JP2000500021A

JP2000500021A - コームドｄｎａ繊維との超高解析度比較核酸ハイブリッド形成

Info

Publication number: JP2000500021A
Application number: JP9518705A
Authority: JP
Inventors: アーロン、ベンシモン; トーマス、クレマー; ユルゲン、クラウス; ペータ、リヒター
Original assignee: アンスティテュ、パストゥール
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 2000-01-11
Also published as: NZ320546A; AU7329096A; CA2235395A1; EP0861331A1; WO1997018326A1

Abstract

(57)【要約】（Ａ）標的核酸配列を支持マトリックス上でコーミングすることにより固定し、（Ｂ）コームド核酸配列を試験される異なって標識された核酸プローブおよび参照核酸プローブとの１：１混合物と接触させて、ハイブリッド形成させ、（Ｃ）コームド核酸配列上に位置する個別標識ハイブリッド形成ドットをカウントし、（Ｄ）試験プローブからの総ドット数と参照プローブからの総ドット数との比を計算して、検出および定量される核酸配列の数を決定することからなる、ゲノム中における核酸配列の存在を検出および定量するための方法。

Description

【発明の詳細な説明】コームドＤＮＡ繊維との超高解析度比較核酸ハイブリッド形成発明の背景本発明はゲノム中における遺伝子の存在の検出および定量に関する。具体的には、本発明はヒト癌遺伝子の検出および定量に関する。比較ゲノムハイブリッド形成（ＣＧＨ）(Kallioniemi et al.1992；du Manoir et al.1993；Joos et al.1993)と称される最近開発された方法は、（例えば、腫瘍標品から得られた）ゲノムＤＮＡでＤＮＡ配列の非ランダム獲得および喪失について検出するための新規な手段を提供する。ＣＧＨの場合、ゲノム腫瘍ＤＮＡはハプテン（例えば、ビオチン）でまたは直接に蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ）で標識される。（患者または他者の）正常細胞から得られたゲノムＤＮＡは、別なハプテン（例えば、ジゴキシゲニン）でまたは直接に別な蛍光色素（例えば、ＴＲＩＴＣまたはテキサスレッド）で異なって標識される。標識された腫瘍およびコントロールＤＮＡは等量で混合される。この混合物は、健康な男性または女性から得られた正常中期スプレッド（標的染色体）と、過剰の未標識ｃｏｔ１ ‐ＤＮＡの存在下でハイブリッド形成される。過剰のｃｏｔ１‐ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡに存在する標識された散在およびタンデム反復配列、並びに標的染色体に存在するこのような配列とハイブリッド形成する。この工程は標的染色体との反復配列の望ましくないハイブリッド形成を抑制する上で必須である（Lichter et al.1988；Pinkel et al.1988）。ハイブリッド形成と洗浄工程の後に、標準検出操作が２つの異なる蛍光色素でハプテン化配列を視覚化させるために適用される（Lichter and Cremer,1992）。この工程は蛍光色素で直接標識されたＤＮＡ‐プローブの場合には省略される。例えば、いくつかの一染色体もしくは三染色体または染色体セグメントを除く、本質的に二倍体核型の腫瘍を考えてみる。腫瘍ＤＮＡおよび正常コントロールＤＮＡからの大きさ数百塩基対の標識されたＤＮＡ断片は、それらの各標的配列と等しい確率でハイブリッド形成する。偽二倍体腫瘍細胞中に２コピーで存在する染色体または染色体セグメントからの標識ＤＮＡ断片は、二倍体細胞のゲノムＤＮＡからの異なって標識された断片と一緒になり、各標的染色体または染色体セグメントにおいてある色の混合物を形成し、例えば染色体または染色体セグメントが腫瘍ＤＮＡおよび正常ＤＮＡからのハイブリッド形成断片を各々表す等数の緑色および赤色蛍光色素で標識されたときには黄色である。腫瘍中に３以上のコピー数で存在する染色体セグメントの場合には、この色はより緑っぽくなり、一方セグメントの喪失はより赤色になる。これらの変色は、標的染色体に沿って蛍光比分布を測定することにより、定量的に記録できる（du Manoir et al.1994；Piper et al.1994）。シグナル強度を測定するために適した装置の選択は重要である。検出器は広範囲にわたり直線的な強度測定を行えるべきである。ＣＣＤ‐カメラがこの点で特に有用である。すべてのデータはデジタル方式で蓄積されるため、それらは蛍光比の計算のためにマイクロプロセッサーで使用できる。こうして、コピー数核型が確定できる。ＣＧＨは保管されたパラフィン包埋組織から抽出されたＤＮＡで行える。ゲノムＤＮＡの均一な微小量が縮重オリゴヌクレオチドプライマーでの増幅（ＤＯＰ ‐ＰＣＲ）後にこの目的に用いることができる（Telenius et al.1992 ；Speich er et al.1993 ；Isola et al.1994）。組織セクションから腫瘍細胞を含む領域を微量切り出して、それをＤＯＰ‐ＰＣＲ増幅ＤＮＡで行われたＣＧＨによりゲノム物質の獲得および喪失についてスクリーニングすることが可能である（Spei cher et al.1994）。腫瘍でＤＮＡコピー数の変化を検出する上でＣＧＨの有用性を証明している研究の数は急増している。