JP2000325085A - デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤 - Google Patents
デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ジストロフィン成熟ｍＲＮＡにおいてエクソ
ン20の完全欠失を有するタイプのデュシェンヌ型筋ジス
トロフィー患者のための治療手段を提供すること。 【解決手段】 ジストロフィンの成熟ｍＲＮＡの産生に
おけるエクソン20の完全欠損を伴うデュシェンヌ型筋ジ
ストロフィーの治療剤の製造のための、ジストロフィン
の前駆体ｍＲＮＡのエクソン19に対する20〜50塩基の配
列よりなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
ン20の完全欠失を有するタイプのデュシェンヌ型筋ジス
トロフィー患者のための治療手段を提供すること。 【解決手段】 ジストロフィンの成熟ｍＲＮＡの産生に
おけるエクソン20の完全欠損を伴うデュシェンヌ型筋ジ
ストロフィーの治療剤の製造のための、ジストロフィン
の前駆体ｍＲＮＡのエクソン19に対する20〜50塩基の配
列よりなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子疾患治療薬
の製造におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用
に関し、より具体的には、異常ジストロフィン遺伝子に
基づく前駆体ｍＲＮＡにエクソンスキッピングを起こさ
せるための、デュシェンヌ（Duchenne）型筋ジストロフ
ィー治療薬に関する。
の製造におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用
に関し、より具体的には、異常ジストロフィン遺伝子に
基づく前駆体ｍＲＮＡにエクソンスキッピングを起こさ
せるための、デュシェンヌ（Duchenne）型筋ジストロフ
ィー治療薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】癌遺伝子やウイルス遺伝子の発現を阻害
する目的でアンチセンスオリゴヌクレオチドの研究が盛
んに行われている。アンチセンスオリゴヌクレオチド
は、標的タンパク質のde novo合成を有効に阻害するこ
とが知られている。例えば、IGF-I(Insulin-like Growt
h Factor-I)をコードするｍＲＮＡに対するアンチセン
スオリゴヌクレオチドが、ラットのグリオブラストーマ
細胞の増殖を阻害することが報告されている［Askari,
F.K., and McDonnell, W.M., N. Engl. J. Med, 334: 3
16-318 (1996), Trojan, et al., Science, 259: 94-97
(1933), Trojan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S.A., 89: 4874-4878 (1992)］。
する目的でアンチセンスオリゴヌクレオチドの研究が盛
んに行われている。アンチセンスオリゴヌクレオチド
は、標的タンパク質のde novo合成を有効に阻害するこ
とが知られている。例えば、IGF-I(Insulin-like Growt
h Factor-I)をコードするｍＲＮＡに対するアンチセン
スオリゴヌクレオチドが、ラットのグリオブラストーマ
細胞の増殖を阻害することが報告されている［Askari,
F.K., and McDonnell, W.M., N. Engl. J. Med, 334: 3
16-318 (1996), Trojan, et al., Science, 259: 94-97
(1933), Trojan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S.A., 89: 4874-4878 (1992)］。
【０００３】また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを
用いて前駆体ｍＲＮＡ分子の異常スプライシングを阻害
する方法も報告されている［特表平８−５１０１３０
号］
用いて前駆体ｍＲＮＡ分子の異常スプライシングを阻害
する方法も報告されている［特表平８−５１０１３０
号］
【０００４】今日、前駆体ｍＲＮＡ分子の異常スプライ
シングによる遺伝子疾患が診断可能となり、特に、難病
である筋ジストロフィーが注目されている。筋ジストロ
フィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ: Du
chenne Muscular Dystrophy）とベッカー（ＢＭＤ：Bec
ker Muscular Dystrophy）とに大別される。ＤＭＤは、
最も頻度の高い遺伝子性筋疾患であり、出生男子3,500
人に１人の割合で発症する。本症の患者は、幼児期に筋
力低下症状を現し、その後一貫して筋萎縮が進行して、
20歳前後で死に至る。現在、ＤＭＤに対する有効な治療
薬はなく、全世界の患者から治療薬の開発が強く求めら
れている。1987年にＤＭＤの原因遺伝子であるジストロ
フィン遺伝子が、逆行遺伝学の手法により発見され、ま
たＢＭＢも同じジストロフィン遺伝子の異常から発症す
ることが明らかにされた［Koenig, M. et al., Cell, 5
0: 509-517 (1987)］。ＢＭＤでは、その発症年齢は成
人期と比較的遅く、発症後に軽度の筋力低下は見られる
ものの、ほぼ正常な生存が可能である。
シングによる遺伝子疾患が診断可能となり、特に、難病
である筋ジストロフィーが注目されている。筋ジストロ
フィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ: Du
chenne Muscular Dystrophy）とベッカー（ＢＭＤ：Bec
ker Muscular Dystrophy）とに大別される。ＤＭＤは、
最も頻度の高い遺伝子性筋疾患であり、出生男子3,500
人に１人の割合で発症する。本症の患者は、幼児期に筋
力低下症状を現し、その後一貫して筋萎縮が進行して、
20歳前後で死に至る。現在、ＤＭＤに対する有効な治療
薬はなく、全世界の患者から治療薬の開発が強く求めら
れている。1987年にＤＭＤの原因遺伝子であるジストロ
フィン遺伝子が、逆行遺伝学の手法により発見され、ま
たＢＭＢも同じジストロフィン遺伝子の異常から発症す
ることが明らかにされた［Koenig, M. et al., Cell, 5
0: 509-517 (1987)］。ＢＭＤでは、その発症年齢は成
人期と比較的遅く、発症後に軽度の筋力低下は見られる
ものの、ほぼ正常な生存が可能である。
【０００５】ジストロフィン遺伝子はＸ染色体短腕21領
域に存在し、西尾等の研究により、その遺伝子サイズは
3,000ｋｂであり、ヒトの最大の既知遺伝子であること
が明らかにされた［Nishio, H. et al., J. Clin. Inve
st., 94: 1037-1042 (1994)］。このように大きなサイ
ズであるが、ジストロフィン遺伝子中でジストロフィン
タンパク質をコードしている領域はわずか14ｋｂに過ぎ
ず、しかもそのコード領域は79ものエクソンに分かれて
遺伝子内に分散して存在している［Roberts, RG., et a
l., Genomics, 16: 536-538 (1993)］。更に、この遺伝
子には７種の異なるプロモーター領域が遺伝子内にやは
り分散して存在し、それぞれが異なったｍＲＮＡを産生
している［Nishio, H., et al., J. Clin. Invest., 9
4: 1073-1042 (1994), Ann, AH. and Kunkel, LM., Nat
ure Genet., 3: 283-291 (1993),D'Souza, VN. et al.,
Hum. Mol. Genet., 4: 837-842 (1995)］。これらのこ
とから、ジストロフィン遺伝子及びその転写物は、非常
に複雑な構成になっている。
域に存在し、西尾等の研究により、その遺伝子サイズは
3,000ｋｂであり、ヒトの最大の既知遺伝子であること
が明らかにされた［Nishio, H. et al., J. Clin. Inve
st., 94: 1037-1042 (1994)］。このように大きなサイ
ズであるが、ジストロフィン遺伝子中でジストロフィン
タンパク質をコードしている領域はわずか14ｋｂに過ぎ
ず、しかもそのコード領域は79ものエクソンに分かれて
遺伝子内に分散して存在している［Roberts, RG., et a
l., Genomics, 16: 536-538 (1993)］。更に、この遺伝
子には７種の異なるプロモーター領域が遺伝子内にやは
り分散して存在し、それぞれが異なったｍＲＮＡを産生
している［Nishio, H., et al., J. Clin. Invest., 9
4: 1073-1042 (1994), Ann, AH. and Kunkel, LM., Nat
ure Genet., 3: 283-291 (1993),D'Souza, VN. et al.,
Hum. Mol. Genet., 4: 837-842 (1995)］。これらのこ
とから、ジストロフィン遺伝子及びその転写物は、非常
に複雑な構成になっている。
【０００６】ＤＭＤ及びＢＭＤの遺伝子診断は、初期に
はジストロフィンの遺伝子断片を用い、次いで、ｃＤＮ
Ａをプローブとして用いたサザンブロット法により行わ
れ、約６割のＤＭＤ／ＢＭＤ患者でジストロフィン遺伝
子に大きな欠失あるいは重複という異常の存在が明らか
にされた［Hoffman, EP. and Kunkel, LM., Neuron,2:
1019-1029 (1989)］。これらＤＭＤ／ＢＭＤで発見され
る遺伝子異常の殆どは遺伝子欠失であり、しかもそのサ
イズは数ｋｂと大きなものであった。遺伝子診断に関し
ては、サザンブロット法で発見されたジストロフィン遺
伝子の異常が、遺伝子の２カ所のホットスポットに集中
していることから、このホットスポットの19個のエクソ
ンに的を絞り、２つのＰＣＲ（Polymerase Chain React
ion）反応系を用いて簡易に欠失を発見する、重複ＰＣ
Ｒ法が考案された［Chamberlain JS., et al., Nucleic
Acids Res., 16: 11141-11156 (1988), Beggs AH., et
al., Hum. Genet., 86: 45-48 (1990)］。この重複ＰＣ
Ｒ法は、短時間で結果を得ることができ、サザンブロッ
ト法で検出できる遺伝子異常の98％がこの方法で検出で
きることから、今日では最もポピュラーな遺伝子診断法
となっている。
はジストロフィンの遺伝子断片を用い、次いで、ｃＤＮ
Ａをプローブとして用いたサザンブロット法により行わ
れ、約６割のＤＭＤ／ＢＭＤ患者でジストロフィン遺伝
子に大きな欠失あるいは重複という異常の存在が明らか
にされた［Hoffman, EP. and Kunkel, LM., Neuron,2:
1019-1029 (1989)］。これらＤＭＤ／ＢＭＤで発見され
る遺伝子異常の殆どは遺伝子欠失であり、しかもそのサ
イズは数ｋｂと大きなものであった。遺伝子診断に関し
ては、サザンブロット法で発見されたジストロフィン遺
伝子の異常が、遺伝子の２カ所のホットスポットに集中
していることから、このホットスポットの19個のエクソ
ンに的を絞り、２つのＰＣＲ（Polymerase Chain React
ion）反応系を用いて簡易に欠失を発見する、重複ＰＣ
Ｒ法が考案された［Chamberlain JS., et al., Nucleic
Acids Res., 16: 11141-11156 (1988), Beggs AH., et
al., Hum. Genet., 86: 45-48 (1990)］。この重複ＰＣ
Ｒ法は、短時間で結果を得ることができ、サザンブロッ
ト法で検出できる遺伝子異常の98％がこの方法で検出で
きることから、今日では最もポピュラーな遺伝子診断法
となっている。
【０００７】ジストロフィン遺伝子という同一遺伝子
の、しかも同じ様な遺伝子異常から発症する２種の疾病
であるＤＭＤとＢＭＤの臨床的な病態における大きな相
違は謎とされていたが、いわゆるフレームシフト説［Mo
naco, AP., et al., Genomics,2: 90-95 (1988)］で説
明されるようになっている。すなわち、「ＤＭＤでは、
遺伝子内の部分的な欠失によりジストロフィンｍＲＮＡ
にコードされるアミノ酸読みとり枠（リーディングフレ
ーム）にずれが生じ（アウトフレーム）、結果的にスト
ップコドンが出現しジストロフィンの合成が途中で停止
してしまう。これに対し、ＢＭＤでは、遺伝子に部分欠
失が存在してもリーディングフレームが維持され（イン
フレーム）て、本来のジストロフィンとはサイズが異な
るものの、ジストロフィンタンパク質が生成できる」と
するものである。実際、患者の筋肉中のジストロフィン
を調べると、ＤＭＤではジストロフィンが消失している
のに対して、ＢＭＤでは染色性を正常とは異にしたジス
トロフィンが存在している。またＤＭＤ／ＢＭＤ患者で
ジストロフィン遺伝子異常から計算されたリーディング
フレームの型と患者の表現型とを比較すると、90％以上
の患者でこのフレームシフト説が当てはまっている。
の、しかも同じ様な遺伝子異常から発症する２種の疾病
であるＤＭＤとＢＭＤの臨床的な病態における大きな相
違は謎とされていたが、いわゆるフレームシフト説［Mo
naco, AP., et al., Genomics,2: 90-95 (1988)］で説
明されるようになっている。すなわち、「ＤＭＤでは、
遺伝子内の部分的な欠失によりジストロフィンｍＲＮＡ
にコードされるアミノ酸読みとり枠（リーディングフレ
ーム）にずれが生じ（アウトフレーム）、結果的にスト
ップコドンが出現しジストロフィンの合成が途中で停止
してしまう。これに対し、ＢＭＤでは、遺伝子に部分欠
失が存在してもリーディングフレームが維持され（イン
フレーム）て、本来のジストロフィンとはサイズが異な
るものの、ジストロフィンタンパク質が生成できる」と
するものである。実際、患者の筋肉中のジストロフィン
を調べると、ＤＭＤではジストロフィンが消失している
のに対して、ＢＭＤでは染色性を正常とは異にしたジス
トロフィンが存在している。またＤＭＤ／ＢＭＤ患者で
ジストロフィン遺伝子異常から計算されたリーディング
フレームの型と患者の表現型とを比較すると、90％以上
の患者でこのフレームシフト説が当てはまっている。
【０００８】遺伝子から転写された遺伝情報は、スプラ
イシングによりイントロン配列が除去される等の修飾を
受け、エクソン配列のみからなる成熟ｍＲＮＡとなる。
更に、この成熟ｍＲＮＡがそのリーディングフレームに
従って翻訳され、遺伝子にコードされた遺伝情報に忠実
に従ったタンパク質の合成が可能となる。ｍＲＮＡ前駆
体のスプライシング時には、ｍＲＮＡ前駆体の塩基配列
のうちでイントロン配列とエクソン配列を正確に決定す
る機構がある。そのためにイントロン・エクソン境界部
の配列は一定のルールで全ての遺伝子で保存されてお
り、コンセンサス配列として知られている。
イシングによりイントロン配列が除去される等の修飾を
受け、エクソン配列のみからなる成熟ｍＲＮＡとなる。
更に、この成熟ｍＲＮＡがそのリーディングフレームに
従って翻訳され、遺伝子にコードされた遺伝情報に忠実
に従ったタンパク質の合成が可能となる。ｍＲＮＡ前駆
体のスプライシング時には、ｍＲＮＡ前駆体の塩基配列
のうちでイントロン配列とエクソン配列を正確に決定す
