JP2000316560A - 核酸試料分析法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】核酸分析のための自動化機器および方法であ
り、核酸試験試料における広範な特異性のスクリーニン
グと多重検出反応をより低コストで行うための、統合シ
ステムを実現する。 【解決手段】自動化機器１２０は、試料調製ステーショ
ン１２２、第１反応ステーション１２８、第２反応ステ
ーション１３４、検出ステーション１３６および制御モ
ジュール１３８からなる。核酸分析には第１反応ステー
ション１２８での低次検出フォーマットを用いた第１試
験反応を行う工程と、必要あれば第２反応ステーション
１３４での高次検出フォーマットを用いる第２試験反応
が含まれ、試験反応で発生した信号を検出ステーション
１３６で検出し、信号データを制御モジュール１３８で
処理し、以降の試験を行うか否かの判定を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試験試料中の微生
物またはウイルスの同定および微生物またはウイルスの
薬剤感受性または抵抗性試験を目的とする、分析的また
は生物学的試料試験の方法および機器に関する。本発明
は特に、生物試験試料中に存在する核酸の検出および分
析のための方法および機器に関する。

【０００２】

【従来の技術】核酸試験は、遺伝子配列および発現の研
究を含む試験試料分析において常に生じる分野である。
まず最初にヒトの患者または他の起源の試験試料が分離
され、試料中の標的核酸を増幅してコピーの数を増や
し、試験試料を分析可能にする。次に標的配列のコピー
は、１種またはそれ以上の相補オリゴヌクレオチドプロ
ーブに対し、溶液中または相補プローブを担持する固体
担体との間でハイブリダイゼーションされ、ハイブリダ
イゼーション複合体を生成する。検出用プローブもある
条件で標的配列にハイブリダイゼーションされる。生成
したハイブリダイゼーション複合体が信号を発生する
と、ハイブリダイゼーション生成物の検出と同定が行わ
れる。核酸配列を増幅することにより、微生物培養に頼
らずに微生物の有無に関する情報が得られる。

【０００３】増幅法は米国特許第４，６８３，１９５号
（Ｍｕｌｌｉｓ）および４，６８３，２０２号（Ｍｕｌ
ｌｉｓ）に記載され、この中ではポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）により標的核酸分子を指数的に複製するた
め、ＤＮＡポリメラーゼ、相補プライマー分子および熱
反応反復サイクルが利用される。米国特許第５，７９
２，６０７号（Ｂａｃｋｍａｎ）にはリガーゼ連鎖反応
（ＬＣＲ）と呼ばれる増幅法が記載され、米国特許第
５，７４４，３１１号（Ｆｒａｉｓｅｒ）、５，６４
８，２１１号（Ｆｒａｉｓｅｒ）および５，６３１，１
４７号（Ｌｏｈｍａｎ）には分子鎖置換増幅（ＳＤＡ）
に基づく等温増幅系が記載される。等温増幅の記載につ
いてはＷａｌｋｅｒら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
２０、１６９１−１６９６（１９９２）、米国特許第
５，４３７，９００号（Ｂｕｒｇ）および欧州特許第３
７３９６０号（Ｇｉｎｇｅｒａｓ）も参照のこと。さら
に別の核酸増幅法が米国特許第５，３９９，４９１号
（Ｋａｃｉａｎ）および５，４０９，８１８号（Ｄａｖ
ｅｙ）に記載されている。前記それぞれ、および全ての
参考資料は、本明細書に引用するその他全ての特許およ
び文献と共に本明細書に参考資料として含まれる。

【０００４】ハイブリダイゼーション技術については多
くの他の文献に、例えば米国特許第４，５６３，４１９
号（Ｒａｎｋｉ）および４，８５１，３３０号（Ｋｏｈ
ｎｅ）、およびＤｕｎｎら、Ｃｅｌｌ １２、ｐｐ２３
−６６（１９７８）に記載がある。溶液中ハイブリダイ
ゼーション、一段階または多段階反応における固体支持
体上へのプローブ補足を含め、ハイブリダイゼーション
反応に対する様々な変法が公知である。

【０００５】米国特許第４，４８６，５３９号（Ｋｏｕ
ｒｌｉｓｋｙ）、４，４１１，９５５号（Ｗａｒｄ）、
４，８８２，２６９号（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）および
４，２１３，８９３号（Ｃａｒｒｉｏ）に記載される検
出法は、特定の核酸並列を検出するための標識検出プロ
ーブの製法を示している。検出可能な標識は、塩基、糖
または１以上の特定のリン酸基上のリンカーアームによ
り、直接または間接的に結合している。公知の標識には
蛍光発色体、放射性同位元素、染料、アルカリホスファ
ターゼ等の酵素、発光または化学発光分子が含まれる。
検出プローブは増幅核酸反応生成物またはアンプリコン
に結合し得る。アンプリコンへのハイブリダイゼーショ
ン後に標識検出プローブから検出される信号量は、アン
プリコン、従って元の試験試料中の一個以上の選択され
た標的核酸の有無を反映する。

【０００６】一般的に、試料中の内部標準は既知の初期
量を増幅し、次いで逆の配列またはセンスを有する検出
プローブとハイブリダイゼーションして、内部標準アン
プリコンとの複合体を生成し、最後に発生する信号を検
出することにより、試験試料中の標的核酸の定性および
定量が可能な一つの方法が得られる。

【０００７】試験試料中に存在する標的の定量法は、米
国特許第５，２１３，９６１号（Ｂｕｎｎ）、５，４７
６，７７４号（Ｗａｎｇ）、５，４７６，７７４号（Ｒ
ｙｄｅｒ）および５，４５７，０２７号（Ｎａｄｅａ
ｕ）に記載されている。

【０００８】核酸検出キットが市販され、上に参照した
増幅、ハイブリダイゼーション、標識検出および定量の
技術が用いられている。例えば、増幅された核酸を検出
するＨＩＶ分析が米国特許第５，５５９，６６２号（Ｒ
ｅｓｐｅｓｓ）およびＧｒａｔｚｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄ ６６、ｐｐ２６９−２９２（１９９
７）に記載されている。この様なＨＩＶ核酸の増幅を行
うキットには、Ｃｈｉｒｏｎ ＱＵＡＮＴＩＰＬＥＸ
Ｂｒａｎｃｈｅｄ ＤＮＡおよびＯｒｇａｎｏｎＴｅｋ
ｎｉｋａ ＮＡＳＢＡ−ＱＴが含まれる。

【０００９】Ｍ．ｔｕｂｅｃｕｌｏｓｉｓ用試験キット
が米国特許第５，６４３，７２３号（Ｐｅｒｓｉｎｇ）
に記載され、マイコバクテリア試験用核酸が５，５８
９，５９５号（Ｍａｂｉｌａｔ）、５，７０２，３１２
号（Ｍａｂｉｌａｔ）および５，８３９，９０１号（Ｍ
ａｂｉｌａｔ）に記載されている。

【００１０】核酸配列解析は制限検出または低次検出フ
ォーマットと、多重または高次検出フォーマットの二つ
の異なった分類に分けられる。その区別は、フォーマッ
トから得られる特定のデータ信号数、または応答数であ
る。

【００１１】欧州特許第０８７５５８４号には低次検出
フォーマットを用いる機器が記載されている。検出プロ
ーブに結合した単一タイプの蛍光標識を測定し、試験試
料中の相補核酸の存在を検出する。この技術を順番に用
いることにより、その機器が試験試料中の少なくとも２
種の特異的標的を測定し得ることが示された。また、ス
クリーニング検定で多重標識（例えば、異なった放射特
性を有する蛍光または発光標識）も同時に測定すること
ができる。しかしながら実用上の理由で、スクリーニン
グ検定で測定し得る標的被分析物の数は１０以下であ
る。これらの技術は低次検出フォーマットのカテゴリー
に入ると考えられる。

【００１２】高次検出フォーマットにおいて、試験パネ
ルの設計または選択は、一部には顧客の要請、特定部位
での疾病発生率、微生物およびウイルス同時感染の頻
度、および（数は少ないが例を挙げれば）環境条件によ
って決められると思われる。

【００１３】この二番目のカテゴリーである多重検出ま
たは高次検出フォーマットは、試験アンプリコンに関す
るより詳細な情報を提供する。この例の一つは、逆ドッ
ト−ブロット技術であり、マトリックス上に固定化され
た多重相補標識に核酸がハイブリダイゼーションされ
る。染色処理後、染色された多重セクションが相補標的
の存在を示す。他の技術では多量のオリゴヌクレオチド
が沈降した、光学的手法で空間的に位置決めできるマト
リックスまたは配列を提供する。

【００１４】大規模遺伝子解析における最近の進歩で
は、微細作成技術による多重検出アレイとして組み込ま
れたオリゴヌクレオチドが利用される。これらのアレイ
の合成と方法は米国特許第５，７００，６３７（Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ）、米国特許第５，４４５，９３４（Ｆｏｄ
ｏｒ）、米国特許第５、８０７、５２２（Ｂｒｏｗ
ｎ）、米国特許第５，２０２，２３１（Ｄｒｍａｎａ
ｃ）および米国特許第５、８３７、８３２（Ｃｈｅｅ）
に記載されている。これらのアレイによりハイブリダイ
ゼーションが行われ、単一または多重塩基置換等の変異
体または突然変異の同定のための固定化オリゴヌクレオ
チドが標識プローブまたは標識アンプリコンにより探査
される。応用例として、ヒト免疫不全ウイルス検出用の
多重検出アレイがＦｏｄｏｒ、Ｓｔｅｐｈｅｎら、「光
学的手法で空間的に位置決めし得る平行化学合成」、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２５１、ｐｐ７６７−７７３
（１９９１）に記載されている。

