JP2000500013A

JP2000500013A - プソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定パッケージング細胞株

Info

Publication number: JP2000500013A
Application number: JP9518303A
Authority: JP
Inventors: エス．オーリ，ダニエル; セードレイン，マイケル; シー．マリガン，リチャード; イー．シャファー，ジーン
Original assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1995-11-08
Filing date: 1996-11-07
Publication date: 2000-01-11
Also published as: CA2237000A1; WO1997017457A2; WO1997017457A3; EP0859856A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生するパッケージング細胞株を含有する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株に関する。該パッケージング細胞株は、（ａ）レトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子および（ｂ）誘導可能なオペレーター系の制御下にあり、その遺伝子産物がレトロウイルスコアウイルス粒子をプソイドタイプ化する非レトロウイルス遺伝子の発現を支配する、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモーターまたはこのプロモーターの誘導体を有する発現構築物（ｐＭＤ等）のような１以上の非レトロウイルス発現構築物を含有する。さらに、本発明は、ヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する、安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株の作製方法に関する。さらに、本発明は、本明細書に記載された特別なパッケージング細胞株（すなわちＨ２９ｇａｇｐｏｌ、Ｈ２９ｎｅｗｇａｇｐｏｌ）および本明細書に記載された安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を製造するために使用される特別な細胞と構築物（すなわちパッケージング要素）（Ｈ２９細胞とｐＭＤ、ｐＭＤｔｅｔ、ｐＭＤｔｅｔ．Ｇ、ＰＭＤ．ｇａｇｐｏｌ、ｐＭＤ．ｎｅｗｇａｇｐｏｌ構築物等）に関する。本発明は、２つのレトロウイルス長末端反復、ｃＤＮＡの挿入のためのクローニング部位およびサイトメガロウイルスプロモーターを含有する、哺乳動物細胞での発現用ｃＤＮＡライブラリーの作製のためのレトロウイルスベクターに関する。また本発明は、本発明のレトロウイルスベクターを含有する、哺乳動物細胞での発現用ｃＤＮＡライブラリーに関する。また本発明は、哺乳動物細胞における発現クローニング方法に関する。また本発明は、哺乳動物細胞におけるｃＤＮＡ発現クローニング方法に関する。また本発明は、哺乳動物細胞での相補性によるｃＤＮＡ発現クローニングを用いる変異した表現型の原因となる遺伝子の欠損を同定する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】プソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定パッケージング細胞株関連出願本特許出願は、ダニエルエス．オーリ、マイケルセードレインおよびリチャードシー．マリガンにより１９９５年１１月８日に出願された「遺伝子伝達のためのプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定パッケージング細胞株」と題する米国特許出願番号第０８／５５５，１５５号明細書およびダニエルエス．オーリおよびジーンイー．シャファーにより１９９６年５月２１日に出願された「相補性による発現クローニングのための水疱性口内炎ウイルス−Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）宿主域を有するレトロウイルスｃＤＮＡ発現ライブラリーの作製方法」と題する米国特許出願番号第０８／６５１，０５０号明細書の一部継続出願である。それぞれの教示は、その内容の全体が参照により本明細書に合体される。基金の陳述本明細書に記載の研究は、国立衛生研究所助成金、Ｋ１１ＨＬ０２９１０により援助された。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。発明の背景組換えレトロウイルスは、イン・ビボおよびイン・ビトロの遺伝子発現ならびに真核宿主細胞における目的の蛋白質の製造に有用である。一般に、組換えレトロウイルスは、適当なプロウイルスＤＮＡベクターを所望の組換えＲＮＡの包膜化および感染性組換えウイルス粒子の産生に必要なウイルス蛋白質を製造する哺乳動物細胞に導入することにより製造される。ほとんどの遺伝子伝達の適用に関しては、複製能を有するヘルパーウイルスフリーの組換えウイルスの高純度のストックの生成が望まれるので、組換えレトロウイルスの生成に必要なウイルス遺伝子産物を産生するが、それ自体検出可能なヘルパーウイルスを生じないかまたはウイルス遺伝子を伝達しない細胞株の開発にかなりの興味が存在している（Co ffin，J.、RNA Tumor Viruses、Weiss，R．ら、（編）．Cold Spring Harbor La boratory，第２巻、36-73 頁（1985）；Mann，R.ら、Cell，33: 153-159(1983); Watanabe，S.ら、Mol．Cell Biol.，3: 2241-2249(1983); Cone，R．D．ら、PN AS,USA，81: 6349-6353(1984); Miller，A．D．ら、Mol．Cell Biol.，6: 2895- 2902(1986); Bosselman，R．A.ら、Mol．Cell Biol.，7: 1797-1806(1986)。かかるようにするための１つのアプローチは、変異したプロウイルスゲノムを使用してレトロウイルスパッケージング細胞株を開発することである。しかしながら、ヘルパーウイルスの産生および／またはパッケージング機能（すなわち、ウイルス遺伝子）の伝達が依然として起こるかもしれない。したがって、ヘルパーウイルスの産生能を制限する改良されたレトロウイルスパッケージング細胞株が必要とされる。発明の概要本発明は、ヘルパーフリーのプソイドタイプのレトロウイルスを産生し、哺乳動物起源であり、好ましくは安定パッケージングヒト細胞株等の非ネズミ起源である安定パッケージング細胞株に関する。これらは、本明細書では、それぞれ、安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株および安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージングヒト細胞株と称する。パッケージング細胞株は、ａ）レトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子と称する、レトロウイルスｇａｇ遺伝子およびレトロウイルスｐｏｌ遺伝子、およびｂ）誘導可能なオペレーター系の制御下にあり、その遺伝子産物がレトロウイルスコアウイルス粒子をプソイドタイプ化する非レトロウイルス遺伝子の発現を支配するヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモーターまたはこのプロモーターの派生物（ｐＭＤ等）等の１以上の非レトロウイルス発現構築物を含有する。ｇａｇｐｏｌ遺伝子産物は、所望の組換えＲＮＡを非レトロウイルス遺伝子産物によりプソイドタイプ化されるコアウイルス粒子内にパッケージングし、ヘルパーフリーの組換えレトロウイルスを産生可能な安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を生ずる。１つの態様において、本発明は、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生可能な安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株に関する。これらの細胞株は、ヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する。パッケージング細胞は、レトロウイルスのｇａｇｐｏｌ遺伝子および水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ− Ｇ）の糖蛋白質遺伝子の発現を支配する１以上の非レトロウイルス発現構築物を含有する。誘導可能なオペレーター系（ｔｅｔオペレーター等）の制御下にあるＶＳＶ−Ｇ糖蛋白質は、ｇａｇｐｏｌ蛋白質により生成されるレトロウイルスコアウイルス粒子をプソイドタイプ化するエンベロープ蛋白質を提供する。その結果は、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株（Ｈ２９ｇａｇｐｏｌ等）である。別の態様において、変化した（突然変異等）レトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子を用いて、安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株（Ｈ２９ｎｅｗｇａｇｐｏｌ細胞株等）を製造する。本発明は、さらに、ヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株の作製方法に関する。本発明の方法において、哺乳動物細胞を、ａ）レトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子、およびｂ）誘導可能なオペレーター系の制御下にあり、レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープを提供する非レトロウイルス遺伝子の発現を支配する１以上の非レトロウイルス発現構築物で同時トランスフェクトする。ｇａｇｐｏｌ蛋白質は、非レトロウイルス遺伝子産物によりプソイドタイプ化されるコアウイルス粒子内に所望の組換えＲＮＡをパッケージングし、ヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を生ずる。１つの態様において、本発明は、汎親和性の宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株の作製方法に関する。この態様において、哺乳動物細胞を、レトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子（例えば、野生型または変化した）およびＶＳＶ−Ｇ遺伝子の発現を支配する１以上の非レトロウイルス発現構築物で同時トランスフェクトする。誘導可能なオペレーター系の制御下にあるＶＳＶ−Ｇ遺伝子は、ｇａｇｐｏｌ蛋白質により製造されるレトロウイルスのコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープ蛋白質を提供する。これにより、汎親和性の宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を生ずる。別の態様において、本発明は、汎親和性の宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株の作製方法に関する。該方法において、哺乳動物宿主細胞を、ｔｅｔトランスアクティベーター融合蛋白質（ｔＴＡ）遺伝子を発現する第１の非レトロウイルス構築物（Gossen，M.とBujard，M.、Proc．Natl． Acad．Sci.，89: 5547-5551(1992)）およびｔｅｔオペレーター（ｔｅｔ結合配列を取り込んだ最小のヒトＣＭＶ即時型初期プロモーター）の制御下でＶＳＶ− Ｇ糖蛋白質に対する遺伝子を発現する第２の非レトロウイルス構築物で同時トランスフェクトする。トランスフェクトした細胞を、テトラサイクリン誘導性ＶＳＶ−Ｇ発現についてスクリーニングする。ＶＳＶ−Ｇ蛋白質は、テトラサイクリンの存在下では検出されず、テトラサイクリンの非存在下で検出される。かかる細胞を、レトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子を発現する第３の非レトロウイルス構築物でトランスフェクトして、レトロウイルスの産生をスクリーニングする。レトロウイルスを産生するトランスフェクトした細胞は、汎親和性の宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞である。