JP2000316577A

JP2000316577A - 成人発症ｉｉ型シトルリン血症の診断方法

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Publication number: JP2000316577A
Application number: JP11128306A
Authority: JP
Inventors: Keiko Kobayashi; 圭子小林; Takeyori Saeki; 武頼佐伯; W Sheller Stephan; ダブリューシェーラーステファン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-05-10
Filing date: 1999-05-10
Publication date: 2000-11-21
Anticipated expiration: 2019-05-10
Also published as: JP4480199B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】 CTLN2の責任遺伝子及びCTLN2を引き起こす該
責任遺伝子中の変異を明らかにし、それによってCTLN2
を遺伝子検査等により簡便、確実に診断する方法を提
供。【解決手段】被検試料中のゲノミックＤＮＡ又はｍＲ
ＮＡ又はｃＤＮＡについて、以下の少なくとも１つを調
べるＣＴＬＮ２の診断方法。１）配列番号１で示される
SLC25A13 cDNAコード領域の851nt〜854ntの領域が欠失
する変異の存在。２）該コード領域の1177ntと1178ntの
間に対応する位置に存在する、SLC25A13遺伝子の第１１
イントロンの５’末端のGがAに置換する変異の存在。
３）該コード領域の1638nt〜1660ntに相当する23 bpの
領域が、該コード領域の1637ntと1638ntの間又は1660nt
と1661ntの間のいずれかの部位に挿入される変異の存
在。４）該コード領域の674ntのＣがＡに置換する変異
の存在。５）該コード領域の1311ntと1312ntの間に対応
する位置に存在する、第１３イントロンの５’末端のG
がAに置換する変異の存在。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、成人発症II型シト
ルリン血症の診断方法並びにそれに用いられるプライマ
ー及びタンパク質に関する。

【０００２】

【従来の技術】シトルリン血症(CTLN)は、血中及び尿中
のシトルリン濃度及びアンモニア濃度が上昇し、嘔吐、
意識障害、けいれん等を発症する疾患であり、尿素サイ
クル酵素の１つであるアルギニノコハク酸合成酵素(AS
S)の異常に基づく疾患である。本願発明者らは、これま
でに１７０症例を超えるCTLNを解析し、酵素異常から３
型に、病因の違いから２病型に分類してきた。そのうち
I型とIII型は、染色体9q34に座位するASS遺伝子の異常
に起因する新生児小児発症の古典型シトルリン血症(CTL
N1)である。

【０００３】一方、成人発症の大部分に見られる成人発
症II型シトルリン血症(CTLN2)は、ASSの肝臓特異的欠損
を特徴とするが、ASS遺伝子には異常がなく、肝細胞中
のASSmRNAにも異常がないという特異な病因に起因する
疾患である。CTLN2は、意識障害及び昏睡を引き起こ
し、多くは発症２〜３年で死に至る。日本におけるCTLN
2の発症頻度は約１０万人に１人であり、CTLN1よりも高
い。CTLN2が肝臓特異的疾患であることは、現在までに
９症例で行われた肝臓移植が良好な治療効果をあげてい
ることからも支持される。本願発明者らは、これまでに
１１８家系のCTLN2を経験し、そのうち２３家系が血族
結婚由来であることから、CTLN2が常染色体劣性の遺伝
性疾患であることを報告してきた。しかしながら、その
責任遺伝子は全く不明であった。

【０００４】現在、CTLN2の診断は、血中のアミノ酸分
析や膵臓分泌トリプシンインヒビター(PSTI)濃度の増加
等の生化学的マーカーを検査し、さらに肝組織における
ASS活性や蛋白の低下を測定することにより行われてい
る。しかしながら、生化学的検査や酵素学的解析は煩雑
で時間がかかるため、多数の検体を短時間で検査しなけ
ればならない臨床検査には必ずしも適してはおらず、ま
た、それだけで確定診断を行うことが困難である。も
し、CTLN2の責任遺伝子を明らかにすることができ、か
つ、CTLN2を引き起こす、責任遺伝子中の変異を明らか
にすることができれば、遺伝子検査により簡便、かつ、
確実にCTLN2を診断することができ、有利である。しか
も、CTLN2の診断のみならず、該遺伝子のキャリアの診
断も可能になる。また、もし、この責任遺伝子がタンパ
ク質をコードする構造遺伝子であり、CTLN2が該タンパ
ク質の異常により引き起こされるものであるならば、該
タンパク質を対象とした免疫測定等により簡便、かつ、
確実にCTLN2を診断することが可能になる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、CTLN2の責任遺伝子及びCTLN2を引き起こす、該責任
遺伝子中の変異を明らかにし、それによってCTLN2を遺
伝子検査等により簡便、かつ、確実に診断することがで
きる診断方法を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、CTLN2
が常染色体劣性の遺伝病であると考え、血族結婚由来の
CTLN2患者及び健常人のゲノミックＤＮＡを用いて、ホ
モザイゴシティ・マッピング法により、CTLN2の遺伝子
座位を７番染色体上に見出し、これを基にゲノミックＤ
ＮＡのポジショナルクローニングを行うことにより、CT
LN2の責任遺伝子と考えられる、染色体7q21.3に位置す
る新規な遺伝子を同定した。さらに、CTLN2患者及び健
常人の該遺伝子の塩基配列を決定することにより、CTLN
2患者にはホモ接合あるいは複合ヘテロ接合で含まれる
が、健常人にはホモ接合で含まれることがない５種類の
突然変異を見出し、該遺伝子がCTLN2の責任遺伝子であ
るという結論に達した。そして、これらの５種類の突然
変異を遺伝子検査により検出する方法を開発した。さら
に、該責任遺伝子がコードするタンパク質を発現させ、
該タンパク質を抗原とする抗体を作製した。

【０００７】すなわち、本発明は、被検試料中のゲノミ
ックＤＮＡ又はｍＲＮＡ若しくは該ｍＲＮＡから合成さ
れるｃＤＮＡについて、下記(1)〜(5)の少なくとも１つ
を調べることを含む、成人発症II型シトルリン血症の診
断方法を提供する。 (1) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAコー
ド領域の851nt〜854ntの領域が欠失する変異がｃＤＮＡ
若しくはｍＲＮＡ中に存在しているか否か、又はゲノミ
ックＤＮＡ中に該変異に対応する変異が存在するか否
か。 (2) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコ
ード領域の1177ntと1178ntの間に対応する位置に存在す
る、SLC25A13遺伝子の第１１イントロンの５’末端のG
がAに置換する変異が存在するか否か。 (3) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコ
ード領域の1638nt〜1660ntに相当する23 bpの領域が、
該コード領域の1637ntと1638ntの間又は1660ntと1661nt
の間のいずれかの部位に挿入される変異がｃＤＮＡ若し
くはｍＲＮＡ中に存在するか否か、又はゲノミックＤＮ
Ａ中に該変異に対応する変異が存在するか否か。 (4) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコ
ード領域の674ntのＣがＡに置換する変異がｃＤＮＡ若
しくはｍＲＮＡ中に存在するか否か、又はゲノミックＤ
ＮＡ中に該変異に対応する変異が存在するか否か。 (5) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコ
ード領域の1311ntと1312ntの間に対応する位置に存在す
る、SLC25A13遺伝子の第１３イントロンの５’末端のG
がAに置換する変異が存在するか否か。

【０００８】さらにまた、本発明は、上記本発明の方法
に用いられるプライマーを提供する。さらに、本発明
は、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するｃ
ＤＮＡ若しくは上記(1)ないし(5)のいずれかの変異を含
むその変異体によりコードされるタンパク質、又は該タ
ンパク質の１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失し若し
くは置換し、若しくは該タンパク質に１若しくは複数の
アミノ酸残基が付加され若しくは挿入された修飾タンパ
ク質であって、上記タンパク質に対する抗体と免疫反応
する修飾タンパク質並びに該タンパク質又は修飾タンパ
ク質をコードする核酸を提供する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本願発明者等は、下記実施例に詳
述するように、CTLN2が常染色体劣性の遺伝病であると
いうことに基づいて、血族結婚由来のCTLN2患者及び健
常人のゲノミックＤＮＡを用いてホモザイゴシティ・マ
ッピング法によりCTLN2遺伝子座位を７番染色体上に見
出し、これを基にゲノミックＤＮＡのポジショナルクロ
ーニングを行うことにより、CTLN2の責任遺伝子と考え
られる、染色体7q21.3に位置する新規な遺伝子を同定
し、そのｃＤＮＡ配列を決定した。さらに、該ｃＤＮＡ
に対応するゲノミックＤＮＡ（イントロン領域を含む）
の塩基配列を決定した。そして、CTLN2患者にはホモ接
合又は複合ヘテロ接合で含まれるが、健常人にはホモ接
合で含まれることがない５種類の突然変異を見出した。
これにより、該遺伝子がCTLN2の責任遺伝子であり、該
５種類の突然変異がCTLN2の病因であることが明らかに
なった。該責任遺伝子を「SLC25A13」と命名し、該遺伝
子がコードするタンパク質を「シトリン」と命名した。