る機構がある。そのためにイントロン・エクソン境界部
の配列は一定のルールで全ての遺伝子で保存されてお
り、コンセンサス配列として知られている。
【０００９】このコンセンサス配列として、イントロン
の５’末端のスプライスドナーサイトと呼ばれるエクソ
ンからイントロンへまたがる部位、イントロンの３’末
端のスプライスアクセプターサイトと呼ばれる部位、そ
して、ブランチングポイントと呼ばれる部位の、３カ所
の配列が知られている。
の５’末端のスプライスドナーサイトと呼ばれるエクソ
ンからイントロンへまたがる部位、イントロンの３’末
端のスプライスアクセプターサイトと呼ばれる部位、そ
して、ブランチングポイントと呼ばれる部位の、３カ所
の配列が知られている。
【００１０】これらのコンセンサス配列の中で、わずか
１塩基の置換でも発生すると、スプライシングの異常を
起こすことが各種の疾病で報告されいるように［Sakura
ba,H. et al., Genomics, 12: 643-650 (1992)］、コン
センサス配列は、スプライシングを進行させる鍵となっ
ている。
１塩基の置換でも発生すると、スプライシングの異常を
起こすことが各種の疾病で報告されいるように［Sakura
ba,H. et al., Genomics, 12: 643-650 (1992)］、コン
センサス配列は、スプライシングを進行させる鍵となっ
ている。
【００１１】このような背景のもとで、本発明は、前駆
体ｍＲＮＡのスプライシングの人為的制御を介して異常
遺伝子の発現を矯正するための薬剤の提供を目的として
研究を重ねた。
体ｍＲＮＡのスプライシングの人為的制御を介して異常
遺伝子の発現を矯正するための薬剤の提供を目的として
研究を重ねた。
【００１２】本発明者等は、ＤＭＤ／ＢＭＤ患者を対象
としたジストロフィン遺伝子異常の診断を日本で初めて
ＰＣＲ法を用いて実施した。そして、ジストロフィン遺
伝子の異常型が欧米人と日本人とで大きな差がないこ
と、すなわち大きな人種差のないことを明らかにした。
こうした遺伝子診断で見出された遺伝子異常は、塩基数
において数ｋｂから数百ｋｂの巨大なものばかりであっ
たが、更に詳細な分析を重ねることにより、あるジスト
ロフィン遺伝子の欠失部位の塩基配列を決定することに
世界で初めて成功し、「ジストロフィン神戸」と命名し
て報告した［Matsuo, M, et al., Biochem. Biophys. R
es. Commun., 170: 963-967 (1990)］。
としたジストロフィン遺伝子異常の診断を日本で初めて
ＰＣＲ法を用いて実施した。そして、ジストロフィン遺
伝子の異常型が欧米人と日本人とで大きな差がないこ
と、すなわち大きな人種差のないことを明らかにした。
こうした遺伝子診断で見出された遺伝子異常は、塩基数
において数ｋｂから数百ｋｂの巨大なものばかりであっ
たが、更に詳細な分析を重ねることにより、あるジスト
ロフィン遺伝子の欠失部位の塩基配列を決定することに
世界で初めて成功し、「ジストロフィン神戸」と命名し
て報告した［Matsuo, M, et al., Biochem. Biophys. R
es. Commun., 170: 963-967 (1990)］。
【００１３】「ジストロフィン神戸」と命名した遺伝子
異常を有する症例は、ＤＭＤであり、重複ＰＣＲ分析の
結果によれば、エクソン19に相当するゲノムＤＮＡの増
幅産物のバンドが、本来存在すべき位置に認められず、
一見、エクソン19の欠失と考えられた。しかしながら、
ゲノムＤＮＡについてエクソン19領域の単独増幅を試み
たところ、エクソン19が正常より小さいサイズの増幅産
物として検出され、ジストロフィン遺伝子によく見られ
る単純なエクソン欠失ではないことが判明した。この患
者の家系の構成員のジストロフィン19領域をＰＣＲ法で
増幅することにより、母親と妹のＤＮＡから正常な増幅
産物と共に患者と同じサイズの増幅産物が得られ、両者
がこの遺伝子異常の保因者であることが判明した。
異常を有する症例は、ＤＭＤであり、重複ＰＣＲ分析の
結果によれば、エクソン19に相当するゲノムＤＮＡの増
幅産物のバンドが、本来存在すべき位置に認められず、
一見、エクソン19の欠失と考えられた。しかしながら、
ゲノムＤＮＡについてエクソン19領域の単独増幅を試み
たところ、エクソン19が正常より小さいサイズの増幅産
物として検出され、ジストロフィン遺伝子によく見られ
る単純なエクソン欠失ではないことが判明した。この患
者の家系の構成員のジストロフィン19領域をＰＣＲ法で
増幅することにより、母親と妹のＤＮＡから正常な増幅
産物と共に患者と同じサイズの増幅産物が得られ、両者
がこの遺伝子異常の保因者であることが判明した。
【００１４】次いで、患者から得られた異常な増幅産物
の塩基配列を決定すると、88塩基からなるエクソン19の
配列のうち52塩基が欠失していることが判明した。この
52塩基の欠失がエクソン配列内に存在することは、この
患者のジストロフィンｍＲＮＡではリーディングフレー
ムにずれを生じて（アウトフレーム）、エクソン20内で
ストップコドンが出現することになる。この遺伝子診断
の結果は、ＤＭＤという臨床診断と一致するものであっ
た。
の塩基配列を決定すると、88塩基からなるエクソン19の
配列のうち52塩基が欠失していることが判明した。この
52塩基の欠失がエクソン配列内に存在することは、この
患者のジストロフィンｍＲＮＡではリーディングフレー
ムにずれを生じて（アウトフレーム）、エクソン20内で
ストップコドンが出現することになる。この遺伝子診断
の結果は、ＤＭＤという臨床診断と一致するものであっ
た。
【００１５】ジストロフィン神戸で発見されたエクソン
19の欠失部分がスプライシングに及ぼす影響を調べるた
めに、患者のジストロフィンｍＲＮＡを分析した［Mats
uo,M., et al., J. Clin. Invest., 87: 2127-2131 (19
91)］。
19の欠失部分がスプライシングに及ぼす影響を調べるた
めに、患者のジストロフィンｍＲＮＡを分析した［Mats
uo,M., et al., J. Clin. Invest., 87: 2127-2131 (19
91)］。
【００１６】まず、患者白血球のｍＲＮＡを逆転写酵素
によりｃＤＮＡに変換し、これを入れ子型ＰＣＲ（nest
ed-PCR）法を用いて増幅した。エクソン18から20にわた
る領域を増幅したところ、ゲノムで発見された異常を基
に計算されたサイズより更に短くなった増幅断片が得ら
れた。これはｍＲＮＡにゲノムＤＮＡの異常とは異なっ
た異常が存在する可能性あるいは白血球と筋肉でｍＲＮ
Ａが異なる可能性を示唆した。そこで、このｍＲＮＡ異
常が疾病と関連する筋肉のｍＲＮＡにも存在することを
確認するため、筋肉のｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを
鋳型としてＰＣＲ法でエクソン18からエクソン20の領域
を増幅した。その結果得られた増幅産のサイズは、白血
球のエクソン18から20の増幅産物と全く同じであった。
によりｃＤＮＡに変換し、これを入れ子型ＰＣＲ（nest
ed-PCR）法を用いて増幅した。エクソン18から20にわた
る領域を増幅したところ、ゲノムで発見された異常を基
に計算されたサイズより更に短くなった増幅断片が得ら
れた。これはｍＲＮＡにゲノムＤＮＡの異常とは異なっ
た異常が存在する可能性あるいは白血球と筋肉でｍＲＮ
Ａが異なる可能性を示唆した。そこで、このｍＲＮＡ異
常が疾病と関連する筋肉のｍＲＮＡにも存在することを
確認するため、筋肉のｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡを
鋳型としてＰＣＲ法でエクソン18からエクソン20の領域
を増幅した。その結果得られた増幅産のサイズは、白血
球のエクソン18から20の増幅産物と全く同じであった。
【００１７】次に、得られた小さな異常増幅産物の塩基
配列決定により、ジストロフィン神戸の患者のジストロ
フィンｃＤＮＡではエクソン18の配列が直接エクソン20
の配列につながっており、エクソン19の配列が完全に消
失していることが判明した。この結果は、ゲノムでは、
エクソン19内の52塩基のみが欠失し36塩基がエクソンと
して残存していたことと矛盾している。これらのことか
ら、ジストロフィン神戸では、前駆体ｍＲＮＡの成熟過
程で36塩基のエクソン19がスプライスアウトされ、エク
ソンのスキッピングが起こったことが示された。
配列決定により、ジストロフィン神戸の患者のジストロ
フィンｃＤＮＡではエクソン18の配列が直接エクソン20
の配列につながっており、エクソン19の配列が完全に消
失していることが判明した。この結果は、ゲノムでは、
エクソン19内の52塩基のみが欠失し36塩基がエクソンと
して残存していたことと矛盾している。これらのことか
ら、ジストロフィン神戸では、前駆体ｍＲＮＡの成熟過
程で36塩基のエクソン19がスプライスアウトされ、エク
ソンのスキッピングが起こったことが示された。
【００１８】遺伝子の異常からエクソンのスキッピング
が生ずる例は少なからず報告されている。既に、本発明
者等はジストロフィン遺伝子の点突然変異例でエクソン
のスキッピングが生じることを世界で初めて発見してい
る［Hagiwara, Y., Am. J. Hum. Genet., 54: 53-61 (1
994)］。これらのエクソンのスキッピングを生じる生じ
る遺伝子変異は、いずれも、先に述べたスプライシング
部位を決定するコンセンサス配列内に生じた異常に起因
している。
が生ずる例は少なからず報告されている。既に、本発明
者等はジストロフィン遺伝子の点突然変異例でエクソン
のスキッピングが生じることを世界で初めて発見してい
る［Hagiwara, Y., Am. J. Hum. Genet., 54: 53-61 (1
994)］。これらのエクソンのスキッピングを生じる生じ
る遺伝子変異は、いずれも、先に述べたスプライシング
部位を決定するコンセンサス配列内に生じた異常に起因
している。
【００１９】これに対し、本発明者等が今回発見したジ
ストロフィン神戸では、エクソン「内」に52塩基の欠失
を認めたのみで、コンセンサス配列には異常がなく、こ
の例でエクソンのスキッピングが生じる原因は不明であ
った。
ストロフィン神戸では、エクソン「内」に52塩基の欠失
を認めたのみで、コンセンサス配列には異常がなく、こ
の例でエクソンのスキッピングが生じる原因は不明であ
った。
【００２０】ジストロフィン神戸に見られたエクソンの
スキッピングの原因がＤＮＡ及びｍＲＮＡ前駆体の一次
構造の異常には求められないことから、ｍＲＮＡ前駆体
の２次構造にエクソンスキッピングの原因が存在するも
のと推察され、その２次構造を解析した。解析には、２
次構造でエネルギー的に最も安定した塩基結合を算出す
るZuker等のアルゴリズムを用い、コンピュータを用い
て行った［Matsuo, M.et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 182: 495-500 (1992)］。野生型のジストロ
フィンのエクソン19及びその両側のイントロンの塩基配
列を含む617塩基を対象にした解析結果では、ｍＲＮＡ
前駆体は比較的単純なステムループ構造を呈した。特徴
的な構造として、エクソン19の配列それ自体が塩基対を
なすイントラエクソンヘアピン構造が確認された。これ
に対し、52塩基のエクソン内欠失を有するジストロフィ
ン神戸のエクソンとその近傍のイントロンの塩基配列か
らｍＲＮＡ前駆体の２次構造を演繹すると、野生型と大
きく異なっており、ジストロフィン神戸における最大の
特徴は、エクソンの配列がイントロンの配列のみと塩基
対をなす単純なステム構造を形成することであった。こ
の結果は野生株で見られたイントラエクソンヘアピン構
造が、ジストロフィン遺伝子のエクソン構造を特徴づけ
る要素である可能性を示唆した。
スキッピングの原因がＤＮＡ及びｍＲＮＡ前駆体の一次
構造の異常には求められないことから、ｍＲＮＡ前駆体
の２次構造にエクソンスキッピングの原因が存在するも
のと推察され、その２次構造を解析した。解析には、２
次構造でエネルギー的に最も安定した塩基結合を算出す
るZuker等のアルゴリズムを用い、コンピュータを用い
て行った［Matsuo, M.et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 182: 495-500 (1992)］。野生型のジストロ
フィンのエクソン19及びその両側のイントロンの塩基配
列を含む617塩基を対象にした解析結果では、ｍＲＮＡ
前駆体は比較的単純なステムループ構造を呈した。特徴
的な構造として、エクソン19の配列それ自体が塩基対を
なすイントラエクソンヘアピン構造が確認された。これ
に対し、52塩基のエクソン内欠失を有するジストロフィ
ン神戸のエクソンとその近傍のイントロンの塩基配列か
らｍＲＮＡ前駆体の２次構造を演繹すると、野生型と大
きく異なっており、ジストロフィン神戸における最大の
特徴は、エクソンの配列がイントロンの配列のみと塩基
対をなす単純なステム構造を形成することであった。こ
の結果は野生株で見られたイントラエクソンヘアピン構
造が、ジストロフィン遺伝子のエクソン構造を特徴づけ
る要素である可能性を示唆した。
【００２１】そこで、ジストロフィン遺伝子の79個のエ
クソンのうちから、近傍のイントロンの塩基配列の明ら
かにされている22個のエクソンを選び、そのｍＲＮＡ前
駆体の２次構造を解析した。解析した全てのエクソン
は、イントラエクソンヘアピン構造を形成する結果とな
り、このイントラエクソンヘアピン構造が、エクソンの
機能の必須な要素と考えられた。これらのことは、ジス
トロフィン神戸に見出されたエクソンのスキッピングが
ｍＲＮＡ前駆体のイントラエクソンヘアピン構造の消失
により発生したことを強く示唆した。これはまた、エク
ソン自体の配列がスプライシング時のエクソン認識に重
要な役割を果たしていることをも示唆した。
クソンのうちから、近傍のイントロンの塩基配列の明ら
かにされている22個のエクソンを選び、そのｍＲＮＡ前
駆体の２次構造を解析した。解析した全てのエクソン
は、イントラエクソンヘアピン構造を形成する結果とな
り、このイントラエクソンヘアピン構造が、エクソンの
機能の必須な要素と考えられた。これらのことは、ジス
トロフィン神戸に見出されたエクソンのスキッピングが
ｍＲＮＡ前駆体のイントラエクソンヘアピン構造の消失
により発生したことを強く示唆した。これはまた、エク
ソン自体の配列がスプライシング時のエクソン認識に重
要な役割を果たしていることをも示唆した。
【００２２】最近、コンセンサス配列以外に、エクソン
内の配列の異常によってもエクソンのスキッピングが生
じ得ることが報告され［Dietz, HC., et al., Science,
259: 680-683 (1993)］、コンセンサス配列に加えてエ
クソンの配列もスプライシング部位決定要因として機能
しているとして注目を集めている。これらのことは、従
来の分子生物学のスプライシングに関する概念を崩すも
のとなっている。
内の配列の異常によってもエクソンのスキッピングが生
じ得ることが報告され［Dietz, HC., et al., Science,
259: 680-683 (1993)］、コンセンサス配列に加えてエ
クソンの配列もスプライシング部位決定要因として機能
しているとして注目を集めている。これらのことは、従
来の分子生物学のスプライシングに関する概念を崩すも
のとなっている。
【００２３】エクソン19内の配列がスプライス部位の決
定に重要なことが示唆されたので、in vitro のスプラ
イシング反応系を構築し、このことを実験的に明らかに
する試みを行った［Takeshima, Y., et al., J. Clin.