さらに、本発明は、本明細書に記載される特別なパッケージング細胞株（Ｈ２９ｇａｇｐｏｌまたは２９３ＧＰＧ細胞株、Ｈ２９ｎｅｗｇａｇｐｏｌ細胞株）ならびに本明細書に記載される安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株（Ｈ２９細胞とｐＭＤ、ｐＭＤｔｅｔ、ｐＭＤｔｅｔ．Ｇ、ＰＭＤ．ｇａｇｐｏｌ、ｐＭＤ．ｎｅｗｇａｇｐｏｌ構築物）の製造に使用される特別な細胞および構築物（パッケージング要素等）に関する。本発明の別の側面は、哺乳動物細胞での発現に関するｃＤＮＡライブラリーを作製するためのレトロウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターは、２つのレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）（５’レトロウイルスＬＴＲと３’ レトロウイルスＬＴＲ等）、ｃＤＮＡの挿入のためのクローニング部位およびサイトメガロウイルス（ヒト等）プロモーターを含有する。１つの態様において、２つのＬＴＲは、モロニー(Moloney)ネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）である。具体的な態様において、３’ＭＭＬＶＬＴＲが非修飾であり、該５’が修飾されるかまたは５’ＭＭＬＶＬＴＲのＵ３領域がサイトメガロウイルス（ヒト等）のプロモーターまたはサイトメガロウイルスのエンハンサー−プロモーターに置換されたキメラＭＭＬＶＬＴＲである。また、本発明は、哺乳動物細胞での発現に関するｃＤＮＡライブラリーに関する。該ライブラリーは、２つのレトロウイルスＬＴＲ、ｃＤＮＡおよびサイトメガロウイルスプロモーターを含有するレトロウイルスベクターを含有する。該ｃＤＮＡは、レトロウイルスベクター内の唯一のクローニング部位に位置し、２つのＬＴＲの間に位置してサイトメガロウイルスプロモーターと操作可能に結合していることが好ましい。また、本発明は、哺乳動物細胞での発現クローニング方法に関する。該方法は、本発明のレトロウイルスベクターを含有するｃＤＮＡ発現ライブラリーを哺乳動物細胞に導入する工程、および該ｃＤＮＡ発現ライブラリーの発現に適する条件下で該発現ライブラリーを含む哺乳動物細胞を維持し、それにより、該発現ライブラリー中のｃＤＮＡを該哺乳動物細胞で発現させる工程を含む。１つの態様において、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、安定な哺乳動物（ヒト、ネズミ等）パッケージング細胞株で産生されるプソイドタイプのレトロウイルスで感染させることにより、哺乳動物細胞に導入する。安定な哺乳動物パッケージング細胞株を選択して、汎親和性、エコトロピックまたはアンホトロピック宿主域、好ましくは汎親和性宿主域を有するプソイドタイプのレトロウイルスを産生させる。特別な態様において、本発明は、哺乳動物細胞における発現クローニング方法に関する。該方法は、２つのレトロウイルスＬＴＲ、ｃＤＮＡおよびサイトメガロウイルスプロモーターを含有するレトロウイルスベクターを含有するｃＤＮＡ発現ライブラリーを、プソイドタイプのレトロウイルスを産生するパッケージング細胞株に導入する工程；該ｃＤＮＡ発現ライブラリーを含むプソイドタイプのレトロウイルス粒子の生成に適した条件下で、該発現ライブラリーを含むパッケージング細胞株を維持する工程；哺乳動物細胞の感染に適した条件下で、プソイドタイプのレトロウイルス粒子で哺乳動物細胞を感染させる工程；ならびに該哺乳動物細胞でのｃＤＮＡの発現に適した条件下で、生ずる哺乳動物細胞を維持する工程を含む。特別な態様において、パッケージング細胞株は、安定なヒト胎児腎細胞株および具体的には、ヒト２９３から派生した細胞株である。また、本発明は、ｃＤＮＡライブラリーにおいてｃＤＮＡの転写により生成したＲＮＡを含有するＶＳＶ−Ｇプソイドタイプのレトロウイルス粒子がパッケージング細胞株で産生される、哺乳動物細胞でのｃＤＮＡの発現クローニング方法に関する。該ｃＤＮＡライブラリーは、順番に、２つのレトロウイルスＬＴＲ、ｃＤＮＡおよびサイトメガロウイルスプロモーターを含有するベクターを含有し；該ｃＤＮＡは、該ＬＴＲ間に位置してプロモーターに操作可能に結合している。次いで、哺乳動物細胞を、ＶＳＶ−Ｇプソイドタイプレトロウイルス粒子内に含まれるＲＮＡの転写および哺乳動物細胞でｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡによりコードされる（レトロウイルス粒子中でＲＮＡの翻訳による）蛋白質の製造に適した条件下で産生されるＶＳＶ−Ｇプソイドタイプレトロウイルス粒子で感染させる。ＶＳＶ−Ｇプソイドタイプレトロウイルス粒子に含まれるＲＮＡまたはｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡによりコードされる蛋白質を含む哺乳動物細胞を、公知の方法を用いて検出する。例えば、ＲＮＡは、インサイチュハイブリダイゼーションを用いて検出することができる。あるいは、ｃＤＮＡが細胞表面で発現する蛋白質をコードし、発現した蛋白質を目的のｃＤＮＡにより発現される蛋白質と結合する抗体を用いて検出することが可能な免疫検出を使用することができる（米国特許第５，５０６，１２６号明細書等を参照のこと）。また、エピトープ標識を用いて発現した蛋白質を検出することができる。また、機能検定を用いて、目的のｃＤＮＡにより発現した蛋白質の機能（細胞での接着表現型を付与する蛋白質等）を検出することができる。また、本発明は、哺乳動物細胞における相補性によるｃＤＮＡ発現クローニングを用いて突然変異表現型の原因である遺伝子欠損の同定方法に関する。この方法において、ｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡの転写により生成したＲＮＡを含むＶＳＶ−Ｇプソイドタイプレトロウイルス粒子が、パッケージング細胞株で産生される。該ｃＤＮＡライブラリーは、２つのレトロウイルスＬＴＲ、ｃＤＮＡおよびサイトメガロウイルスプロモーターを含有し；該ｃＤＮＡは、該ＬＴＲ間に位置してプロモーターに操作可能に結合している。突然変異表現型を示す哺乳動物細胞を、ＶＳＶ−Ｇプソイドタイプレトロウイルス粒子内に含まれるＲＮＡの転写およびｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡによりコードされる（レトロウイルス粒子中でＲＮＡの翻訳による）蛋白質の製造に適した条件下で、ＶＳＶ −Ｇプソイドタイプレトロウイルス粒子で感染させる。該ｃＤＮＡが発現すると野生型の表現型を示す突然変異表現型を有する哺乳動物細胞を同定する。次いで、哺乳動物細胞で野生型表現型を付与するｃＤＮＡを同定し、それにより突然変異表現型の原因となる遺伝子欠損を決定する。本明細書に記載された安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株の開発は、ヘルパーウイルスの生成を抑制する。結果として、安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株は、細胞の系統分析およびヒト遺伝子置換療法の開発に照準を向けたイン・ビボの遺伝子伝達研究に関して特に有用な試薬である。本発明のレトロウイルスベクターの使用は、いかなる哺乳動物細胞の型においてもレトロウイルスｃＤＮＡ発現クローニングを可能にして、効率的な発現クローニングに対する特殊な細胞の必要性を回避する。野生型の親細胞型とは異なる表現型が存在するいかなる突然変異哺乳動物細胞（患者由来の初代ヒト細胞、突然変異動物株由来の初代または確立された細胞株、ノックアウトマウス由来の初代または確立された細胞株、細胞培養で生じた突然変異細胞株等）においても、突然変異細胞と野生型細胞との間の遺伝子の相違（遺伝子の変化または欠損）は、本発明を用いる相補性による発現クローニングにより迅速に同定されうる。図面の簡単な説明図１は、ｐＭＤ構築物の概略図である。図２は、ｐＭＤｔｅｔ構築物の概略図である。図３は、ｐＭＤ．Ｇ構築物の概略図である。図４は、ｐＭＤｔｅｔ．Ｇ構築物の概略図である。図５は、ｐＭＤ．ｇａｇｐｏｌ構築物の概略図である。図６は、ｐＭＤ．ｎｅｗｇａｇｐｏｌ構築物の概略図である。図７は、プラスミドｐＢＣ．ｔＴＡの概略図である。図８は、プラスミドＭＦＧ．ＳｎｌｓＬａｃＺの概略図である。図９Ａは、ΔＵ３レトロウイルス構築物ΔＵ３ｎｌｓＬａｃＺの概略図である。図９Ｂは、ΔＵ３レトロウイルス構築物ΔＵ３Ｂａｍの概略図である。発明の詳細な説明本発明は、プソイドタイプのレトロウイルスを産生し、哺乳動物起源であり、好ましくは安定パッケージングヒト細胞株等の非ネズミ起源である安定なレトロウイルスパッケージング細胞株に関する。これらは、本明細書では、それぞれ、レトロウイルス遺伝子伝達のためのプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株および安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージングヒト細胞株と称する。本発明のパッケージング細胞株は、レトロウイルスコアウイルス粒子を産生するレトロウイルスｇａｇｐｏｌ蛋白質、およびレトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープを提供する蛋白質を発現するための１以上の非レトロウイルス構築物を含有する。レトロウイルスコア蛋白質に対してプソイドタイプのエンベロープを提供する蛋白質は、誘導可能なオペレーター系の制御下にある。すなわち、本明細書に記載されたパッケージング細胞株によるレトロウイルスの産生は、レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープを提供する蛋白質の誘導可能な発現により制御される。本発明のパッケージング細胞株は、非誘導の場合（例えば、ｔｅｔオペレーターを使用するときはテトラサイクリンの存在下で）生存可能であり、非エンベロープ化したレトロウイルスｇａｇｐｏｌ蛋白質を発現し；非誘導化パッケージング細胞株は、誘導された場合（例えば、ｔｅｔオペレーターを使用するときはテトラサイクリンの非存在下で）、組換えプソイドタイプのレトロウイルス粒子を生成（産生）可能である。したがって、本発明のプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株は安定である。一度誘導されると、パッケージング細胞株は、組換えプソイドタイプのレトロウイルス粒子を生成（産生）する。また、本発明のパッケージング細胞株は、ヘルパーウイルスの産生能を抑制する。非レトロウイルス構築物およびレトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープを産生する非レトロウイルス蛋白質の使用は、ヘルパーウイルスの抑制された産生に寄与する。ヘルパーウイルス生成能は、非ネズミ細胞（ヒト細胞等）を用いることによりさらに抑制されうる。レトロウイルスパッケージング細胞株を生成するために、ネズミ細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３細胞等）が典型的に使用される。しかしながら、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等のネズミ細胞株のゲノム中の内在性ネズミレトロウイルスの存在（Danosら、Proc．Natl．Acad．Sci .，85: 6460-6466(1988)）は、宿主細胞ゲノム、レトロウイルス発現構築物およびレトロウイルスベクター間の組換え事象を促進し、それによりヘルパーウイルスの産生に寄与する。また、レトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子を変えて（突然変異等）、さらにヘルパーウイルスの産生能を制限することができる。突然変異させたｇａｇｐｏｌ配列の例（すなわち、ｎｅｗ５’ｇａｇｐｏｌ；ｎｅｗ３’ｇａｇｐｏｌ）を、実施例１に記載する。実施例２に記載のように、本発明のパッケージング細胞株を、ｇａｇｐｏｌ遺伝子を発現するための新規な非レトロウイルス性ヒトＣＭＶ即時型初期プロモーター発現構築物（ｐＭＤ）およびヘルパーウイルスの産生能を抑制するプソイドタイプのエンベロープを組み込んだヒト２９３細胞から派生させることができる。また、ｇａｇｐｏｌコーディング配列のサイレント突然変異は、レトロウイルスベクター配列とのホモロジーを最小にし、さらにヘルパーウイルスの産生能を抑制する。本明細書でさらに記載されるように、本発明のパッケージング細胞株は、レトロウイルスコアウイルス粒子を効率的にプソイドタイプ化する水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）の糖蛋白質を発現する。ＶＳＶ−Ｇの糖蛋白質は、広範な宿主域を有する。したがって、ＶＳＶ−Ｇでプソイドタイプ化したレトロウイルスは、広範な宿主域（汎親和性）を示し、エコトロピックおよびアンホトロピックレトロウイルスによる感染に耐性な細胞を効率よく感染することができる（Yee，J．-K.ら、Proc．Natl．Acad．Sci.