【００１０】健常人のSLC25A13由来のｃＤＮＡの塩基配
列を、これがコードするタンパク質（シトリン）の推定
アミノ酸配列と共に配列表の配列番号１に示す。以下、
本明細書において、塩基の位置は、他に断りがない限
り、配列番号１に示されるコード領域（配列番号１に示
される配列の第１３８番目のＡから始まる）の第何番目
の塩基であるかにより表す。例えば、コード領域第１番
目の塩基であるＡの位置は「1nt」、１０００番目のＣ
の位置は、「1000nt」のように表す。該ｃＤＮＡが由来
するゲノミックＤＮＡ中の遺伝子であるSLC25A13の塩基
配列を解析し、それと配列番号１に示すｃＤＮＡ配列と
を比較することにより、ｃＤＮＡ配列中のエクソン−エ
クソン境界を決定した。その結果、SLC25A13は１８個の
エクソン領域を有することが明らかになった。ｃＤＮＡ
中の各エクソン領域の位置を下記表１に示す。

【００１１】

【表１】

【００１２】イントロンは、SLC25A13中において、表１
に示す各エクソンの間に位置する。イントロンの番号
は、そのイントロンの直上流にあるエクソンの番号と同
じである。すなわち、例えば、第１１イントロンは、表
１に示す第１１エクソンと第１２エクソンの間に位置
し、第１３イントロンは、第１３エクソンと第１４エク
ソンの間に位置する。本発明に関連する各イントロンの
配列（又は部分配列）を配列番号２〜１３に示す。すな
わち、配列番号２には、第７イントロンの３’末端側の
塩基配列（配列番号２に示される塩基配列の３’末端の
Ｇの直後に第８エクソンの５’末端のＡが来る。以下同
様）を示す。配列番号３には、第８イントロンの塩基配
列を示す。配列番号４には、第９イントロンの５’末端
側の塩基配列（第９エクソンの３’末端のＧの直後に配
列番号４に示される塩基配列の５’末端のＧが来る。以
下同様）を示す。配列番号５には、第１０イントロンの
３’末端側、配列番号６には、第１１イントロンの５’
末端側、配列番号７には第１５イントロンの３’末端
側、配列番号８には第１６イントロン、配列番号９には
第１７イントロンの５’末端側、配列番号１０には第６
イントロンの３’末端側、配列番号１１には第７イント
ロンの５’末端側、配列番号１２には第１２イントロン
の３’末端側、配列番号１３には第１３イントロンの
５’末端側の塩基配列をそれぞれ示す。

【００１３】本願発明者らがCTLN2の病因であることを
見出した、SLC25A13中の突然変異は次の５種類である。 (1) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコ
ード領域の851nt〜854ntの領域が欠失する変異（以下、
この変異を「[I]851del4」と言うことがある）。 (2) SLC25A13の第１１イントロンの５’末端のGがAに
置換する変異（以下、この変異を「[II]IVS11+1G>A」と
言うことがある）。 (3) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコ
ード領域の1638nt〜1660ntに相当する23 bpの領域が、
該コード領域の1637ntと1638ntの間又は1660ntと1661nt
の間のいずれかの部位に挿入される変異（以下、この変
異を「[III]1638ins23」と言うことがある）。 (4) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコ
ード領域の674ntのＣがＡに置換する変異（以下、この
変異を「[IV]S225X」と言うことがある）。 (5) SLC25A13の第１３イントロンの５’末端のGがAに
置換する変異（以下、この変異を「[V]IVS13+1G>A」と
言うことがある）。

【００１４】下記実施例において記載するように、シト
リンは、他のミトコンドリアキャリアファミリーと高い
ホモロジーを示し、ミトコンドリアの脂質二重膜を６回
貫通する構造を有し、ミトコンドリアの膜に存在してい
るものと考えられる。さらに、シトリンは特徴的なEF-h
andモチーフを４個有していることから、カルシウム依
存性のミトコンドリアキャリア蛋白であると推測され
る。シトリンの存在状態を図６に模式的に示す。上記
(1)〜(5)の突然変異のおよその位置も図６に併せて示さ
れている。

【００１５】上記(1)の変異により、配列番号１に示す
配列の第２８６番目のコドンの位置に停止コドンが導入
されるので、該変異遺伝子によりコードされるタンパク
質は、途中で切断された不完全なタンパク質となる。上
記(2)の変異はイントロン領域内に起きるものである
が、この変異が存在するとｍＲＮＡ形成時のスプライシ
ングが異常となり、ｍＲＮＡの第１１エクソンが欠失
し、図６に示す膜貫通領域TM1とTM2の間の親水性ループ
内で、配列番号１に示す第３４０〜３９２コドンにより
コードされる５３個のアミノ酸残基が欠失する。上記
(3)の変異が存在すると、第５５４コドンでフレームシ
フトが起き、第５７０コドンが停止コドンとなってこの
間に１６個の正常とは異なるアミノ酸配列が存在するこ
ととなる。従って、この突然変異によれば、シトリンの
Ｃ末端部分が切断された不完全なタンパク質となる。上
記(4)の変異が存在すると、第２２５コドンが停止コド
ンとなり、該変異遺伝子によりコードされるタンパク質
は、途中で切断された不完全なタンパク質となる。上記
(5)の変異はイントロン領域内に起きるものであるが、
この変異が存在するとｍＲＮＡ形成時のスプライシング
が異常となり、図６に示すTM2とTM3の間で２７アミノ酸
残基（第４１１〜４３７コドン）が欠失する。このよう
に、上記突然変異(1)〜(5)のいずれが存在する場合で
も、変異SLC25A13によりコードされるシトリンは、正常
なシトリンとは構造が大きく異なったものとなる。

【００１６】本発明のCTLN2の診断方法では、上記(1)〜
(5)の変異の少なくともいずれかを調べる。好ましく
は、被検試料中のSLC25A13が上記(1)〜(5)の変異を全く
有していないか、また、有しているとすれば(1)〜(5)の
どの変異を有しているのかを調べる。これらの変異は、
ゲノミックＤＮＡ又はｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのいず
れを調べることによってもその存在の有無を調べること
が可能である。上記変異(2)及び(5)は、イントロン領域
内の変異であるが、上記のように、該変異によりｍＲＮ
Ａ及びそれに由来するｃＤＮＡの配列が正常のものとは
大きく異なるので、(2)及び(5)の変異もｃＤＮＡ又はｍ
ＲＮＡを調べることによりその存在の有無を調べること
ができる。なお、CTLN2は肝臓特異的な疾患であるか
ら、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを対象として検査を行うので
あれば被検試料としては肝細胞が必要となる。これに対
し、ゲノミックＤＮＡを対象として検査を行うのであれ
ば、容易に採取できる末梢血細胞等から抽出されるゲノ
ミックＤＮＡを用いることができるので、肝細胞を採取
する必要がなく、簡便で、患者の負担も小さいので好ま
しい。

【００１７】本発明により、SLC25A13のｃＤＮＡの配列
及びゲノミックＤＮＡ中の、上記突然変異部位近傍のイ
ントロン配列並びに上記各突然変異の位置及び構造が明
らかにされたので、上記各突然変異の有無は、種々の常
法により容易に調べることができる。例えば、上記(1)
又は(3)の変異の有無を調べる場合には、変異を含むゲ
ノミックＤＮＡ又はｃＤＮＡの領域をＰＣＲのような核
酸増幅法により増幅し、増幅断片を電気泳動にかけてバ
ンドのサイズを測定することにより行うことができる。
変異が存在すると、欠失又は挿入に起因して増幅核酸断
片のサイズが正常遺伝子の場合と比較して増減するの
で、増幅断片のサイズを調べることによりこれらの変異
の有無を調べることができる。また、ｃＤＮＡについて
調べる場合には、この方法により上記(2)及び(5)の変異
の有無も調べることができる。また、ゲノミックＤＮＡ
について調べる場合、上記(2)、(4)又は(5)の変異は、
塩基の置換なので増幅断片の大きさは正常型も変異型も
同じであるが、いわゆる制限断片長多型(RFLP)の手法を
用いることにより容易に調べることができる。例えば、
上記(4)の変異の有無を調べる場合には、塩基の置換に
よりAluI部位(AGCT)が導入されるので、(4)の変異を含
む断片を核酸増幅法により増幅し、制限酵素AluIで消化
し、消化断片を電気泳動にかけてそのサイズを測定する
ことにより該変異の有無を調べることができる。正常型
の場合には、増幅断片は切断されず、変異型の場合には
増幅断片は、変異が存在する部位でAluIにより切断され
るので、正常型の増幅断片よりも小さな断片が２つ現れ
る。また、変異によって適当な制限酵素部位が導入され
ない場合には、増幅断片中にこのような制限酵素部位が
導入されるように、増幅プライマーの配列を意図的に変
えることができる。例えば、上記(2)の変異を検出する
場合に、リバース側のプライマーの３’末端を、鋳型Ｄ
ＮＡと相補的なＡではなく、Ｇとすることにより、変異
部位に正常型ではGGTC、変異型ではGATCの配列が導入さ
れる。GATCは、制限酵素Sau3AIにより切断されるので、
RFLPにより上記(4)と同様にして変異の有無を調べるこ
とができる。また、上記(5)の変異の有無は、リバース
側プライマーの３’末端を、鋳型ＤＮＡと相補的なＡで
はなくＣとすることにより、変異部位に正常型ではCTGC
GG、変異型ではCTGCAGの配列が導入されるので、制限酵
素PstIを用いたRFLPにより変異(5)の有無を容易に調べ
ることができる。さらに、正常型又は変異型のいずれか
一方とはハイブリダイズしない、又はハイブリダイズし
ても増幅が起きないプライマーを用いて、核酸増幅法を
行い、増幅が起きるか否かを指標として変異の有無を調
べることも可能である。例えば、ゲノミックＤＮＡにつ
いて調べる場合、上記の(1)又は(3)の変異のように、欠
失又は挿入が起きる変異の場合には、変異の箇所とハイ
ブリダイズするプライマーを用いることができる。ま
た、変異の部分にハイブリダイズするプローブを用いた
サザンブロットやノーザンブロットにより変異の有無を
調べることも可能である。また、増幅断片の塩基配列を
直接決定することによって変異の有無を調べることも可
能である。