【００１５】低次および高次フォーマットが分析および
診断試験の双方に用いられているが、それぞれ別な能力
を持っている。低次検出フォーマットは簡便であり、比
較的コストが低く、例えばこの試料が典型的なＨＩＶウ
イルス領域由来の核酸を含んでいるかという、試料に関
する特定の質問に答えることができるという利点があ
る。高次検出フォーマットはより高価であるが、例えば
このＨＩＶ核酸試料が野性型配列由来の突然変異を有す
るか、もしそうならそれは何かという、分析のためのよ
り多くのデータまたは情報を提供できるが、高価である
ため、日常のスクリーニング試験では多重検出または高
次検出フォーマットは費用効率の良い手段とは見なされ
ていない。従って、典型的な有償の試験では制限され
た、または低次検出フォーマットが図１に示す様な医学
的仮説を確認するために行われる。

【００１６】図１において、試験手順は患者が結核に罹
っているという仮定から始まる。工程１０で呼吸試料を
患者の唾液から得る。工程１２で試料を処理し、培養用
組織を得る。次いで試料を分割し、一部を組織培養に用
いる。工程１４で試料の第２の部分を抗酸性スメア試験
に提供する。抗酸性スメア試験の結果が陰性である場
合、工程１６で示されるように医師は培養の結果を待た
なければならない。可能であれば臨床技師は試料を再度
処理し、工程１８で行われる増幅種特異性ＴＢ試験に提
供する。工程２２では、増幅Ａｖｉｕｍ細胞内試験が試
料を同定するために行われる第３の試験となり得る。工
程２２での試験結果が陰性である場合、試験試料または
新しい第２の試料で次の試験反応または培養を行い、試
料中に病原体が存在するかどうか決定する。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】従来の技術において
は、前記の核酸検出キット等の低分解能または低感度検
出フォーマットは簡便で、比較的コストが低く、保存さ
れた、または限定された数の標的配列の存在を検出する
のに有用であるが、これらの試験は特定の突然変異体、
その薬剤感受性または突然変異の有無の解析に必要な、
高いレベルのデータまたは標的核酸に関する詳細を得る
ためにはあまり有効でなかった。高次検出フォーマット
は分析のためのより多くのデータまたは情報を提供でき
るが、それが高価であるため、日常のスクリーニング試
験では多重検出または高次検出フォーマットは費用効率
の良い手段とは見なされていない。

【００１８】図１は公知の低コスト試験の典型例であ
り、抗酸性スメア（工程１４）がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉａを含むと疑われる試験試料のうち、陰性である９０
％の試料をを排除するために用いられる。以後の試験を
陽性である１０％の試料に用いることは正当であるが、
試験試料の全てに適用しなければならない場合、仮に試
験費用が低くても人件費と試料処理費は正当とは言えな
い。

【００１９】核酸分析のための限定検出スクリーニング
を含むだけでなく、更に先へ進む機器および自動化法の
必要がある。このような機器の能力は、例えば他の遺伝
的欠陥と類似、または重複する生理学的影響を生じ得る
遺伝的欠陥の同定等、価値のある情報およびデータを提
供すると思われる。また、集中試験ステーションおよび
使用し得る薬剤に対する微生物の耐性を決定し、適当な
治療法を決めるためのデータを提供できる機器システム
も必要である。さらに、この様なシステムは研究者また
は医療関係者の操作、特に試料調製、増幅および検出を
含む工程を最小にすることを目的としなければならな
い。その機器はモニタリング、データ収集、配列および
核酸の遺伝子型決定と共に、各試験または工程間の汚染
の危険性を制限するための道具として応用し得ることが
好ましい。その機器はまた、正確、高感度であり、妥当
な価格で利用者が購入できることが可能でなければなら
ない。

【００２０】本発明は、核酸分析のために多重または高
次検出フォーマットを何時選択するかを自動的に制御す
る方法および機器を提供し、定性および定量分析のため
の１回以上の第１試験反応から１個以上の信号データを
提供し、また低コスト技術、即ち自動化システムにおい
て限定検出フォーマットを使用してさらなる解析の必要
性を決定するに当たり、試料中の標的核酸配列のスクリ
ーニングを行うことを目的としている。本発明は他の方
法の試みに固有の様々な制約を克服し、生物または試験
試料中の核酸を正確かつより完全に同定する、費用効率
のよい手段を提供する。

【００２１】

【課題を解決するための手段】本発明の提供する、多重
または高次検出フォーマットの選択を自動的に制御する
方法および機器には、制限検出また低次検出フォーマッ
ト中の少なくとも１回の増幅反応で生成した標的アンプ
リコンを検出し、次いで低次検出フォーマット由来のデ
ータまたは信号を取り込む統合システム中の制御アルゴ
リズムを使用し、標的アンプリコンを高次検出フォーマ
ットを使用しその費用で分析するかどうかを決定する工
程が含まれる。本システムは第１試験反応からの出力デ
ータを、制御アルゴリズムおよび高次検出フォーマット
選択のための入力データとして利用する。

【００２２】本発明のさらなる目的は、定性および定量
分析のための１回以上の第１試験反応から１個以上の信
号データを提供することである。第１反応では、試験試
料由来の増幅標的核酸と共に、好ましくは既知の濃度を
有する増幅された内部標準配列がハイブリダイゼーショ
ンおよび検出反応に提供され、信号データを発生する。
得られた信号は制御モジュールに供給され、処理され、
標的／試験試料または内部標準アンプリコンいづれかに
特有の閾値レベル信号と比較される。信号の組み合せ
は、標的アンプリコンをさらなる試験のため、自動的に
機器内部の別のステーションへ移送するかどうかを決定
するアルゴリズムに使用される。必要ありと判断された
場合、１個以上の選ばれた高次検出フォーマットを用い
る第２試験反応により、変異体の同定、核酸配列の突然
変異、微生物またはウイルスの薬剤感受性または耐性等
の標的アンプリコンに対するさらなるデータが得られ
る。第２試験反応の解析には、少なくとも１個の高次検
出フォーマット中でのアンプリコンのハイブリダイゼー
ションが含まれる。

【００２３】本発明の好ましい実施形態では、可能なら
ば核酸増幅能を有する試料調製ステーション、第１およ
び第２ステーションまたはモジュールおよび適当な検出
ステーションを包含し、各ステーションは制御モジュー
ルによって指令される核酸分析用機器を提供する。流体
流路または流体転送手段も備えられ、随意に第１試験反
応ステーションからのアンプリコンを第２反応ステーシ
ョンまたはモジュールに接続する。各ステーションは他
のステーションとモジュールの制御下に連通する。制御
モジュールは第１反応ステーションおよびフィードバッ
クループ中の対応する検出ステーションから得られたデ
ータを統合し、プロセスを終了するか、または第２試験
反応ステーション中の第２反応を開始し、その後検出と
信号解析を行う。

【００２４】本発明の他の実施形態は、試料処理、増
幅、ハイブリダイゼーションおよび検出法を統合したモ
ジュール状の自動化機器システムであり、システムはさ
らに試験試料に関して追加データ収集を行うべきかどう
かを解析し、その後この様な追加データ収集分析を行う
ことができる。

【００２５】本発明一つの目的は、低コスト技術、即ち
自動化システムにおいて限定検出フォーマットを使用
し、さらなる解析の必要性を決定するに当たり試料中の
標的核酸配列をスクリーニングすることである。少なく
ともシステムの高次検出フォーマットによりさらに解析
し得る全ての試料を「陽性」とするために、スクリーニ
ング工程は高感度であるが広範な特異性を有する必要が
ある。

【００２６】別の態様では、異なった反応技術、即ちハ
イブリダイゼーションおよび検出を利用して標的核酸配
列を完全に決定するために、総合的な機器システムが提
供される。好ましい実施形態では、均一溶液ハイブリダ
イゼーション反応を利用するスクリーニング試験が行わ
れ、多重検出解析のために、単一アレイ／マトリックス
ハイブリダイゼーションが利用される。別な目的では、
１回以上のマトリックス系ハイブリダイゼーション分析
を行う必要性を決める目的で信号データを制御モジュー
ルへ提供するため、増幅プロトコールを行わずにスクリ
ーニング解析を提供することが可能である。

【００２７】本発明のシステムは例えば微生物学、ウイ
ルス学、食品研究、水試験、ヒトおよび動物の疾病の診
断、および分析研究用に使用できる。適当な生物または
試験試料材料には動物、ヒトまたは植物細胞または組
織、血液、尿、糞および尿道粘膜が含まれる。さらに、
本発明は食品加工、汚染制御または医薬品研究等の産業
用途にも使用可能である。

【００２８】特に、本発明の一つの態様では疾病の検
出、薬剤耐性の同定および治療の目的で重要なデータと
情報が提供される。

【００２９】

【発明の実施の形態】本発明の代表的な、好ましい選択
的な実施形態が、添付図面と共に以下に示される。参照
番号はそれぞれの図面での対応する要素を表す。

【００３０】制限または低次検出フォーマットは前記の
ハイブリダイゼーションおよび検出法を含む。これらは
溶液中、またはマトリックスに結合した捕捉プローブを
用いて行われる。プローブが固定化されたマトリックス
にはポリスチレン系ポリマー、ニトロセルロース、様々
な組成のシート、ビーズ、ミクロタイターウエル、チュ
ーブ、ガラス粒子、磁気粒子、天然および合成繊維が含
まれる。本明細書で言う低次検出フォーマットには、別
個の配列を有する５０以下、好ましくは少なくとも１個
から１０個のオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。
各プローブは試験試料由来のアンプリコンに対し、また
随意に内部標準に対し、完全なまたは部分的な相補配列
を含んでいる。本明細書で言う高次検出フォーマットと
は、１００個以上、好ましくは４００個以上、最も好ま
しくは１０００個以上のオリゴヌクレオチドプローブを
含み、そのそれぞれが適当なマトリックスに結合または
固定化された別個の配列を有する。プローブはマトリッ
クスに対し高い空間密度、例えば４００プローブ／ｃｍ
^２から１０００プローブ／ｃｍ^２で結合している。各プ
ローブはその一部に潜在的標的アンプリコン配列に対し
完全に、または部分的に相補性のある配列を含んでい
る。