，91: 9564-6568(1994)）。ＶＳＶ−Ｇの高レベルな発現は、細胞毒性を有するので、新規なパッケージング細胞株でのＶＳＶ−Ｇの発現は、誘導可能なｔｅｔオペレーター系等の誘導可能なオペレーター系により制御され、培養培地中のテトラサイクリンの濃度により遺伝子発現（すなわち、レトロウイルス粒子の産生）の厳格な調節を可能にする。最後に、本明細書で示されるように、ＶＳＶ−Ｇでプソイドタイプ化したレトロウイルス粒子は、限外濾過により１００倍以上に濃縮することができる（Burn s，J．C.ら、Proc．Natl．Acad．Sci.，90: 8033-8037(1993)）。安定なＶＳＶ −Ｇでプソイドタイプ化したレトロウイルスのパッケージング細胞株は、１ｍｌ当たり１０⁷〜１０¹¹の範囲のレトロウイルス粒子のレトロウイルス原液を生ずる大規模なウイルス標品（例えば、１０〜５０リットルの上清）の生成を可能にする。誘導可能なＶＳＶ−Ｇ蛋白質を発現するＨ２９細胞は、２０回の継代よりも多い細胞培養で観察された。継代２０回のＨ２９細胞は、成育可能のままであり、初期の継代での細胞と同等なレベルで、誘導可能な様式で検出可能なＶＳＶ−Ｇ蛋白質（例えば、細胞融合研究、ウエスタンブロッティング等により）を発現し続ける。本発明に使用される発現構築物は、レトロウイルスコアウイルス粒子を産生するために使用されるレトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子およびレトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープを提供する蛋白質の発現を支配する非レトロウイルスベクターである。実施例１に記載されるように、本発明の使用に適する発現構築物は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモーター構築物である。本発明を実施するために使用できる他の構築物の例としては、ＳＶ４０、ＲＳＶおよびラットβ−アクチンプロモーターを使用する構築物が挙げられる。１以上の非レトロウイルス発現構築物を使用して、当該技術分野において公知の技術を用いてｇａｇｐｏｌ遺伝子およびプソイドタイプのエンベロープを提供する蛋白質を発現することができる。例えば、該蛋白質は、１つの非レトロウイルス発現構築物を用いて発現させることができる。また、１つの構築物がｇａｇｐｏｌ遺伝子を発現し、他の構築物が誘導可能なオペレーターの制御下でプソイドタイプのエンベロープを提供する遺伝子（ＶＳＶ−Ｇ、ｔＴＡ）を発現する２つの非レトロウイルス発現構築物を使用することができる。あるいは、実施例１に記載されるように、３つの非レトロウイルス構築物：第１の非レトロウイルス構築物は、プソイドタイプのエンベロープを発現する遺伝子の発現を制御する誘導可能なｔｅｔトランスアクティベーター蛋白質（ｔＴＡ）をコードし、第２の非レトロウイルス構築物は、プソイドタイプのエンベロープを提供する遺伝子を発現し、そして、第３の非レトロウイルス構築物は、ｇａｇｐｏｌ遺伝子を発現する、を使用することができる。さらに、ｇａｇとｐｏｌの配列を別々にして発現させることが可能であり、これは、第４の非レトロウイルス構築物（例えば、第３のレトロウイルス構築物がｇａｇ遺伝子を発現し、第４のレトロウイルス発現構築物がｐｏｌ遺伝子を発現する）を必要とする。本明細書に言及するように、「プソイドタイプのエンベロープ」とは、レトロウイルスのコアウイルス粒子をカプシドに包み込む、レトロウイルスコアウイルス粒子に天然に存在するもの以外のエンベロープ蛋白質である（表現型的には混合ウイルスを生ずる）。プソイドタイプのエンベロープを提供する好適な蛋白質は、実施例１に記載されるように水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）糖蛋白質である。本発明においては、ＶＳＶ−Ｇのいかなる好適な血清型（インディアナ、ニュージャージー、チャンディピュラ(chandipura)、ピリ等）および株（ＶＳＶインディアナ、サンジュアン(San Juan)等）も使用することができる。コアウイルス粒子をプソイドタイプ化するために選ばれた蛋白質は、パッケージング細胞株の宿主域を決定する。ＶＳＶ−Ｇは、哺乳動物細胞の表面上の特異的なリン脂質と相互作用する(Schlegel，R．ら、Cell，32: 639-646(1983); Supertzi ，F.ら、J．Gen Virol.，68: 387-399(1987))。したがって、ＶＳＶ−Ｇを利用してレトロウイルスのコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープを提供するパッケージング細胞株は、広範な宿主域（汎親和性）を有する。レトロウイルスのコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープを提供するために使用されうる他の好適な蛋白質としては、Ｃ型ネズミレトロウイルスエンベロープ蛋白質；ＨＴＬＶ−１エンベロープ蛋白質、テナガザル（Ｇｉｂｂｏｎａｐｅ）白血病ウイルスエンベロープ蛋白質およびプソイドタイプのエンベロープを提供する好適な蛋白質の誘導体（ＥＰＯリガンドを有するエコトロピックエンベロープ、合成および／または他のハイブリッドエンベロープ等の標的化したエンベロープ配列を調製するための挿入、欠失または突然変異を含む蛋白質；ＶＳＶ−Ｇ糖蛋白質の誘導体等）を含む。また、ネズミレトロウイルスエンベロープ蛋白質の誘導体を使用することができる。例えば、細胞表面への結合を果たしうる部分のＶＳＶ−Ｇ蛋白質を特異的なリガンドにより置換し、膜融合を果たしうる部分のＶＳＶ−Ｇ蛋白質を保持しているＶＳＶ−Ｇ蛋白質の誘導体を得ることができる。細胞表面への結合を果たしうる部分のＶＳＶ−Ｇ蛋白質は、例えば、ＶＳＶ−Ｇ配列の点突然変異および欠失配列分析を行なうことにより決定される。各変異したＶＳＶ−Ｇ蛋白質の細胞表面への結合能力は、適当な結合アッセイを用いて決定される。ここで、かかるＶＳＶ−Ｇ蛋白質の誘導体を組み込んだレトロウイルス粒子は、特異的な細胞集団に対して標的化させることができる。前記議論したように、誘導可能なオペレーターは、プソイドタイプのエンベロープを提供する遺伝子発現を制御するために使用される。例えば、高レベルのＶＳＶ−Ｇの発現は、細胞毒性を有する(Yee，J．-K.ら、Proc．Natl．Acad．Sci. ，91: 9564-6568(1994))。したがって、誘導可能なテトラサイクリン（すなわち、ｔｅｔ）オペレーター系を用いて、パッケージング細胞株の培養培地中のテトラサイクリンの濃度によりＶＳＶ−Ｇの発現の厳密な調節を可能にする。すなわち、ｔｅｔオペレーター系を用いて、テトラサイクリンの存在下で、テトラサイクリンがｔｅｔトランスアクティベーター融合蛋白質（ｔＴＡ）に結合し、ｔＴＡのｔｅｔオペレーター配列への結合を妨げて、ｔｅｔオペレーター配列の制御下での遺伝子発現を可能にする（Gossen，M.とBujard，M.、Proc．Natl．Acad． Sci.，89: 5547-5551(1992)）。テトラサイクリンの非存在下では、ｔＴＡは、ｔｅｔオペレーター配列に結合して、ｔｅｔオペレーターの制御下で遺伝子の発現を妨げる。プソイドタイプのエンベロープを提供する蛋白質の発現を制御するために使用されうる他の誘導可能なオペレーター系の例は、１）金属イオン（メタロチオネインプロモーター等）、グルココルチコイドホルモンに応答する誘導可能な真核細胞のプロモーター、および２）大腸菌のｌａｃレプレッサー／オペレーター／インデューサー系である。非レトロウイルス構築物によりコードされるヌクレオチド配列は、本発明に使用される種々の好適な供給源から得ることができる。例えば、オペレーター系を発現するヌクレオチド配列、プソイドタイプのエンベロープおよびｇａｇｐｏｌ配列は、天然の供給源から精製、化学合成により製造、または組換えＤＮＡ技術により製造することができる。例えば、実施例１に記載されるように、ｇａｇｐｏｌ配列は、ｐＣｒｉｐｅｎｖ^-構築物を用いて得ることができる。パッケージング細胞を調製するために使用される細胞は、哺乳動物細胞、好ましくは非ネズミ細胞である。特別な態様において、パッケージング細胞株を製造するために使用される細胞は、ヒト細胞である（例えば、２９３細胞、Graham， F.ら、J．Gen．Virol.，36:59-72(1977); ｔｓａ２０１細胞、Heinzel，S．ら、 J．Virol.，62: 3738(1988)）。本発明のパッケージング細胞株を使用して、真核細胞において所望の遺伝子の全部または一部を発現させる目的で、イン・ビトロおよびイン・ビボで遺伝子の伝達を可能にする組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生することができる。例えば、公知の技術を用いて、本明細書に記載されるパッケージング細胞株を使用して、治療目的用の投与または診断状況に有用な量でｍＲＮＡまたは蛋白質を製造するために、特別なｍＲＮＡ、蛋白質またはポリペプチド（インシュリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン等の治療用の蛋白質もしくはポリペプチド、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬレセプター）、ＡＤＡ欠損症（ＡＤＡ）、ゴシェ病（グルコセレブロシダーゼ）のための遺伝子置換、阻害性のｍＲＮＡ配列の発現によるアンチセンス療法等）をコードする遺伝子を、真核細胞に導入するために使用される組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生することができる(Yee，J．-K.ら、Proc．Natl．Acad．Sc i.，91: 9564-6568(1994); Dranoff，G．ら、Proc．Natl．Acad．Sci.，90: 353 9-3543(1993); Miller，A．D．ら、Meth．in Enz.，217: 581-599(1993))。すなわち、プソイドタイプの組換えウイルスを、パッケージング細胞株から回収して、公知の方法を用いて培養中またはイン・ビボでレシピエント細胞を感染させるためのウイルス原液として使用することができる。分泌蛋白質または造血細胞で発現する蛋白質の場合、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティング等の高感度なアッセイを用いて、遺伝子の伝達効率を評価することができる。あるいは、パッケージング細胞株により製造される高力価のウイルス原液は、形質導入細胞（造血細胞等）において優れた遺伝子伝達効率を提供し、現在の共培養技術と比較して混入を低下させる。また、本発明のパッケージング細胞株を用いて、その後に身体の局在した領域内に投与される目的のＤＮＡまたは遺伝子をヒト細胞等の哺乳動物細胞に導入するために、目的のＤＮＡを含むプソイドタイプのレトロウイルスを産生することも可能である（例えば、身体の局在した領域(ares)内への蛋白質の送達のための自家移植した白血球のエクス・ビボでの感染、米国特許第５，３９９，３４６号明細書等を参照のこと）。また、安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞を生成させるために使用されるパッケージング要素を、種々の方法に使用することができる。例えば、誘導可能なＶＳＶ−Ｇの発現を示すＨ２９細胞株を用いて、発現クローニングのためのレトロウイルスライブラリーを作製することができる。高力価のウイルス原液の製造能力は、所定のライブラリーではまれなｃＤＮＡの表現を改良する。また、本発明のパッケージング細胞株は、さらにプソイドタイプのパッケージング細胞株の生成の基礎として役立つことも可能である。効率的な構造性（ｐＭＤ等）および誘導可能な（ｐＭＤｔｅｔ）遺伝子発現の目的のための発現構築物として、パッケージング要素を使用することができる。ＶＳＶ−Ｇの誘導可能な発現のために、ｐＭＤｔｅｔ．Ｇ構築物を別の適用に用いることが可能である。ｐＭＤｇａｇｐｏｌおよびｐＭＤｎｅｗｇａｇｐｏｌを使用して、新規なレトロウイルスパッケージング細胞株の生成を開発することができる。異種遺伝子の効率的な発現のために、ｐＭＤ、ｐＭＤｔｅｔ、ｐＭＤｔｅｔ．ＧおよびｐＭＤ．ｇａｇｐｏｌ構築物を使用することができる。したがって、本明細書に記載されるように、誘導可能な様式でＶＳＶ−Ｇを発現する安定な細胞株が作製された。また、高レベルの発現のためにヒトゲノムβ −グロビン配列を使用する新規なＣＭＶ発現ベクター（ｐＭＤ）とその派生物（ｐＭＤ．Ｇ、ｐＭＤｔｅｔ．Ｇ、ｐＭＤ．ｇａｇｐｏｌ、ｐＭＤ．ｎｅｗｇａｇｐｏｌ）が開発された。さらに、本明細書に記載されるように、ヘルパーウイルスに関する能力を抑制する変異したプロウイルス構築物と比べて、ＣＭＶ発現構築物を使用する２９３に基づく安定なパッケージング細胞株が開発され、ヘルパーウイルスに関する能力を抑制するために、安定な細胞株における変異したｇａｇｐｏｌ発現構築物の使用が示された。