JP2000342294A - Ｌ−トリプトファンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 乳酸を原料とするＬ−トリプトファンの製造
方法を提供する。 【解決手段】 乳酸を酵素的に酸化しピルビン酸を生成
する反応と、生成したピルビン酸をトリプトファナーゼ
の触媒作用により、インドール、アンモニウムイオンと
反応させ、Ｌ−トリプトファンを生成する反応からなる
Ｌ−トリプトファンの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明はＬ−トリプトファン
の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−トリプトファンは必須アミノ酸の一
種であり、医薬、栄養剤、飼料添加物及び医薬原料など
に広く利用されている。Ｌ−トリプトファンの製造方法
としてはトリプトファンシンターゼの作用によりインド
ールとＬ−セリンから製造する方法や、トリプトファナ
ーゼの作用によりインドールとＬ−セリンまたはインド
ール、ピルビン酸及びアンモニウムイオンとから製造す
る方法などが知られている。

【０００３】これらの製法の原料となる、Ｌ−セリンま
たはピルビン酸は比較的高価なものであり、より安価な
原料によるＬ−トリプトファンの製造方法が望まれてい
た。このような試みとしては、Ｌ−酒石酸を脱水しピル
ビン酸へ変換する作用を持つ酵素とトリプトファナーゼ
の共存下、Ｌ−酒石酸、アンモニウムイオン及びインド
ールからＬ−トリプトファンを製造する方法（特開昭６
１−７４５８９号公報）、フマラーゼ、ピルビン酸−リ
ンゴ酸カルボキシラーゼ、トリプトファナーゼの存在
下、フマル酸、アンモニウムイオン及びインドールから
Ｌ−トリプトファンを製造する方法（特開昭６３−１０
５６８７号公報）などが知られているが、さらに安価な
原料からの効率的なＬ−トリプトファンの製造方法が望
まれていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】生分解性プラスチック
の原料である乳酸は、近年安価に大量に入手することが
可能となってきている。本発明者らは、この乳酸をＬ−
トリプトファンの原料とできれば、より安価にＬ−トリ
プトファンを製造することが可能であると考えた。しか
しながら、乳酸を原料としてＬ−トリプトファンを合成
する方法は知られていない。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究を
行った結果、乳酸を酵素的に酸化しピルビン酸を生成さ
せ、生成したピルビン酸をトリプトファナーゼの触媒作
用により、インドール、アンモニウムイオンと反応さ
せ、Ｌ−トリプトファンを製造しうることを見出し本発
明を完成するに至った。

【０００６】すなわち本発明は、乳酸を酵素的に酸化し
ピルビン酸を生成する反応と、生成したピルビン酸をト
リプトファナーゼの触媒作用により、インドール、アン
モニウムイオンと反応させ、Ｌ−トリプトファンを生成
する反応からなるＬ−トリプトファンの製造方法に関
し、さらに具体的には（１）乳酸またはその塩に、乳酸
オキシダーゼまたは２−ヒドロキシ−カルボン酸オキシ
ダーゼ、カタラーゼを作用させピルビン酸を生成する工
程と、（２）生成したピルビン酸に、トリプトファナー
ゼ、ピリドキサールリン酸の存在下、インドール、アン
モニウムイオンを反応させＬ−トリプトファンを生成す
る工程からなるＬ−トリプトファンの製造方法。更に、
（１）乳酸またはその塩に、乳酸デヒドロゲナーゼ、モ
ノオキシゲナーゼ、ニコチンアミドジアミンヌクレオチ
ド（ＮＡＤ）及び炭素数１〜２０の飽和または不飽和の
脂肪族炭化水素、炭素数３〜８の飽和または不飽和環状
炭化水素、芳香族炭化水素、または複素環化合物から選
ばれる有機化合物を作用させピルビン酸を生成する工程
と、（２）生成したピルビン酸に、トリプトファナー
ゼ、ピリドキサールリン酸の存在下、インドール、アン
モニウムイオンを反応させＬ−トリプトファンを生成す
る工程から成るＬ−トリプトファンの製造方法である。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明における、乳酸を酵素的に
酸化しピルビン酸を生成する反応は大きく２種類に大別
される。

【０００８】１つは、乳酸オキシダーゼまたは２−ヒド
ロキシ−カルボン酸オキシダーゼによる酸化反応である
（化１−）。

【０００９】

【化１】

【００１０】本反応は不可逆反応であるが、過酸化水素
が酸化反応に伴なって副生し、乳酸の酸化反応を阻害す
る。したがってカタラーゼを共存させ過酸化水素を水と
酸素に変換することで、乳酸のピルビン酸への酸化を効
率的に進行させる（化１−）。本反応の特徴は、ピル
ビン酸以外の副成物を生成しないため、さらにトリプト
ファナーゼの作用によりインドール、アンモニウムイオ
ンを反応させる際にＬ−トリプトファンのみを生成する
ことができるため、Ｌ−トリプトファン単独の製法とし
ては極めて有利である。

