JP2000338085A - 化学発光検出方法及びその方法を用いたマイクロチップ電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 検出器として化学反応発光法を用い、小型で
安価なマイクロチップ電気泳動装置を提供する。 【解決手段】 試料導入流路２０と分離流路２１とに泳
動液を満たし、リザーバＲ１に試料液を、リザーバＲ４
に発光試薬を入れる。試料導入流路２０に試料を導入し
た後、両流路の交差部に存在する試料を分離流路２１を
通して第４リザーバＲ４の方向に電気泳動させる。泳動
する間に分離した各成分は第４リザーバＲ４に到達した
順に発光試薬と反応して発光する。この発光光は第４リ
ザーバＲ４の直下に配設された光電子増倍管２２で検出
される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、例えば電気泳動チ
ップなどを用いて液体試料成分を分離し、その分離され
た各成分を検出する化学発光検出方法及びその方法を用
いたマイクロチップ電気泳動装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】キャピラリ電気泳動法（ＣＥ）は、ペプ
チド、タンパク質、核酸、糖類等の生体成分の分析のほ
か、光学分割、同位体の分離等、構造が類似している成
分を分離するのに適した方法であり、臨床医学や医薬
品、環境物質のモニタリング等の用途に広く利用されて
いる。

【０００３】キャピラリ電気泳動装置の検出器として
は、これまで紫外可視分光光度計などの検出器が主とし
て利用されているが、近年、より簡便で高感度の検出が
可能であるものとして化学発光検出器が開発されてい
る。化学発光検出器は、試薬と試料成分との化学反応に
よって生じる発光を測定するため、特別な光源を必要と
せず、コストが低廉であって操作も簡便である。また、
雑音源も少ないので高感度の検出が達成できる。

【０００４】化学発光検出法の具体例として、過シュウ
酸エステル系の化学発光反応についてその原理を説明す
る。過シュウ酸エステルの化学発光では、過酸化水素の
作用により、シュウ酸誘導体（例えばシュウ酸ビス(2,
4,6-トリクロロフェニル：ＴＣＰＯ)、シュウ酸ビス(2,
4-ジニトロフェニル：ＤＮＰＯ）など）から、エネルギ
の高い活性中間体とされる1,2-ジキセタンジオン又は置
換1,2-ジキセタンジオンが形成される。この中間体から
エネルギ遷移が生じ、共存する蛍光物質が励起され、こ
れが基底状態に戻るときにその蛍光スペクトルと一致し
た光を発生する。この蛍光物質（フルオロフォア）は再
び活性中間体により励起されて発光し、これを繰り返す
ことで強い発光となる。このようにして、一分子のフル
オロフォアで強い発光を得ることができる。

【０００５】なお、分析対象物質自体が蛍光性を有する
場合はそのままで、また蛍光性を有しない場合には蛍光
性物質に誘導体化することによって、蛍光分析法よりも
高感度の定量が可能である。上述のような、過シュウ酸
エステル−過酸化水素化学発光反応を用いる場合には、
増感剤として作用する蛍光色素を検出することができ、
各種蛍光色素で標識したアミノ酸、ペプチド、タンパク
質、糖類の分析が可能である。また、ルミノール−過酸
化水素化学発光反応を用いる場合には、金属イオン、金
属錯体、ヘムタンパク質など反応触媒となる各種物質を
高感度に検出することができる。

【０００６】しかしながら、このような化学発光検出器
を電気泳動と接続する際には幾つかの問題がある。すな
わち、この発光試薬は難水溶性であって溶媒としては有
機溶媒を必要とし、発光反応も非水条件下で進行する場
合がある。また、加水分解し易く、水系では非常に不安
定であるため、すぐに反応活性が低下する傾向にある。
そのため、予め水溶液と混合して電気泳動に必要な導電
性を持たせておくといった手法は、試薬の溶解性、安定
性等の点から採用することができない。

【０００７】そこで、キャピラリ管を利用した電気泳動
装置と化学発光検出器とを組み合わせる構成としては、
従来、図８及び図９に示すような構成のものが利用され
ている。図８はキャピラリ電気泳動装置の全体構成図、
図９は図８中のＡ部の拡大図である。

【０００８】成分分離用のキャピラリ３０の入口端は泳
動液を満たした液槽３１に浸され、キャピラリ３０の出
口端はＡ部のジョイント３３を介して泳動液を満たした
液槽３２に浸されている。液槽３１中の泳動液には電圧
源（ＨＶ）３４から所定の電圧が印加され、他方、液槽
３２中の泳動液は接地電位になっている。この電位差に
よって、泳動液はキャピラリ３０内を液槽３１から液槽
３２へ向かって移動する。キャピラリ３０の入口側で試
料導入部３５から泳動液に混入された液体試料は、キャ
ピラリ３０内を電気泳動する間に成分分離される。ジョ
イント３３にはポンプＰ１により送給される緩衝液（成
分は泳動液と同じ）と、ポンプＰ２により送給される発
光試薬（ＴＣＰＯ＋Ｈ₂Ｏ₂）とが導入される。

