ／ｋｇである。
【０１１８】（実施例１１） ＜経口投与を含む薬剤投与効果＞Lewisラットを用いて
定法によりアジユバンド誘発関節炎を誘導し、薬剤効果
を実施例１０同様に検討した。条件は上記に同様であ
る。結果を表４に示す。
定法によりアジユバンド誘発関節炎を誘導し、薬剤効果
を実施例１０同様に検討した。条件は上記に同様であ
る。結果を表４に示す。
【０１１９】
【表４】
【０１２０】投与量について、は実施例１０と同様であ
り、（ＮＡｌａＣ−ＯＭｅ）2、γ-グルタミルシステイ
ンジメチルエステル、グルタチオンジエチルエステルは
何れも１００ｍｇ／ｋｇである。
り、（ＮＡｌａＣ−ＯＭｅ）2、γ-グルタミルシステイ
ンジメチルエステル、グルタチオンジエチルエステルは
何れも１００ｍｇ／ｋｇである。
【０１２１】以上の結果は、アジユバント誘発性関節炎
病態動物への薬剤投与においては、Ｎ，Ｎ’−ジアセチ
ルシスチン（(NAC)2）、Ｎ，Ｎ’−ジプロピルシスチン
（(NPC)2）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエ
ステル（(NAC-OMe)2）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチン
ジイソプロピルエステル(（NAC-OiPr）2）、Ｎ，Ｎ’−
ジ−Ｌ−アラニルシスチンジメチルエステル（(NAlaC-O
Me)2）、これらのニトロキシブチルエステル体等、前記
構造式（１）に示され、マクロファージ細胞内の還元型
グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏症反応を抑制
し、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２産生を抑制する作用を有する
化合物に薬効が認められるという事実を明白に示すもの
である。
病態動物への薬剤投与においては、Ｎ，Ｎ’−ジアセチ
ルシスチン（(NAC)2）、Ｎ，Ｎ’−ジプロピルシスチン
（(NPC)2）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエ
ステル（(NAC-OMe)2）、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチン
ジイソプロピルエステル(（NAC-OiPr）2）、Ｎ，Ｎ’−
ジ−Ｌ−アラニルシスチンジメチルエステル（(NAlaC-O
Me)2）、これらのニトロキシブチルエステル体等、前記
構造式（１）に示され、マクロファージ細胞内の還元型
グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏症反応を抑制
し、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２産生を抑制する作用を有する
化合物に薬効が認められるという事実を明白に示すもの
である。
【０１２２】同様の関節腫脹抑制効果は、リウマチ性関
節炎自然発症モデルマウスに週３回上記化合物を投与し
た場合にも認められた。本モデルでは週令２ケ月目より
前足指骨関節腫脹が始まり、関節滑膜におけるパンヌス
形成も認められるが、上述のマクロファージ細胞内の還
元型グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏症反応を抑
制し、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２産生を抑制する作用を有す
る化合物の投与で４．５ケ月後の関節スコアーは生理食
塩水投与群の４０−５０％に抑制された。逆に、還元型
マクロフアージを誘導するγ−グルタミルシステイン、
γ−グルタミルシステインジメチルエステル、Ｎ−アセ
チルシステインニトロキシブチルエステル等のグルタチ
オンの前駆体、グルタチオンモノエステル、グルタチオ
ンニトロキシブチルエステル及びグルタチオンジエステ
ル等のグルタチオン誘導体では腫脹が増大することが判
明した。
節炎自然発症モデルマウスに週３回上記化合物を投与し
た場合にも認められた。本モデルでは週令２ケ月目より
前足指骨関節腫脹が始まり、関節滑膜におけるパンヌス
形成も認められるが、上述のマクロファージ細胞内の還
元型グルタチオン量を減少させ、遅延型過敏症反応を抑
制し、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２産生を抑制する作用を有す
る化合物の投与で４．５ケ月後の関節スコアーは生理食
塩水投与群の４０−５０％に抑制された。逆に、還元型
マクロフアージを誘導するγ−グルタミルシステイン、
γ−グルタミルシステインジメチルエステル、Ｎ−アセ
チルシステインニトロキシブチルエステル等のグルタチ
オンの前駆体、グルタチオンモノエステル、グルタチオ
ンニトロキシブチルエステル及びグルタチオンジエステ
ル等のグルタチオン誘導体では腫脹が増大することが判
明した。
【０１２３】
【発明の効果】本発明の抗リウマチ剤により、マクロフ
ァージ（単球、クッパー細胞及び樹状細胞等を含む。）
の機能の斬新な制御が可能となり、特にヒトのリウマチ
様関節炎、同疾患に随伴する合併症、同疾患のハイリス
ク状態の治療、病態改善、予防を可能とする。
ァージ（単球、クッパー細胞及び樹状細胞等を含む。）
の機能の斬新な制御が可能となり、特にヒトのリウマチ
様関節炎、同疾患に随伴する合併症、同疾患のハイリス
ク状態の治療、病態改善、予防を可能とする。
【０１２４】特に、経口摂取することができ、医薬品並
びに飲食品、栄養剤及び輸液製剤の形態として、即ち抗
リウマチ作用を有する飲食品等として使用可能である。
びに飲食品、栄養剤及び輸液製剤の形態として、即ち抗
リウマチ作用を有する飲食品等として使用可能である。
【図１】図１は、想定される、マクロファージの機能の
相違並びにＴｈ１及びＴｈ２による免疫抑制、悪液質状
態、癌細胞の悪性化誘導の機序、局所炎症等との関係の
仮説模式図を示す。
相違並びにＴｈ１及びＴｈ２による免疫抑制、悪液質状