【００３１】好ましい実施形態では、低次検出フォーマ
ットは高次検出フォーマットと異なっている。例えば、
低次検出フォーマットには均一溶液ハイブリダイゼーシ
ョン反応を行う機器が含まれるが、高次検出フォーマッ
トにはマトリックスハイブリダイゼーション反応を行う
機器が含まれる。また、少数の標的アンプリコンおよび
内部標準アンプリコンをスクリーニングするために、マ
トリックスハイブリダイゼーション反応は低次検出フォ
ーマットに用いられる。

【００３２】図２を参照すると、分析の継続を自動的に
指令し、高次検出フォーマットの選択を制御する方法と
機器を提供するある好ましい実施形態がフローチャート
に示されている。その方法には、低次検出フォーマット
（一般的に工程３０で示される）と制御アルゴリズム４
０を用いて、試験試料中の標的核酸の増幅反応により生
成したアンプリコンを検出し、１個以上の高次検出フォ
ーマットを使用を決定する工程が含まれる。その好まし
い実施形態には試験試料中の核酸の完全な分析のための
単一増幅工程が含まれていてもよい。従って、試料は広
範な特異性を有するスクリーニング検定を行う目的の初
期数の第１ハイブリダイゼーション反応に提供され、検
定に用いられる技術の費用効率の良い選択は、適当なデ
ータ入力を伴う自動制御アルゴリズム４０を用いて決定
される。低次検出フォーマットからの出力データは、選
ばれた高次検出フォーマット（工程５０）のための入力
データとなる。

【００３３】図２の方法により、試料をスクリーニング
するために低コスト技術、即ち工程３０の低次検出フォ
ーマットを使用することが可能になる。この様なアプロ
ーチを用いることにより、標的アンプリコンを試料分析
中に用いることができる。制御アルゴリズム４０が高次
検出フォーマット５０の必要性が正当であることを決定
する場合、第２分析５０を開始する。本発明の機器に試
料を導入する以前、または導入時に、システムユーザー
によりそれ以前の試験または分析からのデータも入力さ
れる。

【００３４】前記手法の第１工程３０（即ち、低次検出
フォーマットで標的アンプリコンを測定する工程）で
は、核酸が処理または放出され、好ましくは１００％に
可能な限り近い「スクリーニング」感度が得られるよう
に選ばれた分析で増幅される。言い換えれば、選ばれた
スクリーニングフォーマット中の任意のパラメータで試
料が実際に陽性である場合、第１分析試験反応は陽性の
結果を与える。

【００３５】代表的な実施形態において、第１工程３０
は２個の独立した工程からなる。第１サブ工程３２は内
部標準配列、および代表的試験パネル中の全ての疑わし
い標的核酸、即ち呼吸、血液中の核酸等を増幅し、内部
標準アンプリコンおよび標的アンプリコン（Ｔ１、Ｔ
２、…Ｔｎ）を生成する工程からなる。内部標準アンプ
リコンは、技術的欠陥による陰性の結果が生じていない
ことを補償する手段として測定される。本明細書で用い
る内部標準配列とは、標的核酸配列により影響されない
ように加工され、試料中のいかなる核酸配列と実質的に
類似でなく、かつ陽性増幅プロセスを決定するオリゴヌ
クレオチド配列である。一般的に、内部標準は標的と共
に増幅され、増幅の陽性対照となる。内部標準信号はま
た、定量的試験試料分析にも利用可能である。

【００３６】第２工程３４は、内部標準および標的それ
ぞれからの信号を測定する工程からなる。信号を測定す
るために用いられる機器は、システム中に組み込まれて
いる。

【００３７】プロセス４０の第２工程、即ち制御アルゴ
リズムを実行する工程において、点線ボックス４０で示
すように信号が制御アルゴリズムに与えられる。内部標
準信号は、増幅プロセスが満足できるものかどうかを示
すために用いられる。制御アルゴリズム４０は、試料の
分析を次工程５０に進めるべきかどうかを制御する２個
の信号を実行する。

【００３８】図２に示される１つの実施形態では、内部
標準信号が設定された閾値（４２）以下であった場合、
増幅反応が生じなかった、または他の理由で適切な閾値
に達しなかったということで、その試験は排除される。
内部標準信号が閾値以上である場合、アルゴリズムによ
り１個以上の標的に対するスクリーニングパラメータが
閾値以上であるかどうかが決定される（４４）。そうで
ない場合、試験結果は陰性とみなされ、仮説が排除され
る。したがって分析の第２工程５０の費用または必要性
の負担はない。逆に、スクリーニングパラメーターが閾
値以上である場合（４４）、第２工程５０の分析へ進む
ことができる。

【００３９】好ましい実施形態において、工程３０の出
力または結果が選択された高次検出フォーマット上で第
２工程５０を実施すべきかどうかを判断するための入力
として使用されるような方法で、図２の方法が行われ
る。対照的に、先行技術に記載されるさらに進んだ、ま
たは継続した試験では、試料を独立に、または繰り返し
扱うことが必要であり、多くの場合、さらにサンプリン
グを行う必要がある。先行技術の試験は試料の保管、追
加操作、および処理工程一回の反復が必要であるが、そ
れらは本発明では避けることができる。さらに、先行技
術においては第１試験の結果を調べ、次の行動を決める
ために人手を介する必要がある。好ましくは、図２のプ
ロセスの最初に試料にただ１回だけ接触する方がよい。

【００４０】本発明の好ましい実施形態では、工程３
０、４０および５０は自動化分析機器内に組み込まれ、
低次検出フォーマット（工程３０）を含むプロセス中に
人手を介さず最終結果に達することができる。本発明の
好ましい実施形態によれば、この機器は高次検出フォー
マット５０で分析される全ての標的に対し、第１工程３
０内であらゆる増幅を行う。次いで、この機器は十分な
量のアンプリコンを有する試料を、より包括的な分析同
定のための高次検出へ向かわせることができる。

【００４１】高次検出フォーマットの好ましい実施形態
は、米国特許第５、８３７、８３２号（Ｃｈｅｅ）に記
載されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥ ＣＨＩＰ技
術である。患者試料からの核酸由来の標識されたアンプ
リコンが標準生化学技術で単離され、高密度カートリッ
ジ（ＧＥＮＥ ＣＨＩＰ）の表面で洗浄される。高密度
カートリッジ中の一本鎖ＤＮＡ配列またはプローブのコ
ピーは相補標識アンプリコンとハイブリダイズする。レ
ーザースキャナーにより、標識配列がハイブリダイゼー
ションした既知の位置からの信号が検出される。

【００４２】図２中の工程３０の代表的な好ましい実施
形態をさらに説明する。疑わしい核酸標的を分析の最初
の部分で処理しなければならない。試験プロトコールの
開発中にプローブ配列、プライマー、保存配列等の増幅
反応に含まれる条件をパネル中で試験されるパラメータ
ーを参照に同定しなければならない。さらに、例えば、
唾液試料由来のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの試験であ
る図３を参照して、米国特許第５，５８９，５８５号
（Ｍａｂｉｌａｔ）、５、７０２、３１７号（Ｍａｂｉ
ｌａｔ）および５，８４９，９０１号（Ｍａｂｉｌａ
ｔ）に記載される制御アルゴリズムの一部となる性質を
有する少なくとも１個の部位を選ばなければならない。
２３Ｓ ｒＲＮＡ配列の保存またはコンセンサス領域
が、低次検出フォーマットに対するスクリーニングパラ
メーターとして選ばれる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
の検出に用いられる２３Ｓ ｒＲＮＡの高度保存領域の
増幅は、低次検出フォーマット中で行われる。スクリー
ニング検定結果が適当な閾値に合致する場合、高次検出
フォーマット用の工程３２Ａで示されるように、増幅は
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ
ｓ中のリファムピン耐性に関係するｒｐｏＢ遺伝子のＤ
ＮＡ上でも行われる。微生物１個あたりＤＮＡよりｒＲ
ＮＡのコピー数が多いので、２３Ｓ ＲＮＡ領域はＭｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの存在をより示し易い。最後の
要請として、２３Ｓ ｒＲＮＡに用いられるプライマー
が内部標準配列と組み合せて用いられ、増幅効率と定量
分析が達成されるように内部標準アンプリコンが生成す
る。