公表された研究は、様々な形の急性および慢性白血病、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、神経膠芽腫、腎臓癌、神経芽腫、前立腺癌、小細胞および非小細胞肺癌、ブドウ膜黒色腫を含めた多様な腫瘍についてこれまで既に表している（例えば、du Manoir et al.1993,1994 ；Isola et al.1994a,b ；Jo os et al.1993 ；Kallioniemi et al.1992,1993,1994a,b ；Muleris et al.1994 ；Ried et al.1994 ；Schrock et al.1994,Speicher et al.1993,1994,1995および我々の未発表データ）。今まで未知の多数の領域、特に増幅部位がこれらの研究でみつけられてきており、各腫瘍関連遺伝子をクローニングすることに努力を集中させるようになるであろう。異なる腫瘍実体は非ランダム変化の明確に異なるパターンを通常示し、臨床追跡研究では特定の獲得および喪失が所定腫瘍の臨床経過および予後とどの程度まで相関しうるのかを示す。単一コピー数変化がＣＧＨにより現在検出できる染色体セグメントの最小サイズは１０Ｍｂｐ程度である（Joos et al.1993 ；du Manoir et al.1994；Piper et al.1994）。おそらく、ＣＧＨが前中期染色体で行われるときには、解析度はやや改善させることができる。増幅されたＤＮＡ配列の場合、ＣＧＨの検出限度は現在２Ｍｂｐである（増幅反復数はアンプリコンサイズに合わせる）。なお、染色体セグメントの境界が獲得または喪失に関与する精度は、標的染色体のバンド解析により制限される。このため、ＣＧＨ開発の現状では、単一腫瘍関連遺伝子（例えば、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子）のコピー数表示を明らかにすることは行えない。これはかなり不均衡な染色体異常の検出へのＣＧＨの適用を制限している。発明の概要本発明は、下記の新しい必須の特徴により最新の比較ゲノムハイブリッド形成とは異なる超高比較ゲノムハイブリッド形成の方法を提供することにより、当業界でこれらの必要性を満たす上で役立つ。その手法は参照染色体の代わりにコームド（combed）ＤＮＡ繊維で行われ、コームド繊維ＣＧＨと称される。コームド繊維ＣＧＨでは、（既に公表された方法としてＭｂ対範囲の代わりにｋｂ対範囲で）超高解析度でゲノム試験ＤＮＡにおける（コームドＤＮＡ繊維で表示される）特定配列のコピー数表示の分析を行える。この改善により、コームド繊維ＣＧＨは単一遺伝子またはその部分のコピー数表示を研究する上で非常に有用な方法になる。コームド繊維ＣＧＨは、蛍光が全ＤＮＡ‐スポットから測定されるときに生じるバックグラウンド問題を蛍光測定で排除するために特に適している。コームド繊維ＣＧＨの場合には、正確にＤＮＡ繊維上に位置するハイブリッド形成ドットだけが試験または参照ゲノムＤＮＡから誘導される測定シグナルに関与するように、蛍光測定の範囲が単一繊維に合わせられる。この改善は、蛍光測定が支持マトリックスに結合された不規則標的ＤＮＡ配列の全ＤＮＡ‐スポットから得られるＣＧＨアプローチと比較して、コームド繊維ＣＧＨの非常に顕著な利点を提供している。標準操作により個別コームド標的ＤＮＡ繊維で行える蛍光強度測定に加えて、コームド繊維ＣＧＨではコームドＤＮＡ繊維上に位置するハイブリッド形成ドットのカウントを行える。このアプローチにより、ハイブリッド形成した試験および参照ゲノムＤＮＡに起因する十分に大きな一連の標的ＤＮＡ繊維におけるドットの総数がカウントでき、試験ゲノムＤＮＡからの総ドット数と参照ゲノムＤＮＡからの総ドット数との比（または差異）が試験および参照ゲノムＤＮＡにおけるコームド標的ＤＮＡ配列のコピー数表示の尺度として計算できる。このアプローチはこれまでＣＧＨ実験で実現されておらず、得られたシグナルが単一ＤＮＡ繊維で蛍光比の有意な測定を行うには弱すぎる状況下でコームド繊維ＣＧＨ実験の評価を行える。試験および参照ゲノムＤＮＡの１：１混合物の代わりに、同数の試験および参照細胞を表すＲＮＡ調製物（ＲＮＡ調製物から合成されたｃＤＮＡ）の１：１混合物も、コームド標的ＤＮＡ繊維、例えば対象遺伝子のコード配列を表すｃＤＮＡ繊維と抑制条件下でハイブリッド形成できる（標準ＣＧＨ操作参照）。実験の評価は上記のように行われる。このアプローチでは、試験細胞（例えば、腫瘍細胞）および参照細胞（例えば、腫瘍細胞の正常始原細胞）でｍＲＮＡの相対コピー数表示の評価を行える。標的ＤＮＡ繊維、例えば対象遺伝子（の一部）を含むコスミドは、散在反復配列が不十分な抑制ハイブリッド形成の問題を避ける上で除かれるように遺伝子工学処理される（注意：ハイブリッド形成混合物中に含まれる散在反復配列ではなく、標的繊維特異性単一コピー配列だけが、これらの処置下でコームド標的ＤＮＡ繊維とハイブリッド形成できる）。個別標的ＤＮＡ繊維の位置が各繊維に沿う多くのシグナルドットの並び方により容易に特定できない場合には、ハイブリッド形成された試験および参照ゲノムＤＮＡ断片の視覚化で示される蛍光色素の発光スペクトルと明確に識別される発光スペクトルを有した蛍光色素で、いくつかの操作が明確な標的繊維同定のために行える。ａ）繊維は適切な蛍光ＤＮＡ染色で染色できる。ｂ）標的繊維ＤＮＡは、繊維の直接視覚化のため蛍光色素標識ＤＮＡヌクレオチドの存在下で、または例えば間接的免疫蛍光による間接的視覚化のためにハプテン修飾ヌクレオチド、例えばＢＲｄＵ、ビオチン、ジゴキシゲニンの存在下でクローニングすることができる。ｃ）標的繊維ＤＮＡは、コームド繊維ＣＧＨに用いられるハイブリッド形成混合物への適量の標識された標的ＤＮＡ配列の添加により視覚化できる。この場合には、標識された標的配列の量は、標的特異性標識試験およびゲノムＤＮＡ配列のハイブリッド形成を抑制するほど過剰であるべきではない。