JP2000333696A - 糖化アミンの測定方法 - Google Patents
糖化アミンの測定方法Info
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- JP2000333696A JP2000333696A JP11146685A JP14668599A JP2000333696A JP 2000333696 A JP2000333696 A JP 2000333696A JP 11146685 A JP11146685 A JP 11146685A JP 14668599 A JP14668599 A JP 14668599A JP 2000333696 A JP2000333696 A JP 2000333696A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料中の糖化アミンを、高精度で測定できる
方法を提供する。 【解決手段】 糖化アミン酸化分解酵素により、前記糖
化アミンを糖とアミンとに酸化分解し、糖酸化分解酵素
により、前記糖を酸化分解し、前記両酸化分解反応によ
る同一生成物または同一消費物の量を測定し、この測定
値から前記糖化アミンの量を決定する。例えば、糖化ア
ミンが糖化タンパク質の場合、試料をプロテアーゼで分
解した後、これをフルクトシルアミノ酸オキシダーゼで
処理し、続いてグルコースオキシダーゼで処理する。そ
して、この溶液にペルオキシダーゼおよび発色性基質を
添加して、その発色を測定すれば、図１に示すように、
従来法よりも測定感度を向上することができる。
方法を提供する。 【解決手段】 糖化アミン酸化分解酵素により、前記糖
化アミンを糖とアミンとに酸化分解し、糖酸化分解酵素
により、前記糖を酸化分解し、前記両酸化分解反応によ
る同一生成物または同一消費物の量を測定し、この測定
値から前記糖化アミンの量を決定する。例えば、糖化ア
ミンが糖化タンパク質の場合、試料をプロテアーゼで分
解した後、これをフルクトシルアミノ酸オキシダーゼで
処理し、続いてグルコースオキシダーゼで処理する。そ
して、この溶液にペルオキシダーゼおよび発色性基質を
添加して、その発色を測定すれば、図１に示すように、
従来法よりも測定感度を向上することができる。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、試料中に存在する
糖化タンパク質、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸等の
糖化アミンの量を測定する方法に関する。
糖化タンパク質、糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸等の
糖化アミンの量を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血液中の糖化タンパク質、例えば、糖化
アルブミンや、赤血球中の糖化ヘモグロビン（以下、
「ＨｂＡ１ｃ」という）等は、生体内血糖値の過去の履
歴を反映しているため、糖尿病の診断や治療等における
重要な指標とされている。
アルブミンや、赤血球中の糖化ヘモグロビン（以下、
「ＨｂＡ１ｃ」という）等は、生体内血糖値の過去の履
歴を反映しているため、糖尿病の診断や治療等における
重要な指標とされている。
【０００３】このような糖化タンパク質の測定方法とし
ては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）法、ミニカラム法、免疫法、酵素法などがあげられ
る。この中でも、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
（ＦＡＯＤ）を用いた酵素法は、他の測定方法に比べ、
正確かつ迅速に糖化タンパク質を測定できる方法であ
る。
ては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）法、ミニカラム法、免疫法、酵素法などがあげられ
る。この中でも、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
（ＦＡＯＤ）を用いた酵素法は、他の測定方法に比べ、
正確かつ迅速に糖化タンパク質を測定できる方法であ
る。
【０００４】このＦＡＯＤを用いた糖化タンパク質の測
定方法は、例えば、ＦＡＯＤが作用し易いように糖化タ
ンパク質をプロテアーゼで処理し、この分解物である糖
化物にＦＡＯＤを作用させ、前記ＦＡＯＤの触媒反応に
より生成する過酸化水素量を測定し、その測定値から糖
化タンパク質の量及び糖化率を求める方法である。
定方法は、例えば、ＦＡＯＤが作用し易いように糖化タ
ンパク質をプロテアーゼで処理し、この分解物である糖
化物にＦＡＯＤを作用させ、前記ＦＡＯＤの触媒反応に
より生成する過酸化水素量を測定し、その測定値から糖
化タンパク質の量及び糖化率を求める方法である。
【０００５】しかし、前述の酵素法によると、低濃度の
糖化タンパク質、特にＨｂＡ１ｃを測定することが困難
であった。ＨｂＡ１ｃの測定のためには、赤血球の溶血
処理が必要であり、また、試薬の添加により試料は希釈
されるため、ＨｂＡ１ｃの濃度が検出限界に至ってしま
い、測定が困難になる場合があった。さらに、前記従来
法によるＨｂＡ１ｃの測定においては、例えば、試料間
におけるＨｂＡ１ｃの濃度値が０．１％しか変化しない
場合、生成される各々の過酸化水素量により前記濃度差
を検出するには、その精度に問題があった。
糖化タンパク質、特にＨｂＡ１ｃを測定することが困難
であった。ＨｂＡ１ｃの測定のためには、赤血球の溶血
処理が必要であり、また、試薬の添加により試料は希釈
されるため、ＨｂＡ１ｃの濃度が検出限界に至ってしま
い、測定が困難になる場合があった。さらに、前記従来
法によるＨｂＡ１ｃの測定においては、例えば、試料間
におけるＨｂＡ１ｃの濃度値が０．１％しか変化しない
場合、生成される各々の過酸化水素量により前記濃度差
を検出するには、その精度に問題があった。
【０００６】これらの問題は、以下に示すような原因に
よると推測される。糖化タンパク質は、通常、Ｎ末端の
α−アミノ基、ペプチド鎖中のリジン（Ｌｙｓ）側鎖
基、アルギニン（Ａｒｇ）側鎖基等に糖が付加してお
り、これらの糖化部分が前述のように測定される。特に
ＨｂＡ１ｃは、通常ヘモグロビン中に２個存在するβ鎖
のＮ末端バリン残基（α−アミノ基）が糖化されている
ことを特徴とするため、この糖化部分を測定することに
よりその量が求められる。実際にその量を数値で表す