【００４３】ある実施形態では、試験の第１工程３０由
来のアンプリコンが第２工程５０へ転送されるが、スク
リーニングおよび検出技術は高次検出フォーマットと互
換性がなければならない。このことは、米国特許第５、
５１２、４９３号（Ｍａｔｈｉｓ）またはＧ．Ｈ．Ｋｅ
ｌｌｅｒおよびＭ．Ｍ．Ｍａｎａｋ「ＤＮＡプローブ」
第２版、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９３、第
６節に記載される様に、工程３２の均一系検出技術を用
いて行われることが好ましい。また、エネルギー転移に
基づくハイブリダイゼーションまたはビーコン／検出基
技術がＧｉｏｎａｔａ Ｌｅｏｎｅら、「ＲＮＡの均
一、リアルタイム検出を可能にするＮＡＳＢＡによる増
幅と組み合せた分子ビーコンプローブ」、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．２６、ｐｐ
２１５０−２１５５（１９８８）に記載されている。標
的配列を均一系で検出可能なビーコン／検出基は、幹ル
ープ構造からなり、ループ部分はアンプリコンに対し相
補性である。標的が存在する場合、ビーコン／検出基構
造は「開」の状態であり、ループは標的にハイブリダイ
ズする。「開」ビーコン／検出基は通常「閉」状態では
消光される蛍光を発する。本発明の１つの実施形態によ
れば、ビーコン／検出基部分は当業者に公知の技術を用
いて固体支持体上に固定化される。固体支持体は好まし
くは微粒子または磁気粒子を含む使い捨て器具である。
ビーコン／検出基は、反応条件により幹構造配列が開く
ような方法で構築する必要がある。アンプリコンはビー
コン／検出基と接触することによりビーコン／検出基の
幹構造を開き、ループ構造へハイブリダイズすることが
できる。図３の工程３２Ｂ参照。標的アンプリコンが存
在する場合、開構造が消光剤を検出分子から取り去り、
標識を検出可能にする。得られた信号は蓄積され、制御
アルゴリズム４０で使用される。

【００４４】選ばれた閾値と組み合せて使用した場合、
制御アルゴリズム４０は３種の異なったプロセスを行
う：（１）予想される標的の存在の定性的検出、（２）
高次検出フォーマットの結果と組み合せて用いられる１
個以上の標的の定性的検出、および（３）数個の標的の
うちの１個の定性的検出、および高次検出フォーマット
分析５０用の試験の特定のアレイの予備選択。

【００４５】好ましい実施形態における第１のタイプの
プロセスである標的の保存領域の存在の定性的検出は、
唾液試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの試験のため
に先に記載されている（図３参照）。例えば、図３で第
１ハイブリダイゼーション反応、または内部標準アンプ
リコンの検出子またはビーコン／検出基へのハイブリダ
イゼーションからの信号が閾値レベル以下である場合
（工程４２）、その試験は排除される。信号が上記閾値
以上である場合、保存２３Ｓ ｒＲＮＡ配列の標識また
はビーコン／検出基の第２グループへのハイブリダイゼ
ーションに対する信号は工程４４で解析される。この信
号が閾値レベル以下である場合、工程４６に示される様
に制御アルゴリズムは結果が陰性であることを示す。逆
に信号が閾値レベル以上である場合、他の２３Ｓ ｒＲ
ＮＡ増幅領域およびｒｐｏＢを含むアンプリコンは工程
５０に示すように高次検出フォーマットへ転送される。

【００４６】第２タイプの制御プロセス、すなわち多重
検出解析結果と組み合せて用いられる１個以上の標的の
定量的検出も、制御アルゴリズムで可能である。ある場
合は、標的核酸の量が分析または診断で重要である。例
としてＡＩＤＳの治療を受けているＨＩＶ患者を考え
る。全ウイルス核酸またはウイルス負荷の測定は重要な
診断／治療上の指針である。例えば、ウイルス負荷レベ
ルが閾値より大きい場合、医者はＨＩＶアンプリコンの
遺伝子型分析をさらに行う価値がある。このような解析
は高価な高次検出フォーマットが必要であるが、適当な
治療によって全ウイルス核酸レベルが低い場合は必要が
なくなる。この用途と図３の単純な定量例との主な違い
は、定量的信号が制御アルゴリズムで使用されるばかり
でなく、例えば多点補正において、または内部標準のレ
ベルが増幅前に既知である場合、既知レベルのウイルス
からのデータを伴い、それにより解析される報告された
場合の結果であることである。

【００４７】この第２タイプの制御アルゴリズムの一例
が図４に示される。この例では、試料はＨＩＶ患者から
得られる。工程３０（低次検出フォーマット）は工程３
２Ａで示されるような内部標準配列、保存ＨＩＶ配列お
よび多形ＨＩＶ配列を増幅する工程からなる。プロセス
は工程３２Ｂで示されるように、内部標準アンプリコン
のハイブリダイゼーションで始まり、ビーコン／検出基
および保存配列アンプリコンまで続く。また、アンプリ
コンは最初に固体支持体に捕捉されて複合体を生成し、
次いで検出子がアンプリコンを検出するために複合体に
ハイブリダイズする。次に工程３４に示すようにビーコ
ン／検出基複合体のハイブリダイゼーションから信号が
測定される。発生した得られた信号はデジタル化され、
制御アルゴリズム４０を実行する制御モジュールまたは
演算ユニットへ送られる。

【００４８】制御アルゴリズム４０では、工程４２は図
３と同じである。ビーコン／検出基＃１からの信号が第
２閾値（工程４４）より小さい場合、工程４６で示す高
次検出フォーマットを実行するために、アルゴリズム４
０はそのレベルが閾値以下である核酸の報告を提供す
る。ビーコン／検出基＃２からの信号が第２閾値より大
きい場合、アンプリコンは第２反応ステーションへ転送
される（工程５０）。

【００４９】また、定量的検出において、補正データを
独立で得るための増幅前に既知料の核酸を有する内部標
準（図示せず）の増幅は、制御アルゴリズムで行われ
る。工程４４で検出される信号からの結果は、内部標準
アンプリコン由来のデータを参照して計算され、工程４
６で示すように報告される。

【００５０】実行し得る第３タイプのプロセスは数個の
標的のうち１個の定量的検出、および第２ハイブリダイ
ゼーション反応用の特定試験パネルの予備選択である。
図２の一実施形態のより一般的な場合として、数個の可
能な標的の内の１個以上を検出するために多重ビーコン
／検出基を使用し、制御アルゴリズムで使用する多重入
力信号を提供することができる。例えば、Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌ
ａｓｍａ、インフルエンザまたはＲＳＶを呼吸パネルで
試験することができる。結核における薬剤耐性を検出す
る必要があるため、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍはこの
標的のみに用いられる多重検出分析が必要である複合標
的である。同様に、インフルエンザとＲＳＶはウイルス
であり、それぞれ異なった多重検出機器を必要とする。
従って、３種の異なった高次検出フォーマットが試験試
料のさらなる、または第２の解析のために適当である。
３種の低次検出フォーマットそれぞれに対する異なった
保存配列を選ぶことにより、制御アルゴリズムが３種の
高次検出フォーマットの内のいづれかを選ぶことができ
るビーコン／検出基を設計することが可能である。この
第３プロセスの一例が図５に示される。

【００５１】図５を参照して、図２および図４に共通の
基本的な特徴、すなわち、制御アルゴリズム４０中のス
クリーンの信号出力を用いる、および制御アルゴリズム
の結果に基づく工程５０におけるより広範囲の高次検出
フォーマットを制御、開始する、工程３０中の低次検出
フォーマットが図５でも共通である。

【００５２】図５の実施形態では、工程７２、７４およ
び７６で示されるように３種の低次検出フォーマットが
平行に走る。この例では、ある与えられた診断仮説に対
する工程７０で呼吸試料が得られる。試験試料が機器に
提供され、次いで核酸を放出するために処理される。工
程７８におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ＲＮＡと同
時に、最初のフォーマット７２で内部標準も増幅され
る。内部標準アンプリコンのビーコン／検出基の第１セ
ットへのハイブリダイゼーション、およびＭｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ＲＮＡアンプリコンの第２セットへの
ハイブリダイゼーションを伴って、前記方法は工程８０
へ続く。最後に、工程８２でビーコン／検出基の第１お
よび第２セットからの信号が、既知の蛍光または他のタ
イプの検出機器を用いて測定される。信号はデジタル形
に変換され、制御モジュール、独立コンピュータ、また
は制御アルゴリズム４０を実行するその他の演算ステー
ションへ供給される。

【００５３】第２フォーマット７４の工程８４で、試料
中のＲＳＶとインフルエンザ標的が増幅される。工程８
６でＲＳＶとインフルエンザアンプリコンがビーコン／
検出基番号３および４とそれぞれハイブリダイゼーショ
ンされる。次いで工程８８でビーコン／検出基の第３お
よび第４セットからの信号が既知の蛍光または他の型の
検出機器を用いて測定される。信号はデジタル型に変換
され、制御アルゴリズム４０を実行する制御モジュール
に供給される。

【００５４】第３フォーマット７６の工程９０で、試料
中のＭｙｃｏｐｌａｓｍａとＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ標的
が増幅される。米国特許第５，６１４，３８８号にはＬ
ｅｇｉｏｎｅｌｌａ解析法が記載され、本明細書中に参
考文献として用いられる。工程９２でアンプリコンは番
号５および６にそれぞれ指定されたビーコン／検出基に
ハイブリダイゼーションされる。次いでビーコン／検出
基の第５および第６セットからの信号が既知の蛍光また
は他の型の検出機器を用いて測定される。信号はデジタ
ル型に変換され、制御アルゴリズム４０を実行する制御
モジュールに供給される。増幅反応を評価し、必要あれ
ば定量分析のため、内部標準アンプリコンを用いること
ができる。

【００５５】図５の制御アルゴリズムはまず内部標準ア
ンプリコン信号と第一フォーマット７２の比較（工程１
００で示される）を行い、信号が所定の閾値より大きい
かどうかを決定する。大きくない場合、工程１０２に示
されるように試験全体が排除される。内部標準信号が閾
値より大きい場合、制御アルゴリズムは第２ビーコン／
検出基信号の比較へ進み（フォーマット７２から）、そ
れが第２閾値より大きいかどうかを決定する。第２閾値
より大きい場合、陽性の結果が示される。工程１１２で
示されるように、その後の多重検出分析に対する閾値が
設定される。例えば、工程１１２では呼吸試料中のＭｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに対する陽性の結果は、タイプ
「Ａ」の高次フォーマット分析をＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍをさらに分析するために開始しなければならない
ことを示す。