Invest., 95: 515-520 (1995)］。まず、ジストロフィ
ン遺伝子のエクソン18と19並びにイントロン18からなる
ミニジーンを作成し、このミニジーンからラジオアイソ
トープでラベルしたｍＲＮＡ前駆体を合成した。得られ
たｍＲＮＡ前駆体をHela細胞の核抽出液と混合しスプラ
イシング反応を試験管内で進行させ、産生された成熟ｍ
ＲＮＡを電気泳動により分離した。この反応系で正常の
エクソン19塩基配列を有するｍＲＮＡ前駆体を用いると
スプライシングは正常に進行し、エクソン18と19が連続
した成熟ｍＲＮＡを得ることができた。しかしエクソン
19の塩基配列をジストロフィンのそれと置換すると、成
熟ｍＲＮＡは産生されなくなった。これは、ジストロフ
ィン神戸でエクソン19から欠失した52塩基がスプライシ
ングに重要な役割を果たしていることを示すものであっ
た。
定に重要なことが示唆されたので、in vitro のスプラ
イシング反応系を構築し、このことを実験的に明らかに
する試みを行った［Takeshima, Y., et al., J. Clin.
Invest., 95: 515-520 (1995)］。まず、ジストロフィ
ン遺伝子のエクソン18と19並びにイントロン18からなる
ミニジーンを作成し、このミニジーンからラジオアイソ
トープでラベルしたｍＲＮＡ前駆体を合成した。得られ
たｍＲＮＡ前駆体をHela細胞の核抽出液と混合しスプラ
イシング反応を試験管内で進行させ、産生された成熟ｍ
ＲＮＡを電気泳動により分離した。この反応系で正常の
エクソン19塩基配列を有するｍＲＮＡ前駆体を用いると
スプライシングは正常に進行し、エクソン18と19が連続
した成熟ｍＲＮＡを得ることができた。しかしエクソン
19の塩基配列をジストロフィンのそれと置換すると、成
熟ｍＲＮＡは産生されなくなった。これは、ジストロフ
ィン神戸でエクソン19から欠失した52塩基がスプライシ
ングに重要な役割を果たしていることを示すものであっ
た。
【００２４】しかしこのスプライシング異常が、エクソ
ン19の「サイズ」が36塩基と短くなった結果による可能
性もあるため、ジストロフィン神戸のエクソン19の欠失
部を補うものとして、欠失した遺伝子を逆方向に挿入
し、同様の実験を行った。このｍＲＮＡ前駆体では、ス
プライシングは進行するものの、その効率は低かった。
この結果は、たとえエクソンが正常な長さを有しても、
エクソン内の塩基配列が異なるとスプライシング効率は
低下することを示し、エクソンの（サイズでなく）塩基
配列自体が重要であることを示すものであった。
ン19の「サイズ」が36塩基と短くなった結果による可能
性もあるため、ジストロフィン神戸のエクソン19の欠失
部を補うものとして、欠失した遺伝子を逆方向に挿入
し、同様の実験を行った。このｍＲＮＡ前駆体では、ス
プライシングは進行するものの、その効率は低かった。
この結果は、たとえエクソンが正常な長さを有しても、
エクソン内の塩基配列が異なるとスプライシング効率は
低下することを示し、エクソンの（サイズでなく）塩基
配列自体が重要であることを示すものであった。
【００２５】 そこで、エクソン内の塩基配列自体のス
プライシングへの影響を更に解析するため、52塩基の欠
失配列に代わって、２種の異なる配列を挿入したｍＲＮ
Ａ前駆体を作成し、そのスプライシング効率を調べた。
β−グロビン遺伝子の一部あるいはアンピシリン耐性遺
伝子の一部をそれぞれ挿入した２種のｍＲＮＡ前駆体に
おいて、いずれもスプライシングは進行したが、ともに
極めて低い効率であった。しかし、β−グロビン遺伝子
を挿入した方が、アンピシリン耐性遺伝子を挿入した方
よりも相対的に高いスプライシング効率を示した。前者
の塩基配列には多くのプリン基が含まれており、エクソ
ン内のプリン配列がエクソン認識に関与していると考え
られている［Watanabe, A., et al., Genes Dev., 7:40
7-418 (1993)］。
プライシングへの影響を更に解析するため、52塩基の欠
失配列に代わって、２種の異なる配列を挿入したｍＲＮ
Ａ前駆体を作成し、そのスプライシング効率を調べた。
β−グロビン遺伝子の一部あるいはアンピシリン耐性遺
伝子の一部をそれぞれ挿入した２種のｍＲＮＡ前駆体に
おいて、いずれもスプライシングは進行したが、ともに
極めて低い効率であった。しかし、β−グロビン遺伝子
を挿入した方が、アンピシリン耐性遺伝子を挿入した方
よりも相対的に高いスプライシング効率を示した。前者
の塩基配列には多くのプリン基が含まれており、エクソ
ン内のプリン配列がエクソン認識に関与していると考え
られている［Watanabe, A., et al., Genes Dev., 7:40
7-418 (1993)］。
【００２６】これらの実験結果は、スプライシングに
は、コンセンサス配列のみならずその下流のエクソンの
配列が関与していることを実験的に明らかにしたもの
で、遺伝情報処理プロセスに新しい概念を導入するもの
である。
は、コンセンサス配列のみならずその下流のエクソンの
配列が関与していることを実験的に明らかにしたもの
で、遺伝情報処理プロセスに新しい概念を導入するもの
である。
【００２７】＜アンチセンスオリゴヌクレオチドによる
スプライシング制御＞ジストロフィン遺伝子のエクソン
19内の配列がスプライシングの進行に極めて重要である
という上記発見から、この配列を破壊することによりス
プライシングの異常が人為的に誘導できるのではないか
という可能性に着目し、続けて検討を行った。
スプライシング制御＞ジストロフィン遺伝子のエクソン
19内の配列がスプライシングの進行に極めて重要である
という上記発見から、この配列を破壊することによりス
プライシングの異常が人為的に誘導できるのではないか
という可能性に着目し、続けて検討を行った。
【００２８】すなわち、ジストロフィン神戸で欠失した
52塩基のうち配列表の配列番号１に示した塩基配列部分
を含んだ配列表の配列番号２に示した31塩基に対し、こ
れに相補的な２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡを合成し、
これが、エクソン18−イントロン18−エクソン19よりな
るｍＲＮＡ前駆体のスプライシングに及ぼす影響を、前
述の試験管内スプライシング反応系で調べた。その結
果、スプライシング反応はアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの添加量に、またその反応時間に依存して阻害され
た。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドによりジ
ストロフィンのイントロンのスプライシングが阻止でき
ることを実験的に初めて証明したものである。そして、
このことは核内でおこるスプライシング反応が人為的な
手段により制御できる可能性を示した［Takeshima, Y.
et al., J. Clin. Invest., 95: 515-520 (1995)］。
52塩基のうち配列表の配列番号１に示した塩基配列部分
を含んだ配列表の配列番号２に示した31塩基に対し、こ
れに相補的な２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡを合成し、
これが、エクソン18−イントロン18−エクソン19よりな
るｍＲＮＡ前駆体のスプライシングに及ぼす影響を、前
述の試験管内スプライシング反応系で調べた。その結
果、スプライシング反応はアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの添加量に、またその反応時間に依存して阻害され
た。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドによりジ
ストロフィンのイントロンのスプライシングが阻止でき
ることを実験的に初めて証明したものである。そして、
このことは核内でおこるスプライシング反応が人為的な
手段により制御できる可能性を示した［Takeshima, Y.
