JP2000500116A

JP2000500116A - 光反応性ペプチド誘導体

Info

Publication number: JP2000500116A
Application number: JP9505187A
Authority: JP
Inventors: ルシャー，イマニュエル; アンジュレ，ファビエンヌ; レイエレ，アンドレアス; ロメロ，ペドロ; セロッティーニ，ジャン−シャルル
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1995-07-05
Filing date: 1996-06-25
Publication date: 2000-01-11
Also published as: AU6541896A; EP0837876A1; AU700981B2; US5827073A; WO1997002282A1; CA2225636A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、合成光反応性ペプチド誘導体を生成する方法に関する。これらの光反応性ペプチド誘導体は、特定のぺプチドが特定のＭＨＣ分子に結合できるか否かの判定に利用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】光反応性ペプチド誘導体発明の分野本発明は、放射ヨウ素標識した光反応性基を含有する合成ペプチド誘導体の製造方法に関する。これらのペプチド誘導体は、特定のペプチドの、特異的なＭＨＣ分子に結合する能力をスクリーニングするのに有用である。発明の背景タンパク質等の高分子のレセプターと、ペプチドやヌクレオチド等の低分子量リガンドとの間の相互作用を含む、分子間相互作用の研究が望まれている。このような相互作用を研究する一つの方法は、ホトアフィニティーラベル（光親和性標識）によるものである。ホトアフィニティーラベルは、その前提条件として、無修飾リガンドと同じか、あるいは非常に類似の様式でレセプターに結合する光反応性リガンド誘導体の合成を必要とする。光反応性基の光活性化によって、レセプターとリガンド又はペプチドとの間に共有結合が形成される。光反応性基に放射能標識がとりこまれることによって、このように形成された共有結合性のレセプター−リガンド複合体の検出が大幅に簡略化される。ホトアフィニティーラベルを利用して、公知のリガンドに対するレセプターを単離及び同定したり、レセプター上に於けるリガンド接触部位をマッピングしたり、レセプター−リガンド又はレセプター−ペプチド相互作用の動力学を研究することが可能である。この技術は、精製レセプター−リガンドシステムはもちろん、細胞可溶化物および生細胞に適用可能である。ホトアフィニティーラベルの一つの有用な応用は、ＭＨＣ分子に依るペプチドの結合性の研究に関する。細胞表面に発現されるこれらの分子は、ペプチドに結合して、抗原性のＭＨＣ−ペプチド複合体を形成する。これらの複合体は、細胞傷害性性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される。これによって、ＣＴＬｓが活性化される可能性がある(タウンゼンド（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）他，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.，７：６０１（１９８９）とロメロ（Ｒｏｍｅｒｏ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ.，１７７：１２４７−１２５６（１９９３）と、ここに参考文献として本出願にその内容が合体される米国特許第５，４０５，９４０号、とを参照 )。従って、ＭＨＣ分子−ペプチド複合体の形成が、免疫学的に非常に注目されている。本発明者等は、ＭＨＣ分子に結合し、ＭＨＣ分子をホトアフィニティーラベルする光反応性ペプチド誘導体の新規な合成方法を開発した。これらの光反応性ペプチド誘導体は、様々なＭＨＣ分子とペプチドとの特異的相互作用の評価に利用可能である。発明の要旨本発明は、合成光反応性ペプチド誘導体の製造方法に関する。合成ペプチドは、アミノ酸を、２，３−［４−アジドサリチロイル］−ジアミノプロピオン酸（２，３−［４−ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌｏｙｌ］−ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ）[ＤＡＰ(ＡＳＡ)]、４−アジドフェナセチルチオエステル (４ａｚｉｄｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌｔｈｉｏｅｓｔｅｒ)、３アジドフェニル −３’−オキシ−２−アミノ−Ｌ−プロピオン酸(３ａｚｉｄｏｐｈｅｎｙｌ− ３’−ｏｘｙ−２−ａｍｉｎｏ−Ｌ−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ)、又はそれらの誘導体等の、光反応性基又は光反応性アミノ酸と置換することによって合成される。次に、その結果得られるペプチド誘導体を放射ヨウ素標識する。この光反応性ペプチド誘導体の、その、ＭＨＣ分子に対する結合、及びＭＨＣ分子をホトアフィニティーラベルする能力をテストする。ＭＨＣ分子に結合し、ホトアフィニティーラベルする能力を有するペプチド誘導体は、様々なＭＨＣ分子の交差反応性についてのスクリーニング、及び、様々なペプチドの、特定のＭＨＣ分子のホトアフィニティーラベルを阻害する能力についてのスクリーニングに利用可能である。図面の簡単な説明上記簡単な記載と、本発明のその他の課題および特徴は、以下の、本発明の現在に於いて好適で、但し、例示的な実施例の詳細な記載を、添付の図面との関連に於いて参照することによってより完全に理解されるであろう。ここで、図１は、光反応性ＭＡＧＥ−１ペプチド誘導体ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹの合成スキームを示している。図２は、図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃから成る。図２Ａは、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）のＨＰＬＣ分析とキャラクタリゼーション（性質決定）とを示し、図２Ｂは、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）のＨＰＬＣ分析とキャラクラリゼーションを示し、図２Ｃは、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹのＨＰＬＣ分析とキャラクタリゼーションを示している。図３は、図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃから成る。図３Ａは、β₂−ミクログロブリンの存在下に於いてＣ１Ｒ／Ａ１細胞又はＷＴ５１細胞とともにインキュベートされたＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図３Ｂは、β₂−ミクログロブリンの非存在下又は存在下に於いて３７℃又は２６℃でインキュベーションを行った場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、そのオートラジオグラムをデンシトメトリーによって評価したものである。図３Ｃは、ＵＶ照射の前又は後のいずれかに於けるＣ１Ｒ／Ａ１細胞上でのＨＬＡ−Ａ１ペプチド誘導体複合体の解離を示している。図４は、(ｉ) 認識に基づく競合アッセイと、(ｉｉ) トランスフェクションされたＣ１Ｒ細胞のＨＬＡ−Ａ１ホトアフィニティーラベル、とによって評価されたＭＡＧＥ−１ペプチドＥＡＤＰＴＧＨＳＹの光反応性誘導体のＨＬＡ−Ａ１結合性を示している。図５は、図５Ａと図５Ｂとから成る。図５Ａは、１５種類の細胞ラインのＭＡＧＥ−１ペプチド誘導体Ｄａｐ（ＩＡＳＡ）ＥＡＤＰＴＧＨＳＹによるホトアフィニティーラベルを示している。図５Ｂは、前記１５種類の細胞ラインのＨＬＡクラスＩ分子発現を示している。図６は、図６Ａと図６Ｂとから成る。図６Ａは、それぞれＨＬＡ−Ａ１によってトランスフェクションされたＣ１Ｒ細胞と、８０７−０２細胞上での、ＨＬＡ −Ａ１およびＨＬＡ−Ａ２９のホトアフィニティーラベルの阻害によって評価された、ＭＡＧＥにコードされるペプチドの、ＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ２９に対する結合能力を示している。図６Ｂは、コンペティターとしてＭＡＧＥ−３ペプチド変異体を使用した競合アッセイを示している。