と、通常、健常者の血液には、分子量約６５，０００の
ヘモグロビン（Ｈｂ）が約１３０ｇ／リットル（２ｍｍ
ｏｌ／リットル）含まれており、前記Ｈｂのうち４％
（８０μｍｏｌ／リットル）がＨｂＡ１ｃであり、前記
測定に関与する糖化部分を含むβ鎖の濃度は１６０μｍ
ｏｌ／リットルである。このβ鎖濃度が糖化部分（糖化
されたα−アミノ基）の濃度に相当する。これを測定す
る際には、試料を１００倍以上に希釈することが必要な
ため、非常に低濃度となる。
よると推測される。糖化タンパク質は、通常、Ｎ末端の
α−アミノ基、ペプチド鎖中のリジン（Ｌｙｓ）側鎖
基、アルギニン（Ａｒｇ）側鎖基等に糖が付加してお
り、これらの糖化部分が前述のように測定される。特に
ＨｂＡ１ｃは、通常ヘモグロビン中に２個存在するβ鎖
のＮ末端バリン残基（α−アミノ基）が糖化されている
ことを特徴とするため、この糖化部分を測定することに
よりその量が求められる。実際にその量を数値で表す
と、通常、健常者の血液には、分子量約６５，０００の
ヘモグロビン（Ｈｂ）が約１３０ｇ／リットル（２ｍｍ
ｏｌ／リットル）含まれており、前記Ｈｂのうち４％
（８０μｍｏｌ／リットル）がＨｂＡ１ｃであり、前記
測定に関与する糖化部分を含むβ鎖の濃度は１６０μｍ
ｏｌ／リットルである。このβ鎖濃度が糖化部分（糖化
されたα−アミノ基）の濃度に相当する。これを測定す
る際には、試料を１００倍以上に希釈することが必要な
ため、非常に低濃度となる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、糖化アミンの量や糖化率の検出限界を従来法よりも
低く設定でき、また、信頼性に優れる測定値を得ること
ができる糖化アミンの測定方法の提供である。
は、糖化アミンの量や糖化率の検出限界を従来法よりも
低く設定でき、また、信頼性に優れる測定値を得ること
ができる糖化アミンの測定方法の提供である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明の測定方法は、試料中の糖化アミンを測定す
る方法であって、糖化アミン酸化分解酵素により、前記
糖化アミンを糖とアミンとに酸化分解し、糖酸化分解酵
素により、前記糖を酸化分解し、前記両酸化分解反応に
よる同一生成物または同一消費物の量を測定して、この
測定値から前記糖化アミンの量を決定することを特徴と
する。
に、本発明の測定方法は、試料中の糖化アミンを測定す
る方法であって、糖化アミン酸化分解酵素により、前記
糖化アミンを糖とアミンとに酸化分解し、糖酸化分解酵
素により、前記糖を酸化分解し、前記両酸化分解反応に
よる同一生成物または同一消費物の量を測定して、この
測定値から前記糖化アミンの量を決定することを特徴と
する。
【０００９】このように、糖化アミン酸化分解酵素およ
び糖酸化分解酵素を併用すれば、１つの糖化部分に対
し、２つの同一生成物が生成され、また２つの同一消費
物が消費される。このため、本発明の測定方法は、従来
法に比べ、理論上２倍の検出感度を実現でき、より正確
に糖化アミンの測定を行うことができる。また、試料の
希釈倍率を上げても、検出可能な前記生成物濃度または
消費物濃度を保持することができるから、試料中の共存
物質の影響を希釈により軽減できるという利点もある。
び糖酸化分解酵素を併用すれば、１つの糖化部分に対
し、２つの同一生成物が生成され、また２つの同一消費
物が消費される。このため、本発明の測定方法は、従来
法に比べ、理論上２倍の検出感度を実現でき、より正確
に糖化アミンの測定を行うことができる。また、試料の
希釈倍率を上げても、検出可能な前記生成物濃度または
消費物濃度を保持することができるから、試料中の共存
物質の影響を希釈により軽減できるという利点もある。
【００１０】本発明の測定方法において、前記同一生成
物は、過酸化水素であることが好ましい。また、前記同
一消費物は、酸素であることが好ましい。
物は、過酸化水素であることが好ましい。また、前記同
一消費物は、酸素であることが好ましい。
【００１１】本発明の測定方法において、測定対象物の
糖化アミンが、糖化アミノ酸、糖化タンパク質または糖
化ペプチドであることが好ましい。また、糖化アミン
が、糖化タンパク質または糖化ペプチドの場合は、予め
前記糖化アミンをプロテアーゼで分解してから、その分
解物と糖化アミン酸化分解酵素とを反応させることが好
ましい。
糖化アミンが、糖化アミノ酸、糖化タンパク質または糖
化ペプチドであることが好ましい。また、糖化アミン
が、糖化タンパク質または糖化ペプチドの場合は、予め
前記糖化アミンをプロテアーゼで分解してから、その分
解物と糖化アミン酸化分解酵素とを反応させることが好
ましい。
【００１２】試料には最初からグルコース等の糖酸化分
解酵素の基質が存在する場合があるが、前記基質と前記
糖酸化分解酵素との反応によって発生する過酸化水素や
消費される酸素が測定精度に影響を与えるおそれがあ
る。これを回避するために、本発明の測定方法におい
て、糖化アミンと糖化アミン酸化分解酵素とを反応させ
る前に、試料中に存在する糖酸化分解酵素の基質を消去
することが好ましく、その手段としては、試料に前記糖
酸化分解酵素を添加することが好ましい。
解酵素の基質が存在する場合があるが、前記基質と前記
糖酸化分解酵素との反応によって発生する過酸化水素や
消費される酸素が測定精度に影響を与えるおそれがあ
る。これを回避するために、本発明の測定方法におい
て、糖化アミンと糖化アミン酸化分解酵素とを反応させ
る前に、試料中に存在する糖酸化分解酵素の基質を消去
することが好ましく、その手段としては、試料に前記糖
酸化分解酵素を添加することが好ましい。
【００１３】本発明の測定方法において、前記糖酸化分
解酵素が、グルコースオキシダーゼ（以下、「ＧＯＤ」
という）、β−ガラクトシダーゼ、ピラノースオキシダ
ーゼからなる群から選択された少なくとも一つの酸化酵
素であることが好ましい。
解酵素が、グルコースオキシダーゼ（以下、「ＧＯＤ」
という）、β−ガラクトシダーゼ、ピラノースオキシダ
ーゼからなる群から選択された少なくとも一つの酸化酵
素であることが好ましい。
【００１４】また、糖化アミンが糖化タンパク質等の場
合、グルコースにより糖化されていることが多いため、
糖化アミンの酸化分解により生成される糖が、グルコソ
ンであることが好ましく、この場合、前記糖酸化分解酵
素は前記ＧＯＤが特に好ましい。
合、グルコースにより糖化されていることが多いため、
糖化アミンの酸化分解により生成される糖が、グルコソ