【００５６】工程１０４における比較が陰性値となる場
合、制御アルゴリズムは更に進んでその試験に対する陰
性の結果が正当であるかどうかを決定する。特に、Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉａの結果が陰性であっても、制御ア
ルゴリズムは工程１０６で第３ビーコン／検出基の測定
が第３閾値（ＲＳＶウイルスに対し）より大きいかどう
か、または第４ビーコン／検出基の測定が第４閾値（イ
ンフルエンザウイルスに対し）より大きいかどうかを決
定する。これらのビーコン／検出基信号のいづれかが閾
値より大きい場合、アルゴリズム４０は分析パラメータ
ー（ｘ）を２の、または異なった値、または、例えばＲ
ＳＶまたはインフルエンザのさらなる解析を行なうため
にタイプ「Ｂ」における高次検出フォーマットを開始し
なければならないことを示す特性「Ｂ」に設定する。

【００５７】工程１０６における比較が陰性の場合、ア
ルゴリズムは第３フォーマット７６の同様な解析のため
に先へ進む。特に、制御アルゴリズム４０は工程１０８
で、ビーコン／検出基信号の第５セットの測定が第５閾
値（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａに対する）より大きいかどう
か、またはビーコン／検出基信号の第６セットの測定が
第６閾値（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａに対する）より大きい
かどうかを決定する。これらのビーコン／検出基信号の
いづれか一つが閾値より大きい場合、アルゴリズム４０
は分析パラメーター（ｘ）を第３または異なった値に設
定する、例えば「Ｃ」は分析タイプ「Ｃ」をＭｙｃｏｐ
ｌａｓｍａまたはＬｅｇｉｏｎｅｌｌａのさらなる解析
のために開始しなければならないことを示す。

【００５８】工程１０８における比較が陰性である場
合、３個のフォーマット７２、７４、７６検出／ビーコ
ンの全て（制御ビーコン以外）は陰性である。従って、
制御アルゴリズムが示す陰性の結果は第１試験パネルに
対して得られ、機器が高次検出フォーマットに進まない
ことを示している。

【００５９】工程１０４、１０６および１０８における
比較の少なくとも一つが陽性の結果になると仮定する
と、陽性の結果を有するフォーマットからの適当なアン
プリコンが、好ましくは自動的に適当な高次検出フォー
マットへ転送される。好ましい実施形態では、第１反応
ステーション（３０）から第２反応ステーション（５
０）への転送工程が、アンプリコンを環境に暴露せずに
生じる。

【００６０】図５で３個の低次フォーマット分析が平行
に走っている間に、第１工程３０中のパネルの任意の数
の組み合せをプロセスに適用することができ、制御アル
ゴリズム４０が適当なデフォルト設定で異なったフォー
マットまたはフォーマットの組み合せを説明するために
変更されることを、当業者は理解し得ると思われる。

【００６１】図５（同時に他の図面）の制御アルゴリズ
ム４０が例えば論理ゲートを用いるハードウエアで実行
し得ることも、当業者は理解し得えると思われる。しか
しながら、スクリーニング分析３０または多重検出分析
５０のいづれかを行っている機器の反応ステーション
が、プログラム可能中央演算ユニットにリンクすると期
待されているので、別個にハードウエア制御モジュール
を構築するよりも、演算ユニットで実行される制御モジ
ュールを設置する方が好ましい。しかしながら、図２〜
５の制御アルゴリズムの操作工程が与えられた場合、完
全にハードウエアで実行される制御モジュールが他の実
施形態となり得ることも確かである。

【００６２】図６を参照して、ブロック図に示される図
２〜５の方法を実行する機器１２０は、モジュールの組
み合せ、即ち本明細書に記載される様なモジュールの操
作および連絡方法を提供する。

【００６３】図６を参照すると、試料は試料調製ステー
ション１２２と第１（１２８）および第２（１３４）反
応ステーション（必要であれば）の間で、流体転送手
段、例えば流路１２４、１２６、１３２を通って転送さ
れる。また、アンプリコンは第１反応ステーション１２
８から第２反応ステーション１３４へ、制御モジュール
１３８で制御される流体流路１４２を通って転送され
る。転送は人手を介さず、液体と外部環境の間の接触が
なく自動的に行われ、試料汚染と空中に飛散したアンプ
リコンの放出の危険性が増幅反応で最小になる。

【００６４】試料調製ステーション１２２から第１（１
２８）、第２（１３４）反応ステーションを経て検出ス
テーション１３６への試料の転送が、流体流路１２４、
１２６、１３２中の試料を実際に動かさずに行われる。
また、第１反応ステーション１２８から、高次検出フォ
ーマットが実行される第２反応ステーション１３４へ転
送される。これは、米国特許第５，７８６，１８２（Ｃ
ａｔａｎｚａｒｉｔｉ）に記載されるようなチャンバー
内の試料モジュールを通じて行われる。この様なチャン
バーは試料調製工程の場所ともなり得る。この様な転送
を行う手段の他の例は、ＦＲ９８１１３８３（出願１９
９８年９月８日）に記載されている。

【００６５】前記の如く、図６のステーション１２８は
第１セットのハイブリダイゼーション反応を行う。第１
反応ステーション１２８は、試料中に存在すると考えら
れる少なくとも１個から１０個の別個の核酸配列を分析
する手段を有する媒体または機器を含んでいる。内部標
準アンプリコンも検出され、従って、内部標準アンプリ
コンに相補性のある標識も提供されなければならない。

【００６６】機器１２０は、第１ハイブリダイゼーショ
ン反応中の標的またはアンプリコンの陽性ハイブリダイ
ゼーション信号測定に使用される、少なくとも１個の適
当な検出システム１３６と制御モジュール１３８を含
む。特に、検出システム１３６は制御モジュール１３８
に信号を供給し、次いで制御モジュール１３８中の中央
演算ユニットで使用するために信号がデジタル化され、
図２〜５の制御アルゴリズム４０を実行する。

【００６７】好ましい実施形態における第２反応ステー
ション１３４は、目録１２９から検索した高次検出フォ
ーマット機器上で第２セットのハイブリダイゼーション
反応を行うステーションからなる。高次検出フォーマッ
トは、１００個以上の別個の核酸配列、好ましくは１０
００個以上の別個の核酸配列を解析する手段を有する媒
体または機器からなる。高次検出フォーマットは前述の
多重検出分析の一例である。

【００６８】制御モジュール１３８は機器１２０の操作
全体にわたる統御と制御を提供する。制御モジュール１
３８は、図２〜５に記載される様に、第１低次検出フォ
ーマットにおける標的またはアンプリコンの陽性ハイブ
リダイゼーションが検出ステーション１３６により検出
されたかどうかに基づき、１個以上の選ばれた高次検出
フォーマット上での第２セットのハイブリダイゼーショ
ン反応の完結または実行の必要性を決定する。最後に、
検出ステーション１３６と制御モジュール１３８が、ス
テーション１３４中の高次検出フォーマット上の複数の
標的またはアンプリコンの陽性ハイブリダイゼーション
信号を検出するが、高次検出フォーマットは試験試料中
の標的核酸配列に対するさらなる分析データを提供す
る。

【００６９】機器１２０には試料調製ステーション１２
２が含まれる。研究者は例えば、患者または他の起源か
らの生物または分析試料をステーション１２２に置き、
試料を公知の技術または本明細書に記載の技術で処理す
る。好ましくはステーション１２２には、試料の起源ま
たは他の状況から増幅した方が良いと考えられる場合は
核酸を増幅するための、積算増幅ステーション構成が含
まれる。増幅ステーションは離れたステーションでもあ
りうる。さらに別な実施形態では、検出ステーション１
３６が増幅しない試料の結果が陰性であることを示す場
合は、試料の増幅が開始される。特定の試料処理工程
は、一部は既に行った資料分析により決定される。

【００７０】機器１２０には、標的またはアンプリコン
を含む流体を３方バルブ１３０に供給する試料調製ステ
ーション１２２に繋がれた流体移送手段、例えば流体流
路または導管１２４が含まれる。バルブ１３０は制御モ
ジュール１３８により制御され、流体を第１反応ステー
ションまたはモジュール１３８に導く第２導管１２６に
供給し、低次検出フォーマット（図２〜５の工程３０）
が実行される。流体導管１２４が試料を第１反応ステー
ション１２８に供給する手段として選ばれる場合は、試
料の汚染を防止するため、適当な既存の脱汚染／洗浄プ
ロセスを導管１２４のために用いなければならない。そ
の例には酸、漂白、オゾンまたはその他の化学的手法、
熱または電気処理技術が含まれる。

【００７１】第１反応ステーション１２８は標的または
アンプリコンによるハイブリダイゼーション反応を行
い、検出子プローブからの信号は検出ステーション１３
６により作られる。検出ステーション１３６は標的アン
プリコンに相補的である検出子プローブからの信号（例
えば蛍光または発光信号）を測定し、信号をデジタル化
し、デジタルデータバス１４６に沿って制御モジュール
１３８に供給する。本明細書に記載した制御アルゴリズ
ム４０は、制御モジュール１３８中のハードウエアまた
はソフトウエアで実行される。