【０００９】図９に詳細を示すように、ジョイント３３
では、左側の細径の分離キャピラリ３０ａの先端部が右
側の太径の反応キャピラリ３０ｂの内側に挿入された二
重管構造となっており、分離キャピラリ３０ａと反応キ
ャピラリ３０ｂとの間隙を介して上述のように緩衝液と
発光試薬とが導入されるようになっている。これによ
り、緩衝液と発光試薬とは泳動液と合流する前にジョイ
ント３３内で混合され、両キャピラリ３０ａ、３０ｂの
間隙から鞘状層流（シースフロー）となって分離キャピ
ラリ３０ａから流れ出た溶液と混じり合う。そして、蛍
光性試料と発光試薬とが化学反応し発光を生じる。この
混合領域には近接して光電子増倍管３６が配設されてお
り、この光電子増倍管３６で検出された信号は、例えば
フォトンカウンタで計数される。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】上述したように従来の
キャピラリ電気泳動装置では、インタフェイス部を二重
管にしなければならず、また発光試薬や緩衝液を送液す
るための高精度ポンプが必要になるため、装置の小型化
が困難であった。また、ジョイント３３内で分離キャピ
ラリ３０ａを反応キャピラリ３０ｂに挿入するなどの煩
雑な作業が必要であった。更には、分離キャピラリ３０
ａの外径と反応キャピラリ３０ｂの内径とのギャップが
大きいと、溶出成分のバンドが混合領域で拡がり、分離
性能を著しく損なうことになる。また、発光試薬は常時
安定した流量で流す必要があるため、試薬のコストも大
きいものとなる。

【００１１】本発明はこれらの課題を解決するために成
されたものであり、その主たる目的は、構成が簡単であ
って装置の小型化や低コスト化が達成できる化学発光検
出方法及びその方法を用いたマイクロチップ電気泳動装
置を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本願発明者は、二枚の透明平板を貼り合わせて形成
するマイクロチップ電気泳動のようなマイクロチップ型
の分離分析装置に化学発光検出器を導入することに想到
した。マイクロチップ電気泳動では、電気泳動のための
分離流路の幅が小さいため、従来、光線径を極めて絞る
ことができるレーザを励起光とした蛍光検出器が利用さ
れている。そのため、電気泳動チップ自体は安価に製造
することができても、検出器は高価にならざるを得なか
った。なお、マイクロチップ電気泳動に蛍光検出器を用
いた構成は、本出願人による特開平８−３２７５９４号
公報に記載されている。

【００１３】上記課題を解決するために成された請求項
１に係る発明は、一対の略同形の平板を備え、少なくと
も一方の平板の表面に液体が流れる溝が形成され、他方
の平板の該溝の端に略対応する位置にそれぞれ貫通孔が
形成され、両平板が溝を内側にして貼り合わされること
により前記溝に対応する分離流路が形成されて成る分離
分析用マイクロチップを用いて液体試料成分を分離し、
その分離した各成分を検出する化学発光検出方法であっ
て、分離流路の出口端の貫通孔に発光試薬を導入し、該
発光試薬と該貫通孔に溶出した成分とを順次反応させ、
それにより発光した光を検出することを特徴としてい
る。

【００１４】また請求項２に係る発明は、上記化学発光
検出方法を用いたマイクロチップ電気泳動装置であっ
て、前記分離流路の両端に所定の電位差を与える電気泳
動用の電圧印加手段と、該電位差によって分離流路内を
泳動して出口端の貫通孔に溶出した成分と発光試薬との
化学反応により生じた光を検出するために、該貫通孔の
略直下に配設された受光手段と、を備えることを特徴と
している。

【００１５】

【発明の実施の形態及び発明の効果】請求項１の発明に
係る化学発光検出方法では、二枚の平板を貼り合わせて
形成される分離分析用マイクロチップの分離流路の出口
端の貫通孔に予め発光試薬を導入しておき、その直後に
成分分離を開始する。成分分離の方法としては、電気泳
動のほか、エレクトロクロマトグラフィーや、分離流路
の両端の差圧（又は入口端からの押圧）によって微流量
で緩衝液を流す、いわゆる液体クロマトグラフィーとし
てもよい。分離流路を通過する間に試料成分は分離さ
れ、時間的にずれて出口端に到達すると、その到達した
順に発光試薬と化学反応を生じ発光する。この発光光を
検出し、各成分毎にその発光強度を測定することによ
り、各成分の定量分析を行うことができる。