図７は、図７Ａと図７Ｂとから成る。図７Ａは、ＨＬＡ−Ａ１−ＭＡＧＥ−３複合体の分子モデリングを示し、図７Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２９−ＭＡＧＥ−３複合体を示している。発明の詳細な説明例１メラノーマ由来ＭＡＧＥ−１ペプチド１６１−１６９、(ＥＡＤＰＴＧＨＳＹ) の光反応性誘導体の合成をここに記載する。図１に模式的に示されるこの合成は、３つの工程で行われる。第１の工程に於いて、前記ペプチドＥＡＤＰＴＧＨＳＹの光反応性誘導体を、Ｈｉｓ−１６７を、光反応性アミノ酸Ｄａｐ（ＡＳＡ）によって置換することによって合成した。Ｃ−末端チロシンをホスホチロシンとして組み込んだ。その結果得られた化合物である、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）を次に、ヨウ化ナトリウムとクロラミンＴとによってヨウ素化を行った。このヨウ素化は、チロシンヨウ素化が、リン酸基によって阻止されるので、ＡＳＡ基に於いて選択的に行われた。(もしも、合成ペプチドがヨウ素化可能なアミノ酸を含有している場合には、このアミノ酸を、リン酸基に付着させる。これによって、そのアミノ酸のヨウ素化が阻止される。前記リン酸基は、ヨウ素化が行われた後、取り除かれる。)前記ヨウ素化主生成物、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）を、アルカリフォスファターゼによって脱リン酸化し、これによって最終生成物ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹが得られた。ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）は、Ｆｍｏｃストラテジーに基づく従来式固相ペプチド合成法によって合成された。光反応性アミノ酸Ｄａｐ（ＡＳＡ）−ＯＨを、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（ＡＳＡ）−ＯＨとして導入した。このＦｍｏｃ−Ｄａｐ（ＡＳＡ）−ＯＨは、市販のＦｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨから、Ｂｏｃ基をＡＳＡと置換することによって容易に調製できる。Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（ＡＳＡ）−ＯＨは、Ｎα−Ｆｍｏｃ，Ｎβ−Ｂｏｃ−Ｌ− ２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）から、ＢｏｃをＡＳＡによって置換することによって調製された。１グラム（２．３４μ Ｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨを、２％の水飽和フェノールを含有する２ｍｌの氷冷ＴＦＡ中で溶解させた。外界温度での１時間のインキュベーション後、ＴＦＡを蒸発させ、乾燥Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ−ＯＨを、７ｍｌのジメチルフォルムアミドと４８０μｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンとの中で溶解させた。５８２ｍｇ（２．１μＭｏｌ）のＡＳＡ−ＯＮＳｕと、８ｍｇ（６０μＭｏｌ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールとを添加し、外界温度で２時間攪拌した後、１００ｍｌのジクロロメタンを添加し、有機相を、０．１ＭＫＨＳＯ₄で３回、そして水で１回抽出した。Ｎａ₂ＳＯ₄による乾燥と、約１０ｍｌの容積への濃縮後、有機相を、ジイソプロピルエチルアミンで中和した。４０ｍｌのジエチルエーテルの添加後、８６６ｍｇ（１．８μＭｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｄａｐ（ＡＳＡ）−ＯＨが、薄黄色の結晶性物質として−２０℃で沈殿した。Ｃ−１８ＨＰＬＣ（溶出時間４９分、２７０および３１０ｍｍのＵＶ吸収極大）と、薄層クロマトグラフィー（Ｒｆ値：０．３６、クロロホルム／メタノール：７／３中で、シリカゲルガラス板上において）によって判断したところ、前記アミノ酸誘導体は、約９０％の純度であった。トリフルオロ酢酸／トリイソプロピルシラン／水９０：５：５で、２．５時間、室温、での処理によってペプチドを脱保護し、樹脂から切断（ｃｌｅａｖｅｄ）した。ろ過による樹脂の除去と前記トリフルオロ酢酸蒸発の後、その粗製生成物を、２ｍｌの５０％酢酸中に戻し、低分子量コンタミネーションを、５０％酢酸中でのＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５でのゲルろ過によって除去した。ボイド容積中で溶出された物質を、分析用Ｃ−１８カラム（４ｘ２５０μｍ，５μ粒子径）でのＨＰＬＣにかけた。前記カラムは、水中０．０１％トリフルオロ酢酸上の、アセトニトリルの直線勾配によって、１ｍｌ／分の流速で溶出され、１時間内に０から７５％までリンスされた(グラジェントをかけた)。この溶出液の吸光度を、２７５ｎｍでモニターし、溶出物質のＵＶ吸収スペクトルを、２８６ＡＴコンピュータに接続されたインライン１０００Ｓダイオードアレイ分光計（ＡＢＩ）によって測定した。クロマトグラムとＵＶ吸収スペクトルを処理するために、Ｌａｂ−Ｃａｌｃソフトウェア・パッケージ（ＧａｌａｃｔｉｃＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓＣｏｒｐ．Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）を使用した。放射標識された物質のクロマトグラフィーのために、ＵＶ検出器を使わないで、クロマトグラフィーを、０．７５分フラクションの３μｌアリコットの γ−カウンティングによってモニターした。前記Ｃ−末端チロシンを、Ｗａｎｇ樹脂に対するエステル化によって、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ₃Ｈ₂）−ＯＨとして導入した。図２Ａは、２７５ｎｍでのＯＤ測定による、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）のＨＰＬＣ分析を示している。図２Ａに示されているように、主成分は、２５．７分後に溶出し(ピークＩ)、２１４、２７０および３１０ｎｍでＵＶ吸収極大を示した(図２Ａ，挿入)。これらのＵＶ吸収極大は、ＡＳＡ−含有ペプチド誘導体について以前に観察されたものに対応している。この物質を、質量分析法によって評価したところ、１１６５．３Ｄａの分子質量を有していた。この質量は、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）の理論上の質量（１１６５．７Ｄａ，図２Ａ挿入）に対応している。このクロマトグラムに於いて観察されたその他の成分は、いずれも、同じＵＶ吸収スペクトル、あるいは同じ質量を示さなかった。２６．１分後に溶出した成分（ピークII）は、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）と同じＵＶ吸収スペクトルを示したが、１１８４．７Ｄａの妥当でない質量を有していた。次に、前記ＨＰＬＣで精製したＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃ Ｈ₂）に対して、ヨウ化ナトリウムとクロラミンＴでのヨウ素化を行った。非放射性ヨウ素化のために、１ｍｇ（０．８５μＭｏｌ）のＨＰＬＣで精製したＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）を、２５０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中に戻し、等モル量のヨウ化ナトリウム水溶液（２５．５ μｌの５ｍｇ／ｍｌ溶液）と混合した。ヨウ素化を、４８．３μｌ（１．０６μ Ｍｏｌ）のクロラミンＴ水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）の添加によって開始した。混合と３０秒間のインキュベーション後、等モル量の硫化水素ナトリウム（sodium b isulfate）水溶液を添加し(２２μｌの５ｍｇ／ｍｌ溶液)、その反応混合物のＨＰＬＣを行った。図２Ｂは、Ｉ、IIおよびIIIと標識化された前記ヨウ素化生成物のＨＰＣＬ分析（ＯＤ２７５ｎｍ）と、ＵＶ吸収スペクトルとを示している。