JP2000500002A - 新規なｄｎａ配列及び植物における防御誘導因子を同定するためのこれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なデオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ配列）、これらの使用、及び植物防御機構を誘導することができる因子を見いだすためのこれらのＤＮＡ配列を含んでなる特定の植物の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なＤＮＡ配列及び植物における防御誘導因子を同定するためのこれらの使用ＤＮＡ配列及びそれらの使用 本発明は、新規なデオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ配列）及びこれらの使用及び 植物において防御機構を誘導することができる因子を見いだすためのこれらのＤ ＮＡ配列を含む特定の植物の使用に関する。 現在知られている大部分の穀物防御因子は、駆除される特定の害虫に対する迅 速な効果を有する。多数の植物は、害虫による襲撃時に、特に植物組織に対して 被った損傷により、ほとんど著しい程度まで誘導されるそれら自身に特有な防御 機構を有する。しかしながら、この植物の防御機構の自然な誘導は、その効果が しばしば時間的ずれの後にしか起こらず、その時にはかなりの損傷がすでに生じ ているので、大部分の場合において害虫による襲撃時により実質的な損傷を回避 するためには不十分である。それ故、特定の穀物防御処置を農業及び園芸におい て実施することができない。しかしながら、穀物の防御に天然の防御機構を含め ることがますます目標とされているので、特定のそして適時の投与後に、その工 程に好ましくない効果を引き起こさずに十分に高い程度にそして十分に迅速に植 物自身の防御機構（例えば、害虫に対して有毒な、もしくは害虫を排斥する物質 、または組織壊死を引き起こし、従って害虫のさらなる拡散を防ぐ物質の形成） を誘導するために適当な化学薬品（合成または天然の低分子量物質）を見いだす ことが必要である。そのような適当な化学薬品の発見は、現在まで困難でそして 面倒であった。それ故、そのような誘導の可能性に関して化学薬品を大規模にで も試験する ために簡単に用いることができる試験方法が非常に望まれている。化学薬品の制 御下にあるプロモーター及び容易に検出できる酵素をコードする配列を含むある 種のＤＮＡ配列を植物のゲノム中へ組み込み、そして得られた植物を化学薬品に よるプロモーターの誘導性に関して試験することがすでに知られている（ＥＰ− Ａ第０ ３３２ １０４号を参照）。しかしながら、先行する類似技術の試験系 は全て、病原菌に加えて化学薬品に対してだけでなく他の非生物的な刺激（例え ば、傷、熱または光への露出、明／暗周期、重金属）に対しても反応するいわゆ るＰＲ（「病原菌に関連した」）プロモーターを利用する。それ故、これらの試 験系は比較的誤りを起こしやすく、そしてかなりの程度の誤った解釈、従って不 正確な結果を導く可能性がある。 今回、相互に直接５’−３’方向に続く以下の構成要素、 １．植物における活性化のために適し、そして植物防御機構を全身的に誘導する ことができる因子により活性化することができるプロモーター、 ２．それに続くホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）−Ｎ −アセチルトランスフェラーゼ（以下、「ＰＡＴ」とも呼ぶ）をコードするＤＮ Ａ配列、及び、 ３．それに続く植物において機能する終結配列、 から成る新規なＤＮＡ配列（以下に「ＤＮＡ配列Ｉ」と呼ぶ）が見いだされた。 植物防御機構を誘導することができる因子は、化学薬品そうでなければ微生物 、それらの代謝産物及び微生物からの抽出物であり、好ましくは化学薬品である 。 本発明のための化学薬品は、合成のまたは天然に見いだされる有機化 合物を意味すると理解され、好ましくは低分子量の有機物質であるが、特に好ま しくは誘発剤として（すなわち防御物質または防御機構を誘導する物質として） 植物において天然に見いだされないものであり、そして特に植物において天然に 見いだされないものである。特に好ましくは、天然に見いだされない合成の有機 低分子量物質である。 植物における活性化のために適し、そして植物防御機構を全身的に誘導するこ とができる好ましく用いられるプロモーターは、植物に由来するプロモーターで ある。植物に由来する好ましく用いられるプロモーターは、誘導された全身的な 耐性をもたらすことに適し、そして化学的な耐性誘導物質（例えば、サリチル酸 ナトリウム、ジクロロイソニコチン酸またはプロベナゾール（ｐｒｏｂｅｎａｚ ｏｌｅ））により同時に活性化することができるものである。 誘導された全身的な耐性をもたらすことができる多数のプロモーターが文献に おいてすでに開示されている（例えば、ＥＰ−Ａ第０ ６４８ ８３９号、ＥＰ −Ａ第０ ５１６ ９５８号、ＥＰ−Ａ第０ ５３３ ０１０号、ＥＰ−Ａ第０ ３０９ ８６２号、ＥＰ−Ａ第０ ４８０ ２３６号、ＥＰ−Ａ第０ ４６４ ４６１号及びＥＰ−Ａ第０ ４１２ ３８１号を参照）。 この分野の一般的な知識及び一般的に通例の方法を用いて、当該技術分野の熟 練者は、これらの既知のプロモーターの中から耐性誘導物質（例えば、サリチル 酸ナトリウム、ジクロロイソニコチン酸またはプロベナゾール）により誘導する ことができ、そして本発明を実施するために適しているものを容易に選択するこ とができる。 好ましくは、植物に由来し、そして植物防御機構を全身的に誘導する ことができるが、（例えば、傷、熱、光への露出または明／暗周期のような）他 の非生物的な刺激により活性化することができないプロモーターが用いられる。 本発明により、好ましくは、上記の欧州特許出願公開明細書（Ｅｕｒｏｐｅａ ｎ Ｏｆｆｅｎｌｅｇｕｎｇｓｓｃｈｒｉｆｔｅｎ）において記述されているプ ロモーターがＤＮＡ配列Ｉの成分１として用いられる。好ましく用いられる他の プロモーターは、ジャガイモｐｒｐ１−１プロモーターであり、これも文献から 既知である。活性を向上するために、ＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡプロモーターの一 部（好ましくは位置−４８ないし＋８）をプロモーターの下流に配置することも できる。 本発明により特に好ましく用いられるプロモーター（ＤＮＡ配列Ｉの成分１） は、ビチスビニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）Ｖｓｔ１プロモーター の領域（位置＋７２ないし−５５２）またはジャガイモｐｒｐ１プロモーターの 位置−４０２から−１３０までの領域であり、特に好ましい態様において、位置 −４６ないし＋８のＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡプロモーター領域がｐｒｐ１プロモ ーター領域の下流に配置される。 ビチスビニフェラに由来するＶｓｔ１プロモーターまたはこのプロモーターを 含んでいる遺伝子は、ＥＰ−Ａ第０ ４６４ ４６１号において開示されており 、そしてプラスミドｐＶＳｔ１、ｐＶＳｔ２及びｐＶＳｔ１２ｔ３に位置する。 エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株エシェリキア コ リ フィア（Ｆｉｅｒ）１ ｐＶＳｔ１はプラスミドｐＶＳｔ１を保有する。エシ ェリキア コリ株エシェリキア コリ フィア２ ｐＶ Ｓｔ２はプラスミドｐＶＳｔ２を保有する。エシェリキア コリ株エシェリキア コリ フィア ｐＶＳｔ１２ｔ３はプラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３を保有する。これ らの株は、上記のＥＰ出願と関連して特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に 関するブダペスト条約の規定に従って、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙに寄託された（寄託日：エシェリキ ア コリフィア１ ｐＶＳｔ１及びフィア２ ｐＶＳｔ２：１９９０年６月１８日 、並びにエシェリキア コリ フィア ｐＶＳｔ１２ｔ３：１９９１年２月１１日 ）。 株エシェリキア コリ フィア１ ｐＶＳｔ１は寄託番号ＤＳＭ６００２を与え られ、株エシェリキア コリ フィア２ ｐＶＳｔ２は寄託番号ＤＳＭ６００３を 与えられ、そして株エシェリキア コリ フィアｐＶＳｔ１２ｔ３は寄託番号６３ ４６を与えられた。 当該技術分野の熟練者は、簡単な常法を用いて微生物及びその中に含まれたプ ラスミドからプロモーターを単離することができる。 