また、本発明は、２つのレトロウイルスＬＴＲ、ｃＤＮＡの挿入のためのクローニング部位およびサイトメガロウイルスプロモーターを含有する、哺乳動物細胞で発現するｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製するためのレトロウイルスベクターに関する。１つの態様において、２つのＬＴＲは、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）である。具体的な態様において、３’ＭＭＬＶＬＴＲは修飾されず、５’が修飾されているか、または５’ＭＭＬＶＬＴＲのＵ３領域がサイトメガロウイルスプロモーターもしくはサイトメガロウイルスエンハンサー− プロモーターで置換されているキメラＭＭＬＶＬＴＲである。レトロウイルスＬＴＲは、いかなる好適なレトロウイルスベクター由来であってもよく、高力価またはレトロウイルスの蛋白質の発現を生ずるレトロウイルスベクターであることが好ましい。２つのＬＴＲは、同一のレトロウイルスベクター由来または異なるレトロウイルスベクター由来であってもよい。例えば、実施例３に記載されるように、両方のレトロウイルスＬＴＲがモロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来であってもよい。その他の好適なレトロウイルスＬＴＲとしては、例えば、ネズミ肉腫ウイルス（ＭＳＶ）、ネズミ乳頭肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）およびフレンドウイルス由来のものが挙げられる。レトロウイルスベクターのクローニング部位は、様々なクローニング部位であってもよい。例えば、実施例３に記載のように、クローニング部位は、ＢａｍＨＩクローニング部位であってもよい。本発明のレトロウイルスベクターでの使用に適する他のクローニング部位としては、例えば、ｇａｇｐｏｌもしくはｅｎｖゲノムもしくはＵ３領域内で唯一の制限部位またはまれな制限部位が挙げられる。サイトメガロウイルスプロモーターは、いかなる好適な供給源からでも入手することが可能である。例えば、実施例３に記載のように、完全なサイトメガロウイルスエンハンサー−プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）由来である。以前に記載されたＣＭＶプロモーターの一部または全体を、本発明で使用することができる。サイトメガロウイルスプロモーターを入手するために適する他の供給源としては、Clontech、InvitrogenおよびStratagene等の市販の供給源が挙げられる。本発明のレトロウイルスベクターは、ｃＤＮＡ発現ライブラリーの発現に適した条件下で、本明細書で記載されるレトロウイルスベクターを含有するｃＤＮＡ発現ライブラリーが哺乳動物細胞に導入される、哺乳動物細胞での発現クローニングに使用可能である。１つの態様において、本発明は、該ライブラリーが２つのレトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルスプロモーターおよびｃＤＮＡを含有し、ｃＤＮＡが該レトロウイルスＬＴＲ間に位置してサイトメガロウイルスプロモーターに操作可能に結合している、哺乳動物細胞での発現用ｃＤＮＡ発現ライブラリーに関する。本発明で使用されるｃＤＮＡは、哺乳動物細胞での発現のための対象物であるいかなるｃＤＮＡでもよい。該ｃＤＮＡは、血液細胞、組織試料由来の細胞または培養細胞等のいかなる型の細胞由来であってもよい。一般に、ｃＤＮＡは、相補性による発現クローニングが進行している場合に、ｃＤＮＡが発現し続けている同じ型の細胞由来である。本発明で使用されるｃＤＮＡライブラリーは、慣用の方法（SeedとAruffo、Pr oc．Natl．Acad．Sci，USA，84: 3365-3369(1987)等）を用いて入手することができる。例えば、ｍＲＮＡは、いかなる細胞からも調製され、ｃＤＮＡは、標準的な技術(Sambrook，J．ら、Molecular Cloning: A Laboratory Mannual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))および商業上利用可能なクローニングキット（Pharmacia、InvitrogenおよびStratagene等）を用いて、合成することができる。本発明のレトロウイルスベクターは、細胞においてｃＤＮＡ発現ライブラリーの発現を生ずるいかなる技術（エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈澱、カチオン性脂質、リポソーム等）を用いても哺乳動物細胞に導入することができる。１つの態様において、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをパッケージング細胞株に導入し、該ｃＤＮＡ発現ライブラリーから転写されるＲＮＡを含み、感染した哺乳動物細胞でｃＤＮＡ発現ライブラリーの発現を生ずる哺乳動物細胞を感染するために使用されるレトロウイルス粒子を産生する。この態様において、パッケージング細胞株（本明細書で記載された２９３ＧＰＧパッケージング細胞株等）を用いて、実施例４に記載されるように、哺乳動物細胞での発現クローニングに有用なプソイドタイプのレトロウイルス粒子を産生することができる。本発明での使用に適する他のパッケージング細胞株は、パッケージング細胞株に由来する（例えば、胚細胞株由来の）他のヒト細胞株ならびに、Ｐｓｉ−２細胞(Mann，R ．ら、Cell，33: 153-159(1983); FLY（Cossett，F．L．ら、Virol.,193: 385-3 95(1993)）、ＢＯＳＣ２３細胞(Pear，W．S.ら、Proc．Natl．Acad．Sci，USA ，90: 8392-8396(1993)、ＰＡ３１７細胞(Miller，A．D.とC．Buttimore、Molec ．and Cell．Biol.，6: 2895-2902(1986))、Ｋａｔ細胞株(Finer，M．H．ら、Bl ood，83: 43-50(1994))、ＧＰ＋Ｅ−８６細胞およびＧＰ＋ＥＭ１２細胞(Markow itz，D.，ら、J．Virol.,62: 1120-1124(1988)、およびＰｓｉＣｒｉｐとＰｓｉＣｒｅ細胞(米国特許第５，４４９，６１４号明細書; Danos，O．とMulliga n，R．C．、PNAS，USA，85: 6460-6464(1988))等のパッケージング細胞株に由来するネズミ細胞株を含む。また、ヤング(Yang，Y.)ら、Human Gene Ther.，6: 1 203-1213（1995）をも参照のこと。本発明に使用されるパッケージング細胞株は、汎親和性、アンホトロピックまたはエコトロピック宿主域を有するレトロウイルス粒子を産生することができる。したがって、この態様において、本発明のｃＤＮＡ発現ライブラリーは、パッケージング細胞株により産生されるレトロウイルス粒子の宿主域内でいかなる細胞においても発現することができる。さらに、この態様において、本発明のレトロウイルスベクターのプロモーターは、特別なパッケージング細胞株においてレトロウイルスベクターの十分な転写レベルを産するいかなるプロモーター（ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、β− アクチンプロモーター等）であってもよい。本発明のレトロウイルスベクター（ΔＵ３レトロウイルスベクター等）は、高力価のプソイドタイプ（ＶＳＶ−Ｇ等）のレトロウイルス産生のために、プソイドタイプのレトロウイルスを産生するパッケージング細胞株（本明細書ではＨ２９ｇａｇｐｏｌ細胞とも称される、本明細書に記載される２９３ＧＰＧ細胞等）の一過性のトランスフェクションに使用することができる。本発明のレトロウイルスベクターは、ｃＤＮＡ発現ライブラリーを含むプソイドタイプのレトロウイルス粒子が産生される、レトロウイルスのパッケージング細胞株のトランスフェクションのためのｃＤＮＡ発現ライブラリーの構築（レトロウイルスベクターで）を可能にする。各プソイドタイプのレトロウイルス粒子は、一般に、多数のｍＲＮＡ分子を含む。実施例４に記載されるように、ＶＳＶ−Ｇ宿主域を有するいかなる細胞株においても相補性による発現クローニングに使用されうる、ΔＵ３レトロウイルスベクターを用いて高力価のＶＳＶ−Ｇでプソイドタイプ化したウイルスは、２９３ＧＰＧ細胞を用いて産生した。レトロウイルスベクター、ΔＵ３ｎｌｓＬＺを用いて、３ｘ１０⁶感染ユニット（ｉ．ｕ．）／ｍｌまでの力価でレトロウイルスを産生する２９３ＧＰＧ細胞をトランスフェクトした。また、実施例５に記載のように、レトロウイルスｃＤＮＡクローニングベクター、ΔＵ３ＢＡＭを用いて、ΔＵ３ｎｌｓＬＺベクターと同等の発現レベルとウイルス力価で２９３ＧＰＧ細胞をトランスフェクトした。ｃＤＮＡ発現およびウイルス力価における５’非翻訳配列の効果の評価により、ウイルスのΔＵ３Ｂａｍベクターは、（ｃＤＮＡの高発現と高ウイルス力価の生成に関して最適化されたＭＦＧ由来に基づくレトロウイルスベクターと比較して）発現またはウイルス力価の適度な低下のみで、５’上流非コード化ＤＮＡ配列の１６５塩基対までが適応可能であることが示された。本明細書に記載される２９３ＧＰＧ細胞により産生されるＶＳＶ−Ｇレトロウイルスプソイドタイプは、広範な宿主域を有し、いかなる哺乳動物のタイプの感染をも可能にする(Yee，J．-K．ら、PNAS，91: 9564-9568)。したがって、本発明は、種々の哺乳動物パッケージング細胞株とともに用いて、次に、ｃＤＮＡによりコードされる発現産物（蛋白質、ポリペプチド）を含む種々の哺乳動物細胞を感染させるために用いられうるプソイドタイプのレトロウイルス粒子を産生可能なレトロウイルスベクターを提供する。具体的な例において、レトロウイルスベクターを用いて２９３ＧＰＧ細胞を一過性にトランスフェクションして、ＶＳＶ−Ｇ宿主域を有する高力価のウイルスを産生する。ΔＵ３ＢＡＭレトロウイルスベクターは、いかなるｃＤＮＡライブラリーの該ベクターへのクローニングをも可能にする。レトロウイルスｃＤＮＡライブラリーの２９３ＧＰＧ細胞へのトランスフェクションにより、いかなる哺乳動物細胞型をも感染可能な１０⁶ｉ．ｕ．／ｍｌを越える力価のレトロウイルスを産生する。このレトロウイルスベクターでの宿主細胞の感染は、レトロウイルス構築物中のｃＤＮＡの長期的な高レベルの発現を促進するプロウイルスゲノムの安定な組み込みを生ずる。本明細書に記載の新規な方法論は、レトロウイルスベクター（ΔＵ３Ｂａｍレトロウイルスベクター等）およびパッケージング細胞株（２９３ＧＰＧ細胞等）を利用して、いかなる哺乳動物細胞型においてもレトロウイルスｃＤＮＡ発現クローニングを提供し、効率的な発現クローニングのための特殊化細胞（Ｃｏｓ７細胞、卵母細胞等）の必要性を回避する。野生型親細胞型とは異なる表現型が存在するいかなる変異哺乳動物型（患者由来の初代ヒト細胞、変異した動物株由来の初代または確立された細胞株、ノックアウトマウス由来の初代または確立された細胞株、細胞培養で生成した変異細胞株等）においても、本発明を用いる相補性による発現クローニングにより、１または複数の遺伝子の欠損を迅速に同定することができる。本発明の方法論の拡大は、遺伝子欠損と確立した表現型を伴う患者由来の細胞における候補ｃＤＮＡクローンの発現に関して、パッケージング細胞でプソイドタイプのレトロウイルスを産生するために本発明のレトロウイルスベクターを使用することである。これにより、相補性分析により患者における遺伝子欠損（代謝に関連する遺伝子の変化した発現等）の基礎を決定するためのスクリーニングを可能にする。例えば、多くの患者が、脂肪酸代謝において単一の遺伝子欠損を有することが生化学的に遺伝学的に特徴付けされている。しかしながら、変異した遺伝子は、通常の方法では確立されていない。脂肪酸代謝における種々の酵素に対する候補ｃＤＮＡをコードするレトロウイルス構築物のパネルを、例えば、これらの患者由来の初代線維芽細胞における相補性に関して試験することができる。本発明のレトロウイルスベクターは、パッケージング細胞株（２９３ＧＰＧ等）での高レベルの発現を促進するために、レトロウイルスエンハンサープロモーターが正確にサイトメガロウイルスエンハンサープロモーターに置換されている（ＨＣＭＶ等）レトロウイルス由来のベクター（モロニーネズミ白血病ウイルス由来のベクター等）である。さらに、本発明のレトロウイルスベクターを使用して、いかなる哺乳動物細胞型での発現クローニングをも可能にするレトロウイルスｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製することができる。また、相補性による発現クローニングによりヒト遺伝子欠損の原因である変異した遺伝子の同定は、本発明のレトロウイルスベクターを用いて達成されうる。培養で突然変異を誘導され、公知の表現型を有する培養細胞株または、変異した表現型を有する動物由来の初代もしくは確立された細胞株からの変異した遺伝子の発現クローニングを行なうことができる。例えば、本発明の発現ｃＤＮＡライブラリーを変異した表現型を有する細胞に導入し、欠損を相補する１または複数の遺伝子の同定を決定する。