【００７２】好ましい実施形態では、第１反応ステーシ
ョン１２８で用いられたスクリーニング分析が使い捨て
器具内で行われ、ユーザーインターフェース１４０での
ユーザーからの入力に基づき機器１２０で選択すること
ができる。例えば、ユーザーが患者由来の血液試料また
は喉の試料を処理している場合、各タイプの試料に対し
機器１２０はステーション１２８で異なったタイプの低
次検出フォーマットを使用する。ユーザーはユーザーイ
ンターフェース１４０で患者試料のタイプを入力し、制
御モジュールが低次検出フォーマット陽のパネルをパネ
ルの目録１２９から選ぶか、またはユーザーにこの様な
使い捨て器具を機器システム中に搭載するように指示す
る。理想的には、低次検出フォーマットを用いた第１反
応ステーションでの試験の試験費用を低減するため、機
器は制限された数のウエルまたはチャンバーを有するパ
ネルを包含し、試薬の少量のスペクトルを検出する（例
えば試料の起源にもよるが１０個以下のウエル、または
それ以上）。さらに、目録１２９に記憶された異なった
タイプの全てのフォーマットが、パネルの同定が機器１
２０中の安全処理ルーチンにより確認でき、正しいフォ
ーマットを目録１２９から検索できる様に、バーコード
または類似の指標で標識されていなければならない。

【００７３】第１反応ステーション１２８は検出ステー
ション１３６のごく近くに位置している。検出ステーシ
ョン１３６は、第１反応ステーション１２８で検出され
る信号のタイプに応じて、例えば光電増幅管、蛍光検出
器または他のタイプの検出システムを含んでいる。第１
反応ステーション１２８中における分析を含む機器はま
た、適当な転送機構により検出ステーション１３６へ移
動する。好ましい検出標識は化学発光または蛍光標識で
ある。

【００７４】制御モジュール１３８で実行される制御ア
ルゴリズムの結果により、試験は排除されるか、陰性と
見なされるか、または多重検出分析へ進む。試験の進行
状況はの一例は、第１反応ステーション１２８を高次検
出フォーマットが実行される第２反応ステーション１３
４へ繋ぐ導管内に置かれた導体１４４に沿って、バルブ
１４２へ制御モジュール１３８にアナログ信号を出させ
ることである。バルブ１４２が開いている場合、試験中
の標的に対するアンプリコンを含む液１流体が第２反応
ステーション１３４へ転送される。

【００７５】代表的な実施形態では、第２反応ステーシ
ョン１３４中のハイブリダイゼーション反応が、前記と
同様な高密度アレイ生成物等の使い捨て高次検出機器上
に備えられる。第２多重検出分析用高次検出フォーマッ
トが同様に装置目録１２９から検索される。高次検出フ
ォーマットでハイブリダイゼーションを検出するため、
多重検出手段がさらに第２反応ステーション１３４中、
またはその隣りに取り込まれる。

【００７６】検出ステーション１３６が第２反応ステー
ションからのハイブリダイゼーション信号の検出を終了
すると、その結果は制御モジュール１３８で処理され、
ユーザーインターフェース１４０に表示される。また、
機器１２０は用意し適当な報告を印刷するか、次の検索
のためにデータを電子的に記憶するか、または結果を付
属機器またはコンピューターの位置へ送る。

【００７７】図７を参照して、図２〜５の方法を実行す
るための分析機器２００の他のデザインがブロック図で
示される。機器２００は図６の機器と同じ基本構造と操
作法を有する。その機器は本明細書で説明した様な核酸
配列を処理し、次いで増幅する、試料準備ステーション
２０２と増幅ステーション２０３を有する。そのステー
ションはアンプリコンを第１反応ステーション２０４に
提供し、そこで標的および内部標準アンプリコンのハイ
ブリダイゼーションを行って機器をビーコン／検出基に
加工する。ステーション２０４で処理されるパネルまた
は装置は検出子２０９の近傍に位置し、ハイブリダイゼ
ーション生成物の測定を行い、信号を制御モジュール２
１０へ提供する。制御モジュール２１０は図２〜５から
のアルゴリズム４０を実行する。検出モジュール２０８
は第２反応ステーション２０６のごく近傍に位置してい
る。高次検出フォーマット、または他の機器が第２反応
ステーション２０６で使用され、検出モジュール２０８
で読み取られ、本明細書で説明した様な方法で信号が制
御モジュール２１０に提供される。制御アルゴリズムの
結果が高次検出フォーマット分析が保証されることを示
した場合、制御モジュール２１０はアンプリコンの第１
反応ステーション２０４から第２反応ステーション２０
６への転送を指令するのみである。最終結果はユーザー
インターフェース２１２上に表示されるか、報告に印刷
されるか、または必要あれば電子的に転送される。

【００７８】前述の様に、第１反応ステーション２０４
から選択した高次検出フォーマット分析へのアンプリコ
ンの転送を指示すべきかどうかを決定する手段を、制御
アルゴリズムは提供する。第２反応ステーションはその
使用が完全に任意である様に、第１反応ステーションか
ら物理的に分離されていなければならない。試験の最初
の部分（すなわち図２〜５の抗体３０）で、増幅処理工
程３０は含まれるべき大量のアンプリコンを生成するこ
とができるか、またはそのアンプリコンが将来の試験の
潜在的汚染物になる。これらのアンプリコンの転送中に
試験モジュールに対する潜在的汚染を物理的に制限する
必要があるため、通常は試験処理ステーションのこの部
分を密封しようとするか、何らかの方法で閉じ込めよう
とする。

【００７９】他の態様では、好ましくは前記制御モジュ
ールで決定される様に人手を介さず標的、好ましくはア
ンプリコンを供給源またはその他の起源から第１反応ス
テーションへ、指示されればアンプリコンを第２反応ス
テーションへ転送するために、システムが流体流路を含
む。

【００８０】また、転送機器はアンプリコンを受け取
り、第１反応ステーションおよび、アンプリコンを１個
以上の第２反応ステーション２０６へ転送するため、必
要あれば第２反応ステーションへ転送し得る。

【００８１】以下の実施例は本発明の多様な実施形態を
説明するためのものである。実施例は本発明をこれらの
実施形態に制限するために構成されるものではなく、本
明細書とその等価な内容を総括する請求の範囲によって
のみ定義されるものである。

【００８２】実施例１ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａの保存領域の増幅を、第１試
験反応ステーション中の試料から行った。核酸配列は米
国特許第５，５４７，８４２号（Ｈｏｇａｎ）、５，６
４３，７２３号（Ｐｅｒｓｉｎｇ）、５，５８９，５８
５号（Ｍａｂｉｌａｔ）、５，７０２，３１７号（Ｍａ
ｂｉｌａｔ）および５，８４９，９０１号（Ｍａｂｉｌ
ａｔ）に記載される。

【００８３】単離するため、バクテリアの新しく生育し
た１または２個のコロニー（直径３〜５ｍｍ、バクテリ
ア約１０８個）をへらの端で掻き取り、１．５ｍｌのエ
ッペンドルフ管中の２５０μｌの滅菌水中に再懸濁し
た。ガラスビーズの存在下にバクテリア懸濁液をボルテ
ックス処理し、全核酸を培養材料から放出した。５μｌ
分の溶菌液をＰＣＲ反応に直接加えた。また、２０ｎｇ
のプラスミドＤＮＡをＰＣＲ反応に加えた。１６Ｓ超可
変領域を、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ族プライマー
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ参照配列上の２１３−
２３６位、Ｍ２０９４０、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＴＢアンプ
リコンサイズは２０２ｂｐ）を用いてＰＣＲ増幅した。
その部位は５’末端にバクテリオファージＴ３またはＴ
７プロモーター配列（Ｔ３−ＭＩ ５’ａａｔｔａａｃ
ｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇ ＡＣＡＣＧＴＧＧＧＴＧ
ＡＴＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡ、およびＴ７Ｍ２ ５’−ｇ
ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｔＴＧＴ
ＧＧＣＣＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＴＣＡ（下部文字中のプ
ロモーター配列、上部文字中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ
ａ配列）のいづれかも含んでいた。Ｍ．ｔｕｂｅｃｕｌ
ｏｓｉｓ ｒｐｏＢ Ｒｉｆ部位を、前記のＴ３および
Ｔ７プロモーター配列末端を有するＭＴＸ ２２８１
ＴＢおよびＭＴＸ ２９８５ ＴＢプライマーを用いて
増幅した。アレイ上で解析したＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌ
ｏｓｉｓ ｋａｔＧの増幅はＴ３またはＴ７末端プライ
マー３３ｆ ５’−ＴＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＡＡＣＡＣ
ＣＡＡＣおよび２２８８ｒ ５’−ＧＧＣＣＧＡＴＣＡ
ＡＣＣＣＧＡＡＴＣＡＧＣ（Ｘ６８０８１上の１９４２
−１９６２位および４１９７−４２１７位、ＴＢアンプ
リコンサイズは２２７５ｂｐ）を用いて行った。

【００８４】５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ
（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００１
％（ｗ／ｖ）のゼラチン、５％のＤＳＭＯ、０．５μｌ
の各プライマー、２００μＭの４種それぞれのデオキシ
ヌクレオチド３リン酸および１．５ユニットのＴａｑポ
リメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒ）を含む１００μｌの反応容積中でＰＣＲを行っ
た。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ２４００熱サイクラー
中、初期変性工程が９４℃で５分間、サイクリング条件
９４℃で４５秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒（ｋ
ａｔＧ標的では２分間）でＰＣＲを行い、最後のサイク
ルは７２℃で１０分間行った。

【００８５】試料中にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａが存在
するかどうかをスクリーニングするためＭｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉａの保存領域（この様な領域は２個のプライマ
ーにより増幅される）中に設計されたプローブを調製し
なければならない。この例では、配列５’ＧＡＴＧＡＧ
ＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＴ
３’からなる検出プローブによりスクリーニングが可能
である。熱またはアルカリ処理でＰＣＲフラグメントを
変性、および増幅フラグメントの標識プローブへのハイ
ブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．２６、ｐｐ２１５０−２１５
５（１９８８））後、蛍光信号の分析はＭｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉａ種が存在することを示している。