ンであることが好ましく、この場合、前記糖酸化分解酵
素は前記ＧＯＤが特に好ましい。
【００１５】本発明の測定方法において、前記糖を酸化
分解するために、前記糖酸化分解酵素を反応溶液に、濃
度１，０００〜５０００，０００Ｕ／リットルの範囲に
なるように添加することが好ましく、特に好ましくは、
１０，０００〜１０００，０００Ｕ／リットルの範囲で
ある。
分解するために、前記糖酸化分解酵素を反応溶液に、濃
度１，０００〜５０００，０００Ｕ／リットルの範囲に
なるように添加することが好ましく、特に好ましくは、
１０，０００〜１０００，０００Ｕ／リットルの範囲で
ある。
【００１６】本発明の測定方法において、糖化アミン酸
化分解酵素が、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（Ｆ
ＡＯＤ）であることが好ましい。
化分解酵素が、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（Ｆ
ＡＯＤ）であることが好ましい。
【００１７】本発明の測定方法において、過酸化水素量
の測定が、ペルオキシダーゼと前記ペルオキシダーゼに
より酸化される基質とを用いた測定であることが好まし
い。
の測定が、ペルオキシダーゼと前記ペルオキシダーゼに
より酸化される基質とを用いた測定であることが好まし
い。
【００１８】前記酸化される基質は、酸化により発色す
る基質（以下、「発色性基質」という）であることが好ま
しい。前記発色性基質としては、Ｎ−（カルボキシメチ
ルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミ
ノ）ジフェニルアミンナトリウム（例えば、ＤＡ−６
４：和光純薬社製等）等の高感度発色剤であることが好
ましいが、これには特に制限されず、この他にも、例え
ば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー
試薬とアミノアンチピリンとを組み合わせた発色性基質
等が使用できる。
る基質（以下、「発色性基質」という）であることが好ま
しい。前記発色性基質としては、Ｎ−（カルボキシメチ
ルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミ
ノ）ジフェニルアミンナトリウム（例えば、ＤＡ−６
４：和光純薬社製等）等の高感度発色剤であることが好
ましいが、これには特に制限されず、この他にも、例え
ば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー
試薬とアミノアンチピリンとを組み合わせた発色性基質
等が使用できる。
【００１９】これらの本発明の測定方法において、測定
対象物は、糖化アミンであれば特に制限されないが、前
述のように糖化タンパク質、糖化ペプチドまたは糖化ア
ミノ酸であることが好ましい。前記糖化タンパク質とし
ては、例えば、ＨｂＡ１ｃ、糖化アルブミン、糖化グロ
ブリン、糖化カゼイン等があげられる。また、血液中の
糖化タンパク質を測定することは、糖尿病の診断に有用
であることから、測定対象試料は、血液であることが好
ましい。しかし、例えば、糖化タンパク質は、全血、血
漿、血清、血球等および尿等の生体試料や、ジュース等
の飲料水、醤油、ソース等の食料等にも含まれるため、
測定対象試料は、特に制限されない。
対象物は、糖化アミンであれば特に制限されないが、前
述のように糖化タンパク質、糖化ペプチドまたは糖化ア
ミノ酸であることが好ましい。前記糖化タンパク質とし
ては、例えば、ＨｂＡ１ｃ、糖化アルブミン、糖化グロ
ブリン、糖化カゼイン等があげられる。また、血液中の
糖化タンパク質を測定することは、糖尿病の診断に有用
であることから、測定対象試料は、血液であることが好
ましい。しかし、例えば、糖化タンパク質は、全血、血
漿、血清、血球等および尿等の生体試料や、ジュース等
の飲料水、醤油、ソース等の食料等にも含まれるため、
測定対象試料は、特に制限されない。
【００２０】なお、本発明の測定方法は、例えば、測定
キットに適用することが好ましく、これにより、本発明
の測定方法を簡便かつ迅速に行なうことができる。
キットに適用することが好ましく、これにより、本発明
の測定方法を簡便かつ迅速に行なうことができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明の測定方法において使用で
きるＦＡＯＤとしては、下記式（化１）に示す反応を触
媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
きるＦＡＯＤとしては、下記式（化１）に示す反応を触
媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
【００２２】
【化１】Ｒ1−ＣＯ−ＣＨ2−ＮＨ−Ｒ2 ＋ Ｈ2Ｏ ＋
Ｏ2→Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ2−Ｒ2 ＋ Ｈ2Ｏ
2
Ｏ2→Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ2−Ｒ2 ＋ Ｈ2Ｏ
2
【００２３】前記式（化１）において、Ｒ1は、水酸基
もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意
味する。前記糖残基（Ｒ1）は、反応前の糖がアルドー
スの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトー
スの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖が
グルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構
造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ
1）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。こ
の糖残基（Ｒ1）は、例えば、 −[ＣＨ（ＯＨ）]n−ＣＨ2ＯＨ で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意
味する。前記糖残基（Ｒ1）は、反応前の糖がアルドー
スの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトー
スの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖が
グルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構
造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ
1）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。こ
の糖残基（Ｒ1）は、例えば、 −[ＣＨ（ＯＨ）]n−ＣＨ2ＯＨ で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
【００２４】前記式（化１）において、Ｒ2は、特に制
限されないが、糖化アミンが糖化アミノ酸、糖化ペプチ
ドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化さ
れている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている
場合とで異なる。
限されないが、糖化アミンが糖化アミノ酸、糖化ペプチ
ドまたは糖化タンパク質の場合、α−アミノ基が糖化さ
れている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている
場合とで異なる。
【００２５】前記式（化１）において、α−アミノ基が
糖化されている場合、Ｒ2は、下記式（化２）で示すア
ミノ酸残基またはペプチド残基である。
糖化されている場合、Ｒ2は、下記式（化２）で示すア
ミノ酸残基またはペプチド残基である。
【００２６】
【化２】−ＣＨＲ3−ＣＯ−Ｒ4
【００２７】前記式（化２）において、Ｒ3はアミノ酸
側鎖基を示し、Ｒ4は水酸基、アミノ酸残基またはペプ
チド残基を示し、例えば、下記式（化３）で示すことが
できる。下記式（化３）において、ｎは、０以上の整数
であり、Ｒ3は、前述と同様に、アミノ酸側鎖基を示
し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良
い。
側鎖基を示し、Ｒ4は水酸基、アミノ酸残基またはペプ
チド残基を示し、例えば、下記式（化３）で示すことが
できる。下記式（化３）において、ｎは、０以上の整数
であり、Ｒ3は、前述と同様に、アミノ酸側鎖基を示
し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良
い。
【００２８】
【化３】−（ＮＨ−ＣＲ3Ｈ−ＣＯ）n−ＯＨ
【００２９】また、前記式（化１）において、α−アミ
ノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基
が糖化されている）場合、Ｒ2は下記式（化４）で示す
ことができる。
ノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基
が糖化されている）場合、Ｒ2は下記式（化４）で示す
ことができる。
【００３０】
【化４】−Ｒ5−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ6）−ＣＯ−Ｒ7
【００３１】前記式（化４）において、Ｒ5は、アミノ
酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示
す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ5
は −ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2− であり、例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場
合、Ｒ5は、 −ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ2）− である。
酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示
す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ5
は −ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2− であり、例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場
合、Ｒ5は、 −ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ2）− である。
【００３２】また、前記式（化４）において、Ｒ6は、
水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例え
ば、下記式（化５）で示すことができる。なお、下記式
（化５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、
前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は
全て同一でも、異なっていても良い。
水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例え
ば、下記式（化５）で示すことができる。なお、下記式
（化５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、
前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は
全て同一でも、異なっていても良い。
【００３３】
【化５】−（ＣＯ−ＣＲ3Ｈ−ＮＨ）n−Ｈ
【００３４】また、前記式（化４）において、Ｒ7は、
水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例え
ば、下記式（化６）で示すことができる。なお、下記式
（化６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、
前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は
全て同一でも、異なっていても良い。
水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例え
ば、下記式（化６）で示すことができる。なお、下記式
（化６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ3は、