したがって、本発明により提供される重要な有利性は、本明細書に記載のような相補性による発現クローニングを用いて、変異により生じた表現型の原因である１または複数の遺伝子を同定したり、１または複数の原因遺伝子の機能の証拠を得ることができるということである。さらに、本発明の実施例は、導入された変異を相補する遺伝子産物または変異により影響される１または複数の経路内で機能する遺伝子産物のノックアウトマウスにおいて、同定（すなわち、サプレッサー分析による下流のエフェクターの同定）を可能にし、本発明のレトロウイルスベクターを用いて決定されうる。また、商業上の販売に関するレトロウイルスベクターで構築されるレトロウイルスｃＤＮＡライブラリーも提供される。本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。実施例実施例１発現ベクターの構築ｐＸＦ３バックボーンとヒトＣＭＶ即時型初期プロモーター領域を含むｐＢＣ１２．ＡＢ由来の３．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片と、エキソン２のＢａｍＨＩ部位から３’非翻訳領域までの６９０ｂｐのヒトβ−グロビンゲノム配列を含むｐＵＣＭｄβｓ（Ｒ）Ｓ（Sadelain，M.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA，92: 6728-6732(1995)）由来の１．３４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片とを用いて、ｐＭＤ（図１を参照）を構築した。しかしながら、プラスミドｐＵＣＭｄβｓ（Ｒ）Ｓは、第１と第３のＲｓａＩ部位間の第２イントロンで３７４ｂｐの欠失が存在するという点でゲノム配列とは異なる。ｐＢＣ１２．ＡＢは、ＩＬ−２配列（ｂｐ７５６〜１４３９）をポリリンカーで置換しているｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＩＬ−２（B．Cullen，Cell 46: 973(1986)）の派生物である。ＥｃｏＲＩとＸｂａＩの突出をＫｌｅｎｏｗ断片での処理により末端平滑化した後、３．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片と１．３４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片とを連結した。ｐＳＶＧＬ(Rose とBergman、Cell 34：513(1983))由来で、ヒトβ−グロビンゲノム配列のエキソン３内のｐＭＤ中のＥｃｏＲＩ部位にクローニングしたＶＳＶＧ遺伝子を含む１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を用いて、ｐＭＤ．Ｇ（図３を参照）を構築した。ｔｅｔオペレーターと最小のＣＭＶプロモーター配列を含むｐＵＨＣ１３− ３(Gossen とBujard、Proc．Natl．Acad．Sci．89: 5547-5551(1992))由来の０．４７ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片、ｐＵＣＭｄβｓ（Ｒ）Ｓ由来の１．３４のＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片およびｐＳＬ３０１（Invitrogen）由来の３．０６ｋｂのＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片を用いて、ｐＭＤｔｅｔ（図２を参照）を作製した。ｐＭＤｔｅｔ．Ｇ（図４を参照）を構築するために、ＶＳＶＧ遺伝子（ｐＳＶＧＬ）を含む１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をヒトβ−グロビンゲノム配列のエキソン３内のｐＭＤ．ｔｅｔＧ中のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。ｐＭＤ．ｇａｇｐｏｌ（図５を参照）を構築するために、ｐＣＲＩＰｅｎｖ− (Danos Mulligan、Proc．Natl．Acad．Sci．85: 6460-6466(1988))と以下のプライマー対：を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで、およびＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII でそれぞれ消化し、０．９４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩおよび０．９４ｋｂのＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ断片が生成した。これらの断片を、ｐＣＲＩＰｅｎｖ−由来の３．３ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII 断片およびＥｃｏＲＩで直鎖状にしてホスファターゼ処理しておいたｐＵＣ１９とともに連結して、ｐＵＣ１９．ｇａｇｐｏｌを作製した。ｐＵＣ１９．ｇａｇｐｏｌ由来の５．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ヒトβ−グロビンゲノム配列のエキソン３内にあるｐＭＤのＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、ｐＭＤ．ｇａｇｐｏｌを得た。ｐＭＤ．ｎｅｗｇａｇｐｏｌ（図６を参照）を構築するために、変異したｇａｇｐｏｌ配列をコードするｐＢＣＩＬ２．ｇａｇｐｏｌ(ChungとMulligan、未発表の結果)と以下のプライマー対：を用いてＰＣＲを行なった。変異したｇａｇｐｏｌ配列は、以下のようである：Ｎｅｗ５’ｇａｇｐｏｌ：Ｎｅｗ３’ｇａｇｐｏｌ：ＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ、およびＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII でそれぞれ消化し、０．９４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩと０．９４ｋｂのＨｉｎｄ III −ＥｃｏＲＩ断片が生成した。これらの断片を、ｐＣＲＩＰｅｎｖ−由来の３．３ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII 断片およびＥｃｏＲＩで直鎖状にしてホスファターゼ処理しておいたｐＵＣ１９と連結して、ｐＵＣ１９．ｎｅｗｇａｇｐｏｌを作製した。ｐＵＣ１９．ｎｅｗｇａｇｐｏｌ由来の５．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、ヒトβ−グロビンゲノム配列のエキソン３内にあるｐＭＤのＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、ｐＭＤ．ｎｅｗｇａｇｐｏｌを得た。野生型ｇａｇｐｏｌの発現（ｐＭＤ．ｇａｇｐｏｌ）および変異したｇａｇｐｏｌ（ｐＭＤ．ｎｅｗｇａｇｐｏｌ）に関して、新規なＣＭＶ発現ベクター（ｐＭＤ）を構築した。ｐＭＤ．ｇａｇｐｏｌに関して、一過性と安定の両方の発現の条件下でレトロウイルス粒子の産生を示唆する逆転写酵素アッセイを行なった。ｐＭＤ．ｎｅｗｇａｇｐｏｌに関して、一過性の発現の条件下でレトロウイルス粒子の産生を示唆する逆転写酵素アッセイを行なった。実施例２パッケージング細胞株の構築Ｈ２９細胞株。ヒト２９３細胞（B．Panningから贈与；Graham，F.，ら、J．Gen．Virol.，36 ：59-72(1977)）を、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足した、５％不活化ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ（２９３成育培地）中で成育させ、３７Ｃ、５％ＣＯ２でインキュベートした。該２９３細胞を、リン酸カルシウム沈殿法(Pear ら、PNAS，90: 8392-8396(1994))により、５μ ｇのＰＢＣ．ｔＴＡ（図７を参照；T．Chung とR．Mulligan、未発表の結果）、５μｇのｐＭＤｔｅｔ．Ｇと１μｇのｐＪ６Ωｐｕｒｏ（J．Morgensternから贈与）で同時トランスフェクトした。トランスフェクションの間、２９３成育培地に、１．０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン(Sigma)を補足した。トランスフェクトした細胞を、１．０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと２μｇ／ｍｌのピューロマイシン(Sigma)を補足した２９３成育培地に、トランスフェクション後４８時間の選択に播種した。７２個の独立したクローンをクローンの増大のために選択し、テトラサイクリンで誘導可能なＶＳＶ−Ｇ発現をスクリーニングした。クローンをスクリーニングするために、各クローンを３０％のコンフルエンスで２つの３５ｍｍ組織培養皿(Corning)に同時に播種した。次の日、１つのプレートをテトラサイクリンを含まない２ｍｌの２９３成育培地で２回洗浄して、２μ ｇ／ｍｌのピューロマイシンを補足した標準２９３培地に培地を交換した。４８時間で、細胞を全細胞性蛋白質用に回収し、１対の試料を還元条件下で７．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。該ゲルをセミドライエレクトロブロッター(Owl Scientific)でニトロセルロース(Schleicher & Schuell、0． 45mm)上に転写した。標準的手法を用いてウエスタンブロッティングを行なった。一次抗体に関しては、ネズミモノクローナル抗ＶＳＶ−ＧＩｇＧ(Sigma)を１：８００の希釈で用いた。二次抗体に関しては、ＨＲＰ結合ロバ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ）２断片(Pharmingen)を１：１０，０００の希釈で用いた。Dupont NEN Renaissanceキットを用いて、化学発光検出を行なった。成育培地にテトラサイクリンの存在下で検出可能なＶＳＶ−Ｇ発現がなく、成育培地にテトラサイクリンの非存在下で誘導可能なＶＳＶ−Ｇ発現が検出されることを基礎として、陽性の細胞株（Ｈ２９等）を選択した。Ｈ２９ｇａｇｐｏｌ細胞株（２９３ＧＰＧ細胞株）。Ｈ２９細胞を１．０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補足した２９３成育培地（Ｈ２９培地）中で成育させ、リン酸カルシウム沈殿法により、２μｇのｐＳＶ２ｎｅｏとＳｃａＩで直鎖状にした１０μｇのｐＭＤ．ｇａｇｐｏｌを用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションの間、Ｈ２９培地に、１．０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補足した。トランスフェクトしたＨ２９細胞を、１．０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと０．３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８(Gibco)を補足したＨ２９培地に、トランスフェクション後４８時間の選択に播種した。６９個の独立したクローンをクローンの拡張のために選択し、逆転写酵素活性をスクリーニングした(Goff ら、J．Virology，3 8:239-248(1981))。クローンの拡張のために選択した６９個の独立したクローンの内で、１０個のクローンが陽性対照（すなわち、Ψ Ｃｒｅ細胞）を越える逆転写酵素活性を有していた。これらの１０個のクローンをさらに特徴付けする。Ｈ２９ｎｅｗｇａｇｐｏｌ細胞株Ｈ２９細胞を１．０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補足した２９３成育培地（Ｈ２９培地）中で成育させ、リン酸カルシウム沈殿法により、２μｇのｐＳＶ２ｎｅｏとＳｃａＩで直鎖状にした１０μｇのｐＭＤ．ｎｅｗｇａｇｐｏｌを用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションの間、Ｈ２９培地に、１．０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補足した。トランスフェクトしたＨ２９細胞に、１．０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと０．３ｍｇ／ｍｌのＧ４１８(Gibco)を補足したＨ２９培地中、トランスフェクション後４８時間の選択に播種した。独立したクローンをクローンの増大のために選択し、逆転写酵素活性をスクリーニングした(Goff ら、J．Virology(19 81))。