et al., J. Clin. Invest., 95: 515-520 (1995)］。
【００２９】＜細胞核内でのスプライシング制御＞生き
た細胞の核内でもアンチセンスオリゴヌクレオチドによ
りジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のスプライシングが制
御できることを明らかにするため、本発明者等は、正常
なヒトリンパ芽球細胞を用い、配列表の配列番号１に示
した塩基配列部分を含んだ配列表の配列番号２に示され
た塩基配列に対し、これに相補的な塩基配列を有するア
ンチセンスオリゴＤＮＡの導入を行って、その存在下に
産生されるジストロフィン成熟ｍＲＮＡについて解析を
行った［Zacharias A. DP. et al., B.B.R.C., 226: 44
5-449 (1996)］。すなわち、アンチセンスオリゴＤＮＡ
の核内への導入は、リポフェクタミンと混合後、これを
リンパ芽球培養液に加えることにより行った。その結
果、先に試験管内スプライシング反応系で得られた結果
とは異なって、ジストロフィンのエクソン19の塩基配列
に対するアンチセンスオリゴＤＮＡはヒトリンパ芽球細
胞においてエクソン19のスキッピングを誘導し、ｍＲＮ
Ａにおいてエクソン18がエクソン20に直接つながったも
のが得られることが確認された。また培養時間を延長す
ることにより、このエクソンスキッピング誘導効果は完
全なものとなり、全てのｍＲＮＡがエクソン19を欠失し
たものとして認められるようになった。更に、用いたア
ンチセンスオリゴＤＮＡは、他のエクソンのスプライシ
ングには問題を起こさなかったことも確認された。
た細胞の核内でもアンチセンスオリゴヌクレオチドによ
りジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のスプライシングが制
御できることを明らかにするため、本発明者等は、正常
なヒトリンパ芽球細胞を用い、配列表の配列番号１に示
した塩基配列部分を含んだ配列表の配列番号２に示され
た塩基配列に対し、これに相補的な塩基配列を有するア
ンチセンスオリゴＤＮＡの導入を行って、その存在下に
産生されるジストロフィン成熟ｍＲＮＡについて解析を
行った［Zacharias A. DP. et al., B.B.R.C., 226: 44
5-449 (1996)］。すなわち、アンチセンスオリゴＤＮＡ
の核内への導入は、リポフェクタミンと混合後、これを
リンパ芽球培養液に加えることにより行った。その結
果、先に試験管内スプライシング反応系で得られた結果
とは異なって、ジストロフィンのエクソン19の塩基配列
に対するアンチセンスオリゴＤＮＡはヒトリンパ芽球細
胞においてエクソン19のスキッピングを誘導し、ｍＲＮ
Ａにおいてエクソン18がエクソン20に直接つながったも
のが得られることが確認された。また培養時間を延長す
ることにより、このエクソンスキッピング誘導効果は完
全なものとなり、全てのｍＲＮＡがエクソン19を欠失し
たものとして認められるようになった。更に、用いたア
ンチセンスオリゴＤＮＡは、他のエクソンのスプライシ
ングには問題を起こさなかったことも確認された。
【００３０】＜人為的エクソンスキッピングの治療への
応用＞先述のように、ＤＭＤでは、ジストロフィンｍＲ
ＮＡのアミノ酸読みとり枠がずれてアウトフレームとな
るような遺伝子異常を有している。もしこの読みとり枠
の異常をインフレームに転換できるとすれば、それによ
りＤＭＤはＢＭＤとなり、症状の改善が期待できる筈で
ある。例えば、仮に、エクソン20のみが単独で欠失して
いる患者を想定すると、エクソン20は242塩基からなっ
ており、当然ながらその単独欠失はフレームシフトを起
こして翻訳途中で停止コドンが出現してジストロフィン
合成が途中で停止し、その結果ＤＭＤの表現型となる。
しかしながら、この症例に対し、前記の実験で用いたよ
うなエクソン19に対するアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドを投与してエクソン19のスキッピングを人為的に誘発
できたとすると、エクソン20の242塩基に加えエクソン1
9の88塩基が前駆体ｍＲＮＡから欠失することとなり、
合計330塩基の欠失となって、リーディングフレームは
一転してインフレームとなる可能性が、すなわちアンチ
センスオリゴヌクレオチドの使用によりＤＭＤの表現型
をＢＭＤに転換できる可能性が、理論上はある。
応用＞先述のように、ＤＭＤでは、ジストロフィンｍＲ
ＮＡのアミノ酸読みとり枠がずれてアウトフレームとな
るような遺伝子異常を有している。もしこの読みとり枠
の異常をインフレームに転換できるとすれば、それによ
りＤＭＤはＢＭＤとなり、症状の改善が期待できる筈で
ある。例えば、仮に、エクソン20のみが単独で欠失して
いる患者を想定すると、エクソン20は242塩基からなっ
ており、当然ながらその単独欠失はフレームシフトを起
こして翻訳途中で停止コドンが出現してジストロフィン
合成が途中で停止し、その結果ＤＭＤの表現型となる。
しかしながら、この症例に対し、前記の実験で用いたよ
うなエクソン19に対するアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドを投与してエクソン19のスキッピングを人為的に誘発
できたとすると、エクソン20の242塩基に加えエクソン1
9の88塩基が前駆体ｍＲＮＡから欠失することとなり、
合計330塩基の欠失となって、リーディングフレームは
一転してインフレームとなる可能性が、すなわちアンチ
センスオリゴヌクレオチドの使用によりＤＭＤの表現型
をＢＭＤに転換できる可能性が、理論上はある。
【００３１】しかしながら、ジストロフィン遺伝子は前
述の通り非常に複雑な構造をしており、そのｍＲＮＡ前
駆体も、スプライスアウトされるべき多数の長いイント
ロンを含んだ複雑な２次構造をなしておりそれがスプラ
イシングの正常な進行を制御している。従って、正常な
ヒトのリンパ球芽細胞でなく、エクソン20の単独欠失を
有する患者の筋芽細胞においても、エクソン19に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチドによって期待通りエク
ソン19のスキッピングを起こすことができるか否か、ま
たエクソン19のスキッピングにうまく成功したとして
も、元々エクソン20のスプライスアウトを引き起こす異
常を有するｍＲＮＡ前駆体において、エクソン20のスプ
ライスアウトや他の部位のスプライシングに対して影響
を及ぼすことなくｍＲＮＡのリーディングフレームをア
ウトフレームからインフレームへと転換することができ
るか否か、そして更には、インフレームへと転換できた
としてもそのｍＲＮＡがジストロフィンに近似のタンパ
ク質を有効に産生できるか否か、という現実の可能性は
不明であった。
述の通り非常に複雑な構造をしており、そのｍＲＮＡ前
駆体も、スプライスアウトされるべき多数の長いイント
ロンを含んだ複雑な２次構造をなしておりそれがスプラ
イシングの正常な進行を制御している。従って、正常な
ヒトのリンパ球芽細胞でなく、エクソン20の単独欠失を
有する患者の筋芽細胞においても、エクソン19に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチドによって期待通りエク
ソン19のスキッピングを起こすことができるか否か、ま
たエクソン19のスキッピングにうまく成功したとして
も、元々エクソン20のスプライスアウトを引き起こす異
常を有するｍＲＮＡ前駆体において、エクソン20のスプ
ライスアウトや他の部位のスプライシングに対して影響
を及ぼすことなくｍＲＮＡのリーディングフレームをア
ウトフレームからインフレームへと転換することができ
るか否か、そして更には、インフレームへと転換できた
としてもそのｍＲＮＡがジストロフィンに近似のタンパ
ク質を有効に産生できるか否か、という現実の可能性は
不明であった。
【００３２】
【発明が解決しようとする課題】このような背景のも
と、本発明者等は、ジストロフィン成熟ｍＲＮＡにおい
てエクソン20の完全欠失を有するＤＭＤ患者の細胞で、
エクソン19に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを
用いてそのスプライスアウトを誘導できるか、そしてそ
れによりジストロフィン成熟ｍＲＮＡの読みとり枠を修
正でき、ジストロフィン陰性細胞を陽性細胞に転換でき
るかどうかを明らかにし、その結果に基づきＤＭＤに対
する治療薬を提供することを目的とする。
と、本発明者等は、ジストロフィン成熟ｍＲＮＡにおい
てエクソン20の完全欠失を有するＤＭＤ患者の細胞で、
エクソン19に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを
用いてそのスプライスアウトを誘導できるか、そしてそ
れによりジストロフィン成熟ｍＲＮＡの読みとり枠を修
正でき、ジストロフィン陰性細胞を陽性細胞に転換でき
るかどうかを明らかにし、その結果に基づきＤＭＤに対
する治療薬を提供することを目的とする。
【００３３】本明細書において後で詳細に述べる通り、
本発明者等は上記目的に基づいて研究を進め、ジストロ
フィンのエクソン19に対するアンチセンスオリゴリボヌ
クレオチドをエクソン20の単独欠失を有するＤＭＤ患者
の筋芽細胞の培養液中に投与することにより、これが筋
芽細胞内へ、次いで核内へと取り込まれ、その結果、エ
クソン19とエクソン20とを完全欠失はするもののアミノ
酸読み取り枠はアウトフレームからインフレームになる
よう回復されて、エクソン19とエクソン20がコードする
部分以外は完全長のジストロフィンを産生できるように
なることが確認された。このことは、エクソン20の単独
欠失に基づくＤＭＤ患者に対して、エクソン19に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによ
り、極めて重篤な疾患であるＤＭＤを比較的軽い疾患で
あるＢＭＤへと転換させ得るという可能性を強く支持し
ている。本発明は、この発見に基づきなされたものであ
る。
本発明者等は上記目的に基づいて研究を進め、ジストロ
フィンのエクソン19に対するアンチセンスオリゴリボヌ
クレオチドをエクソン20の単独欠失を有するＤＭＤ患者
の筋芽細胞の培養液中に投与することにより、これが筋
芽細胞内へ、次いで核内へと取り込まれ、その結果、エ
クソン19とエクソン20とを完全欠失はするもののアミノ
酸読み取り枠はアウトフレームからインフレームになる
よう回復されて、エクソン19とエクソン20がコードする
部分以外は完全長のジストロフィンを産生できるように
なることが確認された。このことは、エクソン20の単独
欠失に基づくＤＭＤ患者に対して、エクソン19に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによ
り、極めて重篤な疾患であるＤＭＤを比較的軽い疾患で
あるＢＭＤへと転換させ得るという可能性を強く支持し
ている。本発明は、この発見に基づきなされたものであ
る。
【００３４】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、ジ
ストロフィンの成熟ｍＲＮＡの産生におけるエクソン20
の完全欠損を伴うデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治
療剤の製造のための、ジストロフィンの前駆体ｍＲＮＡ
のエクソン19に対する20〜50塩基の配列よりなるアンチ
センスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。このよう
なアンチセンスオリゴヌクレオチドを治療剤の薬効成分
として用いることにより、エクソン20の完全欠損を伴う
デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて、ｍＲＮＡの
アミノ酸読みとりフレームを異常なアウトフレームから
インフレームへと転換させることが可能となり、それに
よって、より重篤度が低いBecker型筋ジストロフィーへ
と病態を転換することが可能となる。
ストロフィンの成熟ｍＲＮＡの産生におけるエクソン20
の完全欠損を伴うデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治
療剤の製造のための、ジストロフィンの前駆体ｍＲＮＡ
のエクソン19に対する20〜50塩基の配列よりなるアンチ
センスオリゴヌクレオチドの使用を提供する。このよう
なアンチセンスオリゴヌクレオチドを治療剤の薬効成分
として用いることにより、エクソン20の完全欠損を伴う
デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて、ｍＲＮＡの
アミノ酸読みとりフレームを異常なアウトフレームから
インフレームへと転換させることが可能となり、それに
よって、より重篤度が低いBecker型筋ジストロフィーへ
と病態を転換することが可能となる。
【００３５】本明細書において、「ヌクレオチド」とい
うときは、通常の意味におけるＤＮＡ及びＲＮＡのみな
らず、それらのホスホロチオエート類似体も包含する。
ホスホロチオエートＤＮＡ及びホスホロチオエートＲＮ
Ａは、通常のＤＮＡ及びＲＮＡと同様に塩基対を形成す
るが、各種分解酵素に対して抵抗性が大きく本発明にお
いて用いるのに特に有利である。ここに、「ホスホロチ
オエート類似体」は、通常のＤＮＡ又はＲＮＡのヌクレ
オチド間のホスホロジエステル基の１個以上がホスホロ
チオエート基に置き換えられている構造のものである。
うときは、通常の意味におけるＤＮＡ及びＲＮＡのみな
らず、それらのホスホロチオエート類似体も包含する。
ホスホロチオエートＤＮＡ及びホスホロチオエートＲＮ
Ａは、通常のＤＮＡ及びＲＮＡと同様に塩基対を形成す
るが、各種分解酵素に対して抵抗性が大きく本発明にお
いて用いるのに特に有利である。ここに、「ホスホロチ
オエート類似体」は、通常のＤＮＡ又はＲＮＡのヌクレ
オチド間のホスホロジエステル基の１個以上がホスホロ
チオエート基に置き換えられている構造のものである。
【００３６】該アンチセンスオリゴヌクレオチドとして
は、配列表において配列番号１で示したエクソン19にお
けるエクソン認識配列に対するアンチセンスオリゴヌク
レオチドが取り分け好ましい。従って、本発明は、特に
好ましくは、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配
列表において配列番号１で示した塩基配列に相補的な塩
基配列を含むものである、上記エクソン20の完全欠損を
伴うデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤の製造の
ための、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供
する。
は、配列表において配列番号１で示したエクソン19にお
けるエクソン認識配列に対するアンチセンスオリゴヌク
レオチドが取り分け好ましい。従って、本発明は、特に
好ましくは、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配
列表において配列番号１で示した塩基配列に相補的な塩
基配列を含むものである、上記エクソン20の完全欠損を
伴うデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤の製造の
ための、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提供
する。
【００３７】該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オ
リゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡ及びホス
ホロチオエートオリゴＲＮＡであってよい。
リゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡ及びホス
ホロチオエートオリゴＲＮＡであってよい。
【００３８】また該アンチセンスオリゴヌクレオチドと
して特に好ましいものの一例は、配列表において配列番
号２で示した塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリ
ゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡ又はホスホ
ロチオエートオリゴＲＮＡである。
して特に好ましいものの一例は、配列表において配列番
号２で示した塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリ
ゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡ又はホスホ
ロチオエートオリゴＲＮＡである。
【００３９】更に、上記アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、静脈内投与するのに適した媒質に適当な量含有さ
せた形で、ジストロフィンの成熟ｍＲＮＡの産生に際し
たエクソン20の完全欠損を伴うデュシェンヌ型筋ジスト
ロフィー治療剤として具体化することができる。
ドは、静脈内投与するのに適した媒質に適当な量含有さ
せた形で、ジストロフィンの成熟ｍＲＮＡの産生に際し
たエクソン20の完全欠損を伴うデュシェンヌ型筋ジスト
ロフィー治療剤として具体化することができる。
【００４０】すなわち、本発明は、更に、薬剤学的に許
容し得る注射可能な媒質中に、ジストロフィンの前駆体
ｍＲＮＡのエクソン19に対する20〜50塩基の配列よりな
るアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有することを特
徴とする、ジストロフィンの成熟ｍＲＮＡの産生に際し
たエクソン20の完全欠損を伴うデュシェンヌ型筋ジスト
ロフィーの治療剤をも提供する。
容し得る注射可能な媒質中に、ジストロフィンの前駆体
ｍＲＮＡのエクソン19に対する20〜50塩基の配列よりな
るアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有することを特
徴とする、ジストロフィンの成熟ｍＲＮＡの産生に際し
たエクソン20の完全欠損を伴うデュシェンヌ型筋ジスト
ロフィーの治療剤をも提供する。
【００４１】該アンチセンスオリゴヌクレオチドとして
は、配列表において配列番号１で示したエクソン19にお
けるエクソン認識配列に対するアンチセンスオリゴヌク
レオチドが取り分け好ましい。従って本発明は、該アン
チセンスオリゴヌクレオチドが、配列表において配列番
号１で示した塩基配列に相補的な塩基配列を含むもので
ある、上記デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤を
も提供する。
は、配列表において配列番号１で示したエクソン19にお
けるエクソン認識配列に対するアンチセンスオリゴヌク
レオチドが取り分け好ましい。従って本発明は、該アン
チセンスオリゴヌクレオチドが、配列表において配列番
号１で示した塩基配列に相補的な塩基配列を含むもので
ある、上記デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤を
も提供する。
【００４２】該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、オ
リゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡ及びホス
ホロチオエートオリゴＲＮＡであってよい。
リゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡ及びホス
ホロチオエートオリゴＲＮＡであってよい。
【００４３】また該アンチセンスオリゴヌクレオチドと
して特に好ましいものの一例は、配列表において配列番
号２で示した塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリ
ゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡ又はホスホ
ロチオエートオリゴＲＮＡである。
して特に好ましいものの一例は、配列表において配列番
号２で示した塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリ
ゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡ又はホスホ
ロチオエートオリゴＲＮＡである。
【００４４】本発明の治療剤は、好ましくは、0.05〜５
μmoles／ｍｌの該アンチセンスオリゴヌクレオチド、
0.02〜10％ｗ／ｖの炭水化物又は多価アルコール及び0.