【００１６】したがって、この発明に係る化学発光検出
方法によれば、従来のレーザ蛍光検出器などで必要であ
った光源が不要になると共に、キャピラリ分離部と検出
部とが一体化されており、特殊なインタフェイスが不要
であるので、装置全体をきわめて小型化することができ
る。これにより、携帯型の分析装置も可能となり、取り
扱いも非常に容易になる。また、この化学検出方法によ
れば、分離流路で成分が完全に分離された後に順次検出
が行われるので、検出自体が分離を損ねることがなく、
高い分離性能が維持できる。また、発光試薬を常時流す
必要がないので、発光試薬のコストも小さくて済む。

【００１７】また、請求項２の発明では、特に、成分分
離の方法として電気泳動を利用している。すなわち、電
圧印加手段により分離流路の両端に電位差を与え、試料
を分離流路に満たされている泳動液の中で泳動させる。
電圧印加手段としては、分離流路の両端の貫通孔におい
て泳動液に接触するようにそれぞれ設けられた電極と、
外部より該電極に電圧を加える電圧源とを含むものとす
ることができる。上記電極は例えば蒸着等によって平板
表面に形成した導電性の薄膜とすることができるので、
チップ自体を小型にすることができる。

【００１８】また、このような電気泳動チップでは、分
離流路と共通部分を有するように、両端に貫通孔を備え
た試料導入流路を設ける構成とすることが好ましい。試
料注入の際には、試料導入流路の一端の貫通孔に液体試
料を注入し、電気浸透流又は差圧（押圧）により試料を
試料導入流路全体に置換させる。次いで、上述したよう
に分離流路の両端に電位差を与える。すると、試料導入
流路と分離流路との共通部分にある試料が分離流路の中
に注入され、出口端の方向に泳動してゆき、その間に成
分の分離が行われる。試料が試料導入流路から分離流路
に拡散しないように電圧を制御すれば、試料導入流路と
分離流路との共通部分の体積に対応する一定量の試料が
再現性よく注入されるので、正確な定量分析を行うこと
ができる。

【００１９】なお、このような化学発光法では、受光手
段による検出波長は、蛍光波長と同一か、又はルミノー
ル−過酸化水素系の場合でも５１５ｎｍ程度であるた
め、安価な透明樹脂を用いて平板を成形することができ
る。したがって、ディスポーザブルのチップにも有用で
ある。

【００２０】

【実施例】本発明の一実施例であるマイクロチップ電気
泳動装置を図により説明する。図１は本実施例によるマ
イクロチップ電気泳動装置の外観斜視図、図３は本実施
例における電気泳動チップの平面外観図である。

【００２１】まず、図１及び図３により本実施例による
マイクロチップ電気泳動装置の構成を説明する。電気泳
動チップ１０は、ガラス板、石英板などから成る一対の
透明平板１１、１５から構成される。下側の透明平板１
１の上表面には、それぞれ試料延伸溝１２と泳動溝１３
とが交差する（これを「交差部１４」とする）ように形
成され、上側の透明平板１５にはその両溝１２、１３の
各端部に対応する位置にそれぞれ貫通孔１６が穿孔され
ている。溝１２、１３は、透明平板１１の表面にエッチ
ングにより形成されており、溝部分の幅が１０〜１００
μｍ程度、深さが５〜５０μｍ程度となるように形成さ
れる。なお、取り扱いの便のため、本実施例のチップは
全体の大きさが１辺１〜３ｃｍ程度の矩形となっている
が、大きさや形状はこれに限るものではない。

【００２２】電気泳動チップ１０は、上述の一対の透明
平板１１、１５が溝１２、１３を内側にして貼り合わさ
れることにより、貫通孔１６により形成される第１及び
第２リザーバＲ１、Ｒ２でもって外部と連通する試料導
入流路２０と、第３及び第４リザーバＲ３、Ｒ４でもっ
て外部と連通する分離流路２１とが内部に形成されてい
る。各リザーバＲ１〜Ｒ４は、図１に示すように、外部
より泳動液などの液体を導入するためのキャピラリを受
け入れるようになっており、また、そこに貯留している
泳動液に電圧を印加するための電極（図示しない）がそ
れぞれ設けられている。この電極は、例えば一方の透明
平板の表面にフォトリソグラフィにより形成された導電
性薄膜から成り、連続してその透明平板の端面に至るよ
うに形成されているものとすることができる。