対応のＵＶ吸収スペクトルと観察された質量とが、挿入Ｉ、IIおよびIIIに図示されている。Ｅと標識化されたピークは、未反応のＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃ Ｈ₂）に対応し、主ヨウ素化生成物（ピークＩ）は、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）に対応している。前記主ヨウ素化生成物は、ＨＰＬＣカラムから２８．８分後に溶出し(図２Ｂ、ピークＩ)、２１４，２７２および３２５ｎｍでＵＶ吸収極大を示した(図２Ｂ、挿入Ｉ)。これらのＵＶ吸収極大は、ＩＡＳＡのアミドの特徴であり(ルシャー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８：１００３−１０１１（１９９２）およびルシャー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ. ，２６９：５５７４−５５８２（１９９４）参照)、恐らく、３−ヨード−４− アジドサリチロイル（３−ｉｏｄｏ−４−ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌｏｙｌ）異性体に対応している(テー（Ｔａｅ）他，ＡｎａｌｖｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍ. ，１２１：２８６−２８９(１９８２))。このヨウ素化生成物について観察された質量は、１３１４．０であった(図２Ｂ、挿入Ｉ)。ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）について計算された質量は、１２９１．２Ｄａであり、これは、前記観察質量よりも２２．８Ｄａ低い。この質量の相違は、ナトリウムに対応しており、このナトリウムはおそらくヨウ素化反応を停止させるのに使用した亜硫酸水素ナトリウム（sodium bisulfite）から生じたものであり、ヘミ −リン酸ナトリウムを形成したものと考えられる。２９．９分後に溶出した微量のヨウ素化生成物（図２Ｂ、ピークII）は、約２１４，２８３および３１７ｎｍのＵＶ吸収極大と、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）と同じ質量を示し、従って、恐らく、他のＩＡＳＡ異性体よりも明らかに形成率が低い、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）の５−ヨード−４−アジド− サリチロイル（５−ｉｏｄｏ−４−ａｚｉｄｏ−ｓａｌｉｃｙｌｏｙｌ）異性体に対応している。別のヨウ素化生成物が３３．４分後に溶出し(図２Ｂ、ピークIII)、これは、２１４，２７２および３３２ｎｍのＵＶ吸収極大と、１４４３．２Ｄａの質量とを示した(図２Ｂ、挿入皿)。この生成物は、この物質とＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）との分子質量の差、１２６．９Ｄａが、ヨウ素の質量に対応するため、３，５−ジヨード−，４−アジドサリチロイル（３，５−ｄｉｉｏｄｏ−，４−ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌｏｙｌ）誘導体である可能性が高い。更に、この物質のＨＰＬＣカラムからの溶出の遅延は、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）とＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂ ）（図２Ｂ、ピークＥ、ＩおよびII）との間に観察される遅延と類似しており、これはＡＳＡ基に於ける疎水性のヨウ素残基の導入に対応している。ＩＡＳＡ基は、チロシン及びチロシンリン酸エステル（phosphate）と同じ波長領域で吸収することが判ったが、１０倍以上に高いモル吸光係数を有している。すべての観察されたヨウ素化生成物は、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）とは異なるＵＶ吸収スペクトルを有しており、これは、このヨウ素化が、もっぱらＡＳＡ基に於いて起こったことを示している。これに対して、同じヨウ素化を、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＡＳＡ）ＳＹに対して行った時には、９０％近くのヨウ素化が、チロシン側鎖において起こり、これは、リン酸基がチロンシのヨウ素化を効果的に阻止することを示している。この効果は、チロシン硫酸エステル（sulfate）に関して既に報告されている(パワー（Ｐｏｗｅｒ）他，Ｉｎｔ．ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎ Res. ,31:429-434(1988))ように、立体障害と、チロシン側鎖に於ける電子密度の低下とによって、最も効果的に説明されるであろう。ＨＰＬＣで精製した化合物ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）を、アルカリフォスファターゼによる処理によって、脱リン酸化した。ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）を凍結乾燥し、５００μｌのフォスファターゼ消化（phosphatase digest）緩衝液（０．１Ｍグリシン、ｐＨ１０．４、１０ｍＭの塩化マグネシウムと、１０ｍＭの塩化亜鉛とを含有）中に戻し、２０ユニットのアルカリフォスファターゼ（タイプＶＩＩ−Ｓ）を添加した。室温に於ける５−１０分間のインキュベーション後、その反応混合物をＨＰＬＣにかけた。図２Ｃは、その結果得られた最終生成物、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹのＨＰＬＣ分析（ＯＤ２９５ｎｍ）と、ＵＶ吸収スペクトルと、観察質量とを示している(図２Ｃ，ピークＩ)。主生成物が３１．７分後に溶出し、これは、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）と実質的に同じＵＶ吸収スペクトルと、１２１２．９Ｄａの質量とを示した(図２Ｃ，挿入Ｉ)。この質量は、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹの計算質量、(１２１２．７Ｄａ)と良好に相関し、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）とＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹとの間に観察された１０２Ｄａの質量差は、１ナトリウムリン酸塩の質量に対応している。脱リン酸化によって、ＨＰＬＣカラムからの溶出に約３分間の遅延が発生した(図２Ｂおよび図２Ｃ)。このシフトによって、ＨＰＬＣに依って脱リン酸化のモニターすることが可能となる。動力学的実験は、前記脱リン酸化が２０秒間のインキュベーション後においてほとんど完了している（＞９５％）ことを示した。チロシンリン酸エステル（phosphate）を含む他のペプチドを同様に処理した時にも類似の結果が得られ、これは、アルカリフォスファターゼが、チロシンがリン酸化されたペプチドの脱リン酸化に於いて極めて効率的であることを示している。別の実験では、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）を、放射ヨウ素標識し、その反応混合物を、アルカリフォスファターゼでの処理後、直接にＨＰＬＣにかけた。そのカラム溶出液の放射能を、３μｌのアリコットのγ−カウンティングによって測定した(図２Ｃ，挿入II)。典型的に、５０μｌのリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．４）中に溶解された１０μｇのＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）を、１ｍＣｉの［¹²⁵Ｉ］ヨウ化ナトリウムと混合した。前述したように、ヨウ素化を、１０μｌのクロラミンＴ（５ｍｇ／ｍｌ水中）を添加することによって誘発した。混合と３０秒間のインキュベーション後、１０μｌの亜硫酸水素ナトリウム（５ｍｇ／ｍｌ水中）を添加し、その直後に、同じ脱リン酸化と、ＨＰＬＣによる精製とを行った。そのＨＰＬＣで精製した生成物を、凍結乾燥し、ＰＢＳ中に、約２．５ｘ１０⁸ｃｐｍ／ｍｌとなるように戻した。放射ヨウ素標識の収率は、概して、その投入されたヨウ素の９０％以上であった。