ｄ）ベクター配列を有する標的繊維ＤＮＡは、ハイブリッド形成混合物に加えられた標的ベクター配列とハイブリッド形成できる。所望であれば、ハイブリッド形成混合物への標識リンカーＤＮＡ配列の添加から誘導されるシグナルによりコームド標的繊維のコースと向きを特定することを可能にするように、異なる鎖長のリンカーＤＮＡが標的繊維ＤＮＡに加えることができる。異なる発光スペクトルを有する蛍光色素の代わりに、蛍光寿命の異なる蛍光色素も用いてよい。蛍光色素の選択は、できるだけ多く支持マトリックスからのバックグラウンド蛍光を避けるために、特定の参照で行われる。好ましい態様の詳細な説明本発明は、ゲノム中に存在する遺伝子のマルチコピーの検出および定量のためのＤＮＡアライメント法の使用に関する。マルチコピーとはゲノム当たり少くとも約１００コピーの視覚化を意味し、非常に良好な結果ではゲノム当たり約２０００コピーである。コームドＤＮＡ繊維との超高解析度比較核酸ハイブリッド形成下記部分において、我々は単一遺伝子レベルで解析を行えるＣＧＨ試験の開発について記載している。この試験は十分に自動化させて、臨床面で広く用いることができる。新規試験は、全染色体の代わりに、特定の標識核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）がいずれか望ましい幾何学的方式でガラスまたはプラスチック物質のような支持マトリックスに固定される、という考え方に基づいている。標的核酸（ＴＮＡ‐）スポットの数および各ＴＮＡスポットの配列複雑さは、試験の具体的目標に応じて選択できる（下記適用例参照）。所定マトリックス‐ＣＧＨ試験に含まれるＴＮＡ‐スポットの数は、数個のスポットから数百または数千さえのスポットまでにわたる（可能な適用例については下記参照）。典型的ＴＮＡ‐スポットは対象遺伝子またはその一部を表す単一コスミドからのＤＮＡを含んでいても、あるいは対象となる染色体セグメントまたはその全染色体さえも表すＤＮＡの複合混合物を含んでいてもよい。後者の場合に、マトリックスＣＧＨ試験は参照中期染色体に対するＣＧＨの解析よりも優れた解析度を示さないであろう。下記において、我々は最高の考えうる解析度を有するマトリックスＣＧＨ試験、即ち選択遺伝子の組でコピー数変化を検出する試験の開発に対する我々の考察を主に述べていく。上記のようなＴＮＡ‐スポットを有するマトリックスは、ｋｂｐ範囲まで小さな遺伝子不均衡について試験腫瘍または他の試験ＤＮＡに使用できる。この目的のため、異なって標識された試験および参照ゲノムＤＮＡ（またはＲＮＡもしくはｃＤＮＡ調製物）の１：１混合物からなるハイブリッド形成プローブが、固定されたＴＮＡ‐スポットの組に対する抑制条件下でハイブリッド形成される。各個別ＴＮＡ‐スポットにおける蛍光比の測定では、参照ＤＮＡ（または参照ＲＮＡ）と比較して、試験ＤＮＡ（または試験ＲＮＡ）における各標的配列のコピー数表示の評価を行えるはずである（測定の更なる詳細については下記参照）。このような試験の開発に成功するかどうかは、３つの要件、即ち支持マトリックス、例えばガラスまたはプラスチックに標的核酸をしっかり固定させる能力、マトリックスの低い自己蛍光、および所定ＴＮＡ‐スポットと特異的にハイブリッド形成する配列について十分に高いシグナル／ノイズ比に依存している。特に、２つの異なって標識されたゲノムＤＮＡを用いるＣＧＨ実験において、所定ＴＮＡ‐スポットに特異的な標識ＤＮＡ断片のフラクションは一般的に非常に少ない。マトリックスへの標識配列または検出試薬の非特異的結合は、有意な蛍光比の測定をそこなったりまたは阻止さえすることがある。このような有害作用は、特に特定シグナルがバックグラウンドと比較して比較的小さい場合に、全ＴＮＡ ‐スポットで蛍光比を測定する試みにおいて制限ファクターになるかもしれない。蛍光比測定でバックグラウンド問題を最小にするために、我々は“分子コーミング”（molecular combing）と称される操作（Bensimon et al.1994）を用いる。この手法は信頼されており、引用することによりその全体で本明細書の開示の一部とされる。この操作により、ＤＮＡ標的繊維はコームの使用により毛髪のように延ばして並行に整列させることができる。このために、ＤＮＡ繊維は固体表面に一端で結合され、後退する空気‐水界面により“コーミングされ”、最後に乾燥表面上に固定される（Bensimon et al.1994）。こうして、各ＴＮＡ‐スポットのＤＮＡは一連の“コームド”標的ＤＮＡ繊維で表すことができ、すべてが対象の特定ＤＮＡ配列、例えば対象遺伝子からのコスミドクローンを表している。適切な厳格条件下で標準蛍光 in situ抑制ハイブリッド形成技術を用いると、ハイブリッド形成プローブ中に存在する相補配列はこれらの標的配列と特異的にハイブリッド形成する。各ＴＮＡ‐スポットについて、蛍光はＣＣＤ‐カメラのような適切なカメラを用いて一連の個別コームド標的ＤＮＡ繊維で双方の蛍光色素に関して別々に記録される。評価の場合、各標的配列はハイブリッド形成ＤＮＡ断片の標識／視覚化に適用された蛍光色素の蛍光を調べるために、狭く適用された方形視野に囲まれる。バックグラウンド蛍光は測定される各標的配列のすぐ近くで測定され、差し引かれる。バックグラウンド減算後に、蛍光比がマイクロプロセッサーで各個別標的配列について求められる。各ＴＮＡ‐スポットについて、いくつかのコームド標的ＤＮＡ繊維で得られた蛍光比の偏差が求められる。試験および参照ゲノムＤＮＡ双方において正常なコピー数で表示される標的配列が、増加または減少したコピー数表示の指標である比について信頼しうる閾値を得るために用いられる。試験‐ＤＮＡで過剰または過少表示される標識配列を表すＴＮＡ‐スポットでは、それに対応して増加または減少した蛍光比を得るはずであり、一方均衡のとれた領域はコントロール実験の限界内にある比を得るはずである。