【００２３】上記電気泳動チップ１０では第４リザーバ
Ｒ４が化学発光法による検出点となっており、本実施例
のマイクロチップ電気泳動装置においては、図１に示す
ように、その第４リザーバＲ４の直下に光電子増倍管２
２が配設されている。

【００２４】次に、図２により、上記電極に電圧を印加
する電圧制御回路の構成を説明する。第１〜第４リザー
バＲ１〜Ｒ４に設けられた電極は、それぞれ独立にオン
・オフする第１〜第６なる６個のスイッチＳ１〜Ｓ６の
一端に接続されている。第２スイッチＳ２の他端は第１
電圧源（ＨＶ１）２３に接続され、第１、第３、第６ス
イッチＳ１、Ｓ３、Ｓ６の他端は第２電圧源（ＨＶ２）
２４に接続され、第４、第５スイッチＳ４、Ｓ５の他端
は接地されている。各スイッチＳ１〜Ｓ６のオン・オフ
動作と各電圧源２３、２４の発生電圧は制御部２５によ
り制御されるようになっている。

【００２５】本実施例のマイクロチップ電気泳動装置を
用いた分析の一例は次の通りである。 （１）分析の準備 まず、いずれかのリザーバ（複数でもよい）から泳動液
（０．１Ｍのトリス−ホウ酸緩衝液）を加圧注入し、試
料導入流路２０及び分離流路２１全体に泳動液を充填す
る。そして、第１リザーバ（試料注入点）Ｒ１へ所定量
の微量の試料（例えば１×１０^-4ＭのＤｎｓ−ロイシ
ン、又はＤｎｓ−リシンとＤｎｓ−グリシンの混合液）
を注入すると共に、第２及び第３リザーバＲ２、Ｒ３へ
泳動液（０．１Ｍのトリス−ホウ酸緩衝液）を注入し、
更に第４リザーバＲ４には発光試薬として４ｍＭのＴＤ
ＰＯと１００ｍＭの過酸化水素水の混合液を入れる。

【００２６】（２）試料導入流路２０への試料の導入 制御部２５は、スイッチＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４を閉
じ、第１電圧源２３で０．３ｋＶ、第２電圧源２４で
０．６ｋＶの電圧を１５秒間発生させる。これにより、
図４（ａ）に示すように、第１及び第４リザーバＲ１、
Ｒ４には０．６ｋＶ、第３リザーバＲ３には０．３ｋＶ
が印加され、第２リザーバＲ２は接地される。すると電
位差によって、第１リザーバＲ１に注入された試料は試
料導入流路２０に入り、交差部１４を通過して第２リザ
ーバＲ２の方向へ移動する。このとき、第３及び第４リ
ザーバＲ３、Ｒ４からもそれぞれ第２リザーバＲ２の方
向へ泳動液が移動するので、このような試料の導入期間
中に試料が分離流路２１側へ拡散することはない。

【００２７】（３）試料の分離 次いで、制御部２５は、スイッチＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ
４を開き、直ちにスイッチＳ１、Ｓ２、Ｓ５、Ｓ６を閉
じ、第１電圧源２３で０．５ｋＶ、第２電圧源２４で
０．２ｋＶの電圧を発生させる。これにより、図４
（ｂ）に示すように、第１及び第２リザーバＲ１、Ｒ２
には０．２ｋＶ、第３リザーバＲ３には０．５ｋＶが印
加され、第４リザーバＲ４は接地される。すると電位差
によって、交差部１４に存在する試料が分離流路２１内
に導入され、第４リザーバＲ４の方向へ泳動する。試料
導入流路２０内では、交差部１４よりも第１リザーバＲ
１側に存在する試料は第１リザーバＲ１へ戻るように移
動し、交差部１４よりも第２リザーバＲ２側に存在する
試料は第２リザーバＲ２へ向かって移動する。すなわ
ち、交差部１４の容積に依存する所定量の試料のみが分
離流路２１に導入される。

【００２８】上述のように試料が分離流路２１内を泳動
する際に、その試料に含まれる成分は分離され、時間的
にずれて第４リザーバＲ４に到達する。図４（ｃ）に示
すように、第４リザーバＲ４に到達した試料成分はそこ
に貯留されている発光試薬と接触し、化学反応を生じて
発光する。この発光光は第４リザーバＲ４の直下に位置
している光電子増倍管２２で受光され、その発光強度に
応じた電気信号が光電子増倍管２２から取り出される。