［¹²⁵Ｉ］ヨウ素の高い特異性放射能により(約２０００Ｃｉ／μＭｏｌ)、ヨウ素化に用いるＡＳＡ−ペプチド誘導体は、通常、ヨウ素に対して大過剰であり、従って、ジ−ヨード生成物は、検出可能には形成されない(図２Ｃ，挿入ＩＩ)。この理由に依り、放射性合成の場合には、ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹ（ＰＯ₃Ｈ₂）のＨＰＬＣによる精製は省略することが可能である。更に、逆相カラムからの溶出に於けるかなりの遅延によって、非ヨウ素化前駆物質からのヨウ素化ペプチド誘導体の完全な分離が可能となる。従って、ＨＰＬＣで精製したモノ−ヨード誘導体は、ヨウ素化に使用されたヨウ素と同じ特異的放射能を有する。非放射性ＩＡＳＡ−ペプチド誘導体は、凍結させて無制限に保存することが可能であるが、放射ヨウ素標識されたものは、放射線分解する傾向があり、従って、１週間以内に使用されることが好ましい。これらの放射性ペプチド誘導体は、最も好適には、５ｘ１０⁸ｃｐｍ／ｍｌ未満のＰＢＳ溶液として、ガラスビン中にて２−４℃ で保存される。例２前記ＭＡＧＥ−１ペプチド誘導体ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹがＨＬＡ−Ａ１分子をホトアフィニティーラベルする能力を、ＨＬＡ−Ａ１でトランスフェクションされたＣ１Ｒ細胞（Ｃ１Ｒ／Ａ１）を、β₂−ミクログロブリンの存在下で２６℃で、前記放射標識したペプチド誘導体とインキュベーションすることによって評価した。すべてのホトアフィニティーラベル手順は、実質的に、ルシャー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.，１４８：１００３−１０１１(１９９２)；ルシャー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ）他，Ｎａｔｕｒｅ，３５１：７２−７４(１９９１)；ロメロ（Ｒｏｍｅｒｏ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ.，１７７：１２４７−１２５６(１９９３)；ルシャー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ . ，２６９：５５７４−５５９２(１９９４)；およびロメロ（Ｒｏｍｅｒｏ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１７１：７３−８４（１９９４）に記載されている要領で行った。簡単に説明すると、ハイグロマイシン含有培地で培養されたＨＬＡ−Ａ１でトランスフェクションされたＣ１Ｒ細胞、又は、他の細胞タイプを、指定されているように０．５％の胎児ウシ血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．２５μｇ／ｍｌのヒトβ₂−ミクログロブリンを添加したＤＭＥＭ培地中に６ｘ１０⁶細胞／ｍｌとなるように再懸濁させた。１ｍｌのアリコットを、６−穴・プレート中にて、２０ｘ１０⁶ｃｐｍのペプチド誘導体と、２６ ℃で４時間、指定された要領でインキュベートした。３６５ｎｍの発光極大と、８０ｎｍのバンド幅とを有する１５Ｗの水銀蛍光ランプを用いて、ランプ−サンプル間距離２ｃｍで４分間ＵＶ照射した後、前記細胞を、２％のウシ血清含有のＤＭＥＭで４回と、ＰＢＳで１回、洗浄した。これらの洗浄された細胞を、ＭｇＣｌ₂を添加した還元性サンプル緩衝液中で溶解し、沸騰して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。あるいはこれに代えて、前記ＵＶ照射済みサンプルを、ＨＥＰＥＳ(５０ｍＭ)、ロイペプチン(１０μｇ／ｍｌ)、ＰＭＳＦ(０．１ｍＭ)およびヨードアセトアミド（１０ｍＭ）の存在下で氷上にて、ＮＰ−４０洗浄剤（０．７％）によって溶解した。固定化Ｗ６／３２ｍＡｂでのＨＬＡ分子の免疫沈降法(ブロズキー（Ｂｒｏｄｓｋｙ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.，１２８：１２９−１３５(１９８２))と免疫沈降物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とを、ルシャー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ）他，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，８：５０８（１９８７）によって記載された要領で行った。ゲルを、オートラジオグラフィーと、いくつかの実験に於いては、ルシャー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ. ，１４８：１００３−１０１１（１９９２）に記載されているように、デンシトメトリーとによって評価した。各ラベリング実験は、少なくとも２回行われた。図３に於いて、レーン１は、主な放射標識された物質が、約４５ｋＤａの見かけ上のＭｒで移動したことを示している。この物質は、すべてのＨＬＡクラスＩ分子に結合する、前記Ｗ６／３２ｍＡｂで免疫沈降されたため、ＨＬＡ−Ａ１重鎖に対応し(図３、レーン２)、Ｃ１Ｒ／Ａ１細胞は、ＨＬＡ／Ａ１のみを顕著に発現する。このＨＬＡ−Ａ１のホトアフィニティーラベルは、ＨＬＡ−Ａ１に拘束されるペプチドであるＭＡＧＥ−１とＭＡＧＥ−３とが３００倍モルで過剰に存在した時に完全に阻害された(図３、レーン３および４)。これに対して、ＨＬＡ−Ａ２に拘束されるインフルエンザマトリクスペプチド５７−６６の存在下に於いては検出可能な阻害は観察されなかった(図３、レーン５)。これらのホトアフィニティーラベル実験を、それぞれ、ＨＬＡ−Ａ２６、Ｂ− ３８、及びＡ２３とＢ６５とを発現するホモ接合性のＥＢＶトランスフォーム細胞ラインＴＥＭおよびＷＴ５１に対して行った時には、検出可能なＨＬＡラベリングは観察されなかった。（図３、レーン６及び７）同様に、更に異なるＨＬＡ −Ａ，ＢおよびＣ分子を発現する８種の他のＥＢＶ細胞ラインに対しては、陰性の結果が得られ、これは、ＨＬＡ−Ａ１へのホトアフィニティーラベルが対立遺伝子−特異的であることを示している。これは、ＨＬＡ−Ａ１結合性のペプチドが、すべて、ＨＬＡ−Ａ１結合モチーフ、即ち、位置３の酸性残基と、通常は、位置４のプロリンと、Ｃ末端のチロシン、を発現するという観察と一致している。このホトアフィニティーラベルの明白な特異性と、他の細胞構成成分に対する顕著なラベリングが起こらないことにより、この技術に於いては、ＭＨＣ分子のやっかいな単離が不要である(図３Ａと、ルシャー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ）他，１９９２、前述、ルシャー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ）他，１９９１、前述参照)。従って、これによつて、複数のパネルのペプチドの、所与のＭＨＣクラスＩ分子に対する結合能力を迅速にテストすることが可能となる。また、異なるＨＬＡクラスＩ分子を発現する十分に性質が明らかになっている細胞ラインの複数のパネルをテストすることにより、この方法は、所与のペプチド誘導体の、他のＭＨＣクラスＩ分子に対する結合能力を評価するのに利用可能である。このようなスクリーニングは、他の技術によっては容易に行うことはできず、所与のＣＴＬエピトープが、従来知られているもの以外のＭＨＣ−分子に関しても提示され得るか否かを決定するのに有用である。たとえば、これらの実験は、ある種のＨＬＡ−Ａ１結合性ＭＡＧＥペプチドが、後述するように、同様に、ＨＬＡ−Ａ２９にも効果的に結合することができるということを示した。このホトアフィニティーラベル法は、又、細胞−結合性ＭＨＣクラスＩ分子による、ペプチドの結合性の分子的および細胞的原理の研究にも利用可能である。このような研究は、たとえば、ＭＡＧＥ−１ペプチド誘導体ＥＡＤＰＴＧＤａｐ（ＩＡＳＡ）ＳＹの、Ｃ１Ｒ／Ａ１−結合性ＨＬＡ−Ａ１分子に対する結合が、外来性のヒトβ₂−ミクログロブリンの過剰存在下に於いて顕著に増加（３．３倍）し、あるいは低温下に於いて顕著に増加（２．３倍）するということを示した。（図３Ｂ参照）これらの条件の両方は、既に、外来抗原のマウス又はヒトＭＨＣクラスＩ分子の結合性を増加させることが報告されているが(ロメロ（Ｒｏｍｅｒｏ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１７１：７３−８４（１９９４）参照)、これらの条件の組み合わせによって、ペプチドの結合性が３００倍以上に増加することが観察されたことは驚異的である。