完全なＶｓｔ１遺伝子がビチス ビニフェラから単離され（Ｒ．Ｈａｉｎ等（ １９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６１：１５３−１５６；Ｗ．Ｗｉｅｓｅ等（１９９ ４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６：６６７−６７７）、そして同一起源 及び異種起源の系においてその誘導発現が試験された。ＤＮＡ配列Ｉに用いられ るＶｓｔ１プロモーター領域は、ＰＣＲ技術を用いて増幅され、そして続いて以 下に記述するようにＰＡＴをコードしている領域につながれた。 ｐｒｐ−１プロモーターは、Ｊ．Ｔａｙｌｏｒ等（Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉ ｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（１９９０）３：７２−７７）及びＮ． Ｍａｒｔｉｎｉ等（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９３）２３６：１７９ −１８６）の発表から既知である。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ） ３５ＳＲＮＡプロモーターも文献（Ｂｅｎｆｅｙ ＆ Ｃｈｕａ（１９９０）Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ２５０：９５９−９６０を参照）から既知である。 エシェリキア コリ株エシェリキア コリ ＧＳｐＥＴＶｇｕｓ２７−１は、ジ ャガイモｐｒｐ１プロモーターを含むプラスミドｐＥＴＶｇｕｓ２７−１を保有 する（Ｎ．Ｍａｒｔｉｎｉ等（１９９３）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３６ ：１７９−１８６及びＷＯ第９３／１９ １８８号）。このエシェリキア コリ 株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に 従って、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｍ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓ ｃｈｗｅｉｇ、Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙに寄 託された。これは、寄託番号ＤＳＭ９６２７が与えられた（寄託日１９９４年１ ２月２０日）。以下に記述するように、位置−４０２から−１３０まで（２７２ ｂｐ）のｐｒｐ１−１プロモーター領域をＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡプロモーター のＴＡＴＡボックス領域（位置−４６ないし＋８）と一緒にプラスミドｐＥＴＶ ｇｕｓ２７−１からＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII制限フラグメントとして単離する ことができる。 本発明に用いることができ、そしてホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトラン スフェラーゼ（「ＰＡＴ」）をコードするＤＮＡ配列は既知で ある。 好ましくは、ストレプトミセス ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ ｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）から（「ｐａｔ遺伝子」）または ストレプトミセス ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏ ｓｃｏｐｉｃｕｓ）から（「ｂａｒ遺伝子」）のＰＡＴをコードしている領域が 用いられ、特に好ましくはｐａｔ遺伝子をコードしている配列が用いられる。 ストレプトミセス ビリドクロモゲネスからのＰＡＴをコードしている配列は 、文献（Ｗ．Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ等（１９８８）Ｇｅｎｅ ７ ：１４２−１５１）から既知である。 ストレプトミセス ビリドクロモゲネスからのホスフィノトリシン−Ｎ−アセ チルトランスフェラーゼをコードしているｐａｔ遺伝子の代わりに、ストレプト ミセス ヒグロスコピカスからのｂａｒ遺伝子を用いることも可能である。ｂａ ｒ遺伝子も文献（Ｍ．ＤｅＢｌｏｃｋ等（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１ ３−２５１８；Ｃ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１ ９−２５２３）から既知である。ストレプトミセス ヒグロスコピカスからのｂ ａｒ遺伝子は、ＥＰ−Ａ第０ ２４２ ２４６号にも記述されている。ストレプ トミセス ヒグロスコピカスからのｂａｒ遺伝子の完全なコーディング領域は、 ｐＵＣ１９中の１．６５ｋｂ ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてベクタ ーｐＢＧ３９中に存在する。ＥＰ−Ａ第０４２ ２４６号により、ｐＢＧ３９は 、寄託番号ＤＳＭ３６０７で１９８５年１２月１２日にゲッチンゲン（ドイツ） のＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖ ｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）に寄託された。 ｂａｒ遺伝子のコーディング領域は１８４アミノ酸からなり、これを一般的に 知られている方法によりＰＣＲ技術を用いて増幅し、そして適当なプロモーター 及び終結配列につなぐことができる。 この場合、バクテリアの遺伝子は、真核生物において用いられるＡＴＧ開始コ ドンの代わりに翻訳開始コドンとしてＧＴＧを有することに気をつけなければな らない。従って、開始コドンを植物における発現のために適するように修正しな ければならない。このために、ＰＣＲ増幅のために用いられるオリゴヌクレオチ ド（プライマー）が正しく選択される（以下の実施例Ｂｃを参照）。これらの２ つの遺伝子の発現は、植物においてホスフィノトリシンに対する耐性を与える。 ドイツ特許公開ＤＥ−Ａ第３６ ２８ ７４７号にも記述されているストレプ トミセス ビリドクロモゲネスからのｐａｔ遺伝子を、例えば、ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕ ｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙの一般的な収集物）または（ブダペスト条約の 規定に従って、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍ ｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ、Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉ ｇ、Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙに寄託された） ＤＳＭ４１１２のストレプトミセス ビリドクロモゲネスの全ＤＮＡから得るこ とができる（ＤＥ−Ａ第３６ ４２ ８２９号Ａ１及びＥＰ−Ａ第０ ２７５ ９５７号を参照）。 本発明のＤＮＡの成分３として用いられる転写終結配列として適当なものは、 植物において機能するあらゆる転写終結配列である。以下のもの、すなわちＣａ ＭＶからの３５Ｓ ＲＮＡ転写終結配列並びにブドウの蔓（ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ）（ＥＰ−Ａ第０ ４６４ ４６１号を参照）またはラッカセイ（ＥＰ−Ａ第０ ３０９ ８６２号を参照）からのスチルベンシンターゼ遺伝子、ピノシルビン シンターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ第０ ５３３ ０１０号を参照）、ビベンジルシン ターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ第０ ６４８ ８３９号を参照）及びＣＣｏＡＭＴ遺伝 子（ＥＰ−Ａ第０ ５１６ ９５８号を参照）の転写終結配列を例としてそして 好ましいものとして挙げることができる。