【００１１】乳酸オキシダーゼまたは２−ヒドロキシ−
カルボン酸オキシダーゼ及びカタラーゼはの起源は、微
生物由来、植物由来、及び動物由来のいずれでもよい。
またこれら酵素活性を有する細胞を生体触媒として使用
することもできる。また各々が別々に反応系に供されて
もよいが、両活性を有する細胞を遺伝子工学的に造成し
供すほうがより効率的である。

【００１２】もう一つは乳酸デヒドロゲナーゼによる酸
化反応である（化２−）。

【化２】

【００１３】本反応は酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ）を補酵素とし、ピルビン酸と還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）を生成する。本反応は可逆反応であり、通常逆反応
に反応平衡が偏っているためピルビン酸生成には不利で
あるが、不可逆反応であるモノオキシゲナーゼによる有
機化合物の酸化反応を共役させ、ＮＡＤＨをＮＡＤに変
換することでピルビン酸への酸化を効率的に進行させる
（化２−）。

【００１４】ここでいうモノオキシゲナーゼとは、化２
−の反応を触媒する酸素添加酵素をさす。より具体的
には、メタンモノオキシゲナーゼ、アルカンモノオキシ
ゲナーゼ、フェノールモノオキシゲナーゼ、トルエンモ
ノオキシゲナーゼ、キシレンモノオキシゲナーゼ、およ
びカンファー−５−モノオキシゲナーゼなどのチトクロ
ームＰ−４５０系の酸化酵素等を例示することができ
る。

【００１５】これらのモノオキシゲナーゼは、通常基質
特異性が低く多くの場合例示した有機化合物の水酸化、
エポキシ化などの酸化反応を行なうことができる多機能
酵素である。

【００１６】モノオキシゲナーゼの基質となる有機化合
物としては、有機化合物が炭素数１〜２０の飽和または
不飽和の脂肪族炭化水素、炭素数３〜８の飽和または不
飽和環状炭化水素、芳香族炭化水素、または複素環化合
物を挙げることができる。

【００１７】代表的化合物としては、メタン、エタン、
プロパン、ブタン等の脂肪族アルカン、エチレン、プロ
ピレン、ブテン等のアルケン、ブタジエン等のジエン化
合物、シクロヘキサン等の脂環式化合物、ベンゼン、ト
ルエン、キシレン、などの芳香族化合物、ピリジン、ナ
フタレン、キノリン、等の複素環化合物及びこれらの誘
導体などがあげられる。

【００１８】本反応においては、Ｌ−トリプトファンの
みならず、有用な有機化合物の水酸化物、エポキシ化合
物が同時に得られる点が特徴である。

【００１９】これらの酵素の起源は、微生物由来、植物
由来、及び動物由来のいずれでもよい。またこれら酵素
活性を有する細胞を生体触媒として使用することもでき
る。さらに、これら酵素及び酵素活性を有する細胞を公
知の方法で固定化した固定化酵素または固定化細胞を使
用することもできる。

【００２０】補酵素の再生に利用する乳酸デヒドロゲナ
ーゼの起源は、微生物、動物及び植物のいずれでもよ
く、これら酵素活性を有する細胞を生体触媒として使用
することもできる。さらに、これら酵素及び酵素活性を
有する細胞を公知の方法で固定化した固定化酵素または
固定化細胞を使用することもできる。

【００２１】上記の２つのいずれかを選択するかは、さ
まざまな条件を勘案してもっとも適するほうを選択すれ
ばよい。

【００２２】トリプトファナーゼの起源は、微生物、動
物及び植物のいずれでもよく、これら酵素活性を有する
細胞を生体触媒として使用することもできる。さらに、
これら酵素及び酵素活性を有する細胞を公知の方法で固
定化した固定化酵素または固定化細胞を使用することも
できる。

【００２３】反応方法はすべての反応を、同一の反応系
中で行なうこともできるが、固定化酵素または固定化細
胞または限外濾過膜等を用い各々を別々の反応系で行な
うこともできる。