このペプチドの係合性の非常に顕著な増加は、ＥＢＶ細胞ライン（即ち、ＢＭ２１又はＧＥＲＬ）においても見られ、これは、マウスのシステムに於いて観察された（ロメロ（Ｒｏｍｅｒｏ）他，１９９４，前述）ものよりも２０倍近く高いものであった。この顕著な増加は、主として、生理的条件下（即ち、３７℃、および、外来性 β₂−ミクログロブリン無し）に於けるペプチドの結合性の効率が低いということによって説明される。ヒトとマウスのシステムとの別の相違は、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体の安定性における相違である。Ｃ１Ｒ／Ａ１細胞上に於いて、ＨＬＡ−Ａ１ペプチド誘導体複合体の生理的条件下に於ける解離は、非常にゆっくりとしており、６時間のインキュベーション後に於いても、２０％以下の解離しか起こらなかった(図３Ｃ)。同様にゆっくりとした解離が、他のＨＬＡクラスＩ分子に於いても報告されている(ディ・ブリノ（ＤｉＢｒｉｎｏ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ. ，１５２：６２０−６３１(１９９４)；ツォミデス（Ｔｓｏｍｉｄｅｓ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１１２７６(１９９１))。これに対して、マウスシステム、即ち、Ｋ^d、Ｄ^b、又はＬ^dシステムのに於いては、同じ条件下に於いて、約１時間の範囲の半減時間の急速な解離が、報告されている(ルシャー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ）他，Ｎａｔｕｒｅ，３５１：７２−７４(１９９４)；ルシャー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ. ，２６９：５５７４−５５８２(１９９４)；ロメロ（Ｒｏｍｅｒｏ）他，１９９４前出)。ここに記載した方法は、非放射性光反応性ペプチド誘導体、又は、非光反応性ヨウ素化ペプチド誘導体、のいずれの合成にも適用可能である。後者の場合、同じ方法を、Ｄａｐ（ＡＳＡ）の代わりに、Ｎβ−サリチロイル−Ｌ−２，３−ジアミノプロピオン酸を使用することによって適用することができる。このようにペプチド誘導体が容易に合成可能であることにより、所与のペプチドのすべての可能なＤａｐ（ＩＡＳＡ）誘導体を合成することが容易である。誘導体の、拘束ＭＨＣクラスＩ分子をホトアフィニティーラベルする能力をテストすることによって、ホトアフィニティーラベルに最も適したペプチド誘導体を同定することが可能である。例３それぞれが異なる位置に於いて光反応性アミノ酸置換を有する複数のペプチド誘導体を調製した。次に、これら誘導体の全部を、どれがＭＨＣに対する結合に適しているかを調べるために評価した。ＭＡＧＥ−１ペプチド１６１−１６９（ＥＡＤＰＴＧＨＳＹ）の誘導体を、一つのアミノ酸を光反応性Ｄａｐ（ＩＡＳＡ）で置換することによって、例１と同様に、調製した。図４Ａに示されているように、ＨＬＡ−Ａ１と接触する残基Ａｓｐ−１６３とＴｙｒ−１６９とを除いて、すべてアミノ酸が置換された。これらの結合体の、ＨＬＡ−Ａ１に対する結合能力を、認識に基づく競合アッセイによって評価した。ラベリング手順を、例２に記載した要領で行った。競合アッセイを行うために、ＨＬＡ−Ａ１でトランスフェクションされた⁵¹Ｃｒ標識化Ｃ１Ｒ細胞を、クローン化したＨＬＡ−Ａ１に拘束されるＭＡＧＥ−３ −特異的ＣＴＬ２０／３８と、最適以下（suboptional）濃度のＭＡＧＥ−３ペプチド１６８−１７６の存在下でインキュベートした。特異的溶解の５０％の阻害をもたらしたＭＡＧＥ−１１６１−１６９ペプチドの濃度を、１と定義し、ＭＡＧＥ−１ペプチド誘導体のＨＬＡ−Ａ１に対するコンペティター活性が、この値の相対値として示された。また、放射ヨウ素標識したペプチド誘導体を、ＨＬＡ−Ａ１でトランスフェクションされたＣ１Ｒ細胞とともにインキュベートし、ＵＶ照射後、洗浄済み細胞の可溶化液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した (１０％，還元条件)。これらの細胞と、放射ヨウ素標識したペプチド誘導体とのインキュベーションと、ＵＶ照射の後、細胞可溶化物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した(図４Ｂ)。位置１又は７にＤａｐ（ＩＡＳＡ）を有する誘導体は、約４５ｋＤａの見かけ上のＭｒを有する物質を効果的にラベルした(それぞれ、レーン１および５)。位置２にＤａＰ（ＩＡＳＡ）を有する誘導体は、ＨＬＡ−Ａ１に対するより低い（１００分の１）結合性を示し、従って、それ以上調べられなかった。位置４又は５にＤａＰ（ＩＡＳＡ）を有する誘導体は、この成分を弱くラベルしたのに対して、残りの二つの誘導体は、実質的にラベルすることができなかった(レーン２−４および５)。種々のＭＡＧＥ−１ペプチド誘導体は、約７０，９６および１５０ｋＤａの見かけＭｒの物質を弱くラベルした。これらの物質の少なくともいくつかは、ペプチドに結合することが報告されている（スリヴァスタヴァ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ）他，ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ.，６２：１５３(１９９３)）熱ショックタンパク質である可能性がある。異なった誘導体が、ＨＬＡ −Ａ１に対する強度と比較して異なる強度でこられの種をラベルしたので、基本となる結合原理が異なっている可能性がある。例４ＨＬＡ−Ａ１に効果的に結合し、これをホトアフィニティーラベルしたＭＡＧＥ−１ペプチド誘導体ＤａＰ（ＩＡＳＡ）−ＡＤＰＴＧＨＳＹを選択して、４４種類以上の異なるＨＬＡ−クラスＩ対立遺伝子を発現する１４のリンパ芽Ｂ細胞ラインのパネルをスクリーニングした。図５Ｂは、これらの調べられた細胞ラインのＨＬＡクラスＩ分子発現を要約している。始めの９ラインは、１０ｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｎａｌＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙＷｏｒｋｓｈｏｐ（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆ HLA ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｖｏｌ．１(１９８７)）に記載されたＨＬＡホモ接合性ＥＢＶトランスフォーム細胞ラインである。このワークショップのナンバーは、”ｗｓ＃”として示され、これらのＨＬＡ−Ｃ発現は、ＰＣＲによって判定された(リヴァイン（Ｌｅｖｉｎｅ）他，ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ，４４：７４(１９９４)) 。ヘテロ接合性ＥＢＶトランスフォーム細胞ラインは、ＨＬＡタイピングされた個体に由来するものである。ＨＬＡ−Ｃの場合、疑問符でしめされているように、その血清学的タイピングは不完全であった。残りの細胞ラインは、ＨＬＡ−Ｃ w^*１６０１でトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞であった。これらの細胞に対して、図４Ｂについて説明したものと同じラベリング手法を行った。図５Ａに示されているように、４５ｋＤａの物質の顕著なホトアフィニティーラベルは、ＥＢＶトランスフォーム細胞ラインＢＭ２１(レーン１)，ＭＯＵ(レーン４)，ＬＧ２−ＥＢＶ（レーン１１）および８０７−０２（レーン１５）に於いてのみ観察された。この４５ｋＤａの物質のラベリングは、他のテストされたラインでは検出不能であった(レーン２，３，５−１０，１２−１４)。このラベルされた物質は、Ｗ６／３２ｍＡｂで免疫沈降可能であり、従って、ＨＬＡ重鎖に対応する。ＨＬＡ−Ａ１を発現するＢＭ２１細胞に於けるＨＬＡホトアフィニティーラベルは、予想された通りであった。しかしながら、ＨＬＡ−Ａ^*２９０２，ＨＬＡ −Ｂ^*４４０３およびＨＬＡ−Ｃ^*１６０１を発現するＭＯＵ細胞について観察されたラベリング（図２Ｂ）は、非常に予想外であった。ＨＬＡ−２９⁺，ＨＬＡ−Ｂ４４およびＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１細胞ライン８０７−０２（レーン１５）と８０６−０４に於いて観察された同様に効果的なＨＬＡラベリングによって示唆されるように、このラベリングは、主として、但しそれに限られるものではないが、ＨＬＡ−Ａ２９に関連するものであった。ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１ラベリングは不可能と考えられる。