前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は
全て同一でも、異なっていても良い。
【００３５】
【化６】−（ＮＨ−ＣＨＲ3−ＣＯ）n−ＯＨ
【００３６】本発明の測定方法において、前記糖酸化分
解酵素が酸化分解する糖は、前記式（化１）において、
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯで示される糖である。ただし、この
場合、Ｒ1は、糖残基を示し、水酸基は含まない。この
糖と前記糖酸化分解酵素との反応は、下記式（化７）に
示す反応であると推測される。下記式（化７）におい
て、Ｒ1は、前述のように糖残基であり、例えば、−[Ｃ
Ｈ（ＯＨ）]n−ＣＨ2ＯＨで示すことができ、ｎは、０
〜６の整数である。
解酵素が酸化分解する糖は、前記式（化１）において、
Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯで示される糖である。ただし、この
場合、Ｒ1は、糖残基を示し、水酸基は含まない。この
糖と前記糖酸化分解酵素との反応は、下記式（化７）に
示す反応であると推測される。下記式（化７）におい
て、Ｒ1は、前述のように糖残基であり、例えば、−[Ｃ
Ｈ（ＯＨ）]n−ＣＨ2ＯＨで示すことができ、ｎは、０
〜６の整数である。
【００３７】
【化７】Ｒ1−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｈ2Ｏ ＋ Ｏ2→Ｒ1
−ＣＨＯ ＋ＣＯ2 ＋ Ｈ2Ｏ2
−ＣＨＯ ＋ＣＯ2 ＋ Ｈ2Ｏ2
【００３８】つぎに、本発明の測定方法について、前記
糖化アミン酸化分解酵素としてＦＡＯＤ、糖酸化分解酵
素としてＧＯＤをそれぞれ用いて、血球中の糖化タンパ
ク質を測定する例をあげて説明する。
糖化アミン酸化分解酵素としてＦＡＯＤ、糖酸化分解酵
素としてＧＯＤをそれぞれ用いて、血球中の糖化タンパ
ク質を測定する例をあげて説明する。
【００３９】まず、全血から遠心分離等の常法により血
球画分を分離し、これを溶血する。この溶血方法は、特
に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音
波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用でき
る。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性
剤を用いる方法が好ましい。
球画分を分離し、これを溶血する。この溶血方法は、特
に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音
波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用でき
る。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性
剤を用いる方法が好ましい。
【００４０】前記界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｂｒｉｊ３５等
が使用できる。前記界面活性剤による処理条件は、通
常、処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、
前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように
前記界面活性剤を添加し、室温で、５秒〜１分程度攪拌
すればよい。
ｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｂｒｉｊ３５等
が使用できる。前記界面活性剤による処理条件は、通
常、処理溶液中の血球濃度が、１〜１０体積％の場合、
前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように
前記界面活性剤を添加し、室温で、５秒〜１分程度攪拌
すればよい。
【００４１】つぎに、前記溶血試料に対し、プロテアー
ゼ処理を行う。前記プロテアーゼの種類は、特に制限さ
れず、例えば、プロテアーゼＫ、ズブチリシン、トリプ
シン、アミノペプチダーゼ、パパイン等が使用でき、こ
の他にも、例えば、糖化アミノ酸遊離酵素等が使用でき
る。前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行わ
れ、その処理条件は、使用するプロテアーゼの種類、糖
化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定さ
れる。
ゼ処理を行う。前記プロテアーゼの種類は、特に制限さ
れず、例えば、プロテアーゼＫ、ズブチリシン、トリプ
シン、アミノペプチダーゼ、パパイン等が使用でき、こ
の他にも、例えば、糖化アミノ酸遊離酵素等が使用でき
る。前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行わ
れ、その処理条件は、使用するプロテアーゼの種類、糖
化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定さ
れる。
【００４２】プロテアーゼとしてトリプシンを用いて、
前記溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテ
アーゼ濃度１００〜６，０００Ｕ／リットル、反応液中
の血球濃度０．２〜５体積％、反応温度２０〜５０℃、
反応時間１０分〜２０時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、ト
リス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩ
ＰＥＳ緩衝液等が使用できる。
前記溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテ
アーゼ濃度１００〜６，０００Ｕ／リットル、反応液中
の血球濃度０．２〜５体積％、反応温度２０〜５０℃、
反応時間１０分〜２０時間、ｐＨ６〜９の範囲である。
また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、ト
リス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩ
ＰＥＳ緩衝液等が使用できる。
【００４３】つぎに、前記プロテアーゼ処理により得ら