蛍光比はＴＮＡ‐スポット中に存在する個別標的ＤＮＡ繊維から記録されるため、新規な試験では各ＴＮＡ‐スポット中における標的ＤＮＡの総量の偏差に対して不明確である。モデル実験では、異なる比のビオチン標識およびジゴキシゲニン標識コスミド配列からなるプローブ混合物（例えば、１：１（２０ｎｇ＋２０ｎｇ）、２：１（２０ｎｇ＋１０ｎｇ）、５：１（２０ｎｇ＋４ｎｇ）および１０：１（２０ｎｇ＋２ｎｇ））が調製された。プローブ混合物中にある配列の各選択比について、同様のコスミドが標的配列として用いられた。比較ハイブリッド形成後に、約５０の標的ＤＮＡ繊維が例中で記載されたように評価された。結果は異なるプローブ混合物について得られた平均蛍光比値の高い有意差を証明している。個別標的ＤＮＡ繊維の使用は、ＣＧＨ実験の評価に関してもう１つのアプローチの可能性を提供する。全標的ＤＮＡ繊維からの蛍光強度を測定する代わりに、個別の蛍光ハイブリッド形成ドットを簡単にカウントすることが可能である。このような各ドットは数百ｂｐの個別プローブＤＮＡ断片のハイブリッド形成をおそらく表示している。ゲノムＤＮＡの１：１ハイブリッド形成混合物からの異なって着色されたドットによるコームド標的ＤＮＡ配列のカバーは推計学的現象である。したがって、一連の標的ＤＮＡＤＮＡ繊維についてカウントされた２つの異なって標識されたゲノムＤＮＡに関するドット数は、比較ハイブリッド形成に用いられた２つのゲノムＤＮＡにおける標的ＤＮＡ配列のコピー数表示を反映している。特に、このような手法を用いると、有意な蛍光測定を行う上で各標的配列について異なる標識ゲノムＤＮＡから十分なシグナルを得ることは不要である。試験ゲノムＤＮＡは平均で５つの特異的ハイブリッド形成ドットを生じるが、参照ゲノムＤＮＡは標的ＤＮＡ配列当たり１つの特異的ドットを生じることを考えてみる。そのときには、問題となる標的配列のコピー数表示は試験ゲノムＤＮＡで５倍高い、という結論が妥当であろう。所定ＴＮＡ‐スポットに含まれる一連の標的ＤＮＡＤＮＡ繊維についてカウントされた試験および参照ゲノムＤＮＡからのドットの比は、いくつかの理由から試験および参照ゲノムＤＮＡ中における標的配列のコピー数表示の実際比からずれていることがある。１：１ハイブリッド形成混合物中の異なって標識されたＤＮＡは、同様のサイズ分布に切断されるべきである。標的配列付近におけるバックグラウンドドットの数は、試験および参照双方のゲノムＤＮＡについてほぼ同様のはずである。必要ならば、標的ＤＮＡ配列で偶然のバックグラウンドドットに起因すると予想されるドットの数は、標的ＤＮＡ配列を囲んだ領域から計算されて、全体のカウントドット数から差し引かれる。コームド標的ＤＮＡ配列に沿い整列して正確に並んだバックグラウンドドットだけが、実際のシグナルドットと混同されうる。こうしてコームドＤＮＡ標的ＤＮＡ繊維に沿うドットを測定するように提案されたアプローチは、一連のコームド標的ＤＮＡ繊維に沿う特異的ハイブリッド形成ドットの数をカウントする精度を低下させるバックグラウンドドットの数を最少にする上でかなり役立つ。これは、蛍光比が多数の非コームドＤＮＡ繊維により作られた全ＤＮＡ‐スポットから求められる試験と比較して、提案された試験の決定的な利点である。更に、提案された試験はいくつかのＴＮＡ‐スポットについて蛍光またはドット数比の比較を行えることが強調されるべきである。試験および参照双方のゲノムＤＮＡに等コピー数で存在するコームド標的ＤＮＡ繊維を含んだＴＮＡ‐スポットは、参照ゲノムＤＮＡから得られる蛍光またはドット数による各個別ＴＮＡ ‐スポットにおける内部標準化に関するだけでなく、試験および参照ゲノムＤＮＡに等しいおよび異なるコピー数で存在するコームド標的ＤＮＡ繊維を表す異なるＴＮＡ‐スポット間のデータの標準化に関しても、蛍光比およびドット比を各々標準化するように働くことができる。各標的ＤＮＡＤＮＡ繊維が多くの特異的ドットでカバーされている場合には、標的繊維はドットの直線的並びとして容易に識別することができる。コームド標的ＤＮＡ繊維の明確な同定が少数のドットをカウントする上で絶対的に必須の要件であり、ドット数比（または減算で得られる差異）は一連の標的ＤＮＡ繊維から得られたときだけ有意である。したがって、標的繊維は、ハイブリッド形成ＤＮＡ（またはＲＮＡ）断片の同定に用いられた蛍光色素と識別しうる発光スペクトルを有した特異的ＤＮＡ蛍光色素を含めて、ドットの数が少ないときに、他の手段により視覚化される必要がある。標的ＤＮＡ繊維は、ハイブリッド形成混合物への標識された標的ＤＮＡの混合により視覚化させることもできる。この場合には、第三の標識が試験および参照ゲノムＤＮＡに関する２つの標識に加えて要求される。標識された標的配列の混合は、試験および参照ゲノムＤＮＡに存在する標識された標的配列のハイブリッド形成の多すぎる抑制を避けるために、慎重に調整されねばならない。リンカーが特異的リンカープローブとのハイブリッド形成により視覚化できる標的ＤＮＡ配列と適合させられるならば、この問題は避けられる。そのときに問題となるコームド標的ＤＮＡ配列は、２つの蛍光標識リンカー配列に囲まれるようになる。一方、標的ＤＮＡ配列は、ＢｒｄＵのようなハプテン修飾ヌクレオチドの存在下でクローニングして、免疫細胞化学的に視覚化させてもよい。有用な標的ＤＮＡ配列の選択のためには、散在反復シグナル、例えばＡｌｕ要素を含む配列が、例えば過剰の未標識Ｃｏｔ１‐ＤＮＡとの抑制ハイブリッド形成を要することを考慮すべきである。問題となるゲノム領域と完全に特異的である標的ＤＮＡ繊維を用いるか、または散在反復要素を欠いた標的ＤＮＡ繊維を構築することが好ましいかもしれない。コームドＤＮＡ繊維でのＣＧＨは超高解析度ＣＧＨの可能性を有している。