というのは、ＨＬＡ−Ａ１又はＨＬＡ−Ａ２９でトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞は、ＨＬＡラベリングを示したのに対して、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１でトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞はラベリングを示さなかったからである(レーン１４)。これは、ＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１に拘束されるＭＡＧＥ−１ペプチド（ＳＡＹＧＥＰＲＫＬ）が、ＨＬＡ−Ａ１結合性ＭＡＧＥペプチドに対する相同性を示さなかったという知見（ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２１３４（１９９４）および図６Ａ参照）と合致する。コーカソイド人種に於いては、ＨＬＡ−Ａ２９陽性個体の大半が、ＨＬＡ−Ａ^*２９０１か、ＨＬＡ−Ａ^*２９０２のいずれかを発現する。これらの二つのサブタイプは、位置１９の一つのアミノ酸（ＨＬＡ−Ａ^*２９０１に於いてはＨｉｓに対して、ＨＬＡ−Ａ^*２９０２に於いてはＡｓｐ）に於いてのみ異なる。この位置は、 βプリーツシートの最後のターンに位置し、従って、ＨＬＡ−ペプチド結合ドメインと離れていることから、このアミノ酸置換が、ＨＬＡ−Ａ２９とペプチドとの結合に影響を与えている可能性は低い。ＬＧ２−ＥＢＶ細胞に於いて観察された弱いラベリング（レーン１１）は、Ｄａｐ（ＩＡＳＡ）−ＡＤＰＴＧＨＳＹは、更に別のＨＬＡクラスＩ対立遺伝子、恐らく、ラベリングを示さなかった細胞ラインのいずれにも発現されない、ＨＬＡ−Ｂ４４又はＣｗ３、あるいは、血清学的にタイプされなかった別のＨＬＡ− Ｃ対立遺伝子、にも結合する、ということを示唆している(図５)。例５ＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ２９ホトアフィニティーラベルを利用して、図６ＡにリストしたＭＡＧＥペプチドのＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ２９に対する結合能力を評価した。図６は、ＭＡＧＥにコードされるペプチドのＨＬＡ−Ａ１とＨＬＡ−Ａ２９とに対する結合性を示している。ＨＬＡ−Ａ１でトランスフェクションされたＣ１Ｒ細胞、又は８０７−０２細胞を、図に示されているペプチドの１００倍モルの過剰存在又は不在下で、Ｄａｐ（ＩＡＳＡ）−ＡＤＰＴＧＨＳＹとともにインキュベートした。ＵＶ照射後、前記細胞を溶解し、その免疫沈降されたＨＬＡ分子を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その結果得られたオートラジオグラムを、デンシトメートリーによって評価した。すべての実験は、少なくとも３回反復して行われた。１００％のラベリングは、コンペティターペプチドの不在下に於いて観察されたラベリングを示す（図６Ａ）。Ｃ１ＲＨＬＡ−Ａ１トランスフェクタント上でのＨＬＡ−Ａ１に対するホトアフィニティーラベルは、ＭＡＧＥ−１、３、４ａ、４ｂ、及び６ペプチドの１００倍モルの過剰存在下において効果的に阻害された(約９８％)。これに対して、位置３に於いて酸性残基を欠いている、ＭＡＧＥ−２と１２ペプチドとは、弱いコンペティターであった。ＨＬＡ−Ａ２に拘束されるチロシナーゼペプチド３６８−３７６の存在下に於いては顕著な阻害は観察されなかった(ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，１９９４前出)。これらの結果は、位置３に酸性残基と、Ｃ末端チロシンとを有するという、公知のＨＬＡ−Ａ１結合モチーフと合致している(フォーク（Ｆａｌｋ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４０：２３８(１９９４)；クボ（Ｋｕｂｏ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ. ，１５２：３９１３(１９９４)；およびディ・ブリノ（ＤｉＢｒｉｎｏ）他，１９９４前出、参照)。更に、前記チロシナーゼペプチドが、ＨＬＡ− Ａ１ホトアフィニティーラベルに対して影響を与えることができなかったことは、他のシステムに於いて観察されたように(ルシャー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ）他，Ｎａｔｕｒｅ，３５１：７２(１９９１)；ルシャー（Ｌｕｅｓｃｈｅｒ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ. ，４８：１００３(１９９２)；およびアンジュレ（Ａｎｊｕｅｒｅ）他，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ.，ＩｎＰｒｅｓｓ，１９９５参照)、これらの条件下に於いて、ＵＶ照射誘発ラジカルが、随意のペプチド（free pep tide）と検出可能に反応しない、ということを示した。ＨＬＡ−Ａ２９システムでは、異なったパターンの阻害が観察された(図６Ａ) 。ＨＬＡ−Ａ２９システムに於いては、最も効果的なコンペティターは、ＭＡＧＥ−２、３、６および１２ペプチドであり、これらは、１００倍モルの過剰に於いて、８０７−０２細胞上でのＨＬＡ−Ａ２９に対するホトアフィニティーラベルを、８０ないし９０％阻害した。これに対して、ＭＡＧＥ−１、４ａおよび４ｂペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２９に対するホトアフィニティーラベルを、弱く（６０−１７％）阻害したに過ぎず、前記チロシナーゼペプチドは、ここでも、検出可能な阻害は示さなかった。未修飾の（ｐａｒｅｎｔａｌ）ＭＡＧＥ−１ペプチドに依る、ＨＬＡ−Ａ２９に対するホトアフィニティーラベルの比較的に低い阻害効率は、Ｇｌｕ−１６１のＤａｐ（ＩＡＳＡ）に依る置換が、そのＨＬＡ−Ａ２９に対する結合性を顕著に増加させることを示した。これは、ＩＡＳＡ基とこのＨＬＡ分子との安定化相互作用によって説明可能である。ＨＬＡ−Ａ２９に依るペプチドの結合性を更に詳細に研究するために、単一アラニン置換ＭＡＧＥ−３ペプチド変異体がＨＬＡ−Ａ２９に結合する能力を調べた。図６Ｂに示されているように、ＨＬＡ−Ａ２９ホトアフィニティーラベルは、ＭＡＧＥ−３ペプチド１６８−１７６の２０倍モル過剰存在下に於いて約８０％阻害された。これに対して、位置９にＡｌａを有する前記ＭＡＧＥ−３変異体の存在下に於いては、ＨＬＡ−Ａ２９に対するホトアフィニティーラベルは、１３％しか阻害されず、これはＨＬＡ−Ａ２９への結合にとって、Ｔｙｒ−１７６の側鎖が重要であることを示している。このチロシンを、フェニルアラニンと置換することによって、ＨＬＡ−Ａ２９に対するコンペティター活性がほぼ保存されるが、ロイシンと置換した場合はそうではない。これは、効率的なＨＬＡ−Ａ２９とペプチドとの結合の為には、Ｃ末端がフェニルアラニン又はチロシンであることが好適であり、これに対して、脂肪族疎水性残基では本質的に不十分であるということを示している。ＭＡＧＥ−３ペプチドのＨＬＡ−Ａ２９への結合性を顕著に減少させた他のアラニン置換は、Ｉｌｅ−１７２のものと、Ｌｅｕ−１７５のものと、より低い程度であるが、Ｖａｌ−１６９のものとであった。他のＭＡＧＥ−３ペプチド残基のアラニン置換は、なんらはっきりとした効果を示さなかった。これらの知見は、異なるＭＡＧＥペプチドがＨＬＡ−Ａ２９に対して異なった結合能力を有するという観察と合致している。たとえば、ＨＬＡ−Ａ２９に良好に結合するペプチドＭＡＧＥ−２，３および６は、すべて、位置２，５および８に於いて脂肪族残基を有しているのに対して、この対立遺伝子に対して良好に結合しないＭＡＧＥ−１ペプチドは、位置２に於いてアラニンと、位置５および８に於いて極性残基とを有している(図６Ａ)。例６ＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ２９に依るペプチドの結合を分子レベルでよりよく理解するために、これらのＭＡＧＥ−３ペプチド１６８−１７６との複合体のモデルを構築した。これらの分子を構築するために、ＭＨＣクラスＩ分子のα１およびα２ドメインの平均骨格（average framework）を、現在ＰＤＢデータベースに於いて入手可能な構造（ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ａｗ６８およびＨ−２Ｋｂ）から構築した。