【００８６】スクリーニング手順が陽性である場合、プ
ロモーターでラベルされたＰＣＲアンプリコンを標識一
本鎖ＲＮＡ標的を生体外転写で生成するために用いた。
各２０μｌの反応生成物は約５０ｎｇのＰＣＲ生成物、
２０ＵのＴ３またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）、４０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸（ｐＨ８．１）、
１００ｍＭの酢酸Ｍｇ（アセテート）２、１０ｍＭのＤ
ＴＴ、各１．２５ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰ、
０．５ｍＭのＵＴＰおよび０．２５ｍＭのフルオレスカ
イン−ＵＴＰを含んでいた。反応は３７℃で１時間おこ
なわれた。生体外で転写されたＲＮＡをＭｇＣｌ２濃度
を３０ｍＭに調節し９４℃で３０分間加熱するか、３０
ｍＭのＭｎＣｌ２および３０ｍＭのイミダゾールと共に
６５℃で３０分間インキュベートすることにより断片化
した。断片化の効率を変性ＰＡＧＥで分析した。

【００８７】米国特許第５，８３７，８３２（Ｃｈｅ
ｅ）に記載されるものと同様なアレイタイル戦略を用
い、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株とｒｐｏＢ突然変異
株を区別する配列を同定した。一定の参照配列内の全て
の塩基に対し、同じ長さの４個のプローブをアレイ上に
合成した。問題の塩基はプローブの中心に位置し、共通
の３’および５’末端を有している。１個のプローブは
参照配列に対し正確に相補的であるが、他の３個のプロ
ーブは問題の塩基に対し１個の塩基のミスマッチを有す
る可能性がある。基本となる細胞を標識標的のハイブリ
ダイゼーション強度を４個のプローブと比較して決定し
た。１６Ｓ ｒＲＮＡ配列では、アレイ上で１回だけ参
照される２個以上を共有するプローブを合成することに
より、過剰のプローブを除去した。ｒｐｏＢに対する野
性型プローブに加えて、リファンピン耐性突然変異体は
それ自体のプローブのセットで表される。アレイはま
た、カタラーゼ、ペルオキシダーゼをコードする２．２
ｋｂのＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｋａｔＧ遺伝
子並列を含む。プローブアレイは１６Ｓ ｒＲＮＡ、ｒ
ｐｏＢアンチセンス、およびｋａｔＧセンス配列に対応
する、４個の別個のゾーンに分けられる。アレイは１．
２８ｃｍ×１．２８ｃｍの面積にわたり、特定の５０μ
ｍ×５０μｍユニットまたは細胞に分割され、総数で６
５，０００の異なった合成部位となる。８２の固有の１
６Ｓ ｒＲＮＡ配列のデータベースを用いてアレイを設
計したが、それにより５４の異なったフェノタイプの株
を区別することができた。アレイ上に張り合わせた１６
Ｓ ｒＲＮＡの領域で観察される配列の異質性のため
に、ある株、または分類学上の複合体が、１個以上の参
照配列で表される（例えばＭ． ａｖｉｕｍ細胞間複合
体）。また、６１リファンピン耐性単離株由来のｒｐｏ
Ｂ配列のデータベースがアレイ上に表されている。これ
らの配列は５１個の固有のｒｐｏＢ突然変異体を含んで
いる。

【００８８】プローブアレイのハイブリダイゼーション
をＧＥＮＥ ＣＨＩＰ Ｆｌｕｉｄｉｃｓステーション
（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて行った。断片化した
標識ＲＮＡ標的の１から５μｌを５００μｌのハイブリ
ダイゼーション緩衝液で希釈した。ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液１の組成は４．５Ｘ ＳＳＰＥ（０．６７５
Ｍ ＮａＣｌ、４５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、４．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔ
ｒｉｔｏｎ−Ｘ、３０℃であった。アレイに結合した標
的により放射される蛍光信号をＧｅｎｅＡｒｒａｙ Ｓ
ｃａｎｎｅｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）により光学濃度６で検出した。
プローブアレイ細胞濃度、ヌクレオチド塩基呼び出し、
配列決定および報告は、ＧＥＮＥ ＣＨＩＰソフトウエ
ア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に用意された機能で作成し
た。候補選択インデックスを、実験的に導き出した配列
と、アレイ上に貼り合せた参照配列のすべてとの間の相
同性の比率で決定した。核酸配列は米国特許第５，５８
９，５８５（Ｍａｂｉｌａｔ）、米国特許第５，７０
２，３１７（Ｍａｂｉｌａｔ）および米国特許第５，８
４９，９０１（Ｍａｂｉｌａｔ）に記載されるか、Ｇｅ
ｎＢａｎｋまたはその他のデータベースから入手でき
る。

【００８９】実施例２ ＨＩＶ分析 本発明の第１アレイで、特にウイルス負荷測定のために
用いられたＨＩＶ核酸配列は、Ｌｉｎら、Ｊ． Ｃｌｉ
ｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６（３）、ｐｐ８３５−
８３９（１９９８）およびＫｏｒｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２８０、ｐｐ１８６８−１８７１（１９９８）に記
載され、Ｇｅｎｂａｎｋまたは他のデータベースで一般
に公開されている。ＨＩＶ核酸配列を記載する公開文献
には欧州特許第０３４５３７５号（Ｄｅ Ｌｅｙｓ）、
０１７３５２９号（Ｗｏｎｇ−Ｓｔａｌ）、０１７８９
７８号（Ａｌｉｚｏｎ）、０１８１１５０号（Ｌｕｃｉ
ｗ）、および０１８５４４４号（Ｃｈａｎｇ）が含まれ
る。核酸配列を記載する米国特許には米国特許第５，０
７９，３４２号（Ａｌｉｚｏｎ）および５，３１０，５
４１号（Ａｌｉｚｏｎ）が含まれる。また、Ｋｏｚａ
ｌ、ＭｉｃｈａｅｌＪ．ら「高密度オリゴヌクレオチド
アレイを用いて観測したＨＯＶ−１クレードＢプロテア
ーゼ遺伝子中の広範囲多形」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．２、ｎｏ．７、ｐｐ７５３−７５９
（１９９６年７月）も参照のこと。

【００９０】

【発明の効果】本発明は以上説明したように構成される
ことにより、以下のような効果を奏する。

【００９１】第１・第２ハイブリダイゼーション反応由
来の信号の検出器と、分析機器の統合操作を行う制御モ
ジュールを備えることにより、検出器からの結果に基づ
いて第２ハイブリダイゼーション反応の処理と、解析の
必要性を決定することができる。

【００９２】高次検出フォーマットで前述標的核酸配列
またはその相補的配列の陽性ハイブリダイゼーション反
応シグナルを検出するための第二検出器を備えることに
より、内部の高次検出フォーマットでは標的核酸配列に
ついての追加データを供給することができる。

【００９３】試料調製ステーションで選抜された標的核
酸配列の調製する手段を備えることにより、ここから提
供される標的核酸配列上の核酸増幅行程を行うことがで
きる。

【００９４】試料調製ステーションに内部標準核酸配列
を供給する手段を備えることにより、ここから提供され
る内部標準核酸配列上の核酸増幅行程を行うことができ
る。

【００９５】試料調製ステーションから第１試験反応ス
テーションへ、また制御モジュールでの決定により第１
試験反応ステーションから第２試験反応ステーションへ
の液体移送の手段を備えることにより、自動的かつ人手
を介さずに、移送される液体と外部環境の間で接触の起
こることのない液体の移送を実現する。

【００９６】低次検出フォーマットで均一溶液ハイブリ
ダイゼーション反応実行の手段を備え、第１ハイブリダ
イゼーション反応からの検出信号データの結果に基づ
き、制御モジュールによる一つまたは複数の高次検出フ
ォーマット使用の選択を可能にする。

【００９７】高次検出フォーマットにマトリックスハイ
ブリダイゼーション反応実行の手段を備えることによ
り、多重検出解析を可能にする。

【００９８】低次検出フォーマット機器がマトリックス
ハイブリダイゼーション反応実行の手段を備えることに
より、少数の標的アンプリコンおよび内部標準アンプリ
コンをスクリーニングすることを可能にする。

【００９９】内部標準配列と標的配列を増幅し、増幅さ
れた核酸配列の制限検出解析から測定された内部標準信
号と第１閾値、標的信号と第２閾値の比較を行い、比較
の結果より以降の多重検出分析を行うか否かを決定する
工程を備えることで、より多くの分析データの収集を費
用効率の良く行う核酸分析法を実現する。

【０１００】上記分析法の工程を自動的に、人手を介さ
ず行うことにより、人件費や試料処理費を削減し低コス
ト化をはかる。

【０１０１】１個以上のアンプリコンに対する相補核酸
配列からなる低次検出フォーマットにアンプリコンを提
供し、ハイブリダイゼーションされたアンプリコンの存
在を検出して、制御アルゴリズムにより陽性の決定が得
られた場合にのみ、アンプリコンを高じ検出フォーマッ
トでさらに解析するという工程により、１個以上の核酸
を含む試験試料から低コストでのデータ収集するための
診断法および自動化機器上での手順を実現する。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト試料に関して複数の試験を行うための先行
技術の方法の概略図であり、フローチャートでは感染源
が試料中にあるという仮定から出発している。

【図２】本発明による方法の概略図であり、低次検出フ
ォーマットからの制御アルゴリズム処理信号が高次検出
フォーマットが正当であることを示した場合のみ、高次
検出フォーマットが行われる。