01〜0.4％ｗ／ｖの薬剤学的に許容し得る界面活性剤を
含有する、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの更に好
ましい範囲は、0.1〜１μmoles／ｍｌである。
μmoles／ｍｌの該アンチセンスオリゴヌクレオチド、
0.02〜10％ｗ／ｖの炭水化物又は多価アルコール及び0.
01〜0.4％ｗ／ｖの薬剤学的に許容し得る界面活性剤を
含有する、該アンチセンスオリゴヌクレオチドの更に好
ましい範囲は、0.1〜１μmoles／ｍｌである。
【００４５】該炭水化物としては、担当類及び／又は２
糖類が特にこのましい。これら炭水化物及び多価アルコ
ールの例としては、グルコース、ガラクトース、マンノ
ース、ラクトース、マルトース、マンニトール及びソル
ビトールが挙げられる。これらは、単独で用いても、併
用してもよい。
糖類が特にこのましい。これら炭水化物及び多価アルコ
ールの例としては、グルコース、ガラクトース、マンノ
ース、ラクトース、マルトース、マンニトール及びソル
ビトールが挙げられる。これらは、単独で用いても、併
用してもよい。
【００４６】また、界面活性剤の好ましい例としては、
ポリオキシエチレンソルビタンモノ〜トリ−エステル、
アルキルフェニルポリオキシエチレン、ナトリウムタウ
ロコラート、ナトリウムコラート、及び多価アルコール
エステルが挙げられる。このうち特に好ましいのは、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノ〜トリ−エステルであ
り、ここにおいてエステルとして特に好ましいのは、オ
レエート、ラウレート、ステアレート及びパルミテート
である。これらは単独で用いても、併用してもよい。
ポリオキシエチレンソルビタンモノ〜トリ−エステル、
アルキルフェニルポリオキシエチレン、ナトリウムタウ
ロコラート、ナトリウムコラート、及び多価アルコール
エステルが挙げられる。このうち特に好ましいのは、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノ〜トリ−エステルであ
り、ここにおいてエステルとして特に好ましいのは、オ
レエート、ラウレート、ステアレート及びパルミテート
である。これらは単独で用いても、併用してもよい。
【００４７】また本発明の治療剤は、更に好ましくは、
0.03〜0.09Ｍの薬剤学的に許容し得る中性塩、例えば、
塩化ナトリウム、塩化カリウム及び／又は塩化カルシウ
ムを、含有する。
0.03〜0.09Ｍの薬剤学的に許容し得る中性塩、例えば、
塩化ナトリウム、塩化カリウム及び／又は塩化カルシウ
ムを、含有する。
【００４８】また本発明の治療剤は、更に好ましくは、
0.002〜0.05Ｍの薬剤学的に許容し得る緩衝剤を含有す
ることができる。好ましい緩衝剤の例としては、クエン
酸ナトリウム、ナトリウムグリシネート、リン酸ナトリ
ウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが挙げ
られる。これらの緩衝剤は、単独で用いても、併用して
もよい。
0.002〜0.05Ｍの薬剤学的に許容し得る緩衝剤を含有す
ることができる。好ましい緩衝剤の例としては、クエン
酸ナトリウム、ナトリウムグリシネート、リン酸ナトリ
ウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが挙げ
られる。これらの緩衝剤は、単独で用いても、併用して
もよい。
【００４９】更に、上記の治療剤は、溶液状態で供給し
てもよい。しかし、ある期間保存する必要がある場合等
のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを安定化し
て治療効果の低下を防止する目的で通常は凍結乾燥して
おくことが好ましく、その場合は用時に溶解液（注射用
蒸留水など）で再構成（reconstruction）して、即ち投
与される液体状態にして用いればよい。従って、本発明
の治療剤は、各成分が所定の濃度範囲になるよう溶解液
で再構成して使用するための、凍結乾燥された状態のも
のも包含する。凍結乾燥物の溶解性を促進する目的で、
アルブミン、グリシン等のアミノ酸を更に含有させてお
いてもよい。
てもよい。しかし、ある期間保存する必要がある場合等
のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを安定化し
て治療効果の低下を防止する目的で通常は凍結乾燥して
おくことが好ましく、その場合は用時に溶解液（注射用
蒸留水など）で再構成（reconstruction）して、即ち投
与される液体状態にして用いればよい。従って、本発明
の治療剤は、各成分が所定の濃度範囲になるよう溶解液
で再構成して使用するための、凍結乾燥された状態のも
のも包含する。凍結乾燥物の溶解性を促進する目的で、
アルブミン、グリシン等のアミノ酸を更に含有させてお
いてもよい。
【００５０】
【発明の実施の形態】以下、各種の試験に基づいて本発
明を更に詳細に説明する。
明を更に詳細に説明する。
【００５１】１． 患者由来のリンパ芽球細胞における
エクソンスキッピングの誘導 前述の通り、正常のジストロフィン遺伝子構造を持つ遺
伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体のスプライシング反
応において、本発明者等のデザインしたアンチセンスオ
リゴヌクレオチドがエクソン19のスキッピングを有効に
誘導することが確認された。一方、エクソン20を欠失し
たＤＭＤ患者では、正常とは遺伝子構造を異にするた
め、ジストロフィンのｍＲＮＡ前駆体の２次構造あるい
は３次構造が正常とは異なると予想される。そのような
エクソン20を欠失したＤＭＤ患者でも、前記31塩基のア
ンチセンスオリゴヌクレオチドが有効か否かを検討し
た。すなわち、以下に詳述するように、ジストロフィン
のエクソン20を欠失したＤＭＤ患者２名からＥＢウイル
スでトランスフォームしたリンパ芽球細胞株を樹立し、
これを用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドによりエ
クソンスキッピングを誘導できること確認した。
エクソンスキッピングの誘導 前述の通り、正常のジストロフィン遺伝子構造を持つ遺
伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体のスプライシング反
応において、本発明者等のデザインしたアンチセンスオ
リゴヌクレオチドがエクソン19のスキッピングを有効に
誘導することが確認された。一方、エクソン20を欠失し
たＤＭＤ患者では、正常とは遺伝子構造を異にするた
め、ジストロフィンのｍＲＮＡ前駆体の２次構造あるい
は３次構造が正常とは異なると予想される。そのような
エクソン20を欠失したＤＭＤ患者でも、前記31塩基のア
ンチセンスオリゴヌクレオチドが有効か否かを検討し
た。すなわち、以下に詳述するように、ジストロフィン
のエクソン20を欠失したＤＭＤ患者２名からＥＢウイル
スでトランスフォームしたリンパ芽球細胞株を樹立し、
これを用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドによりエ
クソンスキッピングを誘導できること確認した。
【００５２】（ａ） ＤＭＤ患者由来リンパ球芽細胞株
の樹立 ジストロフィンのエクソン20を欠失したＤＭＤ患者２名
から、ＥＢウイルスで形質転換したリンパ芽球細胞株を
次のようにして樹立した。すなわち、患者より採取した
２ｍｌの全血を２ｍｌのRPMI1640培地（10％FBSを補
充）と混和し、３ｍｌのFicoll Paque（Pharmacia社）
上に重層し、濃度勾配遠心した。その後、リンパ球層の
みを回収し、RPMI1640培地（10％FBSを補充）にて２回
洗浄し、最後に0.5ｍｌのRPMI1640培地（10％FBSを補
充）に浮遊させ、リンパ浮遊液とした。この液と、予め
用意しておいたＥＢウイルス液0.5ｍｌを混和し、混和
液を37℃にて１週間培養した。１週間後にＥＢウイルス
を除くためRPMI1640培地（10％FBSを補充）にて洗浄
し、その後同じ培養液を使用して培養を継続した。こう
して、ＥＢウイルスが患者リンパ球に感染し、形態的に
大きな、リンパ芽球となった細胞を得た。
の樹立 ジストロフィンのエクソン20を欠失したＤＭＤ患者２名
から、ＥＢウイルスで形質転換したリンパ芽球細胞株を
次のようにして樹立した。すなわち、患者より採取した
２ｍｌの全血を２ｍｌのRPMI1640培地（10％FBSを補
充）と混和し、３ｍｌのFicoll Paque（Pharmacia社）
上に重層し、濃度勾配遠心した。その後、リンパ球層の
みを回収し、RPMI1640培地（10％FBSを補充）にて２回
洗浄し、最後に0.5ｍｌのRPMI1640培地（10％FBSを補
充）に浮遊させ、リンパ浮遊液とした。この液と、予め
用意しておいたＥＢウイルス液0.5ｍｌを混和し、混和
液を37℃にて１週間培養した。１週間後にＥＢウイルス
を除くためRPMI1640培地（10％FBSを補充）にて洗浄
し、その後同じ培養液を使用して培養を継続した。こう
して、ＥＢウイルスが患者リンパ球に感染し、形態的に
大きな、リンパ芽球となった細胞を得た。
【００５３】（ｂ） アンチセンスオリゴＤＮＡの導入 上記により得られたリンパ芽球細胞株の細胞培養液を遠
心し、細胞成分のみに分離した。そして、配列表におい
て配列番号２で示した塩基配列に相補的な配列よりなる
31塩基のアンチセンスオリゴＤＮＡを約200ｎＭ（200pm
oles/ml）と２％胎仔牛血清（ＦＢＳ）を含む維持培地
で、この細胞を36℃にて５時間培養した。次いで血清培
地に交換した後に、引き続き12時間培養した。培養終了
後に、常法により細胞を集めて全ＲＮＡを抽出した。
心し、細胞成分のみに分離した。そして、配列表におい
て配列番号２で示した塩基配列に相補的な配列よりなる
31塩基のアンチセンスオリゴＤＮＡを約200ｎＭ（200pm
oles/ml）と２％胎仔牛血清（ＦＢＳ）を含む維持培地
で、この細胞を36℃にて５時間培養した。次いで血清培
地に交換した後に、引き続き12時間培養した。培養終了
後に、常法により細胞を集めて全ＲＮＡを抽出した。
【００５４】（ｃ） ジストロフィンｃＤＮＡの解析 得られた全ＲＮＡを基質とし、ヘキサオリゴヌクレオチ
ドからなるランダムオリゴヌクレオチドをプライマーと
して、常法に従い逆転写酵素の作用によりｃＤＮＡを合
成した。合成したｃＤＮＡよりジストロフィンのエクソ
ン18から21にわたる領域をnested ＰＣＲ法を用いて増
幅した。まず、プライマーをエクソン18と21にデザイン
したもので１回増幅した。この増幅産物をテンプレート
として、１回目に用いたプライマーの内側に位置する領
域にマッチするプライマーをデザインして２回目のＰＣ
Ｒ増幅を行った。この増幅は、アニーリング温度を60℃
に設定して行った。
ドからなるランダムオリゴヌクレオチドをプライマーと
して、常法に従い逆転写酵素の作用によりｃＤＮＡを合
成した。合成したｃＤＮＡよりジストロフィンのエクソ
ン18から21にわたる領域をnested ＰＣＲ法を用いて増
幅した。まず、プライマーをエクソン18と21にデザイン
したもので１回増幅した。この増幅産物をテンプレート
として、１回目に用いたプライマーの内側に位置する領
域にマッチするプライマーをデザインして２回目のＰＣ
Ｒ増幅を行った。この増幅は、アニーリング温度を60℃
に設定して行った。
【００５５】（ｄ） エクソン１９のスキッピングの確
認 こうして、ジストロフィンｃＤＮＡのエクソン18〜21の
領域を増幅したところ、アンチセンスの無添加では384
塩基対のきれいなバンドが得られた。この増幅産物の塩
基配列を常法により決定したところ、これがエクソン1
8、19、21からなることが示された。これは患者の遺伝
子解析結果とよく一致していた。
認 こうして、ジストロフィンｃＤＮＡのエクソン18〜21の
領域を増幅したところ、アンチセンスの無添加では384
塩基対のきれいなバンドが得られた。この増幅産物の塩
基配列を常法により決定したところ、これがエクソン1
8、19、21からなることが示された。これは患者の遺伝
子解析結果とよく一致していた。
【００５６】一方、アンチセンスオリゴＤＮＡ添加細胞
のｃＤＮＡでは、アンチセンスオリゴＤＮＡを導入しな
い細胞から得られた産物と同じサイズの増幅産物が得ら
れたのみならず、培養４日目から小さなサイズの、アミ
ノ酸読み取り枠の維持された産物が得られた。また、症
例２より確立したリンパ芽球細胞でも、同様の処理によ
り２種類のバンドが得られた。これらのうち小さなサイ
ズの増幅産物の塩基配列を決定したところ、エクソン18
の配列が直接エクソン21の配列につながっており、エク
ソン19と20とは欠失していることが判明した。このこと
は、アンチセンス処理によりエクソン19がスキッピング
したことを示している。一方、正常者から確立したリン
パ芽球細胞では、この条件で小さなサイズの転写物、す
なわちエクソン19のスキッピングを有するもののみが得
られた。また、ジストロフィンｃＤＮＡの全領域を10抗
体に分けて増幅して調べたが、スプライシングの異常を
示す断片は得られなかった。
のｃＤＮＡでは、アンチセンスオリゴＤＮＡを導入しな
い細胞から得られた産物と同じサイズの増幅産物が得ら
れたのみならず、培養４日目から小さなサイズの、アミ
ノ酸読み取り枠の維持された産物が得られた。また、症
例２より確立したリンパ芽球細胞でも、同様の処理によ
り２種類のバンドが得られた。これらのうち小さなサイ
ズの増幅産物の塩基配列を決定したところ、エクソン18
の配列が直接エクソン21の配列につながっており、エク
ソン19と20とは欠失していることが判明した。このこと
は、アンチセンス処理によりエクソン19がスキッピング
したことを示している。一方、正常者から確立したリン
パ芽球細胞では、この条件で小さなサイズの転写物、す
なわちエクソン19のスキッピングを有するもののみが得
られた。また、ジストロフィンｃＤＮＡの全領域を10抗
体に分けて増幅して調べたが、スプライシングの異常を
示す断片は得られなかった。
【００５７】（ｅ） 考 察 このアンチセンスオリゴヌクレオチドのエクソンスキッ
ピング誘導効果が正常とＤＭＤ患者で異なっている原因
は、エクソン19近辺のｍＲＮＡ前駆体の２次構造あるい
は３次構造の差に由来するものと考えられた。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの濃度を変えることにより、更
にＤＭＤ患者におけるエクソンスキッピング誘導効率を
調べた。しかし、正常患者由来細胞で見られたような、
全ての転写産物がエクソンスキッピングを示すような条
件は得られなかった。なお、このアンチセンス誘導は、
センスオリゴヌクレオチドでも、また他の領域に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチドでも、見られなかっ
た。
ピング誘導効果が正常とＤＭＤ患者で異なっている原因
は、エクソン19近辺のｍＲＮＡ前駆体の２次構造あるい
は３次構造の差に由来するものと考えられた。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの濃度を変えることにより、更
にＤＭＤ患者におけるエクソンスキッピング誘導効率を
調べた。しかし、正常患者由来細胞で見られたような、
全ての転写産物がエクソンスキッピングを示すような条
件は得られなかった。なお、このアンチセンス誘導は、
センスオリゴヌクレオチドでも、また他の領域に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチドでも、見られなかっ
た。
【００５８】これらの結果は、ジストロフィンｍＲＮＡ
前駆体のスプライシングを制御することによりエクソン
のスキッピングを誘導し、その結果アミノ酸読みとり枠
の修正ができることを示している。しかし、筋細胞にお
いてもこうしたｍＲＮＡの修正でアミノ酸読み取り枠が
維持できるようになったｍＲＮＡが有効にタンパク質を
合成できるか否かは依然として不明であった。
前駆体のスプライシングを制御することによりエクソン
のスキッピングを誘導し、その結果アミノ酸読みとり枠
の修正ができることを示している。しかし、筋細胞にお
いてもこうしたｍＲＮＡの修正でアミノ酸読み取り枠が
維持できるようになったｍＲＮＡが有効にタンパク質を
合成できるか否かは依然として不明であった。
【００５９】２． ＤＭＤ患者由来筋細胞におけるジス
トロフィン近似タンパク質の発現 そこで、次に、エクソン20の欠失したＤＭＤ患者の筋芽
細胞を用いて、ジストロフィン近似のタンパク質が発現
するか否かにつき検討した。
トロフィン近似タンパク質の発現 そこで、次に、エクソン20の欠失したＤＭＤ患者の筋芽
細胞を用いて、ジストロフィン近似のタンパク質が発現
するか否かにつき検討した。
【００６０】（ａ）ＤＭＤ患者由来筋細胞株の樹立 ジストロフィン遺伝子のエクソン20を欠失した患者よ
り、無菌的に筋組織を取り出し、細切した後、トリプシ
ンにて遊離細胞を得た。これを洗浄した後、生育培地
（Growth medium: 20％ FCS、0.5％ chicken胚抽出物を
補充したHam-F10）中にて培養した。継代に際し細胞培
養用のシャーレの中にカバーグラスをおき、その上で筋
細胞の培養を行った。筋芽細胞の割合が80％程度になる
まで増殖したとき、培養液をFusion培地（２％ＨＳを補
充したDMEM）に交換して分化を誘導し、筋細胞とした。
り、無菌的に筋組織を取り出し、細切した後、トリプシ
ンにて遊離細胞を得た。これを洗浄した後、生育培地
（Growth medium: 20％ FCS、0.5％ chicken胚抽出物を
補充したHam-F10）中にて培養した。継代に際し細胞培
養用のシャーレの中にカバーグラスをおき、その上で筋
細胞の培養を行った。筋芽細胞の割合が80％程度になる
まで増殖したとき、培養液をFusion培地（２％ＨＳを補
充したDMEM）に交換して分化を誘導し、筋細胞とした。
【００６１】（ｂ）アンチセンスオリゴＤＮＡの導入 分化誘導して４日目に、アンチセンスオリゴＤＮＡ（20
0 pmol）をリポフェクタミン（６μｌ）によって細胞内