【００１８】なお、核酸増幅のために用いられるプライ
マーは、配列番号１に示すｃＤＮＡ配列又は配列番号２
〜１３のいずれかに示されるイントロン配列と相補的な
ものであり（イントロンとエクソンにまたがる領域と相
補的なものでもよい）、増幅すべき領域の両端にそれぞ
れハイブリダイズするものである。もっとも、完全な相
補性は必ずしも必要ではなく、配列特異的なハイブリダ
イズが可能であれば非相補的な塩基を含んでいてもよ
い。プライマーのサイズは、通常１５塩基〜５０塩基程
度、好ましくは２０塩基〜４０塩基程度であるがこれら
に限定されるものではない。

【００１９】また、上記のように、変異型のSLC25A13に
よりコードされるシトリンは、その構造が正常型シトリ
ンと大きく異なるので、シトリンを調べることにより、
上記変異の有無を調べることもできる。シトリンが変異
型であるか正常型であるかは、例えば免疫測定により簡
便かつ正確に調べることができる。変異型のシトリンと
のみ特異的に反応し、正常型のシトリンとは反応しない
モノクローナル抗体を用いることにより、変異型のシト
リンを特異的に検出することができる。このようなモノ
クローナル抗体は、変異型のシトリンを免疫原として用
いて常法によりモノクローナル抗体を作製し、正常型の
シトリンとは反応しないが変異型のシトリンとは反応す
るモノクローナル抗体を選択することにより得ることが
できる。免疫原として又はモノクローナル抗体のスクリ
ーニングに用いる変異型又は正常型シトリンは、本発明
により、そのｃＤＮＡの全塩基配列が明らかになってい
るので、常法に基づき、遺伝子工学的手法により、大量
に作製することが可能である。この具体的な一例が下記
実施例３に記載されている。なお、免疫原又はスクリー
ニング用のシトリンは、配列表の配列番号１に示される
塩基配列を有するｃＤＮＡ若しくは上記(1)ないし(5)の
いずれかの変異を含むその変異体によりコードされるシ
トリンのみならず、該シトリンの１若しくは複数のアミ
ノ酸残基が欠失し若しくは置換し、若しくは該タンパク
質に１若しくは複数のアミノ酸残基が付加され若しくは
挿入された修飾シトリンであって、上記シトリンに対す
る抗体と免疫反応する修飾シトリンであってもよい。

【００２０】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００２１】実施例１１．方法 (1) 患者血液試料、外科的又は剖検肝臓標本、及び臨床データ
は、互いに関連していない血族結婚家族の１８人の成人
発症患者（１９〜４８歳）から採集した（図２のa）。
なお、シトルリン血症の診断は確立された方法により行
った。１２７人の１８〜５５歳の無関係な健常者を対照
として用いた。

【００２２】(2) ホモ接合マッピング(Lander E.S. et
al., Science 236, 1567-1570(1987))によるゲノムス
クリーニング Research Genetics, Inc.から市販されているCHLC Huma
n Screening Set/Weber version 6からの３９１種のマ
イクロサテライトマーカーパネルを用いてスクリーニン
グを行った。高解像度ジェノタイピングのために、0.2
μＭの蛍光標識[R110]-又は[R6G]-dUTPを含む混合物中
でＰＣＲを行い、それぞれのＰＣＲ産物のサイズは、サ
イズ標準としてGeneScan-500[TAMRA]を用い、ABI310 Ge
netic Analyzer上でGeneScan 672を用いて解像した。PO
N1-192, PON2-148及びPDK4プロモーター領域は、確立さ
れた方法(Humbert, R., et al., Nature Genetics 3, 7
3-76(1993); Hegele, R.A. et al., J. Clin. Endocrin
ol. Metab. 82, 3373-3377(1997); Rowles, J. et al.,
J. Biol. Chem. 271, 22376-22382(1996))に従い、Ｐ
ＣＲと制限酵素消化の組合せにより解析した。関係の統
計学的有意差を評価するために、２×２分割表χ²テス
トを用い、患者におけるホモ接合の百分率を無関係な対
照と比較した。Ｐ値はイェーツの修正により調整した。

【００２３】(3) SLC25A13遺伝子の同定 SLC25A13の３’部分が先ず、ESTクローンyg89b07(GenBa
nk Acc. #R55737)(以下、単にAcc #のみを記載したもの
は全てBenBankのAccession No.を意味する)を図３に示
すYACクローンにマッピングすることにより同定され
た。続いて常法によりｃＤＮＡライブラリースクリーニ
ング、RT-PCR及び5'-RACE実験を行うことにより、この
遺伝子の全長を単離した。遺伝子構造は、BACクローン
であるH GS025M02(Acc. #AC002540)及びH GS244B22 (Ac
c. #AC002450)からｃＤＮＡ配列をゲノム配列と比べる
こと及びゲノミックＤＮＡの逆ＰＣＲにより決定した。
これまでにこの遺伝子の１８のエクソンが同定されてい
る。

【００２４】(4) ノーザンブロット分析プライマー5'-F (5'-acgccagccagccagtcagt-3', -53nt
〜-34nt（SLC25A13 mRNAのヌクレオチドは、開始コドン
のＡを+1として示す）)とプライマー10B(5'-tctgggcctc
agccaagtta-3', 928nt〜909nt)を用いてＰＣＲにより増
幅された981 bpの断片（ｃＤＮＡの５’側）をプローブ
として、ヒト多組織ノーザンブロット(Clontech #7760-
1)とハイブリダイズさせることによりSLC25A13 mRNAを
調べた。さらに、プライマー3'-F (5'-taggaagatcagccc
tggga-3')とプライマーEnd-B (5'-gcgcctctgaccattatgc
a-3')を用いたＰＣＲにより増幅された９３４ｂｐの断
片（SLC25A13の3'-非翻訳領域、2026nt〜2959nt）をプ
ローブとして用いて同じブロットにハイブリダイズさせ
た。aralar mRNA(del Arco, A. et al., J. Biol.Chem.
273, 23327-23334(1998))を検出するために、プライマ
ー5'F (5'-gagcacagcatggcggtca-3')とプライマー5'B
(5'-ctggagccagataggcctg-3')を用いて９７５ｂｐの断
片（ｃＤＮＡの５’側、15nt〜989nt）を増幅し、クロ
ーニング及び配列決定の後、これをプローブとして用い
た。

【００２５】(5) 突然変異検出各ｍＲＮＡのコード領域を増幅するためのＲＴ−ＰＣＲ
に際して、オリゴ(dT) _12-18及びM-MuLV逆転写酵素を用
いて肝臓ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを合成した。増幅さ
れたｃＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分離し、抽出
し、TA-vector (Invitrogen社)を用いてクローニング
し、塩基配列を決定した。SLC25A13 mRNAのためには、
オリゴヌクレオチドプライマー5'-F、10B及びMF (5'-ga
acggattgctcctctgga-3', 871nt〜890nt)及び3'-B (5'-g
acagcactatcccagggct-3', 2055nt〜2036nt)を用いた。T
FPI-2 (Acc. #L27624), PON1 (Acc. #M63012), PON2 (A
cc. #AF001601), PDK4 (Rowles, J. et al., J. biol.
Chem. 271, 22376-22382(1996))及びDNCI1 mRNAの全コ
ード領域は、それぞれ適当なプライマーセットを用いて
増幅した。用いたプライマーセットは、それぞれ、5'-g
gacgccttgcccagcgggc-3'と5'-ccaatgatttgtttcctcatgct
g-3'、5'-cccccgaccatggcgaagct-3'と5'-tggcatgggtgca
aatcggt-3'、5'-cggagcgaggcagcgcgccc-3'と5'-agggccg
ttccttactggaa-3'、5'-atgaaggcggcccgcttcgt-3'と5'-a
gacccactttgatcccgtaaa-3'、及び5'-gagagaggaagtgatcg
ctc-3'と5'-acgctgagctctaggacaca-3'であった。