れた分解物を、ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理
により、前記式（化１）に示す反応が触媒される。
れた分解物を、ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理
により、前記式（化１）に示す反応が触媒される。
【００４４】このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処
理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液
としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同
様の緩衝液が使用できる。
理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液
としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同
様の緩衝液が使用できる。
【００４５】つぎに、前記ＦＡＯＤ処理物を、ＧＯＤで
処理する。これにより、前記ＦＡＯＤ処理で過酸化水素
と共に生成された糖を酸化分解し、さらに過酸化水素を
生成させる。前記ＦＡＯＤ処理とこのＧＯＤ処理とによ
り、理論的には１モルの糖化アミノ酸残基から２モルの
過酸化水素が生成されることになる。
処理する。これにより、前記ＦＡＯＤ処理で過酸化水素
と共に生成された糖を酸化分解し、さらに過酸化水素を
生成させる。前記ＦＡＯＤ処理とこのＧＯＤ処理とによ
り、理論的には１モルの糖化アミノ酸残基から２モルの
過酸化水素が生成されることになる。
【００４６】このＧＯＤ処理は、前述のように、ＧＯＤ
を反応溶液に、濃度１，０００〜５０００，０００Ｕ／
リットルの範囲になるように添加することが好ましく、
反応条件は、通常、温度１５〜３７℃の範囲、反応時間
１〜３０分の範囲である。また、前記プロテアーゼ処理
や前記ＦＡＯＤ処理等と同様に緩衝液中で行うことが好
ましい。前記緩衝液としては、例えば、トリス塩酸緩衝
液、リン酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝
液、クエン酸緩衝液等の緩衝液が使用できるが、操作の
簡便性等の点から、前記プロテアーゼ処理や前記ＦＡＯ
Ｄ処理と同じ緩衝液を使用することが好ましい。
を反応溶液に、濃度１，０００〜５０００，０００Ｕ／
リットルの範囲になるように添加することが好ましく、
反応条件は、通常、温度１５〜３７℃の範囲、反応時間
１〜３０分の範囲である。また、前記プロテアーゼ処理
や前記ＦＡＯＤ処理等と同様に緩衝液中で行うことが好
ましい。前記緩衝液としては、例えば、トリス塩酸緩衝
液、リン酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝
液、クエン酸緩衝液等の緩衝液が使用できるが、操作の
簡便性等の点から、前記プロテアーゼ処理や前記ＦＡＯ
Ｄ処理と同じ緩衝液を使用することが好ましい。
【００４７】そして、前記ＦＡＯＤ処理で生成した過酸
化水素と、前記ＧＯＤ処理で生成した過酸化水素とを、
ＰＯＤおよび前記ＰＯＤの発色性基質を用いた酸化還元
反応を利用して測定する。
化水素と、前記ＧＯＤ処理で生成した過酸化水素とを、
ＰＯＤおよび前記ＰＯＤの発色性基質を用いた酸化還元
反応を利用して測定する。
【００４８】前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行
われ、その条件は、過酸化水素濃度等により適宜決定さ
れる。また、前記緩衝液は、特に制限されず、前記ＦＡ
ＯＤ処理およびＧＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用で
きる。
われ、その条件は、過酸化水素濃度等により適宜決定さ
れる。また、前記緩衝液は、特に制限されず、前記ＦＡ
ＯＤ処理およびＧＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用で
きる。
【００４９】なお、前記過酸化水素量は、前記ペルオキ
シダーゼ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的
手法により測定することもできる。
シダーゼ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的
手法により測定することもできる。
【００５０】前記発色性基質を用いた場合は、その発色
（反応液の吸光度）を分光光度計で測定することによ
り、過酸化水素の濃度を測定でき、これから試料中の糖
化タンパク質濃度を知ることができる。このように、本
発明の測定方法によれば、測定対象物を高精度で測定で
きる。
（反応液の吸光度）を分光光度計で測定することによ
り、過酸化水素の濃度を測定でき、これから試料中の糖
化タンパク質濃度を知ることができる。このように、本
発明の測定方法によれば、測定対象物を高精度で測定で
きる。
【００５１】この測定において、各処理工程は、前述の
ように別々に行ってもよいが、例えば、以下に示すよう
な組み合わせで同時に行ってもよい処理工程がある。 １：溶血処理＋プロテアーゼ処理 ２：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理 ３：ＦＡＯＤ処理＋ＧＯＤ処理 ４：ＦＡＯＤ処理＋ＧＯＤ処理＋ＰＯＤ酸化還元処理 ５：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＧＯＤ処理＋Ｐ
ＯＤ酸化還元処理
ように別々に行ってもよいが、例えば、以下に示すよう
な組み合わせで同時に行ってもよい処理工程がある。 １：溶血処理＋プロテアーゼ処理 ２：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理 ３：ＦＡＯＤ処理＋ＧＯＤ処理 ４：ＦＡＯＤ処理＋ＧＯＤ処理＋ＰＯＤ酸化還元処理 ５：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＧＯＤ処理＋Ｐ
ＯＤ酸化還元処理
【００５２】また、前記ＦＡＯＤと、ＧＯＤと、ＰＯＤ
および発色性基質の添加順序も、特に制限されない。
および発色性基質の添加順序も、特に制限されない。
【００５３】また、試料中にＧＯＤとの反応により過酸
化水素を生成する物質（ＧＯＤ基質）が存在する場合
は、前記ＦＡＯＤ処理等を行う前に、試料（例えば、血
球の場合は溶血試料）の前処理として、予め前記試料に