に導入し、更に３、７、及び10日間培養した。
0 pmol）をリポフェクタミン（６μｌ）によって細胞内
に導入し、更に３、７、及び10日間培養した。
【００６２】（ｃ）ジストロフィン免疫染色 上記培養後のそれぞれの細胞につき、ジストロフィンの
Ｃ末端に対する抗体を用いたジストロフィン免疫染色を
行った。その結果、当初全くジストロフィンの染色のな
かった細胞で、ジストロフィンが染色されるようになっ
た。何れにおいても、ジストロフィン陽性細胞が確認さ
れた。また、ジストロフィンのＮ末端領域を認識する抗
体を用いてもＣ末端領域の染色と同様な染色結果が得ら
れ、この産生されたジストロフィンがＮ末端からＣ末端
に及ぶものであることが確認された。
Ｃ末端に対する抗体を用いたジストロフィン免疫染色を
行った。その結果、当初全くジストロフィンの染色のな
かった細胞で、ジストロフィンが染色されるようになっ
た。何れにおいても、ジストロフィン陽性細胞が確認さ
れた。また、ジストロフィンのＮ末端領域を認識する抗
体を用いてもＣ末端領域の染色と同様な染色結果が得ら
れ、この産生されたジストロフィンがＮ末端からＣ末端
に及ぶものであることが確認された。
【００６３】このように、アンチセンスオリゴＤＮＡを
添加した筋芽細胞には、ジストロフィンの染色が認めら
れたのに対し、同様の方法でアンチセンスオリゴＤＮＡ
無添加の筋芽細胞を検討したところでは、ジストロフィ
ンの染色は全く認められていない。
添加した筋芽細胞には、ジストロフィンの染色が認めら
れたのに対し、同様の方法でアンチセンスオリゴＤＮＡ
無添加の筋芽細胞を検討したところでは、ジストロフィ
ンの染色は全く認められていない。
【００６４】（ｄ）ジストロフィンｃＤＮＡの解析 続いて、上記アンチセンスオリゴＤＮＡ添加培養筋芽細
胞から、常法によりＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡ
よりｃＤＮＡを合成し、リンパ芽球細胞からのＲＮＡに
ついて上記したのと同様にして、ジストロフィンのエク
ソン18〜21の領域を増幅した。
胞から、常法によりＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡ
よりｃＤＮＡを合成し、リンパ芽球細胞からのＲＮＡに
ついて上記したのと同様にして、ジストロフィンのエク
ソン18〜21の領域を増幅した。
【００６５】得られた増幅産物につき、常法により塩基
配列決定した。その結果、培養４日目から、エクソン18
の塩基配列がエクソン21の塩基配列に直接つながってア
ミノ酸読み取り枠がインフレームとなった増幅産物が得
られた。
配列決定した。その結果、培養４日目から、エクソン18
の塩基配列がエクソン21の塩基配列に直接つながってア
ミノ酸読み取り枠がインフレームとなった増幅産物が得
られた。
【００６６】次いで、アンチセンスオリゴＤＮＡ添加培
養筋芽細胞から作成したｃＤＮＡにつき、その全領域を
１０個の部分に分けてＰＣＲ法により増幅し、増幅産物
として得られた各断片のサイズを常法により電気泳動し
て検討した。その結果、エクソン19及び20のスキッピン
グ以外、スプライシングの異常を示唆するような断片は
認めらなかった。これらの結果は、得られたジストロフ
ィン成熟ｍＲＮＡが、エクソン19とエクソン20とを完全
欠失していること以外は、読みとり枠の維持された完全
長のｍＲＮＡであることを示すものである。
養筋芽細胞から作成したｃＤＮＡにつき、その全領域を
１０個の部分に分けてＰＣＲ法により増幅し、増幅産物
として得られた各断片のサイズを常法により電気泳動し
て検討した。その結果、エクソン19及び20のスキッピン
グ以外、スプライシングの異常を示唆するような断片は
認めらなかった。これらの結果は、得られたジストロフ
ィン成熟ｍＲＮＡが、エクソン19とエクソン20とを完全
欠失していること以外は、読みとり枠の維持された完全
長のｍＲＮＡであることを示すものである。
【００６７】３． アンチセンスオリゴＤＮＡの核内へ
の移行 次いで、アンチセンスオリゴＤＮＡが実際に核内に移行
して作用していることの裏付けを得るために、蛍光標識
したアンチセンスオリゴＤＮＡを用いて、その核内への
移行の様子を観察した。
の移行 次いで、アンチセンスオリゴＤＮＡが実際に核内に移行
して作用していることの裏付けを得るために、蛍光標識
したアンチセンスオリゴＤＮＡを用いて、その核内への
移行の様子を観察した。
【００６８】上で用いたアンチセンスオリゴＤＮＡを常
法によりＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネー
ト）標識して、アンチセンスオリゴＤＮＡの核内への移
行について検討した。すなわち、ＤＭＤ患者から採取し
た筋細胞を生育培地（Growth medium: 20％ FCS、0.5％
chicken胚抽出物を補充したHam-F10）中にて培養し
た。培養は、細胞培養用のシャーレ内においたカバーグ
ラス上で行い、細胞がセミコンフルエントになったとき
Fusion培地（２％ＨＳを補充したDMEM）に置換して分化
を誘導し、筋細胞とした。分化誘導して４日目にＦＩＴ
Ｃ標識したアンチセンスオリゴＤＮＡ（200 pmol）をリ
ポフェクタン（６μｌ）によって細胞内に導入し、１、
２、３、７及び10日後に蛍光顕微鏡にてＦＩＴＣの局在
を確認した。
法によりＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネー
ト）標識して、アンチセンスオリゴＤＮＡの核内への移
行について検討した。すなわち、ＤＭＤ患者から採取し
た筋細胞を生育培地（Growth medium: 20％ FCS、0.5％
chicken胚抽出物を補充したHam-F10）中にて培養し
た。培養は、細胞培養用のシャーレ内においたカバーグ
ラス上で行い、細胞がセミコンフルエントになったとき
Fusion培地（２％ＨＳを補充したDMEM）に置換して分化
を誘導し、筋細胞とした。分化誘導して４日目にＦＩＴ
Ｃ標識したアンチセンスオリゴＤＮＡ（200 pmol）をリ
ポフェクタン（６μｌ）によって細胞内に導入し、１、
２、３、７及び10日後に蛍光顕微鏡にてＦＩＴＣの局在
を確認した。
【００６９】その結果、核に一致して蛍光シグナルが検
出された。このことは、アンチセンスオリゴＤＮＡが実
際に核内に移行してエクソン19のスプライシングをスキ
ップさせたことを裏付けるものである。
出された。このことは、アンチセンスオリゴＤＮＡが実
際に核内に移行してエクソン19のスプライシングをスキ
ップさせたことを裏付けるものである。
【００７０】以上の試験結果が示すように、本発明によ
り、ＤＭＤ患者の筋芽細胞において、アミノ酸読み取り
枠をインフレームへと転換させることによって、ジスト
ロフィンに対応するタンパク質を合成させることができ
る。これは、従来極めて重篤な不治の疾患であったＤＭ
Ｄにおいて、特にエクソン20の単独欠失を有する患者
を、比較的穏やかなＢＭＤへと転換させる可能性を示す
ものである。
り、ＤＭＤ患者の筋芽細胞において、アミノ酸読み取り
枠をインフレームへと転換させることによって、ジスト
ロフィンに対応するタンパク質を合成させることができ
る。これは、従来極めて重篤な不治の疾患であったＤＭ
Ｄにおいて、特にエクソン20の単独欠失を有する患者
を、比較的穏やかなＢＭＤへと転換させる可能性を示す
ものである。
【００７１】本発明において、アンチセンスオリゴヌク
レオチドとしては、オリゴＤＮＡ又はホスホロチオエー
トオリゴＲＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡを用
いることができる。ここに、ホスホロチオエートヌクレ
オチドは、リン酸基の酸素原子がイオウ原子で置換され
たヌクレオチドであり、各種の核酸分解酵素に対して耐
性があること等から、部位特異的な遺伝子の置換その他
で遺伝子工学の分野において汎用されているヌクレオチ
ド類似体であり、その製法及び性質、及び種々の用途は
当業者に周知である。アンチセンスホスホロチオエート
オリゴＤＮＡはアンチセンスＤＮＡよりも安定性が高い
ため、本発明において使用するのに特に有利である。
レオチドとしては、オリゴＤＮＡ又はホスホロチオエー
トオリゴＲＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡを用
いることができる。ここに、ホスホロチオエートヌクレ
オチドは、リン酸基の酸素原子がイオウ原子で置換され
たヌクレオチドであり、各種の核酸分解酵素に対して耐
性があること等から、部位特異的な遺伝子の置換その他
で遺伝子工学の分野において汎用されているヌクレオチ
ド類似体であり、その製法及び性質、及び種々の用途は
当業者に周知である。アンチセンスホスホロチオエート
オリゴＤＮＡはアンチセンスＤＮＡよりも安定性が高い
ため、本発明において使用するのに特に有利である。
【００７２】エクソン20の単独欠失を有するＤＭＤ患者
への本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与
は、例えば次の通りに行うことができる。すなわち、配
列表において配列番号２に示された塩基配列に対して相
補的な塩基配列よりなるアンチセンスオリゴＤＮＡ、ア
ンチセンスホスホロチオエートオリゴＤＮＡ又はアンチ
センスホスホロチオエートオリゴＲＮＡを当業者に周知
の方法で製造し、これを常法により滅菌処理し、例えば
1200μｇ／ｍｌの注射用溶液を調製する。この溶液を、
患者静脈内にアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量
が体重１ｋｇ当たり例えば20ｍｇとなるように、例えば
輸液の形で点滴投与する。投与は、例えば２週間の間隔
で４回繰り返し、その後も、筋生検組織におけるジスト
ロフィンタンパク質の発現、血清クレアチンキナーゼ
値、臨床症状を指標とした治療効果の確認をしながら、
適宜この治療を繰り返す。治療効果があり明らかな副作
用が見られない限り、治療を継続し、原則として生涯投
与が行われる。
への本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与
は、例えば次の通りに行うことができる。すなわち、配
列表において配列番号２に示された塩基配列に対して相
補的な塩基配列よりなるアンチセンスオリゴＤＮＡ、ア
ンチセンスホスホロチオエートオリゴＤＮＡ又はアンチ
センスホスホロチオエートオリゴＲＮＡを当業者に周知
の方法で製造し、これを常法により滅菌処理し、例えば
1200μｇ／ｍｌの注射用溶液を調製する。この溶液を、
患者静脈内にアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量
が体重１ｋｇ当たり例えば20ｍｇとなるように、例えば
輸液の形で点滴投与する。投与は、例えば２週間の間隔
で４回繰り返し、その後も、筋生検組織におけるジスト
ロフィンタンパク質の発現、血清クレアチンキナーゼ
値、臨床症状を指標とした治療効果の確認をしながら、
適宜この治療を繰り返す。治療効果があり明らかな副作
用が見られない限り、治療を継続し、原則として生涯投
与が行われる。
【００７３】以下、代表的な実施例を挙げて本発明を更
に具体的に説明するが、本発明が該実施例に限定される
ことは意図しない。
に具体的に説明するが、本発明が該実施例に限定される
ことは意図しない。
【００７４】
【実施例】１． アンチセンスオリゴＤＮＡ、ホスホロ
チオエートオリゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＲ
ＮＡの調製 配列表において配列番号２で示されたヌクレオチド配列
に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、ホスホロ
チオエートオリゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＲ
ＮＡの製造は、Applied Biosystems Model 1380B等のよ
うな市販のＤＮＡ合成装置を用いて、また、Zon et a
l., 「Oligonucleotides and Analogues」：A Practica
l Approach, F. Eckstein, Ed., p. 87-108, Oxford Un
iversity Press, Oxford, England、米国特許第5,151,5
10号に記載された方法を用いて、行うことができる。
チオエートオリゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＲ
ＮＡの調製 配列表において配列番号２で示されたヌクレオチド配列
に相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、ホスホロ
チオエートオリゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＲ
ＮＡの製造は、Applied Biosystems Model 1380B等のよ
うな市販のＤＮＡ合成装置を用いて、また、Zon et a
l., 「Oligonucleotides and Analogues」：A Practica
l Approach, F. Eckstein, Ed., p. 87-108, Oxford Un
iversity Press, Oxford, England、米国特許第5,151,5
10号に記載された方法を用いて、行うことができる。
【００７５】＜製剤実施例１＞下記の処方に従って必要
量の基剤成分を混合して溶解し、これにアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを溶解させ、所定液量とし、ポアサイ
ズ0.22μｍのメンブランフィルターにより濾過して、静
脈内投与用製剤とする。 アンチセンスオリゴヌクレオチド（注１）・・・500ｍｇ 塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.6ｇ 塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3ｇ 塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33ｇ 注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・全量 1000ｍｌ 注１： 配列表の配列番号２に示された塩基配列に対して相補的な塩基配列を有 するホスホロチオエートオリゴＤＮＡ
量の基剤成分を混合して溶解し、これにアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを溶解させ、所定液量とし、ポアサイ
ズ0.22μｍのメンブランフィルターにより濾過して、静
脈内投与用製剤とする。 アンチセンスオリゴヌクレオチド（注１）・・・500ｍｇ 塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.6ｇ 塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3ｇ 塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33ｇ 注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・全量 1000ｍｌ 注１： 配列表の配列番号２に示された塩基配列に対して相補的な塩基配列を有 するホスホロチオエートオリゴＤＮＡ
【００７６】＜製剤実施例２＞下記の処方に従って必要
量の基剤成分を混合して溶解し、これにアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを溶解させ、所定液量とし、ポアサイ
ズ15ｎｍのフィルター（PLANOVE 15：旭化成）により濾
過して、静脈内投与用製剤とする。 アンチセンスオリゴヌクレオチド（注２）・・・100ｍｇ 塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.3ｇ 塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3ｇ 塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33ｇ リン酸水素ナトリウム・12水塩・・・・・・・・1.8ｇ １Ｎ塩酸・・・・・・・・・・・・・適量（ｐＨ7.4） 注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・全量 1000ｍｌ 注２： 配列表の配列番号２に示された塩基配列に対して相補的な塩基配列を有 するホスホロチオエートオリゴＤＮＡ
量の基剤成分を混合して溶解し、これにアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを溶解させ、所定液量とし、ポアサイ
ズ15ｎｍのフィルター（PLANOVE 15：旭化成）により濾
過して、静脈内投与用製剤とする。 アンチセンスオリゴヌクレオチド（注２）・・・100ｍｇ 塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.3ｇ 塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3ｇ 塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33ｇ リン酸水素ナトリウム・12水塩・・・・・・・・1.8ｇ １Ｎ塩酸・・・・・・・・・・・・・適量（ｐＨ7.4） 注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・全量 1000ｍｌ 注２： 配列表の配列番号２に示された塩基配列に対して相補的な塩基配列を有 するホスホロチオエートオリゴＤＮＡ
【００７７】＜製剤実施例３＞下記の処方に従って必要
量の基剤成分を混合して溶解し、これにアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを溶解させ、所定液量とし、ポアサイ