下記シナリオを考えてみる：既知ＤＮＡ配列のＤＮＡ繊維は数百塩基対を含んだ対象標的領域を含んでいる。この標的領域のコピー数が可変的であり、参照ゲノムＤＮＡと比較して試験ゲノムＤＮＡの方が高い（または低い）であろうと、我々は考えている。ＤＮＡ繊維に沿う標的およびコントロール領域の位置は正確に地図化され、ＤＮＡ繊維はその５′‐３′配向が例えば異なるサイズのリンカーアダプターに対するプローブにより視覚化できるように工学処理されると、我々は更に考えている。このようなシナリオにおいて、標的領域は各ＤＮＡ繊維で分別鎖長測定により地図化できる。したがって、標的領域とのハイブリッド形成現象を表すドットを特定して、一連のＤＮＡ繊維でこのような現象の数をカウントすることができる。この数はゲノム試験および参照ＤＮＡにおける標的配列の表示と相関するはずである。標的配列数が参照ゲノムＤＮＡと比較して試験ゲノムＤＮＡで増加している場合には、各ドット比はＤＮＡ繊維の他の領域と対比してこの領域で増加しているはずであり、その際に我々は試験および参照双方のゲノムＤＮＡで等しいコピー数表示を想定している。モデル系として、所定ＤＮＡ繊維の２領域についてＰＣＲ増幅プローブを作製することができる。各プローブからのＤＮＡ部分は異なって標識され、様々なハイブリッド形成混合物が作製されて、その場合に異なって標識された部分は異なる比で存在する。一連のＤＮＡ繊維で２つの標的領域にわたりハイブリッド形成ドットをカウントすることにより、異なって標識されたプローブ部分の比をドット数比がどの程度まで反映するかを調べることができる。この例は、蛍光比がもはや妥当でない非常に小さな標的配列のコピー数表示を求める上で、ドットカウントに基づくアプローチが実施可能であることを説明している。この利点は、下記シナリオにより再強調される。対象の小さな（３００ｂｐ）標的配列を含む１本鎖ＤＮＡ配列を考えてみる。異なって標識された相補的３００ｂｐ配列との４つのＣＧＨプローブ混合物が適用される。各個別繊維では、対象の標的配列は１回ハイブリッド形成できるだけであり、即ちそれは１色だけのドットを有する。標的が二本鎖変性ＤＮＡで表されるならば、双方の鎖が変性二本鎖プローブの標的として働く。したがって、標的領域はせいぜい２つの３００ｂｐ断片とハイブリッド形成するだけである。得られるドットは同様の色または異なる色のいずれかである。単一繊維の標的領域にわたる蛍光比の測定は明らかに無意味であるが、標的領域が一連のＤＮＡ繊維で同様の（例えば、緑または赤）または異なる色（例えば、黄色）のドットによりカバーされる頻度は、ハイブリッド形成混合物で異なって標識された標識配列の頻度に関して高度に情報性があるにちがいない。一方、数百塩基対の標的配列を表すＤＮＡがマトリックスに固定されて、標的スポットおよび蛍光比が全スポットから調べられる。しかしながら、この場合には、バックグラウンドが主要問題になる。これらの考慮から、十分な数の個別ＤＮＡ繊維で行われたドットカウントアプローチが超高解析度ＣＧＨの場合に優れていて、唯一の実施可能な手法でさえある、と我々は結論付けている。参照中期スプレッドにおいてＣＧＨで考慮される個別標的染色体のかなり可変的なサイズ、形および相対位置と対照的に、コームド標識ＤＮＡ繊維の鎖長および配向は厳格にコントロールすることができる。コームド標識ＤＮＡ繊維のこれら画定されたパターンは、それらの完全に自動化された評価をかなり容易にする。多数のＴＮＡ‐スポットの場合には、蛍光比またはドット比測定の着色プリントアウトが過剰または過少表示されたゲノム領域の研究者認識を容易にするために勧められる。このプリントアウトにおいて、各ＴＮＡ‐スポットは着色スポットで表される。１つの色は試験‐ＤＮＡ中に均衡のとれたコピー数で存在する配列を見掛上表す蛍光比の範囲でＴＮＡ‐スポットを反映し、第二の色は増加したコピー数で存在する配列を有したＴＮＡ‐スポットを反映するが、第三の色は減少したコピー数で存在する配列を有するＴＮＡ‐スポットを反映する。所望であれば、カラー強度は過剰または過少表示の相対度を反映させることができる。物理的に地図化された配列を含んだ一連のＴＮＡ‐スポットの場合、カラースポットは染色体上の地図化位置を反映するように並べることができる。例えば、着色スポットの直線的並びはコームドＤＮＡ繊維ＣＧＨに用いられるコンティグ（contig）でクローンの順序を表す。全染色体数がＴＮＡ‐スポットで表される場合に、得られるカラースポットは（染色体１〜２２、ＸおよびＹを表す）２４の直線的並びとして配列される。所定並び内のカラースポットは、各染色体内のクローンの物理的順序を表す。そのとき、研究者は染色体または染色体サブ領域が均衡のとれた増加または減少コピー数で存在するかどうかを一見でみることが可能になる。コームド標的ＤＮＡ繊維を有するマトリックスでＣＧＨの可能な適用例このセクションで、我々はコームド標的ＤＮＡ繊維でＣＧＨの可能な適用例を考えてみる。腫瘍ＤＮＡサンプルで行いうる研究に加えて、我々は臨床遺伝学および細胞遺伝学での適用例も含むようになるだろう。遺伝子特異的ＴＮＡ‐スポットの試験では、特定遺伝子のコピー数変化について腫瘍サンプルからの試験ＤＮＡの迅速なスクリーニングを行える。ＴＮＡ‐スポットの自動評価に適した装置があれば、妥当な価格で対象遺伝子の全組のコピー数表示を行う多数のスポットによるＤＮＡスポットマトリックスを評価することが実施可能となる。最高可能レベルの解析度での全ゲノムの調査には、このような手法が実施不可能なほど多くのスポットを要する。実施目的には、解析度を増加させた一連の試験により未知の獲得および喪失を有した試験ゲノムＤＮＡの調査を行うことが有利であり、中期スプレッドでＣＧＨにより開始してから、特定染色体セグメントに向かっていく。