ＧＯＤを添加して、前記ＧＯＤ基質を消去させてもよ
い。また、この前処理において十分量のＧＯＤを試料に
添加すれば、後で行うＦＡＯＤ処理物に対するＧＯＤ処
理において、再度ＧＯＤを添加しなくてもよい。この場
合は、ＧＯＤを反応液に、濃度１，０００〜５０００，
０００Ｕ／リットルの範囲になるように添加することが
好ましい。
化水素を生成する物質（ＧＯＤ基質）が存在する場合
は、前記ＦＡＯＤ処理等を行う前に、試料（例えば、血
球の場合は溶血試料）の前処理として、予め前記試料に
ＧＯＤを添加して、前記ＧＯＤ基質を消去させてもよ
い。また、この前処理において十分量のＧＯＤを試料に
添加すれば、後で行うＦＡＯＤ処理物に対するＧＯＤ処
理において、再度ＧＯＤを添加しなくてもよい。この場
合は、ＧＯＤを反応液に、濃度１，０００〜５０００，
０００Ｕ／リットルの範囲になるように添加することが
好ましい。
【００５４】前記試料の前処理によって生じた過酸化水
素は、例えば、溶血試料中に最初から存在するカタラー
ゼにより消去させてもよいし、別途カタラーゼを添加し
て消去させてもい。なお、前記試料の前処理を行い、か
つ前処理によって生成した過酸化水素を前記カタラーゼ
により消去した場合、このカタラーゼによって、後に行
うＦＡＯＤ処理およびＧＯＤ処理で生成する過酸化水素
が消去されることを防ぐために、ＦＡＯＤの添加と共
に、過剰量のＰＯＤおよび発色性基質を添加することが
好ましい。この場合、ＰＯＤは、前記カタラーゼの添加
量（Ｕ）に対し、５〜１００倍の活性（Ｕ）量を添加す
ることが好ましい。
素は、例えば、溶血試料中に最初から存在するカタラー
ゼにより消去させてもよいし、別途カタラーゼを添加し
て消去させてもい。なお、前記試料の前処理を行い、か
つ前処理によって生成した過酸化水素を前記カタラーゼ
により消去した場合、このカタラーゼによって、後に行
うＦＡＯＤ処理およびＧＯＤ処理で生成する過酸化水素
が消去されることを防ぐために、ＦＡＯＤの添加と共
に、過剰量のＰＯＤおよび発色性基質を添加することが
好ましい。この場合、ＰＯＤは、前記カタラーゼの添加
量（Ｕ）に対し、５〜１００倍の活性（Ｕ）量を添加す
ることが好ましい。
【００５５】
【実施例】（実施例１および比較例１）各濃度のフルク
トシルバリン（以下、「ＦＶ」という）溶液１０μｌ
に、下記ＧＯＤ溶液４０μｌをそれぞれ添加した。そし
て、これらの溶液に、下記酸化還元反応液Ａ ５０μｌ
をそれぞれ添加して酸化還元反応を開始し、各反応液の
主波長６９４ｎｍ、副波長８８４ｎｍにおける吸光度
を、生化学自動分析装置ＪＣＡ−ＢＭ８（日本電子社
製）を用いて測定した。また、前記ＧＯＤ溶液の代わり
に水（Ｄ．Ｗ）を用いた以外は、前述の方法と同様にし
て吸光度の測定を行ったものを比較例１とした。これら
の結果を、表１および図１のグラフに示す。同図は、Ｆ
Ｖの終濃度と吸光度との関係を示すグラフであり、同図
において●はＧＯＤ処理したもの（実施例１）、はＧＯ
Ｄ未処理（Ｄ．Ｗ添加）のもの（比較例１）を示す。
トシルバリン（以下、「ＦＶ」という）溶液１０μｌ
に、下記ＧＯＤ溶液４０μｌをそれぞれ添加した。そし
て、これらの溶液に、下記酸化還元反応液Ａ ５０μｌ
をそれぞれ添加して酸化還元反応を開始し、各反応液の
主波長６９４ｎｍ、副波長８８４ｎｍにおける吸光度
を、生化学自動分析装置ＪＣＡ−ＢＭ８（日本電子社
製）を用いて測定した。また、前記ＧＯＤ溶液の代わり
に水（Ｄ．Ｗ）を用いた以外は、前述の方法と同様にし
て吸光度の測定を行ったものを比較例１とした。これら
の結果を、表１および図１のグラフに示す。同図は、Ｆ
Ｖの終濃度と吸光度との関係を示すグラフであり、同図
において●はＧＯＤ処理したもの（実施例１）、はＧＯ
Ｄ未処理（Ｄ．Ｗ添加）のもの（比較例１）を示す。
【００５６】（ＦＶ溶液）バリン（ペプチド研究所社
製）とグルコースとを用いて、定法によりＦＶを調製し
た。そして、前記ＦＶを、所定の濃度（６２．５、１２
５、２５０、５００、１０００μｍｏｌ／リットル）に
なるように蒸留水に添加した。
製）とグルコースとを用いて、定法によりＦＶを調製し
た。そして、前記ＦＶを、所定の濃度（６２．５、１２
５、２５０、５００、１０００μｍｏｌ／リットル）に
なるように蒸留水に添加した。
【００５７】（緩衝液）１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4溶液
と、１００ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4溶液とを混合して、１００
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製した。
と、１００ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4溶液とを混合して、１００
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を調製した。
【００５８】 （酸化還元反応液Ａの組成） ＤＡ６４（和光純薬社製） ４０μｍｏｌ／リットル ＰＯＤ（ＴｙｐｅIII：東洋紡社製） ２００ＫＵ／リットル ＦＡＯＤ（旭化成社製） １０ＫＵ／リットル 緩衝液 １００ｍｍｏｌ／リットル
【００５９】（ＧＯＤ溶液）ＧＯＤ（東洋紡社製）を
２，０００ＫＵ／リットルの濃度になるように精製水に
溶解した。
２，０００ＫＵ／リットルの濃度になるように精製水に
溶解した。
【００６０】（実施例２および比較例２）前記実施例１
で使用した前記酸化還元反応液Ａにおいて、前記リン酸
緩衝液の代わりに、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を使用した以外は、実施例１と同様にして吸光
度の測定を行った。また、前記ＧＯＤ溶液の代わりに水
を、前記リン酸緩衝液の代わりに前記トリス塩酸緩衝液
をそれぞれ用いた以外は、実施例１と同様にして測定を
行ったものを比較例２とした。これらの結果を、表２お
よび図２のグラフに示す。同図は、ＦＶの終濃度と吸光
度との関係を示すグラフであり、同図において●はＧＯ
Ｄ処理したもの（実施例２）、はＧＯＤ未処理（Ｄ．Ｗ
添加）のもの（比較例２）を示す。
で使用した前記酸化還元反応液Ａにおいて、前記リン酸
緩衝液の代わりに、１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を使用した以外は、実施例１と同様にして吸光
度の測定を行った。また、前記ＧＯＤ溶液の代わりに水