【００２６】SLC25A13の突然変異検出のためには、各エ
クソンに隣接するイントロンの配列に基づき、以下のオ
リゴヌクレオチドを合成した。IVS-6F (5'-ggagagtacaa
gttctggtc-3'), IVS-7B (5'-actagttgccttcttcaccc-
3'), IVS-7F (5'-tcactcattccagtgccttg-3'), IVS-9B
(5'-caatgccgcaaaggcaactg-3'), IVS-10F (5'-ttgggctg
tagcaatgtgcc-3'), IVS-11B (5'-ctagatgcctccagcctact
-3'), IVS-12F (5'-ctcctgaaacatcagtgatgc-3'), IVS-1
3B (5'-cctagtagactctgcccttg-3'), IVS-15F (5'-ggagc
agacatcttgcacac-3')及びIVS-17B (5'-ggagttgatacattc
tcatca-3')。それぞれの増幅されたゲノミックＤＮＡ断
片の塩基配列を直接決定し、又はTA-vectorにクローニ
ング後、塩基配列を決定した。

【００２７】２．結果上記のように、血族結婚家族の患者からのＤＮＡについ
て、ホモ接合マッピングアプローチ(Lander, E.S., et
al.,上掲)を用いてCTLN2座をゲノム全体に渡って検索し
た。先ず、常染色体に沿って分散された合計３３２個の
遺伝マーカーを１５人のCTLN2患者と１５人の対照に対
して分析した（図１）。染色体7q21-q22上の２つのマー
カー(D7S821とD7S1799)が、それぞれ、１５人の患者の
うち１２人（８０％）及び９人（６０％）においてホモ
接合であり、これらのχ²値（Ｐ値）は、それぞれ13.4
(0.0004)及び12.2(0.0007)であった。

【００２８】常染色体を縦断する３３２個のマーカーの
ホモ接合マッピングの結果を図１に示す。それぞれの多
型ＤＮＡマーカーについてのホモ接合の頻度のχ²解析
は、血族結婚家族（図２参照）からの１８人のCTLN2患
者のうち、AP-9、AP-69及びAP-80を除いた１５人と、１
５人の無関係な対照との間で行った。対照と比較して高
い患者のホモ接合百分率は、各染色体を示す線の右側に
χ²値をプロットした。用いたマーカーの相対位置は、
センチモルガン(cM)単位で各遺伝的距離を示した。染色
体7q21-q22上の２つのマーカー(D7S821及びD7S1799)
は、１５人の患者のうち、それぞれ１２人（８０％）及
び９人（６０％）がホモ接合であり、それらのχ²値
（Ｐ値）は、それぞれ13.4 (0.0004)及び12.2 (0.0007)
であった。患者と対照との間の観察された差異により、
CTLN2遺伝子は、D7S2212 (χ²=2.78,P=0.039)の先端部
領域及びD7S22847(χ²=1.29, P=0.45)の忌憚部領域内に
存在するかもしれないことが示唆された。１８人のCTLN
2患者と１１８人の対照とを調べると、他の常染色体上
では、D19S586もまた非常に有意であった(χ²=11.8, P=
0.0017)。しかしながら、D19S586に１cM以内の距離で隣
接する３つのさらなるマーカー、すなわち、D19S413(χ
²=0.50, P=0.57)、D19S204(χ²=1.65, P=0.26)及びD19S
583(χ²=4.04, P=0.062)では、有意な結果は検出されな
かった。

【００２９】この観察の有意性を確認し、染色体７ｑ上
のCTLN2遺伝子座をより正確に特定するために、１６個
のマイクロサテライトマーカー及び３個の遺伝子(PON1,
PON2及びPDK4)(Humbert et al., 上掲；Hegele,R.A. e
t al.,上掲；Rowles J. et al.,上掲)中の多型を用い
て、１８人の患者及び１２０人の対照全部を解析した。
３つのマーカー(D7S527, D7S1812及びD7S821)のホモ接
合の割合がχ²及びＰ値の両者とも、有意に高かった
（図２）。さらに、D7S1812は、１８人の全てのCTLN2患
者においてホモ接合であった。これらの１８人のCTLN2
患者のうち、１３人（７２％）において２９０ｂｐのD7
S1812対立遺伝子のホモ接合が観察され、これは１１６
人の対照のうちの２４人（２１％）と比較して有意に高
かった(χ²=20.7, P<0.0001)。２８１ｂｐのD7S1812対
立遺伝子のホモ接合は、１８人の患者のうち５人（２８
％）、１１６人の対照のうち１１人（9.5%）で観察さ
れ、これの有意性はより低かった(χ²=4.96、P=0.04
2)。全てのCTLN2患者のハプロタイプを比較すること及
び対照と比較した対立遺伝子頻度に基づき、CTLN2遺伝
子座の最も可能性の高い部位は、D7S527とD7S821の間で
D7S1812に近い、7q21.3であると推定した（各マーカー
の位置については図３参照）。さらに、ハプロタイプの
解析により、５種類の異なる疾患遺伝子担持染色体が存
在する可能性が示された（図２のb）。

【００３０】図２は血族結婚両親(a)からの１８人のCTL
N2患者及び対応するハプロタイプ(b)のリストを示す。
図２のaにおいて、「いとこ」は、両親の血縁の程度を
示す。「Cit」及び「Arg」は、それぞれ血清中のシトル
リン及びアルギニン濃度を示し、Thr/Serは血清中のス
レオニン／セリンの比率を示す。sPSTI及びhPSTIは、そ
れぞれ血清中及び肝臓中のPSTI濃度を示す。肝臓ASS(hA
SS)は、対照に対する％で示されている。括弧内の各数
字は「平均±標準偏差」を示す(Kobayashi, K.,et al.,
Hepatology 25, 1160-1165(1997))。「n.t.」は測定し
なかったことを意味する。図２のbにおいて、D7S2212な
いしD7S1799からの各マーカーが、図の左側に、染色体7
q21-q22領域を含むジェノミックインターバルの動原体
側末端（上）からテロメア側末端（下）に向かう物理マ
ッピングの順に示されている。括弧内の数字は、対照の
ホモ接合(ホモ接合／測定した人数)を示す。各患者がホ
モ接合であったマーカーのストレッチを淡灰色のシェー
ディングで示す。また、図２のｂにおいて、PON1の行の
ＲとＱ、PON2の行のＡとＧは、それぞれにPON1の１９２
番目、PON2の１４８番目のアミノ酸であり、PDK4の行の
CC, CTやTTは、それぞれにPDK4遺伝子の５’上流の-154
番目（Ｃ又はＴ）と-209番目（Ｃ又はＴ）の塩基に相当
するものである。患者では、３つのマーカーが、χ²及
びＰ値の両者ともにおいて、ホモ接合の割合が有意に高
かった。すなわち、χ²及びＰ値がそれぞれ42.1及び8.7
x 10^-11であるD7S527、25.8及び3.9x10^-7であるD7S181
2、並びに25.7及び3.9x10^-7であるD7S821である。共通
のハプロタイプに基づき５つの異なるグループ(I/I, II
/II, III/III, I/IV及びI/V)に分けることが可能であ
り、このことは、図６に示すように５つの異なる疾患遺
伝子担持染色体の存在を示している。

【００３１】染色体７ｑの完全な遺伝子地図を構築しよ
うとする努力において、7q21.3領域から少なくとも１７
個の遺伝子が同定された（図３）。PDK4、TFPI-2及びPO
N遺伝子がCTLN2の位置的（及び機能的）候補であった
が、これらのコード領域の塩基配列を決定したところ、
突然変異は見つからなかった。D7S1812を包含する直近
領域における遺伝子同定実験により、中間鎖ダイニン遺
伝子(DNCI1) 及びこれまでに特徴づけられていない遺伝
子の存在が示された。ＤＮＡ配列決定及び解析、ESTマ
ッピング、並びにｃＤＮＡライブラリースクリーニング
及び特徴付けを組み合わせることにより、後者の遺伝子
（SLC25A13と命名）が１８個のエクソンを有し、約200
kbのＤＮＡから成ることを決定した。この遺伝子はま
た、D7S1812マーカーを包含し（図３）、突然変異スク
リーニングにより究極的にこれがCTLN2遺伝子であるこ
とが同定された。

【００３２】図３に7q21.3におけるCTLN2遺伝子座の物
理的地図を示す。7q21.3をカバーするYACコンティグ及
びこの染色体バンド内の公知の遺伝子が示されている。
既知の場合には、５’から３’への遺伝子の転写方向が
矢印で示されている。この研究に用いた遺伝マーカー
を、YACコンティグ内での位置により決定された順に、
黒丸を付して示す。３つのさらなる遺伝マーカー(D7S15
13, D7S2430及びD7S1849)も白丸を付して示す。CTLN2の
責任遺伝子をSLC25A13として示す。分析した全ての患者
においてホモ接合であったD7S1812は、SLC25A13のエク
ソン１５及び１６の間に位置する。YACクローンは、公
知の染色体７−特異的YACライブラリーからのものであ
る。