参照染色体でのＣＧＨに加えて、全染色体、染色体アームまたはバンドの混成ＤＮＡ配列を表すスポットを有したマトリックスも適用してよい。標的ＤＮＡ繊維で直接行われるＣＧＨは最大レベルの解析度をＣＧＨに付与し、試験ゲノムＤＮＡでコピー数変化に関して標的ＤＮＡ配列の非常に特異的なサブセットのスクリーニングが要される場合のみに妥当する。下記例ではこのような方法がどのように適用されるかを説明している。参照染色体スプレッドでのＣＧＨでは、例えば、ある腫瘍実体についてある染色体セグメントの非ランダム喪失を明らかにする。共通領域はこの欠失を示すすべての腫瘍の比較により解明できる。しかしながら、腫瘍のかなりのフラクションはこのレベルの解析度（＞１０Ｍｂｐ）だとどんな検出しうる欠失も示さない。かなり小さな欠失についてもこれらの腫瘍をスクリーニングするためには、共通領域を表すＴＮＡ‐スポットを有したマトリックスが用いられる。解析度は、所定マトリックスにより表される標的配列のサイズおよび直線的ゲノム距離に依存する。多くの場合に、一連のＴＮＡ‐スポットにより染色体領域を表わせればスクリーニング目的にとり十分であり、各スポットは例えば次のＴＮＡ‐スポットに含まれる標的ＤＮＡ配列から数百ｋｂ離れたコスミド配列を明らかにする。最高の可能な解析度に達するためには、全コンティグさえも一連のＴＮＡ‐スポットで表してよい。対象領域を表す高解析度マトリックスで行われる蛍光比測定はコスミドを明らかにする上で役立ち、特定腫瘍実体を有する患者から得られた全一連のゲノム試験ＤＮＡについてこの対象領域で検出しうる最小欠失を表す。この最小欠失は腫瘍核への各コスミドのＦＩＳＨにより確かめられる。こうして、推定腫瘍サプレッサー遺伝子の部位クロニーングの努力がかなり容易になる。このような目的のためには、対象の染色体セグメントを表すコスミドクローンの正確な直線的順序を知ることが不要である。減少した蛍光比を有する３つのＴＮＡ‐スポットが最小の検出しうる欠失を明らかにするならば、伸長クロマチン繊維に対するこれら３クローンのＦＩＳＨでそれらの付近を確認することが期待できる。後者のアプローチはこれらコスミドの直線的順序を地図化するために用いることもできる。同様に、染色体サブ領域を表す物理的に地図化されたコスミドを有するマトリックスは、増幅領域を明らかにする上で役立つ。増幅に関与する遺伝子の部位クローニングは、このような増幅の伸長が正確に地図化されるならば、かなり容易となるであろう。染色体バンドが参照中期スプレッドに対するＣＧＨにより増幅配列源として特定されることを考えてみる。問題となる染色体バンドを表す一連の物理的に地図化されたクローンを有するマトリックスを適用すれば、ＤＮＡ配列を表すいかなるＴＮＡ‐スポットについても蛍光比増加を示すはずであり、それは実際に増幅されている。通常の蛍光比がすべての他のＴＮＡ‐スポットについて測定されるべきである。増幅の程度は、最も近いおよび最も遠い地図化クローンを表す、増加した蛍光比の２つのＴＮＡ‐スポットにより明らかにされる。将来になれば、癌遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子のコピー数表示についてコームド標的ＤＮＡ繊維を有するＴＮＡ‐スポットを含んだマトリックスが開発できる。所定マトリックスに関する標的配列の選択は、腫瘍実体と試験の要求に依存する。例えば、マトリックスは予後の評価のため獲得または喪失（例えば、神経芽腫でＮ‐ｍｙｅ増幅またはｌｐ３６欠失）を確認できるように特に開発することができる。一部の腫瘍、例えば結腸直腸腫瘍の場合に、腫瘍発生および進行に関与する関連遺伝子の知識はこのような方法の開発を考える上で既に十分に進んでいるようである。他の腫瘍の場合、我々はこのような知識をまだ欠いている。コームドＤＮＡ繊維でのＣＧＨは、将来このような知識を得る上で、更にはゲノムＤＮＡ配列の相対コピー数変化（および特定ｍＲＮＡ数の変化）のパターンの相関関係を求める目的で行われる大規模試験を行う上で役立つ。理想的には、問題となる腫瘍実体の生物学的性質に関連したすべての遺伝子を表すＴＮＡ ‐スポットを含んだマトリックスが開発されるべきである。高解析度マトリックスは臨床細胞遺伝学でも新たな道が開ける。２つの例があれば、可能な適用範囲を明らかにする上で十分であろう。ＣＧＨ試験マトリックスは、不均衡染色体異常の疑いがある表現型を有した患者からのＤＮＡをスクリーニングするために開発できる。不均衡な転位が末端染色体セグメントをよく含むことを考慮にいれると、各個別染色体末端からのクローン化配列を表すコームド標的ＤＮＡ繊維を使ったＴＮＡ‐スポットを含むＣＧＨ‐マトリックスは、大きな臨床的価値をもつようになる。もう１つの例として、Ｘ関連劣性疾患に関するキャリア分析の場合を考えてみる。Duchennu筋ジストロフィーにかかった少年が、家族でその疾患の最初の罹患者である。その場合の約６０％において、欠失が変異の原因としてみられる。彼の疾患が生殖細胞変異によるのか、または彼の母親が既にキャリアであるかについての疑問に答えられねばならない。遺伝カウンセリングの結果は全体的に異なり、後者の場合で他の女性メンバー、例えば少年の母親の姉妹も彼女らのキャリア状態について心配している。全ジストロフィン遺伝子にわたる一連のコスミドを有したマトリックスによれば、ＤＭＤの欠失しがちな場合のキャリアスクリーニングで信頼しうる自動化操作を可能性として提供できる。コームドＤＮＡ繊維における比較ＲＮＡハイブリッド形成：腫瘍関連遺伝子の発現レベルの評価のための新規方法コームドＤＮＡ繊維のＣＧＨは欠失または増幅遺伝子に関する情報を与えるが、それらの正常な対相手と比較して腫瘍細胞で遺伝子の沈黙または過剰発現を検出することはない。我々はコームドＤＮＡ繊維で比較ＲＮＡハイブリッド形成により遺伝子の発現状態を研究するアプローチを提供する。