【００２９】図５は、Ｄｎｓ−ロイシンを試料とした場
合の検出結果の一例を示すグラフ、図６はＤｎｓ−リシ
ンとＤｎｓ−グリシンとの混合液を試料とした場合の検
出結果の一例を示すグラフである。図５及び図６からわ
かるように、上記試料成分に対する強度信号は鋭いピー
クを示しており、これら成分は高い感度で検出されてい
る。また、図６からわかるように、Ｄｎｓ−リシンとＤ
ｎｓ−グリシンとは近接したピークをもちながらほぼ完
全に分離されており、それぞれの成分の定量分析を正確
に行うことができる。

【００３０】このような定量分析では、既知の濃度を有
する複数の標準試料を予め測定した結果を利用して作成
された検量線を利用する。図７は、Ｄｎｓ−リシンとＤ
ｎｓ−グリシンとの混合液の分析によって得られた検量
線を示すグラフである。含有量が未知である成分の定量
分析を行う際には、上述のような測定によって得たピー
ク高さを検量線に照らすことにより、その成分の濃度の
求めることができる。

【００３１】なお、発光試薬は上記記載に限定するもの
ではなく、試料に応じて適宜のものを使用する。例え
ば、遷移金属イオンやヘムタンパク質を試料とする場合
には、ルミノールと過酸化水素水の混合液が利用でき
る。

【００３２】また、上記実施例は本発明に係る化学発光
検出器をマイクロチップ電気泳動装置に適用したもので
あるが、本発明の適用範囲は電気泳動に限定されない。
すなわち、電位差によって試料成分を分離するものに限
らず、例えば分離流路の両端の差圧によって一定微流量
の泳動液を分離流路に流し、これにより成分分離をす
る、いわゆる液体クロマトグラフ態様の分離分析を行う
ものであってもよい。

【００３３】また、上記実施例は一例であって、本発明
の趣旨の範囲で適宜変更や修正を行えることは明らかで
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の一実施例によるマイクロチップ電気
泳動装置の外観斜視図。

【図２】 本実施例によるマイクロチップ電気泳動装置
の電圧制御回路の構成図。

【図３】 本実施例における電気泳動チップの平面外観
図。

【図４】 本実施例によるマイクロチップ電気泳動装置
の分析動作を説明するための状態模式図。

【図５】 本実施例によるマイクロチップ電気泳動装置
における、Ｄｎｓ−ロイシンを試料とした場合の検出結
果の一例を示すグラフ。

【図６】 本実施例によるマイクロチップ電気泳動装置
における、Ｄｎｓ−リシンとＤｎｓ−グリシンとの混合
液を試料とした場合の検出結果の一例を示すグラフ。

【図７】 本実施例によるマイクロチップ電気泳動装置
における、Ｄｎｓ−リシンとＤｎｓ−グリシンとの混合
液の分析によって得られた検量線を示すグラフ。

【図８】 化学発光検出器を用いた従来のキャピラリ電
気泳動装置の構成図。

【図９】 図８中のＡ部の拡大図。

【符号の説明】

１０…電気泳動チップ １１、１５…透明平板 １２…試料延伸溝 １３…泳動溝 １４…交差部 １６…貫通孔 ２０…試料導入流路 ２１…分離流路 ２２…光電子増倍管 ２３、２４…電圧源 ２５…制御部 Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４…リザーバ Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６…スイッチ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中島 理一郎 大阪府高槻市寺谷町27−20 Ｆターム(参考） 2G054 AA06 AB07 BB03 CA21 CE08 EA01 FA06 FA07 FA21 JA06 2G057 AA14 AC01 BA03 BB02

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一対の略同形の平板を備え、少なくとも
   一方の平板の表面に液体が流れる溝が形成され、他方の
   平板の該溝の端に略対応する位置にそれぞれ貫通孔が形
   成され、両平板が溝を内側にして貼り合わされることに
   より前記溝に対応する分離流路が形成されて成る分離分
   析用マイクロチップを用いて液体試料成分を分離し、そ
   の分離した各成分を検出する化学発光検出方法であっ
   て、分離流路の出口端の貫通孔に発光試薬を導入し、該
   発光試薬と該貫通孔に溶出した成分とを順次反応させ、
   それにより発光した光を検出することを特徴とする化学
   発光検出方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の化学発光検出方法を用い
   たマイクロチップ電気泳動装置であって、前記分離流路
   の両端に所定の電位差を与える電気泳動用の電圧印加手
   段と、該電位差によって分離流路内を泳動して出口端の
   貫通孔に溶出した成分と発光試薬との化学反応により生
   じた光を検出するために、該貫通孔の略直下に配設され
   た受光手段と、を備えることを特徴とするマイクロチッ
   プ電気泳動装置。