【００３３】塩基配列解析により、SLC25A13 cDNAの全
長は３１３５ｂｐであり、予想されるオープンリーディ
ングフレーム(ORF)は２０２５ｂｐであることがわかっ
た。推定的ATG翻訳開始部位の近傍のＤＮＡ(ggcgaatcat
gcg)は、Kozakコンセンサス配列(Kozak, M., Mamm. Gen
ome 7, 563-574(1996))にとって必須的な-3プリンと+4
グアニン残基を有する。

【００３４】SLC25A13によりコードされる、「シトリ
ン」と命名した推定タンパク質は、６７５個のアミノ酸
残基から成り、約74 kDaの分子量を有する（図４）。Ｃ
末端領域は、ミトコンドリア溶質キャリアファミリー(K
uan, J. Crit. Rev. Biochem.Mol. Biol. 28, 209-233
(1993))と相同性（２０〜３０％のアミノ酸が一致）を
有する。Ｎ末端領域は、カルシウム結合タンパク質にお
いて保存されている４つの推定的EF-hand領域(Kawasak
i, H. et al., Protein Profile 1, 343-517(1994))を
有する。シトリンの全体的な構造は、カルシウムに結合
するミトコンドリアキャリアスーパーファミリー(del A
rco, A. et al.,上掲)のメンバーであるアララー、及び
C. elegansタンパク質(Q21153)とそれぞれ77.8%及び53.
7%の相同性を有する。シトリンをアララー及びQ21153タ
ンパク質と整列させることにより、Ｎ末端及びＣ末端の
各末端近傍の領域を除き、配列が高度に保存されている
ことが明らかになった（図４）。これらの配列特徴は、
アララーと同様、シトリンもまたミトコンドリアの膜中
に位置し、カルシウム依存性ミトコンドリア溶質キャリ
ア(del Arco, A. et al.,上掲)として機能しているかも
しれないことを示唆している。

【００３５】図４にシトリンと関連タンパク質の整列比
較を示す。シトリン(SLC25A13タンパク質)と、アララー
(SLC25A12タンパク質)と、C. elegans Q21153タンパク
質の推定アミノ酸配列を比較を示す。アミノ酸の同一及
び保存を、それぞれ黒又は斑点で強調してある。シトリ
ンは、４つの推定的EF-hand領域を有し（第２８〜３
９、６６〜７７、１００〜１１１、１７１〜１８２残
基）、これらはカルシウム−結合タンパク質において保
存されている(Kawasaki, H. et al., Protein Profile
1, 343-517(1994))。典型的なミトコンドリアキャリア
シグネチャーであるGX₃GX₈PX(D/E)X(I/L/V)(K/R)X(R/K)
XQX_20-30GX₄(Y/W)(R/K)GX₉PがシトリンのＣ末端側半分
の領域中に観察され（第３３５〜４０３、４３５〜４９
５及び５２７〜５９１残基）、米印で記す。他のミトコ
ンドリア溶質キャリアファミリーの他のメンバーと同様
に、シトリンは、約１００残基の長さの繰り返し配列を
含む。それぞれの繰り返し領域は、２つの膜貫通領域(T
M)を含む。第１の領域は、より疎水性で、保存されたグ
リシン及びプロリン残基を有し、第２の領域は、より親
水性で、非常に保存された親水性残基を規定された位置
(Kuan, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28, 209-2
33(1993))に有する。機能領域は、EF-hand及びTMらせん
をそれぞれ示す、黒塗り及び白抜きの箱で示す。Ｃ末端
側の３領域構造のそれぞれの３つの繰り返し領域内のTM
らせんのそれぞれの対は、それらを結ぶ線で示す。

【００３６】ヒト組織からのpoly(A)⁺RNAのノーザンブ
ロット解析により、SLC25A13 cDNAの異なる領域からの
プローブが、調べたほとんどの組織において約3.4 kbの
主なハイブリダイゼーションバンドを検出することが示
された（図５のa）。肝臓内での発現レベルが最も高い
という観察は、この遺伝子が肝臓特異的CTLN2に関係し
ていることと一貫している。比較的普遍的なSLC25A13の
発現とは対照的に、3.3kbと2.8 kbに２つの主なバンド
を有し、6.6 kbに弱いバンドを有するアララーのｍＲＮ
Ａは、心臓、脳及び骨格筋においてよく発現されるが、
肝臓においては発現されない（図５のｂ）。

【００３７】図５にSLC25A13の発現プロフィールを示
す。図５に示すヒト組織からのpoly(A)⁺RNA(２μｇ)を
含むノーザンブロットを、SLC25A13-特異的プローブ
（コード領域の５’側）(a)、アララー−特異的プロー
ブ（コード領域の５’側）(b)、及びβ−アクチン−特
異的プローブ(c)と連続的にハイブリダイズさせた。Ｈ
は心臓、Ｂは脳、Ｐｌは胎盤、Ｌｕは肺、Ｌｉは肝臓、
Ｓｋは骨格筋、Ｋは腎臓、Ｐａは膵臓を意味する。β−
アクチンｍＲＮＡは、内部対照として検出した。SLC25A
13 mRNA(3.4 kb)とは対照的に、アララー(SLC25A12)の
発現は肝臓では観察されず、心臓、脳及び骨格筋におい
て、3.3 kbと2.8 kbのサイズの２つの主なバンドが観察
された。これらより弱いが、明らかに特異的なハイブリ
ダイズを示す、約6.6 kbのサイズのバンドも観察され
た。

【００３８】図６に示されるように、１８人の全ての血
族結婚CTLN2患者のSLC25A13中に、５つの異なる突然変
異（最初に図２のｂに示すハプロタイプによって定義さ
れた[I]〜[V]と命名）が同定され、これらがCTLN2の病
因であることが確認された。このように、個々の突然変
異は、上記CTLN2患者からのゲノミックＤＮＡ中に検出
された。発見された突然変異は、[I]フレームシフト及
び停止コドンの導入をもたらす４ｂｐの欠失、[II]TM1
及びTM2領域の間のループを欠失させる置換、[III]停止
突然変異をもたらす２３ｂｐの挿入、[IV]ナンセンス変
異をもたらす置換、[V]エクソン１３の欠失を引き起こ
す置換を包含する（図６）。

【００３９】図６にCTLN2患者におけるヒトシトリン及
び突然変異の推定トポロジカルモデルを示す。これはア
ミノ酸配列（図４）に基づいて推定される、ヒトシトリ
ンの模式図であり、SLC25A13の突然変異[I-V]により引
き起こされる変異のおよその位置が示されている。

【００４０】7q21.3における個々の観察されたハプロタ
イプ（図２のｂ）を説明する独立した突然変異の同定に
より、CTLN2が単一の遺伝子により引き起こされること
が強く示唆される。血族結婚の両親から生まれた１８人
の患者のうち、１５人までがそれぞれの突然変異につい
てホモ接合であった。驚くべきことに、３人の患者は、
血族結婚の両親から生まれたにも関わらず、複合ヘテロ
接合であった。このことは、日本人の間でこの疾患の発
生率が高いこと及び／又は表現率が低いことを示唆して
いる。非血族結婚の患者１０人全員にも、上記したのと
同じ突然変異が観察された。さらに、１２７人の無関係
な対照の中では、ただ一人のみがS225X配列変異を有し
ており、このヒトはおそらくこの疾患のキャリアである
（この観察は、日本人の中でCTLN2のキャリアの頻度が1
/150ないし1/200であるとの予想と一致する）。

【００４１】実施例２ＰＣＲ又はＰＣＲ−ＲＦＬＰを
用いた突然変異の検出健常人又はCTLN2患者の末梢血リンパ球より、常法によ
りゲノミックＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、以
下の各変異検出用のプライマーセットを用い、常法に基
づきＰＣＲにより核酸断片を増幅した。

【００４２】(1)の変異検出用プライマーセットフォワード側：IVS-8F2 (5'-ggtatatttgttgcttgtgtttg-
3')(配列番号３の５’末端から166番目〜188番目の塩基
配列) リバース側：Ex-9B (5'-tcttccagaggagcaatccg-3')(配
列番号１のコード領域の874nt〜893ntとハイブリダイ
ズ)

【００４３】(2)の変異検出用プライマーセットフォワード側：Ex-11F2 (5'-gaaagtgctacgctatgaagg-
3')（配列番号１のコード領域の1137nt〜1157nt）リバース側：IVS-11Bm2 (5'-aggtattgagcatgtggcactg-
3')(配列番号６の５’末端から３番目〜２４番目の塩基
配列とハイブリダイズ（ただし、該プライマーの３’末
端は非相補的）)

【００４４】(3)の変異検出用プライマーセットフォワード側：IVS-15F2 (5'-tgttgtgtctctcctgcagg-
3')(配列番号７の５’末端から160番目〜配列番号１の
ｃＤＮＡのコード領域の1592ntの塩基配列) リバース側：Ex-16B (5'-gcagtctatcactccgctgt-3')
（配列番号１のｃＤＮＡのコード領域の1676nt〜1695nt
とハイブリダイズ）

【００４５】(4)の変異検出用プライマーセットフォワード側：ISV-6F (5'-ggagagtacaagttctggtc-3')
(配列番号１０の５’末端から７２番目〜９１番目の塩
基配列) リバース側：ISV-7B (5'-actagttgccttcttcaccc-3')
（配列番号１１の５’末端から５７番目〜７６番目の塩
基配列とハイブリダイズ）