を、前記リン酸緩衝液の代わりに前記トリス塩酸緩衝液
をそれぞれ用いた以外は、実施例１と同様にして測定を
行ったものを比較例２とした。これらの結果を、表２お
よび図２のグラフに示す。同図は、ＦＶの終濃度と吸光
度との関係を示すグラフであり、同図において●はＧＯ
Ｄ処理したもの（実施例２）、はＧＯＤ未処理（Ｄ．Ｗ
添加）のもの（比較例２）を示す。
【００６１】
【表１】 ＦＶ終濃度 実施例１ 比較例１ （μｍｏｌ／リットル） （Ａｂｓ．） （Ａｂｓ．） ０ ０ ０ ０．６２５ ０．０４５ ０．０３８ １．２５ ０．０９８ ０．０７６ ２．５ ０．２０８ ０．１５１ ５．０ ０．４４４ ０．３０４ １０．０ ０．９５０ ０．６２３
【００６２】
【表２】 ＦＶ終濃度 実施例１ 比較例１ （μｍｏｌ／リットル） （Ａｂｓ．） （Ａｂｓ．） ０ ０ ０ ０．６２５ ０．０２１ ０．０１０ １．２５ ０．０７８ ０．０４７ ２．５ ０．２０４ ０．１２６ ５．０ ０．４７６ ０．２９２ １０．０ １．０９７ ０．６６２
【００６３】前記表１、２および図１、２に示すよう
に、実施例では、ＧＯＤ処理を行ったことにより、生成
された過酸化水素量を示す吸光度が比較例に比べて増加
した。また、その検出感度は、比較例に対して、実施例
１では約１．５倍、実施例２では約１．７倍であった。
この結果より、本発明の測定方法によれば、測定精度を
向上できることがわかる。
に、実施例では、ＧＯＤ処理を行ったことにより、生成
された過酸化水素量を示す吸光度が比較例に比べて増加
した。また、その検出感度は、比較例に対して、実施例
１では約１．５倍、実施例２では約１．７倍であった。
この結果より、本発明の測定方法によれば、測定精度を
向上できることがわかる。
【００６４】
【発明の効果】以上のように、本発明の測定方法によれ
ば、試料中の糖化アミンを、簡便かつ高精度で測定でき
る。このため、本発明の測定方法を、例えば、赤血球中
のＨｂＡ１ｃの測定の際に適用すれば、従来よりも測定
精度が向上し、ＨｂＡ１ｃの糖尿病診断等の指標物質と
しての重要性がさらに向上する。
ば、試料中の糖化アミンを、簡便かつ高精度で測定でき
る。このため、本発明の測定方法を、例えば、赤血球中
のＨｂＡ１ｃの測定の際に適用すれば、従来よりも測定
精度が向上し、ＨｂＡ１ｃの糖尿病診断等の指標物質と
しての重要性がさらに向上する。
【図１】本発明の測定方法の一実施例において、試料中
のＦＶ濃度と吸光度との相関関係を示したグラフであ
る。
のＦＶ濃度と吸光度との相関関係を示したグラフであ
る。
【図２】本発明の測定方法のその他の実施例において、
試料中のＦＶ濃度と吸光度との相関関係を示したグラフ
である。
試料中のＦＶ濃度と吸光度との相関関係を示したグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/72 Ｇ０１Ｎ 33/72 Ａ
Claims (2)
- 【請求項１】 試料中の糖化アミンを測定する方法であ
って、糖化アミン酸化分解酵素により、前記糖化アミン
を糖とアミンとに酸化分解し、糖酸化分解酵素により、
前記糖を酸化分解し、前記両酸化分解反応による同一生
成物または同一消費物の量を測定して、この測定値から
前記糖化アミンの量を決定する測定方法。 - 【請求項２】 糖酸化分解酵素を反応溶液に、濃度１，
０００〜５０００，０００Ｕ／リットルの範囲になるよ
うに添加する請求項１に記載の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11146685A JP2000333696A (ja) | 1999-05-26 | 1999-05-26 | 糖化アミンの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11146685A JP2000333696A (ja) | 1999-05-26 | 1999-05-26 | 糖化アミンの測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000333696A true JP2000333696A (ja) | 2000-12-05 |
Family
ID=15413277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11146685A Pending JP2000333696A (ja) | 1999-05-26 | 1999-05-26 | 糖化アミンの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000333696A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| WO2005049857A1 (ja) * | 2003-11-19 | 2005-06-02 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | 糖化蛋白質の測定方法 |
| WO2005056823A1 (ja) * | 2003-12-12 | 2005-06-23 | Arkray, Inc. | 糖化アミンの測定方法 |
| WO2006118306A1 (ja) * | 2005-05-02 | 2006-11-09 | Oji Paper Co., Ltd. | 糖化ヘモグロビンの分析装置および分析方法 |
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| WO2010041715A1 (ja) | 2008-10-09 | 2010-04-15 | 協和メデックス株式会社 | 新規フルクトシルペプチドオキシダーゼ |
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| WO2015005258A1 (ja) | 2013-07-09 | 2015-01-15 | 協和メデックス株式会社 | 糖化ヘキサペプチドオキシダーゼとその利用 |
| WO2015005257A1 (ja) | 2013-07-09 | 2015-01-15 | 協和メデックス株式会社 | 糖化ヘモグロビンの測定方法 |
-
1999
- 1999-05-26 JP JP11146685A patent/JP2000333696A/ja active Pending
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