ズ35ｎｍのフィルター（PLANOVE 35：旭化成）により濾
過して、静脈内投与用製剤とする。 アンチセンスオリゴヌクレオチド（注３）・・・100ｍｇ 塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.3ｇ 塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3ｇ 塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33ｇ グルコース・・・・・・・・・・・・・・・・・0.4ｇ リン酸水素ナトリウム・12水塩・・・・・・・・1.8ｇ １Ｎ塩酸・・・・・・・・・・・・・適量（ｐＨ7.4） 注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・全量 1000ｍｌ 注３： 配列表の配列番号２に示された塩基配列に対して相補的な塩基配列を有 するホスホロチオエートオリゴＤＮＡ
量の基剤成分を混合して溶解し、これにアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを溶解させ、所定液量とし、ポアサイ
ズ35ｎｍのフィルター（PLANOVE 35：旭化成）により濾
過して、静脈内投与用製剤とする。 アンチセンスオリゴヌクレオチド（注３）・・・100ｍｇ 塩化ナトリウム・・・・・・・・・・・・・・・8.3ｇ 塩化カリウム・・・・・・・・・・・・・・・・0.3ｇ 塩化カルシウム・・・・・・・・・・・・・・・0.33ｇ グルコース・・・・・・・・・・・・・・・・・0.4ｇ リン酸水素ナトリウム・12水塩・・・・・・・・1.8ｇ １Ｎ塩酸・・・・・・・・・・・・・適量（ｐＨ7.4） 注射用蒸留水・・・・・・・・・・・・・全量 1000ｍｌ 注３： 配列表の配列番号２に示された塩基配列に対して相補的な塩基配列を有 するホスホロチオエートオリゴＤＮＡ
【００７８】
【配列表】 Sequence Listing <110> JCR Pharmaceuticals Co., Ltd. <120> Pharmaceutical Composition for Treatment of Duchenne Muscular Dyst rophy <130> P55-99 <160> 2 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 1 gcaagatgcc agcaga 16 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 2 aactgcaaga tgccagcaga tcagctcagg c 31
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA01 GA11 GA13 HA17 4C084 AA13 AA27 ZA942 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA02 MA04 MA05 ZA94
Claims (18)
- 【請求項１】ジストロフィンの成熟ｍＲＮＡの産生にお
けるエクソン20の完全欠損を伴うデュシェンヌ型筋ジス
トロフィーの治療剤の製造のための、ジストロフィンの
前駆体ｍＲＮＡのエクソン19に対する20〜50塩基の配列
よりなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。 - 【請求項２】該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配
列表において配列番号１で示した塩基配列に相補的な塩
基配列を含むものである、請求項１の使用。 - 【請求項３】該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、オ
リゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡ又はホス
ホロチオエートオリゴＲＮＡである、請求項１又は２の
使用。 - 【請求項４】該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配
列表において配列番号２で示した塩基配列に相補的な塩
基配列を有するオリゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリ
ゴＤＮＡ又はホスホロチオエートオリゴＲＮＡである、
請求項１の使用 - 【請求項５】薬剤学的に許容し得る注射可能な媒質中
に、ジストロフィンの前駆体ｍＲＮＡのエクソン19に対
する20〜50塩基の配列よりなるアンチセンスオリゴヌク
レオチドを含有することを特徴とする、ジストロフィン
の成熟ｍＲＮＡの産生に際したエクソン20の完全欠損を
伴うデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療剤。 - 【請求項６】該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配
列表において配列番号１で示した塩基配列に相補的な塩
基配列を含むものである、請求項５の治療剤。 - 【請求項７】該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、オ
リゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡ又はホス
ホロチオエートオリゴＲＮＡである、請求項５又は６の
治療剤。 - 【請求項８】該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配
列表において配列番号２で示した塩基配列に相補的な塩
基配列を有するオリゴＤＮＡ、ホスホロチオエートオリ
ゴＤＮＡ又はホスホロチオエートオリゴＲＮＡである、
請求項５の治療剤。 - 【請求項９】0.05〜５μmoles／ｍｌの該アンチセンス
オリゴヌクレオチド、0.02〜10％ｗ／ｖの炭水化物又は
多価アルコール及び0.01〜0.4％ｗ／ｖの薬剤学的に許
容し得る界面活性剤を含有する、請求項５ないし８の何
れかの治療剤。 - 【請求項１０】0.03〜0.09Ｍの薬剤学的に許容し得る中
性塩を含有する、請求項５ないし９の何れかの治療剤。 - 【請求項１１】該中性塩が塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、及び塩化カルシウムよりなる群より選ばれるもので
ある、請求項１０の治療剤。 - 【請求項１２】0.002〜0.05Ｍの薬剤学的に許容し得る
緩衝剤を含有する、請求項５ないし１１の何れかの治療
剤。 - 【請求項１３】該緩衝剤が、クエン酸ナトリウム、ナト
リウムグリシネート、リン酸ナトリウム、トリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタンよりなる群より選ばれるも
のである、請求項１２の治療剤。 - 【請求項１４】該炭水化物が単糖類及び２糖類よりなる
群より選ばれるものである、請求項９ないし１３の何れ
かの治療剤。 - 【請求項１５】該炭水化物又は多価アルコールが、グル
コース、ガラクトース、マンノース、ラクトース、マル
トース、マンニトール及びソルビトールよりなる群より
選ばれるものである、請求項９ないし１３の何れかの治
療剤。 - 【請求項１６】該界面活性剤が、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノ〜トリ−エステル、アルキルフェニルポリ
オキシエチレン、ナトリウムタウロコラート、ナトリウ
ムコラート、及び多価アルコールエステルである、請求
項９ないし１５の治療剤。 - 【請求項１７】該ポリオキシエチレンソルビタンエステ
ルが、オレエート、ラウレート、ステアレート及びパル
ミテートよりなる群より選ばれるエステルである、請求
項１５の治療剤。 - 【請求項１８】凍結乾燥された状態の、請求項９ないし
１７の何れかの治療剤。
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Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6653467B1 (en) | 2000-04-26 | 2003-11-25 | Jcr Pharmaceutical Co., Ltd. | Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy |
| US6727355B2 (en) | 2000-08-25 | 2004-04-27 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy |
| JPWO2004048570A1 (ja) * | 2002-11-25 | 2006-03-23 | 雅文 松尾 | ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬 |
| JP2006523101A (ja) | 2003-03-21 | 2006-10-12 | アカデミス ツィーケンホイス ライデン | ＲＮＡ二次構造の干渉による、ｍＲＮＡ前駆体におけるエクソン認識の調節 |
| JP2009515523A (ja) * | 2005-11-10 | 2009-04-16 | サンタリス ファーマ アー／エス | Ｔｎｆスーパーファミリー受容体に対するスプライス切替オリゴマーならびに疾病治療における該オリゴマーの使用 |
| US9018368B2 (en) | 2004-06-28 | 2015-04-28 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US9217148B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-12-22 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy |
| US9228187B2 (en) | 2009-11-12 | 2016-01-05 | The University Of Western Australia | Antisense molecules and methods for treating pathologies |
| US9234198B1 (en) | 2008-10-24 | 2016-01-12 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Multiple exon skipping compositions for DMD |
| US9506058B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-11-29 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Compositions for treating muscular dystrophy |
| US10385092B2 (en) | 2010-09-01 | 2019-08-20 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Antisense nucleic acids |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000325085A (ja) | 1999-05-21 | 2000-11-28 | Masafumi Matsuo | デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤 |
| WO2001083740A2 (en) | 2000-05-04 | 2001-11-08 | Avi Biopharma, Inc. | Splice-region antisense composition and method |
| EP1191097A1 (en) | 2000-09-21 | 2002-03-27 | Leids Universitair Medisch Centrum | Induction of exon skipping in eukaryotic cells |
| USRE48960E1 (en) | 2004-06-28 | 2022-03-08 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| FR2874384B1 (fr) | 2004-08-17 | 2010-07-30 | Genethon | Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables |
| US20090312532A1 (en) * | 2005-04-22 | 2009-12-17 | Van Deutekom Judith Christina | Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the binding of sr proteins and by interfering with secodary rna structure |
| US20070017138A1 (en) * | 2005-04-25 | 2007-01-25 | Young Kevin D | Weapon grip assist |
| WO2007123391A1 (en) | 2006-04-20 | 2007-11-01 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene. |
| EP1857548A1 (en) | 2006-05-19 | 2007-11-21 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Means and method for inducing exon-skipping |
| JP6047270B2 (ja) | 2006-08-11 | 2016-12-21 | バイオマリン テクノロジーズ ベー．フェー． | Ｄｎａリピートの不安定性に関連した遺伝的障害を治療するための方法及び手段 |
| CN103212085A (zh) | 2007-07-12 | 2013-07-24 | 普罗森那技术公司 | 用于使化合物靶向多种选定器官或组织的分子 |
| CA2693742A1 (en) | 2007-07-12 | 2009-01-15 | Prosensa Technologies B.V. | Molecules for targeting compounds to various selected organs, tissues or tumor cells |
| USRE48468E1 (en) | 2007-10-26 | 2021-03-16 | Biomarin Technologies B.V. | Means and methods for counteracting muscle disorders |
| EP2203173B1 (en) | 2007-10-26 | 2015-12-23 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Means and methods for counteracting muscle disorders |
| WO2009099326A1 (en) | 2008-02-08 | 2009-08-13 | Prosensa Holding Bv | Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders |
| EP2119783A1 (en) | 2008-05-14 | 2009-11-18 | Prosensa Technologies B.V. | Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means |
| EP2421971B1 (en) | 2009-04-24 | 2016-07-06 | BioMarin Technologies B.V. | Oligonucleotide comprising an inosine for treating dmd |
| EP2516647B1 (en) | 2009-12-24 | 2016-12-14 | BioMarin Technologies B.V. | Molecule for treating an inflammatory disorder |
| BR112012020257A8 (pt) | 2010-02-11 | 2018-02-14 | Recombinetics Inc | métodos e aparelhos para produzir artiodátilos transgênicos |
| AU2011325956B2 (en) | 2010-11-12 | 2016-07-14 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding RNAs |
| US9920317B2 (en) | 2010-11-12 | 2018-03-20 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding RNAs |
| US10920242B2 (en) | 2011-02-25 | 2021-02-16 | Recombinetics, Inc. | Non-meiotic allele introgression |
| CN118581086A (zh) | 2012-01-27 | 2024-09-03 | 比奥马林技术公司 | 用于治疗杜兴型肌营养不良症和贝克型肌营养不良症的具有改善特性的rna调节性寡核苷酸 |
| PL2900686T3 (pl) | 2012-09-28 | 2021-01-25 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Wektory aav ukierunkowane na oligodendrocyty |