他のクラスＩ対立遺伝子のα１およびα２ドメインのモデルを、この骨格（framework）から、ＰｒｏＭｏｄｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄｍｏｄｅｌｉｎｇｐａｃｋａｇｅ（ペイチュ（Ｐｅｉｔｓｃｈ）他，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２３３(１９９３)）を使用して構築した。簡単に説明すると、炭素骨格鎖を、３Ｄ類似性について最適化された一次配列アラインメントに基づく骨格に適合させた。ループ領域を、ＰＤＢデータバンクによる構造ホモロジーサーチによって再構築し、不明の側鎖を、許容された回転異性体のライブラリーを使用して再構築した。同様に、ＭＨＣ−結合ペプチドのための平均骨格を、以下のペプチド、ＨＩＶｇｐ１２０１９５−２０７、肝炎Ｂヌクレオキャプシド１８−２７、インフルエンザＡマトリクスタンパク質５８−６６、ＨＩＶ逆転写酵素３０９−３１７、又は、ＨＴＬＶ−１ｔａｘ１１−１９とＨＬＡ−Ａ２とからなる複合体、および、以下のペプチド、水疱性口内炎ウィルス核タンパク質５２−５９又はセンダイウィルス核タンパク質３２４−３３２と、Ｈ −２Ｋ^bとからなる複合体を含む、ＰＤＢから入手可能な構造から構築した。対象のペプチドを、ＰｒｏＭｏｄを使用してこの骨格に適合させた。その結果得られたＭＨＣ−ペプチド複合体の未完成のモデルに対して、（１）剛体エネルギー最小化、（２）束縛されたα−炭素での２００ステップのＰｏｗｅｌｌ最小化、および（３）Ｘ−ＰＬＯＲパッケージとＰＡＲＡＭ１１パラメーターセットを使用した、束縛条件無しの、２００ステップのＰｏｗｅｌｌ最小化、を行った。潜在的に低い自由エネルギーを有するペプチドの立体配座を評価するために、以下の分子ダイナミクスシュミレーションを使用した。前記ペプチド−ＭＨＣ複合体を、１０℃のステップで、３００℃にまで加熱し、ペプチドが、この温度で１０ないし１００ピコ秒自由に移動することを許容し、この複合体を再び０℃にまで冷却した。前と同じように、前記Ｘ−ＰＬＯＲパッケージと、ＰＡＲＡＭ１１パラメーターデータセットとを使用した。最終モデルについて、水素結合、ペプチドの末端アミノ基とカルボキシル基の静電相互作用、および、ペプチド−結合部位の底部（floor）に於ける正準ペプチド結合ポケットの存在、等のペプチド−ＭＨＣ複合体構造の公知のルールとの一致を調べた。図７Ａは、ＨＬＡ−Ａ１−ＭＡＧＥ３ペプチド複合体の分子モデリングを示し、図７Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２９−ＭＡＧＥ−３ペプチド複合体の分子モデリングを示している。ＨＬＡペプチド結合ドメインと近接領域とが図示されている。ペプチドの炭素骨格鎖は黒色で描かれている。大文字は、ペプチド結合部位の様々なポケットの位置を示している。ＨＬＡ−Ａ１−ＭＡＧＥ３ペプチド複合体のモデルに依れば、ペプチドの主要な固着には、Ａｓｐ−１７０側鎖のＤポケットへの収容と、Ｔｙｒ−１７６のＨＬＡ−Ａ１のＦポケットへの収容とが関連している(図７Ａ)。前者の相互作用には、ペプチドＡｓｐ−１７０の側鎖とＨＬＡ−Ａ１の底部のＡｒｇ−１１４の側鎖間に於ける塩橋（salt bridge）の形成が関連しているのに対して、後者の相互作用には、ペプチドＴｙｒ−１７６側鎖と、ＨＬＡ−Ａ１α２−ヘリックスのＴｒｐ−１４７との相互作用、及びペプチドＴｙｒ−１７６側鎖と、ＨＬＡ−Ａ１の底部のＡｓｐ−１１６との水素結合からなるII−II相互作用が関連している。これらの予測は、ＨＬＡ−Ａ１の公知のペプチド結合モチーフ（フォーク（Ｆａｌｋ）他，１９９４，前出；クブロ（Ｋｕｂｒｏ）他，１９９４、前出；ディ・ブリノ（ＤｉＢｒｉｎｏ）他，１９９４、前出）と、更に、位置３においてＡｓｐを有さないＭＡＧＥ−２とＭＡＧＥ１２ペプチドとを除いて、テストされたすべてのＭＡＧＥペプチドが、ＨＬＡ−Ａ１に効率的に結合したという観察（図６Ａ）とに合致している。更に、ＭＡＧＥ−３ペプチドの単一アラニン置換体のなかで、Ａｓｐ−１７０とＴｒｙ−１７６の置換体だけが、そのＨＬＡ−Ａ１−Ａ１に対する結合を大幅に阻害した。他方、ＨＬＡ−Ａ２９−ＭＡＧＥ−３ペプチド複合体のモデリングは、大きく異なる結合原理を示唆している。図７Ｂに示すように、ＨＬＡ−Ａ２９のＢおよびＤポケットの幾何学的および物理学的性質は、ＨＬＡ−Ａ１のそれらとは大きく異なっている。該モデルに依れば、疎水性Ｂポケットは、位置２のバリンの側鎖を収容している。ＨＬＡ−Ａ２９によるペプチドの結合には、位置２の疎水性ペプチド側鎖の、無極性Ｂポケットへの収容が関連しており、これは、ＭＡＧＥ −３ペプチドのＨＬＡ−Ａ２９への結合は、位置２に於けるアラニンとの置換によって阻害されるが、イソロイシン又はフェニルアラニンとの置換によっては増強される、という観察結果に一致している(図６Ｂ)。前記モデルは、ＨＬＡ−Ａ２９のＦポケットにおけるペプチドチロシン側鎖の密接な結合を提示している。このポケットは、ＨＬＡ−Ａ１のそれよりも浅いものではあるが、そのペプチドチロシン側鎖との結合は、同様に、Ｔｒｐ−１４７との芳・相互作用（aromatic interaction）に加えて、ＨＬＡ−Ａ２９のα−ヘリックスのＡｓｐ−７４との安定化水素結合にも関連している。これは、Ｃ末端ペプチドチロシンを、フェニルアラニン又は、ロイシンと置換することによって、ＨＬＡ−Ａ２９に対する結合が大幅に減少するという知見と合致している(図６Ｂ)。ＭＡＧＥ−３ペプチドの位置５のイソロイシンと、位置８のロイシンとが、そのＨＬＡ−Ａ２９に対する結合を安定化させたという知見（図６Ａおよび６Ｂ）は、前記モデルに依って、これらの側鎖と、α２およびα１ヘリックスの対応の隣接領域上の同様に疎水性のドメインとの疎水性相互作用によって説明される(図７Ｂ)。前記分子モデリングの結果は、一つのペプチドが複数のＨＬＡタイプに結合可能であるという知見と一致している。生細胞に対するＨＬＡホトアフィニティーラベルを使用して、様々なＨＬＡクラスＩ分子に依るペプチドの結合性を評価することができる。本研究に於ける主要な知見は、ＨＬＡ−Ａ１結合性のＭＡＧＥ−３および６ペプチド、更に、相同的なＭＡＧＥ−２および１２ペプチドも同様に、ＨＬＡ−Ａ２９と、恐らく、ＨＬＡ −Ｂ４４又はＨＬＡ−ＣＷ３にも強く結合する、ということである。これは、これらのペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２９，ＨＬＡ−Ｂ４４又はＨＬＡ−ＣＷ３に拘束されるＭＡＧＥ特異的ＣＴＬによって認識されるエピトープを構成するものである、ということを示唆している。遺伝子ＭＡＧＥ−２，３および１２は、腫瘍サンプルに於いて最も頻繁に発現されるＭＡＧＥ遺伝子であるので、これは、ＭＡＧＥにコードされるペプチドによる免疫療法を適用可能な患者の割合を増加させるであろう。以上、本発明を、特定の実施例を参照して記載したが、これらの実施例は本発明の種々の態様を例示するものに過ぎないということが理解されるべきである。従って、本発明の精神と範囲から離脱することなく、これら例示的実施例に於いて様々な改変が可能であり、様々な構成を考案することができるであろうということが理解されるべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年８月１１日（１９９７．８．１１）【補正内容】請求の範囲：１．合成光反応性ペプチドの製造方法であって、２，３−［４−アジドサリチロイル］−ジアミノプロピオン酸（２，３−［４−ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌｏｙｌ］−ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ）および３−アジドフェニル−３’−オキシ−２−アミノ−Ｌ−プロピオン酸(３ａｚｉｄｏｐｈｅｎｙｌ −３’−ｏｘｙ−２−ａｍｉｎｏ−Ｌ−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ)、およびそれらの誘導体から成るグループから選択された光反応性にラベルしたアミノ酸を有するペプチドを、前記光反応性にラベルしたアミノ酸に於いて放射ヨウ素標識する工程を有し、前記光反応性にラベルしたアミノ酸は、前記ペプチド中において、前記光反応性にラベルしたアミノ酸が、前記ペプチドの、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合する能力を変化させない状態で位置している、合成光反応性ペプチドの製造方法。２．