【００２４】反応温度、反応ｐＨは組み合わせる酵素の
特性により適宜最適な条件を選べばよい。

【００２５】反応媒体は反応に悪影響を及ぼさない溶媒
またはそれらの混合物を用いることができる。

【００２６】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれにより限定されるものではな
い。

【００２７】実施例１ 下記表１に示す組成の反応液１ｍｌを、２８℃で２４時
間保温し反応を行なった。３．５％ＨＣｌを０．５ｍｌ
添加し反応を停止したのち、水で希釈し生成したＬ−ト
リプトファンを薄層クロマトグラフィーで検出したとこ
ろ、Ｌ−トリプトファンの生成が認められた。薄層クロ
マトグラフィーの展開液組成は、ｎ−ブタノール：酢
酸：水＝４：１：１を使用し、検出はニンヒドリンによ
るアミノ酸の発色を用いた。

【００２８】

【表１】 （註１）ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩＭ社製
（ウシ肝臓由来） （註２）ＳＩＧＭＡ社製（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属由
来） （註３）ＳＩＧＭＡ社製（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ由来）

【００２９】実施例２ 表２の組成の培地２０ｍｌ を１００ｍｌ容フラスコに
入れ殺菌した後、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃ
ｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ＯＢ３ｂ 株を１白金耳量接種し
た。フラスコの気相部に１６ｍｌのメタンを挿入し、密
栓をして３０℃で３日間振とう培養を行なった。遠心分
離により菌体を回収し、１０ｍｌの生理食塩水で２回集
菌体を洗浄した。この菌体を１ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ
緩衝液（ｐＨ９．０）に懸濁し、超音波破砕を行ない菌
体破砕液を調製した。５０ｍｌ容フラスコに表３に示す
組成の反応液９ｍｌと、菌体破砕液１ｍｌを添加し、フ
ラスコの気相部に８ｍｌの１，３−ブタジエンを挿入
し、密栓をして３０℃で５時間振とうし反応を行なっ
た。反応終了後、クロロホルムで抽出し有機相をガスク
ロマトグラフィー（イオン化フレーム検出器カラム）で
分析したところ、エポキシブテンの生成が認められた。
遠心上清を水で希釈し、生成したＬ−トリプトファンを
薄層クロマトグラフィーで検出したところ、Ｌ−トリプ
トファンの生成が認められた。薄層クロマトグラフィー
の展開液組成は、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：
１を使用し、検出はニンヒドリンによるアミノ酸の発色
を用いた。

【００３０】

【表２】 ｐＨ ７．０ 殺菌条件 １２０℃、２０分 固体寒天培地を調製する場合は、１．０％（ｗ／ｖｏ
ｌ）の寒天を上記組成に加える。

【００３１】

【表３】 （註１）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（オリ
エンタル酵母工業株式会社製） （註２）ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ ＭＡＮＮＨＥＩＭ社製
（ブタ筋肉由来） （註３）ＳＩＧＭＡ社製（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｉｌ由来）

【００３２】

【発明の効果】本発明によれば、安価な乳酸を原料とし
たＬ−トリプトファンの製造法を提供することができ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B064 AD52 AE34 CA21 CC03 CD01 CD07 CD12 DA01 DA11 4C204 AB01 BB01 BB04 CB03 DB20 EB02 FB01 GB01

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 乳酸を酵素的に酸化しピルビン酸を生成
   する反応と、生成したピルビン酸をトリプトファナーゼ
   の触媒作用により、インドール、アンモニウムイオンと
   反応させ、Ｌ−トリプトファンを生成する反応からなる
   Ｌ−トリプトファンの製造方法。
2. 【請求項２】 （１）乳酸またはその塩に、乳酸オキシ
   ダーゼまたは２−ヒドロキシ−カルボン酸オキシダー
   ゼ、カタラーゼを作用させピルビン酸を生成する工程
   と、（２）生成したピルビン酸に、トリプトファナー
   ゼ、ピリドキサールリン酸の存在下、インドール、アン
   モニウムイオンを反応させＬ−トリプトファンを生成す
   る工程からなるＬ−トリプトファンの製造方法。
3. 【請求項３】（１）乳酸またはその塩に、乳酸デヒドロ
   ゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ニコチンアミドジアミ
   ンヌクレオチド（ＮＡＤ）及び炭素数１〜２０の飽和ま
   たは不飽和の脂肪族炭化水素、炭素数３〜８の飽和また
   は不飽和環状炭化水素、芳香族炭化水素、または複素環
   化合物から選ばれる有機化合物を作用させピルビン酸を
   生成する工程と、（２）生成したピルビン酸に、トリプ
   トファナーゼ、ピリドキサールリン酸の存在下、インド
   ール、アンモニウムイオンを反応させＬ−トリプトファ
   ンを生成する工程から成るＬ−トリプトファンの製造方
   法。