JP2000500162A - 瘢痕の形成を減少するためのベータグリカンの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、瘢痕の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するのに用いる可溶性ベータグリカンならびにその使用方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 瘢痕の形成を減少するためのベータグリカンの使用 本発明は、創傷または線維性疾患の治癒、特に瘢痕の形成の減少をともなって 創傷または線維性疾患の治癒を促進するための医薬組成物に関する。 “創傷または線維性疾患”とは、結果的に瘢痕組織が形成されうる状態のいず れをも意味する。特に、皮膚創傷の治癒、腱損傷の回復、挫傷の治癒、角膜創傷 などの眼創傷の治癒、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷の治癒、中枢神経系に瘢痕組織 が形成される状態、打撃による瘢痕組織の形成、および損傷または外科手術の結 果として起こる組織の癒着（これには、腱治癒および腹部狭窄および癒着などを 含めてもよい）が包含される。線維性疾患の例としては、肺線維症、糸球体腎炎 、肝硬変および増殖性硝子体網膜症が挙げられる。 “瘢痕の形成の減少”とは、非処置の創傷または線維性疾患と比較した場合の 瘢痕の減少のレベルを意味する。 特に、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進する ための組成物が欠如している。瘢痕組織の形成は、治癒した創傷に機械的強度を 与えるものではあるが、醜いものとなりえるものであり、かつ組織の機能を損な う可能性もある。 このことは、特にＣＮＳにおける瘢痕組織が形成される創傷が該当し、該瘢痕 組織は損傷を受けるかまたは再成長した神経末端を阻害し、その機能に非常に重 大な影響を及ぼす。 また、たとえば、静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍および床ずれ（褥瘡性潰瘍）（特に 高齢かつ車椅子使用患者におけるもの）といったような慢性創傷の治療および治 癒を促進する組成物が欠如している。このような組成物は、創傷の治癒が遅いか または創傷の治癒過程がまだ開始していない患者において極めて有用である。こ のような組成物を用いて、創傷の治癒を“キックスタート”させ、次いで本発明 組成物と組み合わせて用いることができる。したがって、慢性創傷が治癒される のみならず、瘢痕の形成も減少して治癒されうることになる。 別称ＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子β）レセプターＩＩＩ（ＲＩ ＩＩ）として知られているベータグリカン（ＢＧ）は、１００ｋＤａのコアタン パク質ならびにそれに結合するヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸側鎖を特 徴とする広範囲に分散している膜プロテオグリカンである（Lopez-Casillasら、1 991、Cell,67:785-795を参照）。ＴＧＦ−βは、グリコサミノグリカン(ＧＡＧ) 側鎖を必要とせずにＢＧコアタンパク質と相互作用して結合するが、一方、ＦＧ Ｆ−２は、ヘパラン硫酸側鎖を介してＢＧに結合する（Cheifetz,Sら、1988、J.Bi ol.Chem.,263:16984-16991）。 ＢＧコアタンパク質は、 ｉ）細胞外ドメイン； ii）膜貫通ドメイン；および iii）認識可能なシグナリング構造をもたない細胞内ドメイン からなる。 細胞は、膜貫通ドメインの近傍にある切断サイトを介して細胞外ドメインを放 出することができるが、このことは、血清中に発見された可溶性ＢＧ(solＢＧ) においてインビボで起きているとみなされている（Andres,J.L.ら、1989,J.Biol. Chem.,109:3137-3145）。 ＴＧＦ−βは、種々の膜タンパク質に結合するが（Massague,J.ら、1994、Trend s in Cell Biol.,4:172-178を参照）、そのうちの２つ、ＴＧＦ−βレセプター ＩとＩＩ（ＲＩおよびＲＩＩ）は、シグナリングレセプター複合体を形成する。 ＲＩは、ＲＩＩの存在を必要としてリガンドに結合し、ＲＩＩはＲＩの存在を必 要としてシグナリングする(リガンド結合ではない)ようである（Wrana,I.J.ら、 1992、Cell,71:1003-1014を参照）。ＲＩとＲＩＩは、ＴＧＦβ₂よりもＴＧＦβ₁ とＴＧＦβ₂を、より大きい親和性をもって結合するので、ＴＧＦβレセプター のイソ体の特異性は、３つの異なるレセプタータイプによって付与されており、 この差異は、ＢＧの欠けた細胞において最も顕著である。ＢＧの発現は、ＲＩＩ に対する結合がすべてのＴＧＦβ群において上昇することに相関しており、この 相関関係は、ＢＧがない条件下でＲＩおよびＲＩＩに対する親和性の低いイソ体 であるＴＧＦβ₂の場合に特に明白である（Lopez-Casillas,F.ら、1993、Cell,73: 1435-1444を参照）。