【００４６】(5)の変異検出用プライマーセットフォワード側：Ex-13F(5'-gtgaacgattttgtgagggata-3')
(配列番号１のコード領域の1231nt〜1250ntの塩基配列) リバース側：IVS-13Bm (5'-gaagagagcttcaaaaggtacttc-
3')（配列番号１３の５’末端から２番目〜２６番目の
塩基配列とハイブリダイズ（ただし、該プライマーの
３’末端は非相補的）

【００４７】(1)の変異を調べる場合には、上記プライ
マーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、増幅産物を直
接アガロースゲル電気泳動にかけた。その結果、正常型
遺伝子の場合には、８２ｂｐの増幅断片が検出され、
(1)の変異を有する変異型遺伝子の場合には、７８ｂｐ
の増幅断片が検出された。

【００４８】(2)の変異を調べる場合には、上記プライ
マーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、Sau3AIで消化
し、消化産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。その
結果、正常型遺伝子の場合には、６５ｂｐの増幅断片が
検出され、(2)の変異を有する変異型遺伝子の場合に
は、４２ｂｐと２３ｂｐの２つの増幅断片が検出され
た。

【００４９】(3)の変異を調べる場合には、上記プライ
マーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、増幅産物を直
接アガロースゲル電気泳動にかけた。その結果、正常型
遺伝子の場合には、１２３ｂｐの増幅断片が検出され、
(3)の変異を有する変異型遺伝子の場合には、１４６ｂ
ｐの増幅断片が検出された。

【００５０】(4)の変異を調べる場合には、上記プライ
マーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、AluIで消化
し、消化産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。その
結果、正常型遺伝子の場合には、５７ｂｐと３６９ｂｐ
の２つの増幅断片が検出され、(4)の変異を有する変異
型遺伝子の場合には、５７ｂｐ、２１４ｂｐと１５５ｂ
ｐの３つの増幅断片が検出された。

【００５１】(5)の変異を調べる場合には、上記プライ
マーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、PstIで消化
し、消化産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。その
結果、正常型遺伝子の場合には、１０６ｂｐの増幅断片
が検出され、(2)の変異を有する変異型遺伝子の場合に
は、８０ｂｐと２６ｂｐの２つの増幅断片が検出され
た。

【００５２】実施例３リコンビナントシトリン蛋白の作成シトリンのリコンビナント蛋白として、N-half（883 b
p）、C-half（1188 bp）、Full-length（2044 bp）、C
末端膜外部（201 bp）の４種類を作成した。ヒト肝細胞
より抽出したmRNAを用いて、First Strand cDNA Synthe
sis Kit（Pharmacia Biotech社）により、cDNAを合成し
た。そのcDNAを鋳型にして、以下のprimerを用いて RT
-PCRを行なった。プライマーの組み合わせは、N-half：
ORF-1FN(5'-taggatccgatggcggccgccaaggtg-3')とORF-1B
(5'-tcggatccaatgtctgctaaggtcgtc-3')、C-half：ORF-
2F (5'-tgcatatgaccttagcagacattgaa-3')とORF-2B (5'-
tcggatcctatgggcctccaccaa-3') 、Full-length：ORF-1F
NとORF-2B、C末端膜外部：Ex17F (5'-caagcttcatatggga
tcagagccagttcc-3')とORF-2Bであり、下線部分はCitrin
cDNAの塩基配列を示す。PCRの条件は、すべて１cycl
e（94℃、５分）、30 cycle（94℃、１分； 58℃、１
分； 72℃、４分）、１cycle（72℃、20分）で行なっ
た。PCR-productは１％agarose S gel（ニッポンジーン
社）を用いて電気泳動を行ない、目的のバンドを切りだ
し、QIAEX II（QIAGEN社）によりDNAをゲルから抽出し
た。目的DNAはTA vector（Invitrogen社）に組み込み、
クローニングした。Positive cloneの選別後、それぞれ
のプラスミドを適切な制限酵素で切断した。得られたイ
ンサートDNAをそれぞれ対応する制限酵素で切断したpET
-15b vector（Novagen社）に組み込んで、クローン化し
た。N-halfおよびFull-lengthにはBamHI、C-halfならび
にC末端膜外部にはNdeIとBamHIが用いられた。目的DNA
をpET-15bに挿入したplasmidをBL21(DE3)細胞にtransfo
rmし、培養菌液のOD600nmが0.5-0.6付近になった時点
で、終濃度0.4 mM のIPTGを添加後、さらに４時間培養
することにより蛋白発現を行なった。得られた菌体を5,
000g、20分、4℃の遠心で集めた。その沈殿を20 mM Tri
s-HCl（pH8.0）、1 mM DTT、1% Triton X-100溶液に懸
濁し、凍結融解を３回行ない、5,000g、20分、4℃で遠
心した。その沈殿を8M Urea存在下0.1 M Tris-HCl（pH
8.0）に溶解し、His-Tag SystemのNi-columnにアプライ
後、8 M Urea存在下0.1 M Imidazole、0.5 M NaCl、20
mM Tris-HCl（pH8.0）溶液を用いて目的蛋白を溶出し、
精製を行なった。目的蛋白を含む画分は終濃度10%のト
リクロロ酢酸により濃縮し、その最終沈殿は100%エタノ
ールで２回洗浄した後、-20℃で保存した。

【００５３】実施例４抗シトリン抗体の作成上記の方法で精製したリコンビナント蛋白400μｇを250
μｌの8M Urea存在下20mM Tris-HCl（pH8.0）で溶解
し、同量のTiterMax Gold（CytRx社）を加えて超音波処
理により混合し、その混液をウサギに注射した。１回目
の免疫から３週間後、同様の方法で２回目の免疫を行な
い、ELISA法により抗体の力価を測定した。最初の免疫
から４週間後に３回目の免疫を実施し、その１週間後に
全採血を行ない、抗血清を得た。

【００５４】

【発明の効果】本発明により、初めてCTLN2を遺伝子検
査又は免疫測定により、簡便、かつ確実に診断できるよ
うになった。

【００５５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Keiko KOBAYASHI et al., <120> Method for diagnosing adult-onset type II citrullinemia <130> 99602 <160> 13