非常に特に好ましくは、アグロバクテ リウム チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ ｅｎｓ）からのノパリンシンターゼ遺伝子（「ｎｏｓ遺伝子」）の転写終結配列 が用いられる。 ＤＮＡ配列の成分３として非常に特に好ましく用いられるものであるアグロバ クテリウム チュメファシエンスからのノパリンシンターゼ遺伝子（「ｎｏｓ遺 伝子」）の転写終結配列は既知であり、または一般的に知られている方法により 得ることができる（Ａ．Ｄｅｐｉｃｋｅｒ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７４を参照）。 本発明の非常に特に好ましいものは、相互に直接５’−３’方向に続く以下の 構成要素、 １．ビチス ビニフェラＶｓｔ１プロモーターの位置＋７２から−５５２までの 領域（６２４ｂｐ）、 ２．それに続く、ホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトランスフェラー ゼ（ＰＡＴ）−ストレプトミセス ビリドクロモゲネスからのｐａｔ遺伝子のコ ーディング領域、及び、 ３．それに続くアグロバクテリウム チュメファシエンスのノパリンシンターゼ 遺伝子「ｎｏｓ」の転写終結配列、 からなり、そして以下に「ＤＮＡ配列II」と呼ばれるＤＮＡ配列Ｉである。 本発明のさらに非常に特に好ましいものは、相互に直接５’−３’方向に続く 以下の構成要素、 １．ジャガイモｐｒｐ１−１プロモーターの位置−４０２から−１３０までの領 域（２７２ｂｐ）及び それに続くＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡプロモーターの領域（ＴＡＴＡボックス 領域）（位置−４６ないし＋８）、 ２．それに続く、ホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡ Ｔ）−ストレプトミセス ビリドクロモゲネスからのｐａｔ遺伝子のコーディン グ領域、並びに、 ３．それに続くアグロバクテリウム チュメファシエンスのノパリンシンターゼ 遺伝子「ｎｏｓ」の転写終結配列、 からなり、そして以下に「ＤＮＡ配列III」と呼ばれるＤＮＡ配列Ｉである。 存在する先行する類似技術を考慮すると、植物防御機構を誘導することができ る因子を検出するために本発明のＤＮＡ配列Ｉ並びにＤＮＡ配列II及びIIIを特 に都合よく用いることができることは意外である。現在までに開示されているホ スフィノトリシン耐性において、関係するコーディング配列はいつも構成的に発 現され、これは予想されるように高い レベルの耐性をもたらす。しかしながら、植物において誘導することができるプ ロモーターが用いられる本発明の構築物が、本発明のスクリーニング方法のため に十分に高いホスフィノトリシン耐性を生じることは意外であり、そして当該技 術分野の熟練者は予想することができなかった。 ＤＮＡ配列Ｉ並びにＤＮＡ配列II及びIIIという用語は、上記の成分１ないし ３からなるＤＮＡ配列を意味すると理解されるものである。しかしながら、この 用語は、ＤＮＡ配列Ｉ、II及びIIIに由来するＤＮＡ配列も含む。由来するＤＮ Ａ配列は、本質的にＤＮＡ配列Ｉ、II及びIIIに相当し、そして本発明に用いる ことができるＤＮＡ配列である。例えば、これらは、ＤＮＡ配列Ｉ、IIまたはII Iを本発明のそれらの機能を損なわない、または本質的に損なわないように含ん でなるＤＮＡ断片である。そのようなＤＮＡ断片を、例えば、制限酵素を用いて より大きいＤＮＡ断片からＤＮＡ配列Ｉ、II及びIIIを切り取る場合に生じるこ とができる。ＤＮＡ配列Ｉ、II及びIIIは、それらの末端に各場合において扱わ れる方法に適するように適合するＤＮＡ配列（例えば、いわゆるリンカー）を付 けることもできる。さらに、ＤＮＡ配列Ｉ、IIまたはIIIの一つまたはそれより 多いＤＮＡまたはＤＮＡ断片を、遺伝子コードの縮重によるＤＮＡの変形から生 じることができるような本質的に等しく作用する他のＤＮＡまたはＤＮＡ断片に より置き換えることができる。 本発明の使用のために、ＤＮＡ配列ＩまたはＤＮＡ配列IIもしくはIIIは植物 のゲノム中に組み込まれる。得られたトランスジェニック植物もしくは葉、茎、 根、花及び種子のような植物器官、またはこれらの部分もしくは（プロトプラス トを含む）細胞、カルスなどを、誘導効能に関 して調べられる化学薬品と接触させる。そのような誘導効能が存在する場合、ｐ ａｔまたはｂａｒ遺伝子の配列は酵素ホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトラン スフェラーゼ（ＰＡＴ）を生じ、これまたはその活性を試験植物のホスフィノト リシン耐性に基づきまたは酵素アッセイにおいて定性的または定量的に測定する ことができる。このように、実施が容易で、そして誘導特性に関して多数の試験 物質でも比較的迅速にそして確かに試験することができる試験系を構築すること が可能である。この試験系の特別な利点は、陽性の結果を有する物質が、Ｖｓｔ １またはｐｒｐ１−１プロモーターを活性化するだけでなく、害虫に対する防御 のための植物遺伝子の他のプロモーター、特にフィトアレキシン遺伝子のプロモ ーター及びＰＲプロモーターも誘導するために通例適しているということでもあ る。従って、本発明の方法により、適当な化合物を多数の化学薬品の中から迅速 にそして確実に決定することができ、そして次に場合によってはこれらの化合物 をさらなる研究のために特に用いることができる。本発明の方法により、試験植 物が試験物質での処理後に処理されるホスフィノトリシンの除草作用を観察する ことにより試験物質の遺伝子活性化の潜在能力を簡単に目で見て評価することが でき、従って酵素レベルでの分析を必要としない。従って本発明は、潜在的に植 物遺伝子を誘導することができ、従って害虫制御のための穀物防御因子として適 している有機化合物を簡単な常法を用いて多数の有機化合物から選択することが できる試験方法に関する。誘導される植物防御遺伝子は、好ましくは、植物病原 体の微生物害虫による、好ましくは真菌、バクテリアまたはウイルスによる、特 に好ましくは植物病原体の真菌による襲撃に対して植物の防御をもたらす遺伝子 である。 従って、本発明は、植物害虫に対して植物自身の防御機構を誘導するために適 する化学薬品を検出するための、ＤＮＡ配列Ｉ（またはＤＮＡ配列II及びIII） 並びにゲノム中にＤＮＡ配列Ｉ（またはＤＮＡ配列IIもしくはIII）またはそれ に由来するＤＮＡ配列を含んでなるトランスジェニック植物または植物器官の使 用にも関する。本発明はさらに、植物防御機構を誘導することができる因子を検 出するための、植物における誘導性植物プロモーターと連結したレポーター遺伝 子としてのホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードして いるＤＮＡ配列の新規な使用にも関する。 従って、本発明はさらに、ＤＮＡ配列Ｉ（またはＤＮＡ配列IIもしくはIII） またはそれに由来するＤＮＡ配列をゲノム中に含んでなるトランスジェニック植 物または植物器官における誘導効能に関して調べられる化学薬品と接触させ、そ してホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼの増加した発現、従 ってホスフィノトリシンに対する増加した耐性をもたらす物質を選択することを 特徴とする、植物害虫に対する植物自身の防御機構を誘導するために適する化学 薬品を検出するための方法にも関する。 本発明に用いることができ、そしてゲノム中にＤＮＡ配列Ｉを含んでなる試験 植物は、実質的に全ての植物である。好ましくは、検出される耐性誘導物質を害 虫制御のために用いることを意図する植物が用いられる。中でも、これらは、農 業及び森林のために、鑑賞用及び薬用植物の生産のために、そして植物育種のた めに重要である植物を含む。しかしながら、試験植物として特に好ましく用いら れる植物は、試験研究所で容易に取り扱うことができ、そして迅速にそして容易 に増殖するもので ある。非常に特に好ましいものとして述べることができるトランスジェニック植 物は、アラビドプシス サリアナ、トマト及びタバコであり、特にタバコである 。 本発明は、ＤＮＡ配列Ｉ（またはＤＮＡ配列IIもしくはIII）をゲノム中に含 んでなる（植物器官及び種子、切り枝、塊茎、細胞、プロトプラスト、カルスな どのような増殖材料を含む）新規な植物も含む。本発明による好ましい新規な植 物は、アラビドプシス サリアナ、トマト、ジャガイモ及びタバコであり、非常 に好ましくはタバコである。 