【図３】図２の方法の変法の概略図である。

【図４】図２の方法の２番目の実施形態の概略図であ
り、第２レベルの試験を行うかどうか、同様に試料中の
核酸レベルの定量評価を行うべきかどうかが、制御アル
ゴリズムにより決定される。

【図５】本法の３番目の実施形態の概略図であり、３個
の低次検出フォーマットが平行して走り、結果を表す信
号が制御アルゴリズムを実行する制御モジュールに供給
される。３個の異なった分析パラメータが供給され、１
個の高次検出フォーマット選択用の１個の入力となる。

【図６】図２から５の方法を行うために用いられる好ま
しい分析機器のブロック図である。

【図７】図２から５の方法を行うための分析機器の別な
設計のブロック図である。

【符号の説明】

１２０ 核酸分析機器 １２２ 試料調製ステーション １２４ 流路 １２６ 流路 １２８ 第１反応ステーション １２９ パネル目録 １３０ ３方バルブ １３２ 流路 １３４ 第２反応ステーション １３６ 検出ステーション １３８ 制御モジュール １４０ ユーザーインターフェース １４４ 導体 ２０２ 試料調製ステーション ２０３ 増幅 ２０４ 第１反応ステーション ２０６ 多重検出反応ステーション ２０８ 多重検出器 ２０９ 第１検出器 ２１０ 制御モジュール ２１２ ユーザーインターフェース

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 11/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 自動核酸分析用統合機器システムであ
   り、以下からなる： ａ）試験試料由来の１種以上の標的核酸配列を提供する
   試料調製ステーション。 ｂ）１種以上の前記標的核酸配列またはその相補配列上
   で第１ハイブリダイゼーション反応を行う場であり、前
   記第１反応は少なくとも１個から１０個の別個の核酸配
   列を有する低次検出フォーマット機器からなる第１試験
   反応ステーション。 ｃ）１種以上の前記標的核酸配列またはその相補配列上
   での第２ハイブリダイゼーション反応を行う場であり、
   前記第２反応は１００個以上の別個の核酸配列を有する
   高次検出フォーマット機器からなる第２試験反応ステー
   ション。 ｄ）前記第１または第２ハイブリダイゼーション反応に
   おける標的核酸配列またはその相補配列用の陽性ハイブ
   リダイゼーション信号を検出するための、少なくとも１
   個の検出器。 ｅ）前記検出器を内部に包含し、ここからの結果に基づ
   いて、第２ハイブリダイゼーション反応の処理と、前記
   第１・第２ハイブリダイゼーション反応由来の検出シグ
   ナル解析の必要性を決定する、前記機器の統合操作のた
   めの制御モジュール。
2. 【請求項２】内部の前述の機器に加えて、さらに高次検
   出フォーマットで前述標的核酸配列またはその相補的配
   列の陽性ハイブリダイゼーション反応シグナルを検出す
   るための第二検出器も含み、また内部の前述高次検出フ
   ォーマットでは前述標的核酸配列についてのさらなるデ
   ータを供給する、請求項１に記載の機器。
3. 【請求項３】 内部の前述試料調製ステーションに加え
   て、選抜された標的核酸配列の調製手段を含む、請求項
   １に記載の機器。
4. 【請求項４】 内部の前記試料調製ステーションに加え
   て、さらに工程ａから提供される前記標的核酸配列上の
   核酸増幅処理を行う手段を含む、請求項１に記載の機
   器。
5. 【請求項５】 内部の前記試料調製ステーションに加え
   て、さらに内部標準核酸配列を供給する手段を含む、請
   求項４に記載の機器。
6. 【請求項６】 内部の前記機器に加えて、さらに試料調
   製ステーションから前述の第１試験反応ステーションへ
   の液体移送手段を含む、請求項１に記載の機器。
7. 【請求項７】 内部の前記機器に加えて、前述制御モジ
   ュールで決定される、前述の第１試験反応ステーション
   から前述第２試験反応ステーションへの液体移送の手段
   を含む、請求項１に記載の機器。
8. 【請求項８】 内部の前記機器に加えて、自動的かつ人
   手を介さず、移送される液体と外部環境の間で接触の起
   こることなく、前述の第１試験反応ステーションから前
   述第２試験反応ステーションへの液体移送の手段を含
   む、請求項１に記載の機器。
9. 【請求項９】 内部に、均一溶液ハイブリダイゼーショ
   ン反応実行手段を提供する前記低次検出フォーマット機
   器を含む、請求項１に記載の機器。
10. 【請求項１０】 内部に、マトリックスハイブリダイゼ
    ーション反応実行手段を提供する前記高次検出フォーマ
    ット機器を含む、請求項１に記載の機器。
11. 【請求項１１】 内部で、前記標的核酸配列上と内部標
    準核酸配列上での増幅工程を実行する、請求項５に記載
    の機器。
12. 【請求項１２】 内部で、前述第１ハイブリダイゼーシ
    ョン反応からの検出信号データの結果に基づき、前記制
    御モジュールによって一つまたは複数の高次検出フォー
    マットの使用が選択される、請求項１に記載の機器。
13. 【請求項１３】 内部で、前記標的核酸配列上と前記内
    部標準核酸配列上の前記増幅が同時に実行される、請求
    項１１に記載の機器。
14. 【請求項１４】 内部で、ＴＭＡ、ＰＣＲ、ＮＡＳＢ
    Ａ、ＳＤＡおよびＬＣＲからなる群から前記増幅工程が
    選択される、請求項４に記載の機器。
15. 【請求項１５】 内部で、前記低次検出フォーマット機
    器がマトリックスハイブリダイゼーション反応実行の手
    段を提供する、請求項１に記載の機器。
16. 【請求項１６】 内部に、複数の核酸配列を含み４００
    ヌクレオチド／ｃｍ ²以上の空間密度を有する前記高次
    検出フォーマットのある、請求項１に記載の機器。
17. 【請求項１７】 内部に、少なくとも１０００個の別個
    の核酸配列を含む前記高次検出フォーマット機器があ
    る、請求項１に記載の機器。
18. 【請求項１８】 内部の、前記低次・高次検出フォーマ
    ット機器が使い捨て可能である、請求項１に記載の機
    器。
19. 【請求項１９】 以下の工程からなる核酸分析法： （ａ）試験試料由来の標的核酸配列またはその相補配列
    と第１ハイブリダイゼーション反応を行う工程、（ｂ）
    前記第１ハイブリダイゼーション工程から信号を発生す
    る工程、（ｃ）前記信号を制御モジュールに供給する工
    程、（ｄ）前記信号を前記制御モジュールで処理し、前
    記信号が閾値レベルより大きいかどうかを決定する工
    程、（ｅ）前記信号が前記閾値レベルより大きい場合、
    前記標的核酸配列またはその相補配列を機器に移送する
    工程（ｆ）第２ハイブリダイゼーション反応を行う工
    程、（ｇ）前記第２反応から信号を発生する工程、
    （ｈ）前記信号を制御モジュールで処理して前記標的核
    酸を解析する工程。
20. 【請求項２０】 １００個以上の核酸配列からなる高次
    検出フォーマットからなる前記第２反応を含む、請求項
    １９に記載の分析法。
21. 【請求項２１】 １０００個以上の核酸配列からなる高
    次検出フォーマットからなる前記第２反応を含む、請求
    項１９に記載の分析法。
22. 【請求項２２】 前述に加え、選択された標的核酸配列
    と内部標準核酸配列を同時に増幅する工程、前記内部標
    準からの信号を測定する工程、前記内部標準からの信号
    とそれに対する閾値を比較し、内部標準信号が閾値より
    小さかった場合には試験を排除する工程を網羅した、請
    求項１９に記載の分析法。
23. 【請求項２３】 以下の工程からなる核酸分析法：試験
    試料中のすべての標的核酸配列、および制限・多重検出
    分析に必要な内部標準配列を増幅する工程、１個以上の
    増幅された核酸配列の制限検出解析を行う工程、前記制
    限検出解析からの内部標準信号および標的信号を測定す
    る工程、前記内部標準信号および標的信号を制御モジュ
    ールへ供給する工程、 ｉ）内部標準信号を第１閾値の比較を行い、その比較に
    より該試験の排除を決定するか、およびその比較が該試
    験を排除しないことを示すかを決定する工程、 ｉｉ）前記標的信号を第２閾値と比較する制御モジュー
    ルである、前記制御モジュール中の制御アルゴリズムを
    実行する工程、１個以上のあらかじめ増幅された核酸配
    列を多重検出機器に転送し、該機器中で多重検出分析を
    行う工程。
24. 【請求項２４】 それぞれの工程が自動的に、人手を介
    さず行われる、請求項２３に記載の分析法。
25. 【請求項２５】 以下の工程からなる、１個以上の核酸
    を含む試験試料からデータを収集するための診断法およ
    び自動化機器上での手順： ａ．試験試料から核酸配列を放出する工程、 ｂ．前記核酸配列を増幅してアンプリコンを生成する工
    程、 ｃ．１個以上の前記アンプリコンに対する相補核酸配列
    からなる低次検出フォーマットに、ハイブリダイゼーシ
    ョン反応のため前記アンプリコンを提供する工程、 ｄ．前記低次検出フォーマットによりハイブリダイゼー
    ションされたアンプリコンの存在を検出する工程、 ｅ．制御アルゴリズムにより工程ｃでの陽性または陰性
    の結果を決定する工程。陽性の結果が得られたかどうか
    データ収集のために、工程ｂ由来の前記アンプリコンを
    高次検出フォーマットでさらに解析する工程を含む。