【００５６】 <210> 1 <211> 3159 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggccaggaac gcacgctgcc tggccgtatc gccgccccca ccgacgccgc cgccgggact 60 agaagtgagc cgcccgggtc ccaaacgcca gccagccagt cagtgggtcc cgcagtcgcc 120 cgcaaccggg gcgaatc atg gcg gcc gcc aag gtg gct tta acc aag aga 170 Met Ala Ala Ala Lys Val Ala Leu Thr Lys Arg 1 5 10 gca gat cca gct gag ctt aga aca ata ttt ttg aag tat gca agc att 218 Ala Asp Pro Ala Glu Leu Arg Thr Ile Phe Leu Lys Tyr Ala Ser Ile 15 20 25 gag aaa aac ggt gaa ttt ttc atg tcc ccc aat gac ttt gtc act cga 266 Glu Lys Asn Gly Glu Phe Phe Met Ser Pro Asn Asp Phe Val Thr Arg 30 35 40 tac ttg aac att ttt gga gaa agc cag cct aat cca aag act gtg gaa 314 Tyr Leu Asn Ile Phe Gly Glu Ser Gln Pro Asn Pro Lys Thr Val Glu 45 50 55 ctt tta agt gga gtg gtg gat cag acc aaa gat gga tta ata tct ttt 362 Leu Leu Ser Gly Val Val Asp Gln Thr Lys Asp Gly Leu Ile Ser Phe 60 65 70 75 caa gaa ttt gtt gcc ttt gaa tct gtc ctg tgt gcc cct gat gct ttg 410 Gln Glu Phe Val Ala Phe Glu Ser Val Leu Cys Ala Pro Asp Ala Leu 80 85 90 ttt atg gta gcc ttt cag ctg ttt gac aaa gct ggc aaa gga gaa gta 458 Phe Met Val Ala Phe Gln Leu Phe Asp Lys Ala Gly Lys Gly Glu Val 95 100 105 act ttt gag gat gtt aag caa gtt ttt gga cag acc aca att cat caa 506 Thr Phe Glu Asp Val Lys Gln Val Phe Gly Gln Thr Thr Ile His Gln 110 115 120 cat att cca ttt aac tgg gat tca gaa ttt gtg caa cta cat ttt gga 554 His Ile Pro Phe Asn Trp Asp Ser Glu Phe Val Gln Leu His Phe Gly 125 130 135 aaa gaa aga aaa aga cac ctg aca tat gcg gaa ttt act cag ttt tta 602 Lys Glu Arg Lys Arg His Leu Thr Tyr Ala Glu Phe Thr Gln Phe Leu 140 145 150 155 ttg gaa ata caa ctg gag cac gca aag caa gcc ttt gtg caa cgg gac 650 Leu Glu Ile Gln Leu Glu His Ala Lys Gln Ala Phe Val Gln Arg Asp 160 165 170 aat gct agg act ggg aga gtc aca gcc atc gac ttc cga gac atc atg 698 Asn Ala Arg Thr Gly Arg Val Thr Ala Ile Asp Phe Arg Asp Ile Met 175 180 185 gtc acc atc cgc ccc cat gtc ttg act cct ttt gta gaa gaa tgt cta 746 Val Thr Ile Arg Pro His Val Leu Thr Pro Phe Val Glu Glu Cys Leu 190 195 200 gta gct gct gct gga ggt acc aca tcc cat caa gtt agt ttc tcc tat 794 Val Ala Ala Ala Gly Gly Thr Thr Ser His Gln Val Ser Phe Ser Tyr 205 210 215 ttt aat gga ttt aat tcg ctc ctt aac aac atg gaa ctc att aga aag 842 Phe Asn Gly Phe Asn Ser Leu Leu Asn Asn Met Glu Leu Ile Arg Lys 220 225 230 235 atc tat agc act ctg gct ggc acc agg aaa gat gtt gaa gtg act aag 890 Ile Tyr Ser Thr Leu Ala Gly Thr Arg Lys Asp Val Glu Val Thr Lys 240 245 250 gag gag ttt gtt ctg gca gct cag aaa ttt ggt cag gtt aca ccc atg 938 Glu Glu Phe Val Leu Ala Ala Gln Lys Phe Gly Gln Val Thr Pro Met 255 260 265 gaa gtt gac atc ttg ttt cag tta gca gat tta tat gag cca agg gga 986 Glu Val Asp Ile Leu Phe Gln Leu Ala Asp Leu Tyr Glu Pro Arg Gly 270 275 280 cgt atg acc tta gca gac att gaa cgg att gct cct ctg gaa gag gga 1034 Arg Met Thr Leu Ala Asp Ile Glu Arg Ile Ala Pro Leu Glu Glu Gly 285 290 295 act ctg ccc ttt aac ttg gct gag gcc cag agg cag aag gcc tca ggt 1082 Thr Leu Pro Phe Asn Leu Ala Glu Ala Gln Arg Gln Lys Ala Ser Gly 300 305 310 315 gat tca gct cga cca gtt ctt cta caa gtt gca gag tcg gcc tac agg 1130 Asp Ser Ala Arg Pro Val Leu Leu Gln Val Ala Glu Ser Ala Tyr Arg 320 325 330 ttt ggt ctg ggt tct gtt gct gga gct gtt gga gcc act gct gtg tat 1178 Phe Gly Leu Gly Ser Val Ala Gly Ala Val Gly Ala Thr Ala Val Tyr 335 340 345 cct atc gat ctt gta aaa act cga atg cag aac caa cga tca act ggc 1226 Pro Ile Asp Leu Val Lys Thr Arg Met Gln Asn Gln Arg Ser Thr Gly 350 355 360 tct ttt gtg gga gaa ctc atg tat aaa aac agc ttt gac tgt ttt aag 1274 Ser Phe Val Gly Glu Leu Met Tyr Lys Asn Ser Phe Asp Cys Phe Lys 365 370 375 aaa gtg cta cgc tat gaa ggc ttc ttt gga ctg tat aga ggt ctg ttg 1322 Lys Val Leu Arg Tyr Glu Gly Phe Phe Gly Leu Tyr Arg Gly Leu Leu 380 385 390 395 cca cag tta ttg gga gtt gcc cca gag aag gcc ata aaa ctt aca gtg 1370 Pro Gln Leu Leu Gly Val Ala Pro Glu Lys Ala Ile Lys Leu Thr Val 400 405 410 aac gat ttt gtg agg gat aaa ttt atg cac aaa gat ggt tcg gtc cca 1418 Asn Asp Phe Val Arg Asp Lys Phe Met His Lys Asp Gly Ser Val Pro 415 420 425 ctt gca gca gaa att ctt gct gga ggc tgc gct gga ggc tcc cag gtg 1466 Leu Ala Ala Glu Ile Leu Ala Gly Gly Cys Ala Gly Gly Ser Gln Val 430 435 440 att ttc aca aat cct tta gaa atc gtc aag atc cgt ttg caa gtg gca 1514 Ile Phe Thr Asn Pro Leu Glu Ile Val Lys Ile Arg Leu Gln Val Ala 445 450 455 gga gaa atc acc act ggt cct cga gtc agt gct ctg tct gtc gtg cgg 1562 Gly Glu Ile Thr Thr Gly Pro Arg Val Ser Ala Leu Ser Val Val Arg 460 465 470 475 gac ctg ggg ttt ttt ggg atc tac aag ggt gcc aaa gca tgc ttt ctg 1610 Asp Leu Gly Phe Phe Gly Ile Tyr Lys Gly Ala Lys Ala Cys Phe Leu 480 485 490 cgg gac att cct ttc tcg gcc atc tac ttt ccg tgc tat gct cat gtg 1658 Arg Asp Ile Pro Phe Ser Ala Ile Tyr Phe Pro Cys Tyr Ala His Val 495 500 505 aag gct tcc ttt gca aat gaa gat ggg cag gtt agc cca gga agc ctg 1706 Lys Ala Ser Phe Ala Asn Glu Asp Gly Gln Val Ser Pro Gly Ser Leu 510 515 520 ctc tta gct ggt gcc ata gct ggt atg cct gca gca tct tta gtg acc 1754 Leu Leu Ala Gly Ala Ile Ala Gly Met Pro Ala Ala Ser Leu Val Thr 525 530 535 cct gct gat gtt atc aag acg aga tta cag gtg gct gcc cgg gct ggc 1802 Pro Ala Asp Val Ile Lys Thr Arg Leu Gln Val Ala Ala Arg Ala Gly 540 545 550 555 caa acc act tac agc gga gtg ata gac tgc ttt aga aag ata ctg cgt 1850 Gln Thr Thr Tyr Ser Gly Val Ile Asp Cys Phe Arg Lys Ile Leu Arg 560 565 570 gaa gaa gga cca aaa gct ctg tgg aag gga gct ggt gct cgt gta ttt 1898 Glu Glu Gly Pro Lys Ala Leu Trp Lys Gly Ala Gly Ala Arg Val Phe 575 580 585 cga tcc tca ccc cag ttt ggt gta act ttg ctg act tac gaa ttg cta 1946 Arg Ser Ser Pro Gln Phe Gly Val Thr Leu Leu Thr Tyr Glu Leu Leu 590 595 600 cag cga tgg ttc tac att gat ttt gga gga gta aaa ccc atg gga tca 1994 Gln Arg Trp Phe Tyr Ile Asp Phe Gly Gly Val Lys Pro Met Gly Ser 605 610 615 gag cca gtt cct aaa tcc agg atc aac ctg cct gcc ccg aat cct gat 2042 Glu Pro Val Pro Lys Ser Arg Ile Asn Leu Pro Ala Pro Asn Pro Asp 620 625 630 635 cac gtt ggg ggc tac aaa ctg gca gtt gct aca ttt gca ggg att gaa 2090 His Val Gly Gly Tyr Lys Leu Ala Val Ala Thr Phe Ala Gly Ile Glu 640 645 650 aac aaa ttt gga ctt tac cta cct ctc ttc aag cca tca gta tct acc 2138 Asn Lys Phe Gly Leu Tyr Leu Pro Leu Phe Lys Pro Ser Val Ser Thr 655 660 665 tca aag gct att ggt gga ggc cca taggaagatc agccctggga tagtgctgtc 2192 Ser Lys Ala Ile Gly Gly Gly Pro 670 675 tttttgtggg tactgcagta aagaacatcc ctcctgggaa tgaagcaatg cttcatccct 2252 tttacgtcca tctcttgttt aaattcaagt ccaggctttt ttatcatgtg aaatcattca 2312 ttttctgggt gttttcttaa ccagatcatt gtgaaattat tcataattat tatttggccc 2372 tctgcccaga aacctttgtt tgcatctgaa aattgatggg atttggtcaa cactaacatg 2432 atttggggaa aggagcaagt cagaatagaa attagtactc ccctccttga actaggattg 2492 tagtcccaaa gaggctactg taaggcaatc atggtgctca gagcagtgtt tcgtgtgtgt 2552 tttaaactgg taggaaacta ggtgcatatt tataaaaata aaaaacactg ggagaaatga 2612 aaaaatatat atcaaatata ttcagcctgg cttcaaattg taagcatgca caaattctgt 2672 ctctggatta tattatgaag cttttatgtg aaacatgttt ctttgtaatg aaaaccacat 2732 tggagatgtt tagtaatcat attgttactg gtaccaagac tactagggaa atgcctttgt 2792 actttaggga agtacttttg gcattttact gtacagacag aaaaaactga gatgtagccc 2852 ctctcctgga agtgctaatt ttgaaaaact gctcatatga tgtacatgta ctgattactg 2912 cctattttaa taaacactct tgaaaaatgc atgttgccct gttgctgcct gccctattct 2972 cctcatctcc ccatcattgg tacccacttg cttttaaaat ccactttatc ttgaataatg 3032 taagacaaat atgttctgac ataagtattt aattcatgtt gccttgcata atggtcagag 3092 gcgcatgaat ttgtgaaggt ggaaataaac tatttgtaaa gtgaaaaaaa aaaaaaaaaa 3152 aaaaaaa 3159