本発明は、 （ａ）ＤＮＡ配列Ｉ（またはＤＮＡ配列IIもしくはIII）またはそれに由来する ＤＮＡ配列が（プロトプラストを含む）植物細胞のゲノム中へ導入され、そして 場合によっては、 （ｂ）形質転換された植物細胞から完全な形質転換植物が再生され、そして場合 によっては増殖され、そして、 （ｃ）場合によっては、親世代またはそれから得られた他の世代の得られたトラ ンスジェニック植物から植物増殖材料を含む適切な植物器官が得られる、 ことを特徴とする、（植物器官及び増殖材料を含む）本発明の新規なトランスジ ェニック植物の産生方法にも関する。 本発明は、上記の方法により得ることができるトランスジェニック植物も含む 。 方法の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を既知の手順及び方法により通例のよう に行うことができる。 試験方法を行うために、試験される有機化学薬品は、好ましくは水に 溶解される。水に限られた可溶性を示す物質の場合、アセトン、ジメチルホルム アミド、ジメチルスルホキシド、メタノールまたはエタノールのような生理学的 に受容しうる有機溶媒中に溶液をまず調製することが好ましい。この溶液を次に 水で希釈する。試験溶液は、好ましくは５％未満（重量パーセント）、特に好ま しくは１％未満の有機溶媒を含んでならなければならない。 試験溶液中の試験物質の濃度は、広い範囲内で変えることができ、そして試験 物質の可溶性及び試験方法の関連する細目、例えば試験のために選択された試験 植物または植物器官の感受性により決まり、そして当該技術分野の熟練者は、簡 単な通例の実験において、例えばサリチル酸ナトリウム、ジクロロイソニコチン 酸またはプロベナゾールのような例えば既知の耐性誘導物質を用いて決定するこ とができる。試験系をその実用性に関して調べるために、試験系を調整するため に、そして一般的な状況に適合するように最適化するためにもこれらの物質を用 いることができる。試験物質は、好ましくは５μＭないし２０，０００μＭ、特 に好ましくは１００μＭから１０，０００μＭまで、そして非常に特に好ましく は５０μＭから５，０００μＭまでの濃度で用いられる。強酸性または強塩基性 の化合物の場合、通常のバッファー溶液を添加することにより生理学的に受容し うる範囲にｐＨをすることが有益であることができる（好ましくはｐＨ４．５な いし７．５）。しかしながら、そのようなｐＨ調整は、通例必要ではない。表面 添加のためには、通例の湿潤剤の一つを植物材料の湿気（ｗｅｔｔｉｎｇ）を向 上するために加えることもできるが、この湿潤剤自身が誘導特性を有さないこと に気をつけなければならない。 同様に、ホスフィノトリシン濃度を広い範囲内で変えることができる。植物、 その年齢、植物器官、遺伝子型及び表現型因子などにより、０．１ｋｇ／ｈａ及 び１０ｋｇ／ｈａの間のホスフィノトリシンの添加の通例の割合に相当するホス フィノトリシン濃度を用いることができる。各場合においてホスフィノトリシン の添加の最適な割合を簡単な一連の試験により容易に決定することができる。 すでに上に述べたように、完全な植物の形態で、そうでなければ植物器官の形 態で、好ましくは葉、葉の一部、茎または茎の一部の形態で試験植物を本発明の 試験方法のために用いることができる。そのまままたは植物器官もしくはそれか ら得られた部分（例えば葉の切片）の形態で用いられる試験植物は、少なくとも ４枚葉の段階に達していなければならず、すなわち子葉の後に生える少なくとも 最初の完全に形成された葉を有さなければならない。一般的な条件により、この 段階はタバコに対しては２０ないし２２℃及び約１０，０００ルクスの照度で土 壌中種子から開始して約１４ないし２１日後に達せられる。必要な場合、栽培期 間中若い植物を、例えばそれらを覆うことにより過度に多い水の蒸発から保護す ることができる。試験植物の大きさ及び年齢を実質的に変えることができる。４ 枚葉の段階またはそのすぐ後に続く成長段階に達した小さく若い植物が、適切に そして好ましく用いられる。特に好ましくは、４枚葉の段階の試験植物が用いら れる。 あらゆる適切な方法で、例えば噴霧または塗布することにより、溶解した試験 物質を植物または植物材料と接触させることができる。植物材料を試験物質の溶 液中に浸すまたは置くこともできる。これらの表面添加の方法に加えて、植物ま たは植物器官の根または維管束を通して試験 物質の取り込みを達成することも可能である。このために、試験物質の取り込み ができるように十分に長い期間、完全な植物の根、植物の茎または葉柄を試験溶 液中に浸す。好ましくは、添加は根を通して行われる。露出時間は、好ましくは １及び９６時間の間、特に好ましくは２及び７２時間の間、そして非常に特に好 ましくは２４及び４８時間の間である。インキュベーションは、好ましくは、通 常の照明または通常の光源付き培養室の照明下で行われ、植物に対して通常の明 暗周期性（例えば１６時間の光、８時間の暗黒）に従うことが適切である。イン キュベーションは、好ましくは１５及び３０℃の間、特に好ましくは１８及び２ ８℃の間の温度で行われる。 除草剤のホスフィノトリシンの添加を試験される化学薬品の処理と同時に、ま たは試験される化学薬品の処理に続く異なる長さの期間の後に行うことができる 。調べられるものが土壌に植えられた完全な植物である場合、試験物質またはホ スフィノトリシンで処理された試験植物は、温室条件下（２０−２５℃、約１０ ，０００ルクス及び６０％の相対大気湿度）でインキュベートされ、そして底面 からのみ給水される。ホスフィノトリシン処理後３−２１日目に評価が行われる 。このために、試験物質の耐性誘導効果は、ホスフィノトリシンのみで処理され たコントロールの植物と比較した試験植物のホスフィノトリシン耐性に基いて評 価される。葉の大きさ、成長速度、葉の損傷などのような規準を用いることがで きる。加えて、インビトロのホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトランスフェラ ーゼ活性を測定することにより、試験物質の遺伝子活性化潜在能力をより詳細に 分析することができる。 本発明の他の可能な態様において、試験物質は若い試験植物の根を通 して添加される。この場合、物質は根により取り込まれ、そして維管束系を通し て植物に分配される。次に試験が行われ、そして記述したように評価される。 本発明の試験方法の処置が、増加したホスフィノトリシン耐性の測定、すなわ ち、例えば、コントロール植物と比較して試験物質で処理した試験植物の増加し た植物成長またはホスフィノトリシンにより引き起こされる植物損傷の減少をも たらす場合、適切な誘導特性を有すると考えることができる試験物質が存在する 。この際、コントロール植物を処理する試験溶液は、必要な場合適当な濃度で用 いる有機溶媒及び／または用いる界面活性剤を含む水である。ホスフィノトリシ ン耐性のレベルは、通常、当該試験物質の誘導能力と相関関係がある。 ゲノム中にＤＮＡ配列Ｉ（またはＤＮＡ配列IIもしくはIII）を含んでなり、 そして本発明の試験方法のための試験植物として用いることができるトランスジ ェニック試験植物を、一般的に通例の方法により得ることができる。 多数の様々な方法が、ＤＮＡ配列Ｉ（またはＤＮＡ配列IIもしくはIII）を植 物または植物細胞の遺伝子材料中へ導入するために利用できる。すでに述べたよ うに、一般的に通例の既知の方法によりＤＮＡ導入を行うことができ、そして当 該技術分野の熟練者は特定の場合に適している方法を決定し、そして行うことが 容易にできる。 他に特定しないかぎり、この本文に記述された全てのパーセンテージは重量パ ーゼントをいう。 本発明の試験方法及び本発明に用いることができるトランスジェニック植物の 産生は、以下の実施例により例示されるが、制限としてではな い。実施例において「ＰＰＴ」はホスフィノトリシンである。実施例 Ｉ．実施例Ａ （試験手順） ａ）ホスフィノトリシン耐性の試験植物の栽培及び処理 ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）耐性のタバコ植物を温室条件下（２２℃、６０ ％の相対大気湿度、約１５，０００ルクス）で開花時期に達するまで成長させ、 そして雑種（Ｆ１）世代を得るために自家受粉させる。Ｆ１世代の種子を７５μ ｇ／ｍｌカナマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＬＳ培地での滅菌培養で前以て選択 し、そして耐性のＦ１実生を２週間後に土壌中へ移す。さらに６−１４日後に、 これらの植物に試験される様々な化学薬品／活性化合物の試験水溶液（５−２０ ，０００μＭ）を噴霧し、そして続いて様々な間隔でＰＰＴ（０．１−１０ｋｇ ／ｈａ）で処理した。