考察したがって、ｐＭＤの派生物であるｐＭＤｔｅｔ．Ｇは、ＶＳＶ．Ｇのテトラサイクリンにより誘導可能な発現を提供する。ＶＳＶ−Ｇの誘導可能な発現は、一過性のアッセイおよび安定な細胞株、Ｈ２９で示された。Ｈ２９は、２９３細胞（Graham，F.ら、J．Gen．Virol.，36: 59-72(1977)）由来であり、ｐＢＣ．ｔＴＡ（Ｔｅｔトランスアクティベーター）、ｐＭＤｔｅｔ．ＧおよびｐＪＧΩ ｐｕｒｏで同時トランスフェクション後に選択された。Ｈ２９細胞は、親の２９３細胞での一過性のＶＳＶ−Ｇの発現よりも５倍だけ低い誘導可能なＶＳＶ−Ｇの発現を、ウエスタンブロッティングにより示す。Ｈ２９細胞は、誘導可能なＶＳＶ−Ｇの発現を示すために、連続２０回の継代培養を繰り返した。実施例３ ΔＵ３レトロウイルスクローニングベクターの構築 ΔＵ３ｎｌｓＬａｃＺレトロウイルスベクターを、ＭＦＧ．ＳｎｌｓＬａｃＺ (Bernsら、Human Gene Therapy，6: 347-368(1995); 図８を参照）の５’ＬＴＲのＵ３領域をＨＣＭＶエンハンサー−プロモーター（ｎｔ−６７１〜−２）（Bo shart，M.、Cell，41: 521-530(1985)）への正確な置換により構築した。ΔＵ３ｎｌｓＬａｃＺにおいて、完全な５’ゲノムフランキング領域およびＭＦＧ．ＳｎｌｓＬａｃＺ由来の３’のゲノムフランキング領域から６５ｂｐ以外のすべてを除去する。ｐＭＤプラスミドを、実施例１に記載のように構築した。ΔＵ３ｎｌｓＬａｃＺの構築に関しては、ＨＣＭＶプロモーターをコードする７０１ｂｐの断片を、ｐＭＤプラスミドを鋳型とし、５’ＨｉｎｄIII 部位および３’ＫａｓＩ部位を創出する１対のプライマー、を用いてＰＣＲにより作製した。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄIII とＫａｓＩで消化して、６７７ｂｐの断片を得た。ＭＦＧ(Riviere，I.ら、PNAS，92: 6733-6737（1 995))の３’ＬＴＲから、９１ｂｐのＫａｓＩ−ＳｔｙＩを単離した。２５３ｂｐのＳｔｙＩ−ＥａｇＩおよび４９９４ｂｐのＥａｇＩ−ＳｃａＩ断片を、ＭＦＧ．ＳＮｌｓＬａｃＺ(Bernsら、Human Gene Therapy，6: 342-368(1995))から単離し、ΔＵ３ｎｌｓＬａｃＺのバックボーンは、ｐＵＣ１８由来の２．６５ｋｂのＨｉｎｄIII −ＳｍａＩ断片である。 ΔＵ３Ｂａｍの構築に関しては、５６１ｂｐの断片を、ΔＵ３ｎｌｓＬａｃＺを鋳型とし、５’ＫａｓＩ部位および３’ＢａｍＨＩ部位を創出する１対のプライマー、を用いてＰＣＲにより作製した。ＰＣＲ産物をＫａｓＩとＢａｍＨＩで消化して、３８９ｂｐの断片を得た。３８９ｂｐのＫａｓＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ΔＵ３ｎｌｓＬａｃＺ由来の４４６６ｂｐのＢａｍＨＩ−ＥａｇＩおよび６９５ｂｐのＥａｇＩ−ＫａｓＩ断片と連結した。図９Ａは、ΔＵ３ｎｌｓＬａｃＺベクターの構造を示し、図９Ｂは、ΔＵ３Ｂａｍベクターの構造を示す。実施例４２９３ＧＰＧ細胞の一過性トランスフェクションによるＶＳＶ−Ｇプソイドタイプのレトロウイルスの産生プラスミドｐＢＣ．ｔＴＡを、ｐＵＨＤ１０−１(Gossen，M．ら、Proc．Natl ．Acad．Sci．89: 5547-551(1992))由来のｔｅｔトランスアクティベーター遺伝子でのＩＬ−２配列（ｂｐ７５６〜１４３９）の置換により、ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＩＬ−２（Cullen，B．R.、Cell，46: 973-982(1986)）から構築した。図７は、ｐＢＣ．ｔＴＡプラスミドの構造を示す。ｐＭＤ、ｐＭＤ．Ｇ、ｐＭＤｔｅｔ、ｐＭＤｔｅｔ．ＧおよびｐＭＤ．ｇａｇｐｏｌ構築物ならびに２９３ＧＰＧ細胞株を、実施例１に記載のように構築した。２９３ＧＰＧ細胞を用いる一過性のトランスフェクションを、４〜５ｘ１０⁶ 細胞を一晩前に４ｍｌの２９３ＧＰＧ培地中に播種した６０ｍｍのディッシュで行なった。４μｇのΔＵ３ｎｌｓＬａｃＺを３００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ(Gib co BRL)中で希釈し、３００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で希釈した２５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(Gibco BRL)とともに、室温で３０分間インキュベートした。２．４ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを、ＤＮＡ−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合物に添加して、トランスフェクション前３０分にリンスして２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭに培地交換しておいた２９３ＧＰＧ細胞の上部に置いた。トランスフェクション後７〜８時間に、２ｍｌの２９３培地を添加し、該培地を２４時間で交換した。７２時間で上清を回収し、以下のようにウイルスの力価を測定した。β−ガラクトシダーゼ活性のアッセイおよびウイルス力価の測定 β−ガラクトシダーゼ活性に関して細胞を染色するために、細胞を１ｍＭのマグネシウムを補足したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ＋）で洗浄して、ＰＢＳ＋中１％のグルタルアルデヒドを用いて、３７℃で１０分間固定した(Lim，K.ら、 Biotechniques，7: 576-579(1989)）。固定液を吸引除去し、細胞を、ＰＢＳ＋中３．３ｍＭのフェリシアン化カリウム(Sigma)、３．３ｍＭのフェロシアン化カリウム(Sigma)および０．２％のＸ−ｇａｌ(Molecular Probes)とともに、３７℃で２時間インキュベートした。定量的なβ−ガラクトシダーゼ活性は、市販の発光アッセイ(Clontech)を用いて測定した。ウイルス力価を測定するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染前１６時間に６ウエルの培養皿中ウエル当たり１ｘ１０⁵細胞で播種し、８μｇ／ｍｌのポリブレン(Sigma)を含むウイルス上清の連続希釈液とともに２４時間インキュベートした。ウイルス力価は、２０個の１ｍｍ² の視野当たり青い核を有する細胞（β−ガラクトシダーゼ産生細胞）の平均数 ×プレートサイズを占める因子、ウイルス原液の希釈÷組織培養ウエルにおける標的細胞として決定した。２９３ＧＰＧ細胞の一過性トランスフェクションによるＶＳＶ−Ｇプソイドタイプのレトロウイルスの産生２９３ＧＰＧクローンを用いて、２９３細胞の高トランスフェクション効率を利用して、一過性のトランスフェクションによりＶＳＶ−Ｇでプソイドタイプ化したレトロウイルスを産生させた。２９３ＧＰＧ細胞の一過性のトランスフェクションに関して、ＭＦＧ．ｎｌｓＬａｃＺの５’ＬＴＲのＵ３領域をＨＣＭＶエンハンサー−プロモーターへの置換およびＭＦＧ．ＳｎｌｓＬａｃＺの５’と３ ’のゲノムフランキング領域の欠失により、ΔＵ３ｎｌｓＬａｃＺレトロウイルス構築物を作製した。ＭＦＧ．ＳｎｌｓＬａｃＺと比較したとき、ΔＵ３ｎｌｓＬａｃＺは、一過性のトランスフェクションにおいて２０倍の発現増加を可能にした。２９３ＧＰＧクローンを、４０％の平均効率で、ΔＵ３ｎｌｓＬａｃＺ構築物を用いるリポフェクタミンにより一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間と７２時間の間で４８時間のウイルス上清を回収し、成育培地からテトラサイクリンを除去した。１〜３ｘ１０⁶ｉ．ｕ．／ｍｌの範囲のウイルス力価が一過性に達成された。実施例５ｃＤＮＡ発現およびウイルス力価における５’非翻訳配列の効果以前に使用したベクターとΔＵ３レトロウイルスクローニングベクターとの間に、いくつかの相違が存在する。第１に、ΔＵ３ベクターは、５’ＬＴＲのＵ３領域を完全なヒトＣＭＶエンハンサー−プロモーター(Boshartら、Cell，41: 52 1-530(1985))により正確に置換することにより、２９３由来の細胞株（２９３ＧＰＧ細胞等）において高い一過性の発現のために特別に修正されている。第２に、ΔＵ３ベクターは、確立された高力価で高発現ベクターであるＭＧＦに由来する。最後に、以前のレトロウイルス発現クローニングに使用されたベクターとは異なり、ｃＤＮＡ発現とｃＤＮＡウイルス力価における５’非翻訳配列の効果を試験した。このことは、ｃＤＮＡライブラリーの構築過程(Seed，B．とAruffo， S.、PNAS，84: 3365-3369(1987))において、ｃＤＮＡ挿入物がたびたび２００塩基対までの５’非翻訳配列を含むので重要である。したがって、レトロウイルスクローニングベクターは、バイアスをライブラリー内に導入しないように、これらの追加の配列を適用することができなければならない。ｃＤＮＡ発現とウイルス力価における５’非翻訳配列の効果は、５’非翻訳配列の０〜１６５塩基対を有するｌａｃＺ遺伝子をΔＵ３Ｂａｍベクター内に挿入することにより試験した。下記は、非翻訳配列の０塩基対（すなわち、修飾されたＢａｍＨＩクローニング部位を含まないΔＵ３ｌａｃＺ）に対して標準化したデータである：これらの結果により、ΔＵ３Ｂａｍベクターは、非クローニングＭＧＦに基づくレトロウイルスベクターと比べて、発現またはウイルス力価において適度に減少するだけでｃＤＮＡ挿入物内の１６５ｂｐまでの５’非翻訳配列を適用することができることが示される。このデータは、ΔＵ３ＢａｍベクターがｃＤＮＡ挿入物の効率的なパッケージングおよび標的細胞(call)に対するｃＤＮＡの効率的な伝達を促進する可能性を支持する。均等物当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。かかる均等物は、下記請求の範囲に記載されるような本発明の範疇に含まれるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１２月９日（１９９７．１２．９）【補正内容】請求の範囲１．ヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株であって、ａ）レトロウイルスコアウイルス粒子を製造するレトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子；およびｂ）レトロウイルスコアウイルス粒子に対するプソイドタイプのエンベロープ蛋白質をコードし、誘導可能なオペレーター系の制御下にある遺伝子（ここで、該ｂ）の蛋白質は、ヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を生ずる、レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープ蛋白質を提供する）の発現を支配する１以上の非レトロウイルス発現構築物を含有してなるパッケージング細胞株。２．ヒト由来であり、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株であって、ａ）レトロウイルスコアウイルス粒子を製造するレトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子；およびｂ）レトロウイルスコアに対するプソイドタイプのエンベロープ蛋白質をコードし、誘導可能なオペレーター系の制御下にある遺伝子（ここで、水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質は、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を生ずる、レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープ蛋白質を提供する）の発現を支配する１以上の非レトロウイルス発現構築物を含有してなるパッケージング細胞株。３．ｂ）のエンベロープ蛋白質が水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質である、請求項２記載の安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株。４．非レトロウイルス発現構築物がヒトサイトメガロウイルス即時型初期プロモーターを含有してなる、請求項３記載のパッケージング細胞株。５．水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質の発現に関して誘導可能なオペレーター系がｔｅｔオペレーター系である、請求項３記載のパッケージング細胞株。６．レトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子が変異している、請求項３記載のパッケージング細胞株。７．