| US10858650B2 (en) | 2014-10-30 | 2020-12-08 | The General Hospital Corporation | Methods for modulating ATRX-dependent gene repression |
| EP4344741A3 (en) | 2014-11-21 | 2024-08-28 | The University of North Carolina at Chapel Hill | Aav vectors targeted to the central nervous system |
| WO2016127057A1 (en) | 2015-02-06 | 2016-08-11 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Optimized human clotting factor viii gene expression cassettes and their use |
| WO2016149455A2 (en) | 2015-03-17 | 2016-09-22 | The General Hospital Corporation | The rna interactome of polycomb repressive complex 1 (prc1) |
| HRP20201125T1 (hr) * | 2015-09-15 | 2020-10-30 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Antisens nukleinska kiselina |
| AU2017290231A1 (en) | 2016-06-30 | 2019-02-07 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Exon skipping oligomers for muscular dystrophy |
| EP3554552B1 (en) | 2016-12-19 | 2022-08-17 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy |
| LT3554553T (lt) | 2016-12-19 | 2022-08-25 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Egzoną šalinantys oligomero konjugatai nuo raumenų distrofojos |
| CN117298290A (zh) | 2016-12-19 | 2023-12-29 | 萨勒普塔医疗公司 | 用于肌肉萎缩症的外显子跳跃寡聚体缀合物 |
| EA201991450A1 (ru) | 2017-09-22 | 2019-12-30 | Сарепта Терапьютикс, Инк. | Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии |
| SG11202010841QA (en) * | 2018-05-11 | 2020-11-27 | Alpha Anomeric Sas | Oligonucleotides conjugates comprising 7'-5'-alpha-anomeric-bicyclic sugar nucleosides |
| US10758629B2 (en) | 2018-05-29 | 2020-09-01 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy |
| US12410441B2 (en) | 2018-06-12 | 2025-09-09 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Synthetic liver-tropic adeno-associated virus capsids and uses thereof |
| MX2022013819A (es) | 2020-05-05 | 2023-01-30 | Univ North Carolina Chapel Hill | Capsides de virus adeno-asociado 5 modificado y usos del mismo. |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5151520A (en) | 1985-11-20 | 1992-09-29 | The Mead Corporation | Cationic dye-triarylmonoalkylorate anion complexes |
| US5239060A (en) | 1986-07-25 | 1993-08-24 | The Children's Medical Center Corporation | Muscular dystrophy protein, dystrophin |
| US5151510A (en) | 1990-04-20 | 1992-09-29 | Applied Biosystems, Inc. | Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs |
| EP1897942A1 (en) | 1993-05-11 | 2008-03-12 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Antisense oligonucleotides which combat aberrant splicing and methods of using the same |
| JP2000125448A (ja) | 1998-10-14 | 2000-04-28 | Yazaki Corp | 電気接続箱 |
| US5948680A (en) | 1998-12-17 | 1999-09-07 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense inhibition of Elk-1 expression |
| JP2000325085A (ja) | 1999-05-21 | 2000-11-28 | Masafumi Matsuo | デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤 |
| JP3585769B2 (ja) | 1999-06-02 | 2004-11-04 | 三菱電機株式会社 | 零相変流器 |
-
1999
- 1999-05-21 JP JP11140930A patent/JP2000325085A/ja active Pending
-
2000
- 2000-05-18 EP EP00110231A patent/EP1054058A1/en not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-07-31 US US09/917,907 patent/US6653466B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (59)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6653467B1 (en) | 2000-04-26 | 2003-11-25 | Jcr Pharmaceutical Co., Ltd. | Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy |
| US6727355B2 (en) | 2000-08-25 | 2004-04-27 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy |
| JP2014110798A (ja) * | 2002-11-25 | 2014-06-19 | Masafumi Matsuo | ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬 |
| JPWO2004048570A1 (ja) * | 2002-11-25 | 2006-03-23 | 雅文 松尾 | ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬 |
| JP2010229132A (ja) * | 2002-11-25 | 2010-10-14 | Masafumi Matsuo | ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬 |
| US7902160B2 (en) | 2002-11-25 | 2011-03-08 | Masafumi Matsuo | ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor |
| JP2012135314A (ja) * | 2002-11-25 | 2012-07-19 | Masafumi Matsuo | ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬 |
| US8624019B2 (en) | 2002-11-25 | 2014-01-07 | Masafumi Matsuo | ENA nucleic acid drugs modifying splicing in mRNA precursor |
| US9243026B2 (en) | 2002-11-25 | 2016-01-26 | Daiichi Sankyo Company, Limited | ENA nucleic acid pharmaceuticals capable of modifying splicing of mRNA precursors |
| US9657050B2 (en) | 2002-11-25 | 2017-05-23 | Masafumi Matsuo | ENA nucleic acid pharmaceuticals capable of modifying splicing of mRNA precursors |
| US9657049B2 (en) | 2002-11-25 | 2017-05-23 | Masafumi Matsuo | ENA nucleic acid pharmaceuticals capable of modifying splicing of mRNA precursors |
| JP2016182122A (ja) * | 2002-11-25 | 2016-10-20 | 雅文 松尾 | ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬 |
| JP2015180208A (ja) * | 2002-11-25 | 2015-10-15 | 雅文 松尾 | ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬 |
| JP2006523101A (ja) | 2003-03-21 | 2006-10-12 | アカデミス ツィーケンホイス ライデン | ＲＮＡ二次構造の干渉による、ｍＲＮＡ前駆体におけるエクソン認識の調節 |
| JP2014138589A (ja) * | 2003-03-21 | 2014-07-31 | Academisch Ziekenhuis Leiden | ＲＮＡ二次構造の干渉による、ｍＲＮＡ前駆体におけるエクソン認識の調節 |
| USRE47691E1 (en) | 2004-06-28 | 2019-11-05 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| USRE47769E1 (en) | 2004-06-28 | 2019-12-17 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US10995337B2 (en) | 2004-06-28 | 2021-05-04 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US10968450B2 (en) | 2004-06-28 | 2021-04-06 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US9175286B2 (en) | 2004-06-28 | 2015-11-03 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US9249416B2 (en) | 2004-06-28 | 2016-02-02 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US9422555B2 (en) | 2004-06-28 | 2016-08-23 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US10781451B2 (en) | 2004-06-28 | 2020-09-22 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US9441229B2 (en) | 2004-06-28 | 2016-09-13 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US9447415B2 (en) | 2004-06-28 | 2016-09-20 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| USRE47751E1 (en) | 2004-06-28 | 2019-12-03 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US10421966B2 (en) | 2004-06-28 | 2019-09-24 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US10266827B2 (en) | 2004-06-28 | 2019-04-23 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US9035040B2 (en) | 2004-06-28 | 2015-05-19 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US10227590B2 (en) | 2004-06-28 | 2019-03-12 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US9605262B2 (en) | 2004-06-28 | 2017-03-28 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US9024007B2 (en) | 2004-06-28 | 2015-05-05 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US9018368B2 (en) | 2004-06-28 | 2015-04-28 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| US9994851B2 (en) | 2004-06-28 | 2018-06-12 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| JP2009515523A (ja) * | 2005-11-10 | 2009-04-16 | サンタリス ファーマ アー／エス | Ｔｎｆスーパーファミリー受容体に対するスプライス切替オリゴマーならびに疾病治療における該オリゴマーの使用 |
| US9447417B2 (en) | 2008-10-24 | 2016-09-20 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Multiple exon skipping compositions for DMD |
| US9453225B2 (en) | 2008-10-24 | 2016-09-27 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Multiple exon skipping compositions for DMD |
| US9234198B1 (en) | 2008-10-24 | 2016-01-12 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Multiple exon skipping compositions for DMD |
| US9434948B2 (en) | 2008-10-24 | 2016-09-06 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Multiple exon skipping compositions for DMD |
| US9447416B2 (en) | 2008-10-24 | 2016-09-20 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Multiple exon skipping compositions for DMD |
| US11447776B2 (en) | 2009-11-12 | 2022-09-20 | The University Of Western Australia | Antisense molecules and methods for treating pathologies |
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