態、癌細胞の悪性化誘導の機序、局所炎症等との関係の
仮説模式図を示す。
【図２】図２は、酸化型、還元型マクロファージの存在
比がＴｈ１型、Ｔｈ２型サイトカインの選択的な産生制
御を介して免疫機能を制御していることを説明したもの
である。本発明者等の新しい知見に基づくものであり、
マクロファージの酸化還元状態がｉｎ ｖｉｖｏにおけ
る免疫能の傾きを増幅する要になっていることを示す。
比がＴｈ１型、Ｔｈ２型サイトカインの選択的な産生制
御を介して免疫機能を制御していることを説明したもの
である。本発明者等の新しい知見に基づくものであり、
マクロファージの酸化還元状態がｉｎ ｖｉｖｏにおけ
る免疫能の傾きを増幅する要になっていることを示す。
【図３】図３は、実施例１における両マクロファージの
機能の検定の結果を表す図で、酸化型マクロファージ及
び還元型マクロファージにおける機能の差を示したグラ
フである。
機能の検定の結果を表す図で、酸化型マクロファージ及
び還元型マクロファージにおける機能の差を示したグラ
フである。
【図４】図４は、ＬＮＴ誘導ＭφとＬＰＳ誘導Ｍφにお
いて、ＩＬ−１２産生能が異なるか否かを検討した結果
を表す図で、酸化型、還元型マクロファージによってＴ
ｈ１サイトカインであるＩＬ−１２の産生量が全く異な
り、ＩＬ−１２は還元型グルタチオン含量の高い還元型
マクロファージからのみ産生されることを示す。
いて、ＩＬ−１２産生能が異なるか否かを検討した結果
を表す図で、酸化型、還元型マクロファージによってＴ
ｈ１サイトカインであるＩＬ−１２の産生量が全く異な
り、ＩＬ−１２は還元型グルタチオン含量の高い還元型
マクロファージからのみ産生されることを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/235 Ａ６１Ｋ 31/235 (72)発明者 村田 幸恵 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 Ｆターム(参考） 4B018 ME14 4C076 AA11 CC07 4C206 AA01 AA02 JA26 JA62 MA36 MA86 NA14 ZB15
Claims (6)
- 【請求項１】マクロファージ細胞内の還元型グルタチオ
ン量を減少させることによりＩＬ−１２産生、ＮＯ産生
及びＩＦＮγ産生を抑制し、遅延型過敏症反応を抑制す
る作用を有する物質を含有することを特徴とする抗リウ
マチ剤。 - 【請求項２】当該物質が、分子内にジスルフイド結合を
有する化合物である請求項１記載の抗リウマチ剤。 - 【請求項３】分子内にジスルフイド結合を有する化合物
が、下記構造式（１）で示される化合物の何れかである
請求項２記載の抗リウマチ剤。 【化１】 但し、上記式中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立していて、
置換又は未置換のアルキル基を、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ
独立していて、アシル基及びペプチジル基の何れかを、
それぞれ表す。 - 【請求項４】細胞内の還元型グルタチオン量が多い還元
型マクロファージを選択的に除去し得る物質を含有する
請求項１記載の抗リウマチ剤。 - 【請求項５】当該物質が、細胞毒性を有するＤＮＡアル
キル化剤にグルタチオンを共役させた物質及び前駆体と
してマクロファージに取り込まれた後に細胞毒性を示す
物質の何れかである請求項４記載の抗リウマチ剤。 - 【請求項６】飲食品、栄養剤及び輸液製剤の何れかの形
態にある請求項１〜５何れか記載の抗リウマチ剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11121066A JP2000309532A (ja) | 1999-04-28 | 1999-04-28 | 抗リウマチ剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11121066A JP2000309532A (ja) | 1999-04-28 | 1999-04-28 | 抗リウマチ剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000309532A true JP2000309532A (ja) | 2000-11-07 |
Family
ID=14802007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11121066A Pending JP2000309532A (ja) | 1999-04-28 | 1999-04-28 | 抗リウマチ剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000309532A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1345600A1 (en) * | 2000-12-27 | 2003-09-24 | Nactilus AB | New clinical treatment |
| WO2009102050A1 (ja) | 2008-02-15 | 2009-08-20 | Ajinomoto Co., Inc. | 腸管免疫賦活剤 |
-
1999
- 1999-04-28 JP JP11121066A patent/JP2000309532A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1345600A1 (en) * | 2000-12-27 | 2003-09-24 | Nactilus AB | New clinical treatment |
| WO2009102050A1 (ja) | 2008-02-15 | 2009-08-20 | Ajinomoto Co., Inc. | 腸管免疫賦活剤 |
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