細胞が、誘導可能なｔｅｔオペレーターの制御下でＶＳＶ−Ｇを発現するヒト細胞、ｔＴＡ、およびｇａｇｐｏｌを含有してなるＨ２９ｇａｇｐｏｌ細胞である、請求項３記載のパッケージング細胞株。８．細胞が、誘導可能なｔｅｔオペレーターの制御下でＶＳＶ−Ｇを発現するヒト細胞、ｔＴＡ、および変異したｇａｇｐｏｌ遺伝子を含有してなるＨ２９ｎｅｗｇａｇｐｏｌ細胞である、請求項６記載のパッケージング細胞株。９．汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株であって、ａ）レトロウイルスコアウイルス粒子を製造するレトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子；およびｂ）誘導可能なｔｅｔオペレーター系の制御下の水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質（ここで、該水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質は、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を生ずる、レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープ蛋白質を提供する）の発現を支配する１以上のサイトメガロウイルス発現構築物を含有してなるパッケージング細胞株。１０．細胞が、誘導可能なｔｅｔオペレーターの制御下でＶＳＶ−Ｇを発現するヒト細胞、ｔＴＡ、およびｇａｇｐｏｌを含有してなるＨ２９ｇａｇｐｏｌ細胞である、請求項９記載のパッケージング細胞株。１１．汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株であって、ａ）変異したレトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子；およびｂ）誘導可能なｔｅｔオペレーター系の制御下の水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質（ここで、該水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質は、安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株から汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生するために、変異したｇａｇｐｏｌ遺伝子から発現されるレトロウイルスｇａｇｐｏｌ蛋白質と相互作用するプソイドタイプのエンベロープ蛋白質を提供する）の発現を支配する１以上のサイトメガロウイルス発現構築物を含有してなるパッケージング細胞株。１２．細胞が、誘導可能なｔｅｔオペレーターの制御下でＶＳＶ−Ｇを発現するヒト細胞、ｔＴＡ、および変異したｇａｇｐｏｌ遺伝子を含有してなるＨ２９ｎｅｗｇａｇｐｏｌ細胞である、請求項１１記載のパッケージング細胞株。１３．ａ）レトロウイルスコアウイルス粒子を製造するレトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子、およびｂ）レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープを提供し、誘導可能なオペレーター系の制御下にある蛋白質（ここで、該ｂ）の蛋白質は、ヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を生ずる、レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープ蛋白質を提供する）の発現を支配する１以上の非レトロウイルス発現構築物で哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程を含む、ヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株の作製方法。１４．ａ）レトロウイルスコアウイルス粒子を製造するレトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子、およびｂ）誘導可能なオペレーター系の制御下の水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質（ここで、該水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質は、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を生ずる、レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープ蛋白質を提供する）の発現を支配する１以上の非レトロウイルス発現構築物で哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程を含む、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株の作製方法。１５．非レトロウイルス発現構築物がサイトメガロウイルス構築物である、請求項１４記載の方法。１６．水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質の発現に関して誘導可能なオペレーター系がｔｅｔオペレーター系である、請求項１４記載の方法。１７．哺乳動物細胞が、誘導可能なｔｅｔオペレーターの制御下でＶＳＶ−Ｇを発現するヒト細胞、およびｔＴＡを含有してなるＨ２９細胞である、請求項１４記載の方法。１８．レトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子が変異している、請求項１４記載の方法。１９．変異したｇａｇｐｏｌ遺伝子がｎｅｗ５’ｇａｇｐｏｌおよびｎｅｗ３’ｇａｇｐｏｌヌクレオチド配列、配列番号：７および８を含有してなる、請求項１８記載の方法。２０．ａ）ｔｅｔトランスアクティベーターをコードする第１の非レトロウイルス構築物およびｔｅｔトランスアクティベーターの制御下で水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質をコードする第２の非レトロウイルス構築物で、哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程；ｂ）テトラサイクリンの存在下ではＶＳＶ−Ｇが検出されず、テトラサイクリンの非存在下では検出されるテトラサイクリンで誘導可能なＶＳＶ−Ｇの発現に関して、ａ）の細胞をスクリーニングする工程；ｃ）レトロウイルスｇａｇｐｏｌ蛋白質をコードする第３の非レトロウイルス構築物で、ｂ）の細胞をトランスフェクトする工程；ならびにｄ）レトロウイルスの産生に関してｃ）の細胞をスクリーニングする工程（ここで、レトロウイルスを産生するｄ）のトランスフェクトした細胞は、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞である）を含む、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株の作製方法。２１．第２および第３の構築物がサイトメガロウイルス構築物である、請求項２０記載の方法。２２．哺乳動物細胞が、誘導可能なｔｅｔオペレーターの制御下でＶＳＶ−Ｇを発現するヒト細胞、およびｔＴＡを含有してなるＨ２９細胞である、請求項２０記載の方法。２３．レトロウイルスｇａｇｐｏｌ蛋白質が変異している請求項２０記載の方法。２４．変異したｇａｇｐｏｌ蛋白質が、配列番号：７および８によりコードされるｎｅｗ５’ｇａｇおよびｎｅｗ３’ｐｏｌ蛋白質を含有してなる、請求項２３記載の方法。２５．誘導可能なｔｅｔオペレーターの制御下でＶＳＶ−Ｇを発現するヒト細胞、およびｔＴＡを含有してなるＨ２９細胞株。２６．誘導可能なｔｅｔオペレーターの制御下でＶＳＶ−Ｇを発現するヒト細胞、ｔＴＡ、およびｇａｇｐｏｌを含有してなるＨ２９ｇａｇｐｏｌ細胞株。２７．誘導可能なｔｅｔオペレーターの制御下でＶＳＶ−Ｇを発現するヒト細胞、ｔＴＡ、および変異したｇａｇｐｏｌ遺伝子を含有してなるＨ２９ｎｅｗｇａｇｐｏｌ細胞株。２８．図１のベクターを含有してなるｐＭＤ。２９．図２のベクターを含有してなるｐＭＤｔｅｔ。３０．図４のベクターを含有してなるｐＭＤｔｅｔ．Ｇ。３１．図５のベクターを含有してなるｐＭＤ．ｇａｇｐｏｌ。３２．図６のベクターを含有してなるｐＭＤ．ｎｅｗｇａｇｐｏｌ。３３．ａ）２つのレトロウイルスＬＴＲ；ｂ）ｃＤＮＡの挿入のためのクローニング部位；およびｃ）サイトメガロウイルスプロモーターを含有してなる、哺乳動物細胞での発現用ｃＤＮＡライブラリーの作製のためのレトロウイルスベクター。３４．レトロウイルスＬＴＲがモロニーネズミ白血病ウイルスＬＴＲである、請求項３３記載のレトロウイルスベクター。３５．該ＬＴＲの１つは、モロニーネズミ白血病ウイルスＬＴＲのＵ３領域がヒトサイトメガロウイルスプロモーターで置換されている修飾したモロニーネズミ白血病ウイルスＬＴＲである、請求項３４記載のレトロウイルスベクター。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者オーリ，ダニエルエス. アメリカ合衆国ミズーリ 63124 セントルイス，グリーンブライアーストリート８ (72)発明者セードレイン，マイケルアメリカ合衆国ニューヨーク 10128 ニューヨーク，イースト 89ティーエイチストリート 401 (72)発明者マリガン，リチャードシー. アメリカ合衆国カリフォルニア 94705 バークレー，ベルローズアベニュー 2337 (72)発明者シャファー，ジーンイー. アメリカ合衆国ミズーリ 63124 セントルイス，グリーンブライアーストリート８【要約の続き】れる特別な細胞と構築物（すなわちパッケージング要素）（Ｈ２９細胞とｐＭＤ、ｐＭＤｔｅｔ、ｐＭＤｔｅｔ．Ｇ、ＰＭＤ．ｇａｇｐｏｌ、ｐＭＤ．ｎｅｗｇａｇｐｏｌ構築物等）に関する。本発明は、２つのレトロウイルス長末端反復、ｃＤＮＡの挿入のためのクローニング部位およびサイトメガロウイルスプロモーターを含有する、哺乳動物細胞での発現用ｃＤＮＡライブラリーの作製のためのレトロウイルスベクターに関する。また本発明は、本発明のレトロウイルスベクターを含有する、哺乳動物細胞での発現用ｃＤＮＡライブラリーに関する。また本発明は、哺乳動物細胞における発現クローニング方法に関する。また本発明は、哺乳動物細胞におけるｃＤＮＡ発現クローニング方法に関する。また本発明は、哺乳動物細胞での相補性によるｃＤＮＡ発現クローニングを用いる変異した表現型の原因となる遺伝子の欠損を同定する方法に関する。

Claims

【特許請求の範囲】１．ヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生可能な、安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株であって、ａ）レトロウイルスコアウイルス粒子を製造するレトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子；およびｂ）レトロウイルスコアウイルス粒子に対するプソイドタイプのエンベロープをコードし、誘導可能なオペレーター系の制御下にある遺伝子（ここで、該ｂ）の蛋白質は、ヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を生ずる、レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープ蛋白質を提供する）の発現を支配する１以上の非レトロウイルス発現構築物を含有してなるパッケージング細胞株。２．汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生可能な、安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株であって、ａ）レトロウイルスコアウイルス粒子を製造するレトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子；およびｂ）誘導可能なオペレーター系の制御下の水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質（ここで、該水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質は、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を生ずる、レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープ蛋白質を提供する）の発現を支配する１以上の非レトロウイルス発現構築物を含有してなるパッケージング細胞株。３．非レトロウイルス発現構築物がヒトサイトメガロウイルス即時型初期プロモーターを含有してなる、請求項２記載のパッケージング細胞株。４．