【００５７】 <210> 2 <211> 101 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aaagttttgt gatgttcact cattccagtg ccttgagtta atgctgaatt tagtggctat 60 ttcttcttga atctttccct tttaactttt cttccataca g 101

【００５８】 <210> 3 <211> 202 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gtaagttggc tttttttttt ttttttttgg aattagctta ataaaaggag gttaggagga 60 gggcagcaat caggagaaaa agaagccaaa ctgaaggcta tactgaaata tgagaaatga 120 aaaaagggat gtttttaaat tttataatgt aaattgtaat aaattggtat atttgttgct 180 tgtgtttgtt tttcccctac ag 202

【００５９】 <210> 4 <211> 118 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gtgagcaaag aggagcaaac ttgcattctg gggtttcctt agcaggatac cccaaccctg 60 ttccacttgc agttgccttt gcggcattgg tatctgactt aaccattttt ctgttttg 118

【００６０】 <210> 5 <211> 240 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ttgggctgta gcaatgtgcc ttaatttaaa atatctatga catcctttta ttaggggata 60 cttgaatgaa aaccctcaat tgtttattaa agatataaga aaggtagtac tgttttaaaa 120 tctgtattta aaattcaaaa cacatttctt ttctcagtct tgtccttgac tttaactacc 180 ttcttctttc ttctgaccta tcttactttc ttctgagata atgatattgt ttaattttag 240

【００６１】 <210> 6 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gttagtgcca catgctcaat acctgttagg tgaaataaca ctcaaaggtt tggtttctca 60 tcttagtgcc tgacatgaat tagcaagact gcgttaaaat ggaaatacag cagattttca 120 attatccatg ctaatgggag taggctggag gcatctaggg cttggctaat caaaacagcc 180 cataatctga aaattattta t 201

【００６２】 <210> 7 <211> 179 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggagcagaca tcttgcacac aggagaggca tggttgcatt tcccatagag gacagcaaaa 60 taggcatttt attgaatcgg atttttaact ttctttccac ggccagcagt tcaaagcaca 120 gttattttta tatagtgaga atgtgaccag actgagatgg tgttgtgtct ctcctgcag 179

【００６３】 <210> 8 <211> 93 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gtatggaaat aatgtgttct taactaactc tttggtatca ggtaaatttt taaaatatct 60 aattatatct gtgatttctc cattttttta aag 93

【００６４】 <210> 9 <211> 198 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gtaagtatca tgctaaatct gctgctaaat tttggctgct gctaatgctc tgttgtcgta 60 gggaaaggta cctcagtcta gtctctataa taaaatagaa gagatttagg gaaatgttga 120 aattgtgtta acaaggtcat ttccaagggg aacatacaac tgatgagaat gtatcaactc 180 ctttacatta aatatttg 198

【００６５】 <210> 10 <211> 282 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 aactctaaat tactactagt cctgttataa tcctacacat gtatttattt agttttctag 60 gagttgtgta tggagagtac aagttctggt catgattagt tgcagttgct tctaaaaatc 120 atttatagct tttttttaat gcaaaagaaa aatacttata gtcatttctt cttgtacatg 180 catttttgat tactttcaaa ctagttttag atgtatgtac ttctgaatca tctataaatc 240 ttttgtatat ttttcttctc tcttgttttc aatttatttg ag 282

【００６６】 <210> 11 <211> 129 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 gtgagtgaga atatatctga attctagcct gcaagtattg tggtgtatta ttattagggt 60 gaagaaggca actagtactt tattattttt ctatcccatt gacacatatt aactatatga 120 taacgtgtg 129

【００６７】 <210> 12 <211> 270 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 tctaattgca gaacatattt ttggctttca tttatctttt aacttttctc ctgaaacatc 60 agtgatgcat atatattttt cattttttaa aactattata ctattaagag tacttctcaa 120 actattttaa gatctgttaa attgtgcaat ttatgattac tccaatagac tgatagaaaa 180 aaatagcata tattgacaga tgcatattta taagtgttta atgactttct ttatattttt 240 catcagcttc tataaatatt tttcttcaag 270

【００６８】 <210> 13 <211> 129 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gtaagtacct tttgaagctc tcttcattga aaagacttgt ttcacatata tatcactacc 60 atggtcaaca ggtgtggact aaggcttctg tttaaccaca gatcctgcac aagggcagag 120 tctactagg 129

【図面の簡単な説明】

【図１】第７染色体上のCTLN2の遺伝マッピングを示す
図である。

【図２】血族結婚両親からの１８人のCTLN2患者(a)及び
対応するハプロタイプ(b)のリストを示す図である。

【図３】染色体7q21.3におけるCTLN2遺伝子座の物理的
地図を示す図である。

【図４】シトリンと関連タンパク質の整列比較を示す図
である。

【図５】SLC25A13 mRNAの発現プロフィールを示す図で
ある。

【図６】CTLN2患者におけるヒトシトリン及び突然変異
の推定トポロジカルモデルを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/68 33/68 // Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 (71)出願人 599063251 ステファンダブリューシェーラーカナダ国エム５ジー１エックス８オンタリオ州トロントユニバーシテイアべニュー 555 ザ・ホスピタル・フォー・シック・チルドレン内 (72)発明者小林圭子鹿児島県鹿児島市桜ヶ丘１丁目29―17 (72)発明者佐伯武頼鹿児島県鹿児島市桜ヶ丘１丁目29―８ (72)発明者ステファンダブリューシェーラーカナダ国エム５ジー１エックス８オンタリオ州トロントユニバーシテイアべニュー 555 ザ・ホスピタル・フォー・シック・チルドレン内Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA34 AA35 DA13 DA14 DA36 FB01 FB03 4B024 AA11 BA80 CA03 HA11 4B063 QA08 QA17 QA19 QQ02 QQ40 QQ42 QR08 QR62 QS25 QS33 QS34 QX02 4B064 AG01 AG26 CA10 CC24 DA13 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA75 DA89 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被検試料中のゲノミックＤＮＡ又はｍＲ
ＮＡ若しくは該ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡについ
て、下記(1)〜(5)の少なくとも１つを調べることを含
む、成人発症II型シトルリン血症の診断方法。 (1) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAコー
ド領域の851nt〜854ntの領域が欠失する変異がｃＤＮＡ
若しくはｍＲＮＡ中に存在しているか否か、又はゲノミ
ックＤＮＡ中に該変異に対応する変異が存在するか否
か。 (2) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコ
ード領域の1177ntと1178ntの間に対応する位置に存在す
る、SLC25A13遺伝子の第１１イントロンの５’末端のG
がAに置換する変異が存在するか否か。 (3) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコ
ード領域の1638nt〜1660ntに相当する23 bpの領域が、
該コード領域の1637ntと1638ntの間又は1660ntと1661nt
の間のいずれかの部位に挿入される変異がｃＤＮＡ若し
くはｍＲＮＡ中に存在するか否か、又はゲノミックＤＮ
Ａ中に該変異に対応する変異が存在するか否か。 (4) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコ
ード領域の674ntのＣがＡに置換する変異がｃＤＮＡ若
しくはｍＲＮＡ中に存在するか否か、又はゲノミックＤ
ＮＡ中に該変異に対応する変異が存在するか否か。 (5) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコ
ード領域の1311ntと1312ntの間に対応する位置に存在す
る、SLC25A13遺伝子の第１３イントロンの５’末端のG
がAに置換する変異が存在するか否か。
【請求項２】上記(1)又は(3)に記載の変異の有無は、
これらのいずれかの変異を含む核酸領域を増幅し、増幅
された核酸断片のサイズから該変異の有無を調べること
により行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】上記(2)、(4)又は(5)に記載の変異の有
無は、これらのいずれかの変異を含む核酸領域を増幅
し、増幅された核酸断片を、該変異の有無により異なる
サイズの消化核酸断片を生じる制限酵素で消化し、消化
により生じた消化核酸断片のサイズから該変異の有無を
調べることにより行われる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】上記(1)〜(5)に記載の変異が、ゲノミッ
クＤＮＡ中に存在するか否かを調べる請求項１ないし３
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】上記(1)〜(5)に記載の変異の有無は、上
記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を調べること
により行われる請求項１ないし４のいずれか１項に記載
の方法。
【請求項６】免疫測定法により行う請求項５記載の方
法。
【請求項７】上記(1)〜(5)に記載の全ての変異の有無
を調べる請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項８】請求項２又は３記載の方法に用いられ
る、核酸増幅用プライマー。
【請求項９】配列表の配列番号１に示される塩基配列
を有するｃＤＮＡ若しくは上記(1)ないし(5)のいずれか
の変異を含むその変異体によりコードされるタンパク
質、又は該タンパク質の１若しくは複数のアミノ酸残基
が欠失し若しくは置換し、若しくは該タンパク質に１若
しくは複数のアミノ酸残基が付加され若しくは挿入され
た修飾タンパク質であって、上記タンパク質に対する抗
体と免疫反応する修飾タンパク質。
【請求項１０】請求項９記載のタンパク質又は修飾タ
ンパク質をコードする核酸。