用いた陰性コントロールは、ＳＲ１野生型実生またはカナ マイシン耐性遺伝子（ｎｐｔII）を含むが、プロモーター／ｐａｔまたはプロモ ーター／ｂａｒの融合を含まない導入プラスミドのみを保有するタバコ実生であ る。Ｆ１植物に対するスクリーニング試験に平行して、トランスジェニック系当 たり約１０のＦ１植物を自家受粉させ、そしてホモ接合体の子孫を同定するため にＦ２種子をカナマイシンを含んでいるＬＳ培地上に置く。次にホモ接合体のＦ ２種子を直接土壌中にまき、そしてタバコ実生を約１０日後に移植し、そしてさ らに５−１４日後にＦ１実生のように処理する。噴霧を噴霧室中で行う。このた めに、各場合において約８０植物／ｍ²を同時に噴霧するように３．０バールの 圧力で１ｍ²の領域に対して５０ｍｌの試験またはＰＰＴ溶液を均一に散布する 。 ｂ）誘導物質で処理したタバコ実生の評価 実生の年齢及び添加したＰＰＴ濃度により、５−２０日後に各場合において最 も大きい葉を測定することにより植物の成長を評価する。加えて、これらの葉を 誘導化学薬品で処理するとすぐにあらゆる葉の損傷に関して調べる。ＰＰＴ処理 後の様々な間隔での繰り返された評価は、様々な化学薬品による遺伝子の活性化 またはＰＰＴ耐性の誘導が時間の経過中に非常に変わる可能性があるので、非常 に有用であるとわかった。物質が耐性誘導効果を示す場合、簡単な酵素試験（Ｍ ．ＤｅＢｌｏｃｋ等（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１３−２５１８及びＭ ．ＤｅＢｌｏｃｋ等（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：６９４− ７０１）を用いて時間経過及び遺伝子活性化のレベルをより詳細に分析し、そし て定量的に測定することができる。 ｃ）実験結果 実験１ ストレプトミセス ビリドクロモゲネスｐａｔ遺伝子を含むＤＮＡ配列IIIを 保有しているタバコ植物をＰＰＴ耐性試験に供した。すなわち、Ｆ２世代のホモ 接合体の実生を植え付け、そしてその後１６日目にプロベナゾール（１ｍＭ）、 コントロール試験溶液として水及び５−クロロサリチル酸（１ｍＭ）で処理した 。２４時間後に、植物に２ｋｇ／ｈａ ＰＰＴを噴霧した。ＰＰＴ処理後１週目 に、耐性誘導物質で処理した試験植物の葉は、水だけで処理した植物のものより かなり大きかった。 実験２ ストレプトミセス ビリドクロモゲネスｐａｔ遺伝子を含むＤＮＡ配列IIIを 保有しているタバコ植物をＰＰＴ耐性試験に供した。すなわち、 Ｆ２のホモ接合体の実生を植え付け、そしてその後２０日目に１０ｍＭサリチル 酸ナトリウムまたは水で処理し、そして４ｋｇ／ｈａ ＰＰＴを２４時間後に添 加した。用いたコントロールは、野生型植物及びカリフラワーモザイクウイウス からの構成的３５Ｓ ＲＮＡプロモーターの下にＰＰＴ耐性ｐａｔ遺伝子を含む 植物であった（Ｗ．Ｄｒｏｇｅ等（１９９２）Ｐｌａｎｔａ １８７：１４２− １５１）。 サリチル酸ナトリウムで処理した試験植物の葉は、水だけで処理した植物のも のよりかなり大きかった。サリチル酸ナトリウムで処理した植物の葉の大きさは 、構成的ＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡプロモーターを含むコントロール植物のものに 相当した。野生型の植物は、４ｋｇ／ｈａＰＰＴにより処理後数日であらゆる成 長が停止する程度まで損傷を受け、そしてこれらの植物は枯れた。II ．実施例Ｂ ａ）ＤＮＡ配列IIを得るためのクローニング方法 以下の配列番号１及び配列番号２の配列のプライマー（図１及び図２も参照） を用いたＰＣＲ技術を用いて、ビチス ビニフェラＶｓｔ１プロモーターの位置 ＋７２から−５５２までの領域（６２４ｂｐ）を増幅した。 用いた鋳型は、ＥＰ−Ａ第０ ４６４ ４６１号のプラスミドｐＶＳｔ１２ｔ ３であり、これは、ＤＳＭ６３４６のエシェリキア コリ株エシェリキア コリ フィアｐＶＳｔ１２ｔ３中に存在する。 次に、ビチス ビニフェラＶｓｔ１プロモーターの位置＋７２から−５５２ま での配列を含む増幅されたフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で切断した。得られたＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII Ｖｓｔ １プロモーターフラグメントをストレプトミセス ビリドクロモゲネスｐａｔ遺 伝子のコーディング領域及びアグロバクテリウム チュメファシエンスのノパリ ンシンターゼ遺伝子のポリＡ付加配列を含むベクター ７，：１４２−１５１）からのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント（約９０ ０ｂｐ）と一緒にＨｉｎｄIIIで直鎖状にしたバイナリーベクターｐＰＣＶ００ ２（Ｃ．Ｋｏｎｃｚ及びＪ．Ｓｃｈｅｌｌ（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ ｅｔ．２０４：３８３−３９６）に連結した。得られた構築物ｐＶＳｔ１ＰＡＴ において、ｐａｔ遺伝子のコーディング領域は、（−５５２までの）Ｖｓｔ１プ ロモーターの制御下にある。ｐＶＳｔ１ＰＡＴは、ＤＮＡ配列IIに相当する。 ｂ）ＤＮＡ配列IIIを得るためのクローニング方法（図４参照） ソラナム ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）ｐｒｐ１−１ プロモーターの領域（位置−４０２ないし−１３０）をそれに続くＣａＭＶ ３ ５Ｓ ＲＮＡプロモーターの領域（ＴＡＴＡボックス領域）（位置−４６ないし ＋８）と共にベクターｐＥＴＶｇｕｓ２７−１（Ｎ．Ｍａｒｔｉｎｉ等（１９９ ３）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３６：１７９−１８６）からＥｃｏＲＩ／ ＨｉｎｄIIIフラグメント（３２６ｂｐ）として単離し、そしてバイナリーベク ターｐＰＣＶ００２（Ｃ．Ｋｏｎｃｚ及びＪ．Ｓｃｈｅｌｌ（１９８６）Ｍｏｌ ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：３８３−３９６）のマルチクローニング部位に 挿入した（→ｐＰＲＰ１−１Ｐｒｏ）。ストレプトミセス ビリドクロモゲネス ｐａｔ遺伝子のコーディング領域をアグロバクテリウム チュメファシエンスの ノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）の転写終結シグナルと ｎｔａ １８７：１４２−１５１）からＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント （約９００ｂｐ）として精製した。バクテリアのｐａｔ遺伝子は、植物における 効率よい発現が可能であるような修正された形態でベクターｐＷＤ２６．４１中 にすでに存在する。９００ｂｐのフラグメントをＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩオリ ゴヌクレオチドリンカー（以下を参照）につなぎ、このリンカーは、そのＨｉｎ ｄIII制限切断部位が次のＨｉｎｄIII制限消化によってのみ生じるように配置さ れている。得られたＨｉｎｄIIIフラグメントを、ｐａｔ遺伝子のコーディング 領域がｐｒｐ１−１プロモーターの制御下にあるように構築物ｐＰＲＰ１−１Ｐ ｒｏのＨｉｎｄIII制限切断部位へ連結した（-＞ｐＰＲＰ１−ＰＡＴ（＝ＤＮＡ 配列III）。 用いたＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩオリゴヌクレオチドリンカーは、配列番号３ のオリゴヌクレオチドからなった（図３を参照）。 ｃ）ストレプトミセス ヒグロスコピカスからのｂａｒ遺伝子を含むＤＮＡ配列 IIを得るための実施例 １．ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ（５’→３’）制限フラグメントとしてのｂａｒ遺 伝子のコーディング領域の増幅 ｂａｒ遺伝子を配列番号４及び配列番号５の配列のプライマー（図５及び６も 参照）を用いてＰＣＲ反応において増幅し、続いて制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃ ｏＲＩで制限消化する。 ２．ポリＡシグナルとｂａｒ遺伝子の融合 得られたＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ（５’→３’）フラグメント（５５ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５８９０）からあらかじめＥｃｏＲＩ／ ＨｉｎｄIII（５’→３’）フラグメント（約２５０ｂｐ）として単離したカリ フラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡのポリＡ付加シグナルにつなぐ。 ３．ブドウの蔓Ｖｓｔ１プロモーターへのｂａｒ遺伝子の融合 ｂａｒ遺伝子及びポリＡ配列からなる得られたＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII（５ ’→３’）フラグメントを一般的に通例の方法を用いて精製し、そしてＨｉｎｄ III／ＢａｍＨＩ（５’→３’）フラグメントとして存在するＶｓｔ１プロモー ター（ストレプトミセス ビリドクロモゲネスｐａｔ遺伝子を含むＤＮＡ配列II を得るためのクローニング方法を参照）と共に次のクローニング工程においてバ イナリーベクターｐＰＣＶ００２（Ｃ．Ｋｏｎｃｚ及びＪ．Ｓｃｈｅｌｌ（１９ ８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：３８３−３９６）のＨｉｎｄIII 切断部位に連結する。得られた構築物ｐＶＳＴ１ＢＡＲにおいて、ｂａｒ遺伝子 のコーディング領域は、Ｖｓｔ１プロモーター（−５５２まで；ＤＮＡ配列IIを 参照）の制御下にある。 ｄ）ストレプトミセス ヒグロスコピカスｂａｒ遺伝子を含むＤＮＡ配列IIIを 得るための実施例 １．ＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩ（５’→３’）制限フラグメントとしてのｂａｒ 遺伝子のコーディング領域の増幅 ｂａｒ遺伝子を配列番号６及び配列番号７の配列のプライマー（図７及び８も 参照）を用いてＰＣＲ反応において増幅し、続いて制限酵素ＨｉｎｄIII及びＢ ａｍＨＩで制限消化する。 ２．ポリＡシグナルとｂａｒ遺伝子の融合 得られたＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩ（５’→３’）フラグメント（５５ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５８９０）からあらかじめＢａｍＨＩ／ ＨｉｎｄIII（５’→３’）フラグメント（約２５０ｂｐ）として単離したカリ フラワーモザイクウイルス３５Ｓ ＲＮＡのポリＡ付加シグナルにつなぐ。 ３．ジャガイモｐｒｐ１−１プロモーターへのｂａｒ遺伝子の融合 ｂａｒ遺伝子及びポリＡ配列からなる得られたＨｉｎｄIIIフラグメントを一 般的に通例の方法を用いて精製し、そして次のクローニング工程においてベクタ ーｐＰＲＰ１−１ＰｒｏのＨｉｎｄIII制限切断部位に連結する（図４参照）。 得られた構築物ｐＰＲＰ１−１ＢＡＲにおいて、ｂａｒ遺伝子のコーディング領 域は、ソラナム ツベロサムｐｒｐ１−１プロモーターの制御下にある（ＤＮＡ 配列IIIを参照）。III ．実施例Ｃ （トランスジェニック植物の産生） １．タバコの形質転換 ａ）タバコシュートの培養及びタバコプロトプラストの単離 ニコチアナ タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）（Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ１）を滅菌シュート培養としてホルモンを含まないＬＳ培 地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ及びＳｋｏｏｇ、１９６５）で増殖させる。約６−８週 の間隔で、シュートの切片を新しいＬＳ培地へ移す。１２時間の照明の光（１０ ００−３０００ルクス）で２４−２６℃で制御された環境の部屋でシュート培養 を続ける。 葉のプロトプラストを単離するために、約２ｇの葉（約３−５ｃｍの長さ）を 新しい安全かみそりの刃を用いて小さい切片（０．５ｃｍ ｘ １ｃｍ）に切断する。この葉の材料をＫ３培地（Ｎａｇｙ及びＭａｌｉｇａ １ ９７６）、０．４Ｍショ糖、ｐＨ ５．６、２％ Ｚｅｌｌｕｌａｓｅ Ｒ１０（ Ｓｅｒｖａ）、０．５％ Ｍａｃｅｒｏｚｙｍ Ｒ１０（Ｓｅｒｖａ）からなる２ ０ｍｌの酵素溶液中で室温で１４−１６時間インキュベートする。その後すぐに 、０．３ｍｍ及び０．１ｍｍの鋼のふるいを通した濾過によりプロトプラストを 細胞残渣から分離する。濾過液を１００ ｘ ｇで１０分間遠心分離する。この遠 心分離の工程の間に、完全なプロトプラストは浮かび、そしてバンドの形態で酵 素溶液の最上部に集まる。ガラス毛細管を用いた吸引により細胞残渣のペレット 及び酵素溶液を除去する。前もってきれいにしたプロトプラストを新しいＫ３培 地（浸透剤として０．４Ｍショ糖）で１０ｍｌにし、そして再び浮かばせる。洗 浄培地を吸引で除去し、そして培養のためまたは次のアグロバクテリアでの感染 （共存培養）のためにプロトプラストを１−２ ｘ １０⁵／ｍｌに希釈する。プ ロトプラスト濃度を血球計測器で測定する。 ｂ）アグロバクテリウム チュメファシエンスとの共存培養による再生するタバ コプロトプラストの形質転換 次に用いた方法は、わずかな修正を含むＭａｒｔｏｎ等１９７９の方法である 。プロトプラストを記述されたように単離し、そして１−２ ｘ １０⁵／ｍｌの 密度でＫ３培地（０．４Ｍショ糖、０．１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌキ ネチン）中２６℃で暗黒で２日間そして弱い光（５００ルクス）の下で１ないし ２日間インキュベートする。いったん最初のプロトプラスト分裂が起こると、最 小Ａ（Ａｍ）培地中３０μｌの株ＧＶ３１０１ Ｃ５８ＣＩ ｐＭＰ９０ＲＫ：ｐ ｒｐ１−１−ＰＡ ＴもしくはＶｓｔ１−ＰＡＴまたはｐｒｐ１−１−ＰＡＴもしくはＶｓｔ１−Ｐ ＡＴを含んでいる他の適当なアグロバクテリア株のアグロバクテリア懸濁液（密 度：約１０⁹アグロバクテリア／ｍｌ）を３ｍｌの再生するプロトプラストに加 える。培養を暗黒で２０℃で３−４日間行った。次に、タバコ細胞を１２ｍｌの 遠心管に入れ、海水（６００ｍＯｓｍ／ｋｇ）を用いて１０ｍｌまで希釈し、そ して６０ ｘ ｇで１０分間ペレットにする。大部分のアグロバクテリアを除去す るためにこの洗浄工程をもう１−２回繰り返す。細胞懸濁液を１ｍｇ／ｍｌ Ｎ ＡＡ（ナフチル−１−酢酸）、０．２ｍｇ／ｌキネチン及び５００ｍｇ／ｌのセ ファロスポリン抗生物質セホタキシムを含むＫ３培地（０．３Ｍショ糖）中５ ｘ １０⁴／ｍｌの密度で培養する。細胞懸濁液を毎週新しいＫ３培地で希釈し、 そして培地の浸透価を週当たり０．０５Ｍショ糖（約６０ｍＯｓｍ／ｋｇ）ずつ 徐々に減少する。カナマイシン（１００ｍｇ／ｌカナマイシン硫酸塩）での選択 をアガロース「ビーズ型培養」（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ等、１９８３）での共存培養 後２−３週で開始する。カナマイシン耐性のコロニーを選択の開始後３−４週で バックグラウンドの遅れたコロニーから区別することができる。 ｃ）ＤＮＡでのタバコプロトプラストの直接形質転換。硝酸カルシウムＰＥＧ形 質転換 ペトリ皿に０．５μｇ／ｌのプラスミドｐｒｐ１−１−ＰＡＴまたはＶｓｔ１ −ＰＡＴを含んでなる２０μｌのＤＮＡ水溶液と１８０μｌのＫ３培地中約１０⁶ のプロトプラストを注意深く混合する。次に２００μｌの融合溶液（０．１Ｍ 硝酸カルシウム、０．４５Ｍマンニトール、２５％ポリエチレングリコール（Ｐ ＥＧ６０００）、ｐＨ ９）を注意 深く加える。１５分後に５ｍｌの洗浄溶液（０．２７５Ｍ硝酸カルシウム ｐＨ ６）を加え、そしてさらに５分後にプロトプラストを遠心管へ移し、６０ ｘ ｇ でペレットにする。ペレットを少量のＫ３培地に溶解し、そして以下の項で記述 するように培養する。代わりに、Ｈａｉｎ等、１９８５の方法によりプロトプラ ストを形質転換することもできる。 ｄ）ＤＮＡとインキュベートしたプロトプラストの培養及びカナマイシン耐性カ ルスの選択 以下に記述する培養及びカナマイシン耐性コロニーの選択のために修正したビ ード型培養技術（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ等、１９８３）を用いる。プロトプラストを ＤＮＡで処理した（ｃを参照）後１週目に、５ｃｍのペトリ皿中で３ｍｌの細胞 懸濁液を３ｍｌのＫ３培地（０．３Ｍショ糖＋ホルモン；１．２％の（Ｓｅａｐ ｌａｑｕｅ）ＬＭＴアガロース（低融点アガロース、Ｍａｒｉｎｅ Ｃｏｌｌｏ ｉｄｓ）と混合する。このためにアガロースを乾燥した形態でオートクレーブし 、Ｋ３培地を加え、そして次にこの混合物を電子レンジでしばらくの間煮沸する 。アガロースが固まった後、タバコの小カルスが中に包埋されたアガロースディ スク（「ビード」）をさらなる培養及び選択のために１０ｃｍのペトリ皿へ移し 、そして各場合において１０ｍｌのＫ３培地（０．