水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質の発現に関して誘導可能なオペレーター系がｔｅｔオペレーター系である、請求項２記載のパッケージング細胞株。５．レトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子が変異している、請求項２記載のパッケージング細胞株。６．細胞がＨ２９ｇａｇｐｏｌ細胞である、請求項２記載のパッケージング細胞株。７．細胞がＨ２９ｎｅｗｇａｇｐｏｌ細胞である、請求項５記載のパッケージング細胞株。８．汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生可能な、安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株であって、ａ）レトロウイルスコアウイルス粒子を製造するレトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子；およびｂ）誘導可能なｔｅｔオペレーター系の制御下の水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質（ここで、該水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質は、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を生ずる、レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープ蛋白質を提供する）の発現を支配する１以上のサイトメガロウイルス発現構築物を含有してなるパッケージング細胞株。９．細胞がＨ２９ｇａｇｐｏｌ細胞である、請求項８記載のパッケージング細胞株。１０．汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生可能な、安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株であって、ａ）変異したレトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子；およびｂ）誘導可能なｔｅｔオペレーター系の制御下の水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質（ここで、該水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質は、安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株から汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生するために、変異したｇａｇｐｏｌ遺伝子から発現されるレトロウイルスｇａｇｐｏｌ蛋白質と相互作用するプソイドタイプのエンベロープ蛋白質を提供する）の発現を支配する１以上のサイトメガロウイルス発現構築物を含有してなるパッケージング細胞株。１１．細胞がＨ２９ｎｅｗｇａｇｐｏｌ細胞である、請求項１０記載のパッケージング細胞株。１２．ａ）レトロウイルスコアウイルス粒子を製造するレトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子、およびｂ）レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープを提供し、誘導可能なオペレーター系の制御下にある蛋白質（ここで、該ｂ）の蛋白質は、ヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を生ずる、レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープ蛋白質を提供する）の発現を支配する１以上の非レトロウイルス発現構築物で哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程を含む、ヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生可能な安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株の作製方法。１３．ａ）レトロウイルスコアウイルス粒子を製造するレトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子、およびｂ）誘導可能なオペレーター系の制御下の水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質（ここで、該水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質は、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生する安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株を生ずる、レトロウイルスコアウイルス粒子に対してプソイドタイプのエンベロープ蛋白質を提供する）の発現を支配する１以上の非レトロウイルス発現構築物で哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程を含む、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生可能な安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株の作製方法。１４．非レトロウイルス発現構築物がサイトメガロウイルス構築物である、請求項１３記載の方法。１５．水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質の発現に関して誘導可能なオペレーター系がｔｅｔオペレーター系である、請求項１３記載の方法。１６．哺乳動物細胞がＨ２９細胞である、請求項１３記載の方法。１７．レトロウイルスｇａｇｐｏｌ遺伝子が変異している、請求項１３記載の方法。１８．変異したｇａｇｐｏｌ遺伝子がｎｅｗ５’ｇａｇｐｏｌおよびｎｅｗ３’ｇａｇｐｏｌヌクレオチド配列である、請求項１７記載の方法。１９．ａ）ｔｅｔオペレーターをコードする第１の非レトロウイルス構築物および水疱性口内炎ウイルスＧ糖蛋白質をコードする第２の非レトロウイルス構築物で、哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程；ｂ）テトラサイクリンの存在下ではＶＳＶ−Ｇが検出されず、テトラサイクリンの非存在下では検出されるテトラサイクリンで誘導可能なＶＳＶ−Ｇの発現に関して、ａ）の細胞をスクリーニングする工程；ｃ）レトロウイルスｇａｇｐｏｌ蛋白質をコードする第３の非レトロウイルス構築物で、ｂ）の細胞をトランスフェクトする工程；ならびにｄ）レトロウイルスの産生に関してｃ）の細胞をスクリーニングする工程（ここで、レトロウイルスを産生するｄ）のトランスフェクトした細胞は、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生可能な安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞である）を含む、汎親和性宿主域を有するヘルパーフリーの組換えプソイドタイプのレトロウイルスを産生可能な安定なプソイドタイプのレトロウイルスパッケージング細胞株の作製方法。２０．第２および第３の構築物がサイトメガロウイルス構築物である、請求項１９記載の方法。２１．哺乳動物細胞がＨ２９細胞である請求項１９記載の方法。２２．レトロウイルスｇａｇｐｏｌ蛋白質が変異している請求項１９記載の方法。２３．変異したｇａｇｐｏｌ蛋白質がｎｅｗ５’ｇａｇおよびｎｅｗ３’ｐｏｌ蛋白質である、請求項１９記載の方法。２４．Ｈ２９細胞株。２５．Ｈ２９ｇａｇｐｏｌ細胞株。２６．Ｈ２９ｎｅｗｇａｇｐｏｌ細胞株。２７．ｐＭＤ。２８．ｐＭＤｔｅｔ。２９．ｐＭＤｔｅｔ．Ｇ。３０．ｐＭＤ．ｇａｇｐｏｌ。３１．ｐＭＤ．ｎｅｗｇａｇｐｏｌ。３２．ａ）２つのレトロウイルスＬＴＲ；ｂ）ｃＤＮＡの挿入のためのクローニング部位；およびｃ）サイトメガロウイルスプロモーターを含有してなる、哺乳動物細胞での発現用ｃＤＮＡライブラリーの作製のためのレトロウイルスベクター。３３．レトロウイルスＬＴＲがモロニーネズミ白血病ウイルスＬＴＲである、請求項３２記載のレトロウイルスベクター。３４．該ＬＴＲの１つは、モロニーネズミ白血病ウイルスＬＴＲのＵ３領域がヒトサイトメガロウイルスプロモーターで置換されている修飾されたモロニーネズミ白血病ウイルスＬＴＲである、請求項３３記載のレトロウイルスベクター。３５．ライブラリーが、ａ）２つのレトロウイルスＬＴＲ；ｂ）ｃＤＮＡ；およびｃ）サイトメガロウイルスプロモーター（ここで、該ｃＤＮＡはレトロウイルスＬＴＲ間に位置して、サイトメガロウイルスプロモーターに操作可能に結合している）を含有するレトロウイルスベクターを含有してなる、哺乳動物細胞での発現用ｃＤＮＡ発現ライブラリー。３６．レトロウイルスＬＴＲがモロニーネズミ白血病ウイルスＬＴＲであり、該ＬＴＲの１つは、モロニーネズミ白血病ウイルスＬＴＲのＵ３領域がヒトサイトメガロウイルスプロモーターで置換されている修飾されたモロニーネズミ白血病ウイルスＬＴＲである、請求項３５記載のｃＤＮＡ発現ライブラリー。３７．ａ）２つのレトロウイルスＬＴＲ、ｃＤＮＡおよびサイトメガロウイルスプロモーターを含有するレトロウイルスベクター（ここで、該ｃＤＮＡはレトロウイルスＬＴＲ間に位置して、サイトメガロウイルスプロモーターに操作可能に結合している）を含有してなるｃＤＮＡ発現ライブラリーを哺乳動物細胞に導入する工程；ならびにｂ）該ｃＤＮＡ発現ライブラリーの発現に適する条件下で、ａ）で製造されたｃＤＮＡ発現ライブラリーを含む哺乳動物細胞を維持する工程を含み、それにより、該哺乳動物細胞においてｃＤＮＡ発現ライブラリーが作製される、哺乳動物細胞におけるｃＤＮＡ発現ライブラリーの作製方法。３８．パッケージング細胞株で産生されるプソイドタイプのレトロウイルスを用いて、ｃＤＮＡ発現ライブラリーが細胞に導入される請求項３７記載の方法。３９．ａ）２つのレトロウイルスＬＴＲ、ｃＤＮＡおよびサイトメガロウイルスプロモーターを含有するレトロウイルスベクター（ここで、該ｃＤＮＡはレトロウイルスＬＴＲ間に位置して、サイトメガロウイルスプロモーターに操作可能に結合している）を含有してなるｃＤＮＡ発現ライブラリーを、プソイドタイプのレトロウイルス粒子を産生するパッケージング細胞株に導入し、それにより発現ライブラリーを含むパッケージング細胞株を製造する工程；ｂ）該ｃＤＮＡ発現ライブラリーから転写されるＲＮＡを含むプソイドタイプのレトロウイルス粒子の産生に適する条件下で、該発現ライブラリーを含むパッケージング細胞株を維持する工程；ｃ）ｂ）のプソイドタイプのレトロウイルスで哺乳動物細胞を感染させる工程を含み、それにより哺乳動物細胞でｃＤＮＡ発現ライブラリーが作製される、哺乳動物細胞におけるｃＤＮＡ発現ライブラリーの作製方法。４０．パッケージング細胞株が、２９３ＧＰＧ細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、Ｋａｔ細胞株、ＧＰ＋Ｅ−８６細胞株、ＧＰ＋ＥＡＭ１２細胞株およびＦＬＹ細胞株からなる群より選ばれる請求項３９記載の方法。４１．ａ）１）２つのモロニーネズミ白血病ウイルスＬＴＲ；２）ｃＤＮＡ；および３）サイトメガロウイルスプロモーター（ここで、該ｃＤＮＡはモロニーネズミ白血病ウイルスＬＴＲ間に位置して、サイトメガロウイルスプロモーターに操作可能に結合している）を含有するレトロウイルスベクターを含有してなるｃＤＮＡ発現ライブラリーを作製する工程；ｂ）該ｃＤＮＡ発現ライブラリーを、プソイドタイプのレトロウイルスを産生する哺乳動物パッケージング細胞株に導入する工程；ならびにｃ）該ｃＤＮＡ発現ライブラリー中のｃＤＮＡからのＲＮＡ転写物の製造およびＲＮＡ転写物を含むプソイドタイプのレトロウイルス粒子の産生に適する条件下で、該哺乳動物パッケージング細胞株を維持する工程を含む、ｃＤＮＡ発現ライブラリーから転写されるＲＮＡを含む広範な宿主域のプソイドタイプのレトロウイルス粒子の製造方法。４２．プソイドタイプのレトロウイルス粒子が、ＶＳＶ−Ｇでプソイドタイプ化したレトロウイルス粒子である、請求項４１記載の方法。４３．請求項４２記載の方法により製造される広範な宿主域のプソイドタイプのレトロウイルス粒子。４４．哺乳動物細胞での発現用ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのレトロウイルスベクターから転写されるＲＮＡを含有してなり、該レトロウイルスベクターは、２つのレトロウイルスＬＴＲ；ｃＤＮＡの挿入のためのクローニング部位；およびサイトメガロウイルスプロモーターを含有してなる、広範な宿主域のプソイドタイプのレトロウイルス粒子。４５．ＶＳＶ−Ｇレトロウイルスプソイドタイプである、請求項４４記載のプソイドタイプのレトロウイルス粒子。