例えば、増幅が所定腫瘍実体で検出されるシナリオを考えてみる。アプリコンは大きく、いくつかの遺伝子を含んでいる。これら遺伝子が強く発現されるかどうかは明らかでない。問題となる全遺伝子のコード配列に関するコームドｃＤＮＡ繊維を含んだＤＮＡ‐ スポットマトリックスは、腫瘍および正常参照組織からの異なって標識されたＲＮＡ調製物（または対応ｃＤＮＡ調製物）との比較核酸ハイブリッド形成に用いることができる。得られた蛍光またはドット数比から、正常組織と比較した、腫瘍での試験遺伝子の（相対的）発現状態をみることができる。同様のアプローチが、遺伝子の解明を妨げる点変異を検出するために用いられる。本発明は下記例で更に詳細に記載されている。例１コームドＤＮＡ繊維を有するガラススライドの調製いかなるクローン化ＤＮＡ、ＰＣＲ増幅ＤＮＡまたは他の精製ＤＮＡも、比較ハイブリッド形成実験の目的に応じて、ＤＮＡコーミングに用いることができる。ＴＮＡ‐スポット当たりで必要なＤＮＡの量は少なく、その理由は少数のＤＮＡ繊維がコームド繊維ＣＧＨ実験での評価に必要とされるだけだからである（例えば、コスミドＤＮＡ（４０ｋｂ）１ｎｇは２．４×１０２の分子を含んでいる）。以下において、我々はコスミドＤＮＡによる典型的実験を説明している。標的ＤＮＡ繊維の結合には、既に記載されたような塩処理により前処理されたガラス表面を要する（Bensimon et al.1994）。それらの結合前に、コスミドは室温で１時間かけてＹＯＹＯ‐１で染色することができる（モレキュラープローブ；Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｙ‐３６０１）。染色溶液は下記のように新らしく調製した：Ｔ₄₀Ｅ₂に１：１００希釈された１ｍｌＤＮＡ（１ mg/ml）＋３３ｍｌＹＯＹＯ‐１＋６６ｍｌＴ₄₀Ｅ₂；Ｔ₄₀Ｅ₂緩衝液は４０ｍＭトリス‐酢酸、２ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０を含有している。ＹＯＹＯ‐１染色コスミドＤＮＡをｐＨ５．５の５０ｍＭＭＥＳ緩衝液で希釈し、その後ガラス表面に結合させた（ｐＨが結合の成功にとり最も重要な点であることに注意せよ）。我々の本実験において、各ガラススライド（２２×２２ｍｍ）は１タイプのコームドＤＮＡ繊維だけを含んでいた。適宜に、異なる配列のＤＮＡ繊維を含んだいくつかのガラススライドを並行して処理した。コームドＤＮＡ繊維をもつ一連のＴＮＡスポットを有した単一マトリックスの調製の場合には、ガラス表面の塩処理はＴＮＡスポットの位置について選択された領域に制限することができる。各々が所定領域に必要なＤＮＡ標的配列をもつＤＮＡ繊維を有した一連の小滴を、これらの前選択領域に置ける。各小滴に含まれた標的繊維は、表面と結合することができる。非結合繊維を含む過剰液体は、表面を濡らせておくことに注意しながら除去する。ＤＮＡ繊維結合後、コーミングを記載されたように行った（Bensimon et al.1 994）。ＹＯＹＯ‐１染色繊維の顕微鏡観察で、結合繊維の密度および方向のコントロールを行った。コームドＤＮＡ繊維のスライドを６０℃で少くとも４時間焼き、２×ＳＳＣ中３％ＢＳＡからなる“ブロック溶液”により３７℃で３０分間処理した。２×ＳＳＣで簡単な洗浄後に、スライドを一連の７０％、９０％、１００％ＥｒＯＨに各々２分間とおして、風乾させた。乾燥スライドの貯蔵は密封ボックス中＋４℃で勧められる。例２コームドＤＮＡ繊維との比較ハイブリッド形成：コームドＤＮＡ繊維との比較ゲノムハイブリッド形成（ＣＧＨ）は、中期染色体のＣＧＨについて他で記載されたように本質的に行った（du Manoir et al.19 93,1995）。簡単に言えば、試験および参照ゲノムＤＮＡを各々ビオチンおよびジゴキシゲニンでニックトランスレートした。一方、ＤＮＡは適切な蛍光色素複合化ヌクレオチドで直接標識してもよい。コームドＤＮＡ繊維をｐＨ７．０の７０％ＦＡ／０．６×ＳＳＣ中７２℃で２分間変性させた。その後、スライドを一連の氷冷ＥｒＯＨ（７０％、９０％、１００％）にとおして、風乾させた。ハイブリッド形成混合液１０ｍｌ（５０％ホルムアミド、１×ＳＳＣおよび１０％硫酸デキストラン中に試験および参照ゲノムＤＮＡ各５００ｎｇ、ヒトＤＮＡのＣｏｔ１フラクション（BRL/Life Technologies）５０ｍｇおよび音波処理サケ試験ＤＮＡ（Sigma）５５ｍｇを含有している）をコームドＤＮＡ繊維保有の各ガラススライド（２２×２２ｍｍ）にのせた。もう１枚のやや小さなガラススライド（１８×１８ｍｍ）を上にのせて、fixogum でシールした。ハイブリッド形成を３７℃で一夜行った。ビオチンおよびジゴキシゲニン標識配列の洗浄および検出操作は、わずかな変更を加えて記載されたように行った（Lichter and Cremer.1992,du Manoir et al.1993,1995）。スライドを５０％ＦＡ／ＳＳＣで３×５分間および２×ＳＳＣで３×５分間室温で洗浄した。４× ＳＳＣ／０．１％ Tween２０中３７℃で平衡化後、スライドを３％ＢＳＡ／４× ＳＳＣ／０．１％ Tween２０中で３０分間にわたり３７℃でインキュベートした（バックグラウンドを減少させるブロック工程）。次いでスライドを４×ＳＳＣ／０．１％ Tween２０中で５分間にわたり３７℃で洗浄し、ＦＩＴＣ（Vector L aboratories）に複合化されたアビジンＤＣＳと共に３７℃で４５分間インキュベートして、ビオチン標識プローブを視覚化させた。ジゴキシゲニン標識プローブを一次抗体としてマウス抗ジゴキシンＩｇＧ抗体（Sigma）とのインキュベート、その後蛍光色素ＣＹ３と複合化されたヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体とのインキュベートにより検出した。