ペプチドの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に対する結合能力を評価する方法であって、以下の工程、（ｉ）評価対象の前記ペプチド中のアミノ酸に対する置換物として、前記ペプチドのアミノ酸配列中に組み込まれた、２，３−［４−アジドサリチロイル］− ジアミノプロピオン酸（２，３−［４−ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌｏｙｌ］−ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ）および３−アジドフェニル−３’ −オキシ−２−アミノ−Ｌ−プロピオン酸(３−ａｚｉｄｏｐｈｅｎｙｌ−３’ −ｏｘｙ−２−ａｍｉｎｏ−Ｌ−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ)、およびそれらの誘導体から成るグループから選択された光反応性にラベルしたアミノ酸を有する前記ペプチドの誘導体を調製する工程、ここで、前記光反応性にラベルしたアミノ酸は、前記ペプチドの、ＭＨＣ分子に対する結合能力を変化させない、（ｉｉ）前記ペプチドを、前記光反応性にラベルしたアミノ酸に於いて放射ヨウ素標識する工程、そして、（ｉｉｉ）前記誘導体が、ＭＨＣ分子に結合する能力を、前記ペプチドが前記ＭＨＣ分子に結合する能力の判定として測定する工程、を有する方法。３．前記放射ヨウ素標識は、クロラミンＴの存在下でヨウ化物を使用して行われる請求項１の方法。４．前記ペプチドはＭＡＧＥ−由来ペプチドである請求項１の方法。５．前記ペプチドは、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４ａ、ＭＡＧＥ−４ｂ、ＭＡＧＥ−６およびＭＡＧＥ−１２由来ペプチドから成るグループから選択される請求項４の方法。６．前記合成ペプチドは、ヨウ素化可能アミノ酸を含有し、前記ヨウ素化可能アミノ酸は、放射ヨウ素標識を行う前に、リン酸基に結合される請求項１の方法。７．前記リン酸基は、放射ヨウ素標識を行った後、前記アミノ酸から除去される請求項６の方法。８．前記リン酸基は、アルカリフォスファターゼを利用して除去される請求項７の方法。９．前記放射ヨウ素標識は、クロラミンＴの存在下でヨウ化物を使用して行われる請求項２の方法。１０．前記ペプチドはＭＡＧＥ−由来ペプチドである請求項２の方法。１１．前記ペプチドは、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４ａ、ＭＡＧＥ−４ｂ、ＭＡＧＥ−６およびＭＡＧＥ−１２由来ペプチドから成るグループから選択される請求項１０の方法。１２．前記合成ペプチドは、ヨウ素化可能アミノ酸を含有し、前記ヨウ素化可能アミノ酸は、放射ヨウ素標識を行う前に、リン酸基に結合される請求項２の方法。１３．前記リン酸基は、放射ヨウ素標識を行った後、前記アミノ酸から除去される請求項１２の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者レイエレ，アンドレアススイス国ツェーハー−1066 エパランジュシュマン・デ・ボヴレッス 155 (72)発明者ロメロ，ペドロスイス国ツェーハー−1066 エパランジュシュマン・デ・ボヴレッス 155 (72)発明者セロッティーニ，ジャン−シャルルスイス国ツェーハー−1066 エパランジュシュマン・デ・ボヴレッス 155

Claims

【特許請求の範囲】１．合成光反応ペプチド誘導体を製造する方法であって、以下の工程、（ａ）直鎖状合成（linear syntehsis）によって合成ペプチドを製造する工程、（ｂ）前記ペプチドのアミノ酸を、光反応性アミノ酸と、前記光反応性アミノ酸が前記ペプチドの結合能力を変化させないよな位置において、置換する工程、そして（ｃ）前記光反応性アミノ酸を特異的に放射ヨウ素標識する工程、からなる方法。２．前記光反応性アミノ酸が、２，３−［４−アジドサリチロイル］−ジアミノプロピオン酸（２，３−［４−ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌｏｙｌ］−ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ）[ＤＡＰ(ＡＳＡ)]、４−アジドフェナセチルチオエステル(４ａｚｉｄｏｐｈｎａｃｅｔｙｌｔｈｉｏｅｓｔｅｒ)、３アジドフェニル−３’−オキシ−２−アミノ−Ｌ−プロピオン酸(３ａｚｉｄｏｐｈｅｎｙｌ−３’−ｏｘｙ−２−ａｍｉｎｏ−Ｌ−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ)、及びそれらの誘導体等からなるグループから選択される請求項１の方法。３．前記放射ヨウ素標識が、クラロミンＴの存在下でヨウ化物を使用して行われる請求項１の方法。４．前記ペプチドはＭＡＧＥ−由来ペプチドである請求項１の方法。５．前記ペプチドは、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４ａ、ＭＡＧＥ−４ｂ、ＭＡＧＥ−６およびＭＡＧＥ−１２由来のペプチドから成るグループから選択される請求項４の方法。６．前記合成ペプチドは、ヨウ素化可能なアミノ酸を含有し、前記ヨウ素化可能なアミノ酸は、放射ヨウ素標識を行う前に、リン酸基に結合される請求項１の方法。７．前記リン酸基は、放射ヨウ素標識を行った後、前記アミノ酸から除去される請求項６の方法。８．前記リン酸基は、アルカリフォスファターゼを利用して除去される請求項７の方法。９．ペプチドの、単数又は複数のＭＨＣ分子に結合する能力を評価する方法であって、以下の工程、（ａ）直鎖状合成によって前記ペプチドの合成光反応性誘導体を製造する工程、（ｂ）前記ペプチドのアミノ酸を光反応性アミノ酸と、前記光反応性アミノ酸が、前記ペプチド誘導体の結合能力を変化させないような位置において、置換する工程、（ｃ）前記光反応性アミノ酸を放射ヨウ素標識する工程、（ｄ）前記合成ペプチド誘導体が、単数又は複数のＭＨＣ分子に結合するか否かを判定する工程、ここで、その結合は、前記ペプチドが前記単数又は複数のＭＨＣ分子に結合することができることを示すという行程からなる方法。１０．前記光反応性アミノ酸が、２，３−［４−アジドサリチロイル］−ジアミノプロピオン酸（２，３−［４−ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌｏｙｌ］−ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ）[ＤＡＰ(ＡＳＡ)]、４−アジドフェナセチルチオエステル(４ａｚｉｄｏｐｈｎａｃｅｔｙｌｔｈｉｏｅｓｔｅｒ)、３アジドフェニル−３’−オキシ−２−アミノ−Ｌ−プロピオン酸 (３ａｚｉｄｏｐｈｅｎｙｌ−３’−ｏｘｙ−２−ａｍｉｎｏ−Ｌ−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ)、及びそれらの誘導体等からなるグループから選択される請求項９の方法。１１．前記放射ヨウ素標識が、クラロミンＴの存在下でヨウ化物を使用して行われる請求項９の方法。１２．前記ペプチドはＭＡＧＥ−由来ペプチドである請求項９の方法。１３．前記ペプチドは、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４ａ、ＭＡＧＥ−４ｂ、ＭＡＧＥ−６およびＭＡＧＥ−１２由来のペプチドから成るグループから選択される請求項１２の方法。１４．前記合成ペプチドは、ヨウ素化可能なアミノ酸を含有し、前記ヨウ素化可能なアミノ酸は、放射ヨウ素標識を行う前に、リン酸基に結合される請求項９の方法。１５．前記リン酸基は、放射ヨウ素標識を行った後、前記アミノ酸から除去される請求項１４の方法。１６．前記リン酸基は、アルカリフォスファターゼを利用して除去される請求項１５の方法。１７．以下の式の単離ペプチド、Ｄａｐ(ＩＡＳＡ)（Ｘａａ）₁（Ｘａａ）_xＴｙｒここで、Ｄａｐ（ＩＡＳＡ）は、ヨウ素化された、２，３−［４−アジドサリチロイル］−ジアミノプロピオン酸(２，３−［４−ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌｏｙｌ］−ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ)、（Ｘａａ）₁は、Ａｌａ又はＶａｌ、（Ｘａａ）_xは、いずれのものでもよい６個のアミノ酸である。１８．以下の式の単離ペプチド、Ｑ（Ｘａａ）₁（Ｘａａ）_xＴｙｒここで、Ｑは、光励起性基である。１９．Ｑがヨウ素化された、２，３−［４−アジドサリチロイル］−ジアミノプロピオン酸（２，３−［４−ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌｏｙｌ］− ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ）である請求項１８の単離ペプチド。