３Ｍショ糖、１ｍｇ／ｌ Ｎ ＡＡ、０．２ｍｇ／ｌキネチン）及び１００ｍｇ／ｌカナマイシン硫酸塩を加え る。液体培地を毎週交換する。この間、培地の浸透価は徐々に減少する。 交換培地（Ｋ３＋Ｋｍ）は、週当たり０．０５Ｍショ糖（約６０ｍＯｓｍ）ず つ減少する。 ＤＮＡ形質転換後のカナマイシン耐性のタバココロニーの選択の図 0.4M 0.3M 0.25M 0.20M 0.15M 0.10M 液体培地中のショ糖 （Ｋ３培地 １ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌキネチン） Ａ＝ＤＮＡの取り込み Ｅ＝アガロースへの包埋 Ｓ＝カナマイシン（１００ｍｇ／ｌカナマイシン硫酸塩）での選択 Ｋ＝カナマイシン耐性のコロニーをバックグラウンドから明らかに区別すること ができる。 ｅ）カナマイシン耐性の植物の再生 カナマイシン耐性のコロニーが約０．５ｃｍの直径に達するとすぐに、それら の半分を再生培地（ＬＳ培地、２％ショ糖、０．５ｍｇ／ｌベンジルアミノプリ ン ＢＡＰ）へ移し、そして２４℃及び１２時間の照明の光（３０００−５００ ０ルクス）で制御された環境の部屋で育てる。他の半分を１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、 ０．２ｍｇ／ｌキネチン、０．１ｍｇ／ｌ ＢＡＰ及び１００ｍｇ／ｌカナマイ シン硫酸塩を含むＬＳ培地でカルス培養として増殖させる。再生したシュートが 約１ｃｍの長さに達すると、これらを切除し、そして発根のための成長調節剤を 含まない１／２ＬＳ培地（１％ショ糖、０．８％寒天）上におく。シュートは、 １００ｍｇ／ｌカナマイシン硫酸塩を含む１／２ＭＳ培地で根を下ろし、そして 後にこれらを土壌中へ移植する。 これらの再生物のＦ１、Ｆ２及びＦ３世代を試験植物として用いる。 ｆ）アグロバクテリウム チュメファシエンスを用いた葉のディスクの形質転換 葉のディスクの形質転換（Ｈｏｒｓｃｈ等、１９８５）のために、滅菌シュー ト培養の約２−３ｃｍの長さの葉を１ｃｍの直径のディスクを得るために穴をあ け、そしてＡｍ培地（以下を参照）中の適当なアグロバクテリア、ＧＶ３１０１ Ｃ５８ＣＩｐＭＰ９０ＲＫ::ｐｒｐ１−１ＰＡＴまたはＶｓｔ１−ＰＡＴの懸 濁液（約１０⁹／ｍｌ）（ｂを参照）と約５分間インキュベートする。感染した 葉の断片をホルモンを含まないＭＳ培地（以下を参照）で約２４℃で３−４日間 維持する。この期間の間、葉の切片はアグロバクテリウムの成長に覆われる。次 にこれらの葉の切片をＭＳ培地（０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＡＰ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＮＡＡ）中で洗浄し、そして５００ｇ／ｍｌセホタキシム及び１００ｇ／ｍｌカ ナマイシン硫酸塩を含む同じ培地（０．８％寒天）上に置く。２週間後に、培地 を新しい培地で置き換えなければならない。形質転換されたシュートはさらに２ −３週間後に明らかになる。シュートの再生を平行して選択圧力なしにも行わな ければならない。次に、再生したシュートを生化学的試験を用いて形質転換に関 して、例えば、ノパリンシンターゼまたはＰＡＴ活性に関して試験しなければな らない。このようにして、１−１０％の形質転換されたシュートを得る。形質転換の生化学的検出方法 上の実施例により得られた植物細胞及び植物（タバコ）において、ＤＮＡ配列 Ｉ（またはII及びIII）の存在をノーザンブロット分析、サザンブロット分析、 ホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ活性（Ｍ．Ｄｅ Ｂｌｏ ｃｋ等（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２５１ ３−２５１８及びＭ．Ｄｅ Ｂｌｏｃｋ等（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ ｌ．９１：６９４−７０１）及びホスフィノトリシンを含んでいる栄養培地での ホスフィノトリシン耐性により確かめた。 植物または植物細胞の形質転換に用いたいくつかの培地を以下に記述する。Ａｍ培地 １１に対して ３．５ｇ Ｋ₂ＨＰＯ₄ １．５ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ クエン酸Ｎａ₃ ０．１ｇ ＭｇＳＯ₄ ｘ ７Ｈ₂Ｏ １ ｇ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２ ｇ グルコース滅菌タバコシュート培養用培地 Ｋ３培地 ニコチアナ タバカム ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａ ＳＲ１、ニコチアナ タ バカム Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ３８及びニコチアナ プラムバギニフォリア（Ｎ ｉｃｏｔｉａｎａ ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）のプロトプラストの培養 用（Ｎａｇｙ及びＭａｌｉｇａ、１９７６） リンスマイヤー及びスクーグ培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ及びＳｋｏｏｇ、１９６ ５） 再生するプロトプラストの培養用及びタバコ腫瘍及びカルスの組織培養用。リ ンスマイヤー及びスクーグ（ＬＳ）培地は、以下の修正、 - チアミン濃度がより高い：０．１ｍｇ／ｌの代わりに０．４ｍｇ／ｌ、 - グリシン、ピリドキシン及びニコチン酸を含まない、 を含むムラシゲ及びスクーグ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ、１９６ ２）である。 植物及び植物細胞の形質転換に関する以下の参考文献を挙げることができる。 Ｆromm ＭＥ，Ｔaylor ＬＰ，Ｗalbot Ｖ(1986)Ｓtable transformation of mai ze after gene transfer by electroporation．Ｎature 319: 791-793 Ｈain，Ｒ.，Ｓtabel，Ｐ.，Ｃzernilofsky，Ａ.Ｐp.，Ｓteinbiβ，Ｈ.Ｈ.，Ｈ errera-Ｅstrella，Ｌ.，Ｓchell，Ｊ.(1985)Ｕptake，integration，expressio n and genetic transmission of a selectable chimeric gene by plant protop lasts．Ｍolec Ｇen Ｇenet 199: 161-168 Ｈerrera-ＥＳtrella Ｌ.，Ｄe Ｂlock Ｍ.，Ｍessens'Ｅ.，Ｈernalsteens Ｊ Ｐ.，van Ｍontagu Ｍ.，Ｓchell Ｊ.(1983)ＥＭＢＯ Ｊ.2: 987-995 Ｈorsch ＲＢ，Ｆry ＪＥ，Ｈoffinann ＮＬ，Ｅichholtz Ｄ，Ｒogers ＳＧ， Ｆraley ＲＴ（1985）Ａsimple and general method for transferring genes i nto plants．Ｓcience 227: 1229-1231 Ｋrens ＦＨ，Ｍolendijk Ｌ，Ｗullems ＧＪ，Ｓchilperoort ＲＡ（1982）in vitro transformation of plant protoplasts with Ｔi-plasmid ＤＮＡ．Ｎatu re 296: 72-74 Ｋoncz Ｃ，Ｓchell Ｊ（1986）Ｔhe promoter of Ｔ_L-ＤＮＡ gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel ty pe of Ａgrobacterium binary vector．Ｍol．Ｇen．Ｇenet．(1986)204: 338-3 96 Ｌinsmaier ＤＭ，Ｓkoog Ｆ（1965）Ｏrganic growth factor requirements of tobacco tissue cultures．Ｐhysiol Ｐlant 18: 100-127 Ｍarton Ｌ，Ｗullems ＧＪ，Ｍolendijk Ｌ，Ｓchilperoort ＰＲ（1979）Ｉn vitro transformation of cultured cells from Ｎicotiana tabacum by Ａgrob acterium tumefaciens．