これら工程の間に、スライドを４×ＳＳＣ／０．１％ Tween２０で５分間にわたり３７℃で各々洗浄した。必要であれば、アビジン‐ＦＩＴＣシグナルを記載されたように増幅させた（ Pinkel et al.1986）。最後に、スライドを風乾して、アンチフェード（antifad e）としてVectashield （Vector Laboratories）にのせた。一連のモデル実験において、異なる比のビオチン標識およびジゴキシゲニン標識コスミド配列からなるプローブ混合物（例えば、１：１（２０ｎｇ＋２０ｎｇ）、２：１（２０ｎｇ＋１０ｎｇ）、５：１（２０ｎｇ＋４ｎｇ）および１０：１（２０ｎｇ＋２ｎｇ））を、標的配列と同様のコスミドを表すコームドＤＮＡ繊維とのin situ ハイブリッド形成に用いた。例３比較ハイブリッド形成に付されたコームドＤＮＡ繊維の評価（Ａ）画像入手グレーレベル画像を各蛍光色素について冷却された黒色および白色ＣＣＤカメラ（Photometrics）で別々に記録した。最適露出時間および光学的設定を実験で決めて、その後所定実験で記録される全組のＤＮＡ繊維について一定に保った。画像はＦＩＴＳ方式で蓄積した。（Ｂ）画像処理（１）蛍光比の測定デジタル画像をＮＩＨ画像により処理した（バージョン１．５９ｂ９）。方形マスクを各ＤＮＡ繊維に適用した。マスク内で、２つの積分された蛍光値をすべての画素についてグレーレベル値の合計として得た。バックグラウンド蛍光強度は所定ＤＮＡ繊維のすぐ近くまでマスクをシフトさせた後に調べた。蛍光強度をバックグラウンド減算により補正した。各繊維の蛍光比は、補正ＦＩＴＣ蛍光強度を補正Ｃｙ３蛍光強度で割ることにより計算した。５０のＤＮＡ繊維を典型的実験で評価して、平均蛍光比値を計算した。（２）ドットカウント特に、上記実験でコームドＤＮＡ繊維に沿い観察される標識は均一ではない。シグナルの代わりに、ハイブリッド形成標識ＤＮＡ断片をおそらく表すドットがこれらの繊維で識別しうる。ドットカウントの場合には、デジタル画像は限界にあり、比重中心を調べた。要約すると、本発明ではコームドＤＮＡ繊維比較ハイブリッド形成（ＣＦＣＨ）と称される操作を提供する。この新規な操作の場合には、以下が得られる：１）キロ塩基対範囲の解析度で、即ち単一遺伝子のレベルで、異なって標識された正常ゲノムＤＮＡのコピー数表示と比較して、標識されたゲノム試験ＤＮＡ（例えば、腫瘍ＤＮＡ、不均衡タイプの染色体異常の患者からのＤＮＡ）からのＤＮＡ配列の相対コピー数表示を測定しうる可能性。逆に、前記のようなＣＧＨではメガ塩基対範囲でコピー数変化を検出できるだけである。２）試験および参照細胞から得られたｍＲＮＡの混合物の比較ハイブリッド形成により、特定遺伝子から転写されたｍＲＮＡのコピー数差異を測定しうる可能性。３）下記のような配置を自動評価にとり特に有用なものとさせる幾何学的方式におけるハイブリッド形成混合物の相対コピー数表示について多数配列の同時試験に適したマトリックス上における、対象のゲノムまたはｃＤＮＡ試験配列を表すコームドＤＮＡ繊維を有した標的ＤＮＡスポットの配置。本発明は真核細胞で遺伝子疾患の検出に特に有用である。参考文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＺ，ＵＳ (72)発明者トーマス、クレマードイツ連邦共和国ハイデルベルク、イム、ノイエンハイマー、フェルト、328 ユニバーシティ、オブ、ハイデルベルク、ラボラトリウム、フュール、モレクラーレ、ツィトゲネティック、インスティトゥート、フュール、ファーマンゲネティック、ウント、アントロポロジー (72)発明者ユルゲン、クラウスドイツ連邦共和国ハイデルベルク、イム、ノイエンハイマー、フェルト、328 ユニバーシティ、オブ、ハイデルベルク、ラボラトリウム、フュール、モレクラーレ、ツィトゲネティック、インスティトゥート、フュール、ファーマンゲネティック、ウント、アントロポロジー (72)発明者ペータ、リヒタードイツ連邦共和国ハイデルベルク、イム、ノイエンハイマー、フェルト、280 ドイチェ、クレープスフォルシュングスツェントルム（デーカーエフツェット）、オルガニザチオン、コンプレクサー、ゲローメ

Claims

【特許請求の範囲】１．ゲノム中における核酸配列の存在を検出および定量するための方法であって、（Ａ）標的核酸配列を支持マトリックス上でコーミングすることにより固定し、（Ｂ）コームド核酸配列を試験される異なって標識された核酸プローブおよび参照核酸プローブの１：１混合物と接触させて、ハイブリッド形成させ、（Ｃ）コームド核酸配列上に位置する個別標識ハイブリッド形成ドットをカウントし、（Ｄ）試験プローブからの総ドット数と参照プローブからの総ドット数との比を計算して、検出および定量される核酸配列の数を決定することを含む方法。２．標的配列のコーミングが（Ａ）上記配列の末端を支持マトリックスに固定し、（Ｂ）固定された配列を液体と接触させて、メニスカスを形成させ、（Ｄ）後退する空気‐水界面により上記配列をコーミングすることからなる、請求項１に記載の方法。３．液体がメニスカスを形成させる上で約５〜約１０のｐＨを有している、請求項２に記載の方法。４．標的配列が標識されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。５．コームド標識配列がＤＮＡであり、試験および参照プローブがＲＮＡ‐ 、ｃＤＮＡ‐またはゲノムＤＮＡ‐調製物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。６．検出および定量される核酸配列がヒト癌遺伝子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。