Ｎature 277: 1229-131 Ｍurashige，Ｔ．and Ｓkoog Ｆ．(1962)Ａ revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture．Ｐhysiol．Ｐlant．15，47 Ｎagy ＪＩ，Ｍaliga Ｐ（1976）Ｃallus induction and plant regeneration f rom mesophyll protoplasts of Ｎicotiana sylvestris．Ｚ．Ｐflanzenphysiol 78: 453-455 Ｐaszkowski Ｊ，Ｓhillito ＲＤ，Ｓaul Ｍ，Ｍandak Ｖ，Ｈohn Ｔ，Ｈohn Ｂ ，Ｐotrykus Ｉ(1984)Ｄirect gene transfer to plants．ＥＭＢＯ Ｊ 3: 2717 -2722 Ｓhillito ＲＤ.，Ｐaszkowski Ｊ，Ｐotrykus Ｉ（1983）Ａgarose plating an d bead typeculture technique enable and stimulate development of protopl ast-derived colonies in an number of plant species．ＰＩ Ｃell Ｒep 2: 2 44-247 Ｖan den Ｅlzen ＰＪＭ，Ｔownsend Ｊ，Ｌee ＫＹ，Ｂedbrook ＪＲ（1985） Ａchimaeric resistance gene as a selectable marker in plant cells．Ｐlan t Ｍol．Ｂiol．5，299-302． Ｖan Ｈaute Ｅ，Ｊoos Ｈ，Ｍaes Ｍ，Ｗarren Ｇ，Ｖan Ｍontagu Ｍ，Ｓchel l Ｊ(1983)Ｉntergenic transfer and exchange recombination of restriction fragments cloned in pＢＲ322: a novel strategy for the reversed genetics of Ｔi plasmids of/ Ａgrobacterium tumefaciens．ＥＭＢＯ Ｊ 2: 411-418 Ｖelten Ｊ，Ｖelten Ｌ，Ｈain Ｒ，Ｓchell Ｊ（1984）Ｉsolation of a dual plant promoter fragment from the Ｔi plasmid of Ａgrobacterium tumefaci ens．ＥＭＢＯ Ｊ 12: 2723-2730 Ｗullems ＧＪ，Ｍolendijk Ｌ，Ｏoms Ｇ，Ｓchilperoort ＲＡ（1981）Ｄiffe rential expresson of crown gall tumor markers in transformants obtained after in vitro Ａgrobacterium tumefaciens - induced transformation of ce ll wall regenerating protoplasts derived from Ｎicotiana tabacum．Ｐroc Ｎatl Ａcad Ｓci 78: 4344-4348 Ｚambryski Ｐ，Ｊoos Ｈ，Ｇenetello Ｃ，van Ｍontagu Ｍ，Ｓchell Ｊ（198 3）Ｔi-plasmid vector for the introduction of ＤＮＡ into plant cells wi thout altering their nomral regeneration capacity，ＥＭＢＯ Ｊ 12: 2143- 2150 以下の開示された特許出願をさらに挙げることができる。 ＥＰ-Ａ 116 718 ＥＰ-Ａ 159 418 ＥＰ-Ａ 120 515 ＥＰ-Ａ 120 516 ＥＰ-Ａ 172 112 ＥＰ-Ａ 140 556 ＥＰ-Ａ 174 166 ＥＰ-Ａ 122 791 ＥＰ-Ａ 126 546 ＥＰ-Ａ 164 597 ＥＰ-Ａ 175 966 ＷＯ 84/02913 ＷＯ 84/02919 ＷＯ 84/02920 ＷＯ 83/01176

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 相互に直接５’−３’の方向に続く以下の構成要素、 １．植物における活性化に適し、そして植物防御機構を全身的に誘導する ことができる因子により活性化することができるプロモーター、 ２．それに続くホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ 以下に「ＰＡＴ」とも呼ぶ）をコードするＤＮＡ配列、及び、 ３．それに続く植物において機能する終結配列、 からなるＤＮＡ配列（以下に「ＤＮＡ配列Ｉ」と呼ぶ）またはそれに由来するＤ ＮＡ配列。 ２． 相互に直接５’−３’方向に続く以下の構成要素、 １．ビチス ビニフェラＶｓｔ１プロモーターの位置＋７２から−５５２ までの領域（６２４ｂｐ）、 ２．それに続くホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ ＰＡＴ）−ストレプトミセス ビリドクロモゲネスからのｐａｔ遺伝子のコーデ ィング領域、及び、 ３．それに続くアグロバクテリウム チュメファシエンスのノパリンシン ターゼ遺伝子「ｎｏｓ」の終結配列、 からなり、そして以下に「ＤＮＡ配列II」と呼ばれる請求の範囲１に記載のＤＮ Ａ配列またはそれに由来するＤＮＡ配列。 ３． 互いに直接５’−３’方向に続く以下の成分、 １．ジャガイモｐｒｐ１−１プロモーターの位置−４０２から−１３０ま での領域（２７２ｂｐ）及び それに続くＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡプロモーターの領域（ＴＡＴＡボ ックス領域）（位置−４６ないし＋８）、 ２．それに続くホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ ＰＡＴ）−ストレプトミセス ビリドクロモゲネスからのｐａｔ遺伝子のコーデ ィング領域、並びに、 ３．それに続くアグロバクテリウム チュメファシエンスのノパリンシン ターゼ遺伝子「ｎｏｓ」の終結配列、 からなり、そして以下に「ＤＮＡ配列III」と呼ばれる請求の範囲１に記載のＤ ＮＡ配列またはそれに由来するＤＮＡ配列。 ４． 植物害虫に対する植物自身の防御機構を誘導するために適する因子を見 いだすための、請求の範囲１に記載のＤＮＡ配列Ｉまたはそれに由来するＤＮＡ 配列の使用。 ５． 植物害虫に対する植物自身の防御機構を誘導するために適する因子を見 いだすための、請求の範囲１に記載のＤＮＡ配列Ｉまたはそれに由来するＤＮＡ 配列をゲノム中に含んでなるトランスジェニック植物または植物器官の使用。 ６． 請求の範囲１に記載のＤＮＡ配列Ｉまたはそれに由来するＤＮＡ配列を ゲノム中に含んでなるトランスジェニック植物または植物器官を誘導効力に関し て調べられる因子と接触させ、そしてホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトラン スフェラーゼの増加した発現をもたらす、そして／またはホスフィノトリシンに 対する耐性を増加する物質を選択することを特徴とする、植物害虫に対する植物 自身の防御機構を誘導するために適する因子を見いだす方法。 ７． 請求の範囲１に記載のＤＮＡ配列Ｉまたはそれに由来するＤＮ Ａ配列をゲノム中に含んでなる（増殖材料の植物器官を含む）トランスジェニッ ク植物。 ８． （ａ）請求の範囲１に記載のＤＮＡ配列Ｉまたはそれに由来するＤＮＡ 配列を（プロトプラストを含む）植物細胞のゲノム中に挿入し、そして（ｂ）形 質転換された植物細胞から完全な形質転換植物を再生し、そして場合によっては 増殖させ、そして必要な場合、（ｃ）親世代またはそれから得られた他の世代の 得られたトランスジェニック植物から（増殖材料を含む）適切な植物器官を得る ことを特徴とする、（植物器官及び増殖材料を含む）請求の範囲７に記載のトラ ンスジェニック植物の産生方法。 ９． 請求の範囲７に記載のトランスジェニック植物または植物器官が用いら れる請求の範囲４に記載の使用。 １０． 請求の範囲７に記載のトランスジェニック植物または植物器官が用い られる請求の範囲６に記載の方法。 １１． 植物害虫に対する植物自身の防御機構を誘導するために適する因子を 見いだすための、誘導性植物プロモーターと結合したレポーター遺伝子としての ホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの使 用。