膜に係留されたＢＧの重要な機能は、ＲＩＩにＴＧＦ−β を提示して、三重複合体を形成し、ＴＧＦβに対するレセプター結合親和性およ び細胞応答性を増強することである。 逆に、可溶性形態のＢＧは、膜係留ＢＧとは全くことなる役割をもっている。 可溶性ＢＧは、ＴＧＦ−βに結合し、ＴＧＦ−β分子が、細胞表面レセプターに 結合するのを阻害することによって、ＴＧＦ−βアンタゴニストとして作用する （Lopez-Casillas,F.ら、1994、J.Cell Biol.,124:557-568を参照）。 したがって、その異なる形態のＢＧは、ＴＧＦ−βがシグナリングレセプター へ接近する際に二元モジュレーターとして作用する。 創傷の治癒における線維性および非線維性成長因子の影響に関するこれまでの 研究（Shah,M.ら、1994、J.Cell Sci.,107:1137-1157；Shah,M.ら、1995、J.Cell Sc i.,108:985-1002；WO92/17206およびその参考文献）は、瘢痕の形成の減少をと もなって効果的に治癒を促進するためには、ＴＧＦβ₁およびＴＧＦβ₂の両方が 同程度に阻害されなければならないことを示しており、実験から、ＴＧＦβ₂単 独を阻害しても瘢痕の形成における有意な改善はみられないことが示されている 。ところが本発明者らは、驚くべきことに、可溶性ＢＧを部位（“部位”とは、 創傷または線維性疾患の部位を意味する）、特に創傷部位に適用すると、瘢痕の 減少をともなう治癒効果があることを見いだした。 ＴＧＦ−β１に対して特異的な中和作用の組成物と組み合わせてのＢＧの使用 よりもむしろＴ、ＧＦβ₂に対して主として特異的である可溶性ＢＧ単独の使用 によってこのような効能に到達しえたという結果は、特に驚くべきことであり、 このような使用は従来の技術において明らかに必要とされているものである。実 験例（後記）もまた、驚くべきことに、特定の濃度のsolＢＧにおいて、創傷中 のＴＧＦβ₃のレベルが増加することを示している。solＢＧの濃度がそれよりも 低いと、ＴＧＦβ₃のレベル関してに効果がなく、逆にその濃度が高すぎると、 ＴＧＦβ₃のレベルに関して逆効果を与える。ＴＧＦβ₁およびＴＧＦβ₂とは異 なって、ＴＧＦβ₃は、瘢痕の減少をともなって創傷および線維性疾患の治癒を 促進するので、このことは特に重要であり、これによってsolＢＧの抗瘢痕効果 を説明することができる。 本発明にしたがって、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の 治癒を促進するのに使用する可溶性ベータグリカンまたはそのフラグメントもし くは一部修飾体が提供される。 可溶性ベータグリカンは、たとえば組換え可溶性ベータグリカンである。 “フラグメント”または“一部修飾体”とは、ＴＧＦβ₂に結合する能力をも ち、先に述べたsolＢＧの役割を果す分子を意味する。一部修飾としては、アミ ノ酸残基の置換、欠失または付加などによるものが挙げられる。たとえば、置換 は、保存された置換である。したがって、solＢＧの一部修飾体は、solＢＧの相 同体である。たとえば、solＢＧと少なくとも４０％の相同性をもつことができ る。たとえば、solＢＧと少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または９５ ％の相同性をもつことができる。 たとえば、solＢＧは、少なくともsolＢＧのＴＧＦ−β結合フラグメントを含 む。 solＢＧは、創傷または線維性疾患の早められた治癒を促進することができる 。“早められた治癒”とは、非処置のコントロール創傷の治癒よりも早くに創傷 が治癒することを意味する。 solＢＧの濃度は約０．０１〜１μＭ、たとえば約０．１μＭである。実験例 （後記）から、創傷の治癒の促進におけるsolＢＧの効能が用量依存性であるこ とが示される。実験例（後記）は、ラットのみに関するものであり、ラットおよ び他の動物における瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒 を促進するためのsolＢＧの最適濃度は、実験によって容易に決定することがで きる。 solＢＧは、ＴＧＦβ₁およびＴＧＦβ₃に対するよりも、ＴＧＦβ₂に対して、 より大きい結合親和を有している。ＴＧＦβ₁、ＴＧＦβ₂およびＴＧＦβ₃に対 して、それぞれ２：７：２の比率で結合することができる。 solＢＧは、細胞表面レセプターに結合するＴＧＦβ₂の量を減少させることが できる。 solＢＧは、細胞表面レセプターのＴＧＦβ₂による活性化を減少させることが できる。 solＢＧは、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに用いるこ とができる。 solＢＧは、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促 進するための組成物とともに用いることができる。 solＢＧは、慢性の創傷の治癒を促進するための組成物とともに用いることが できる。 また本発明にしたがって、solＢＧまたはそのフラグメントもしくは一部修飾 体の使用を特徴とする、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の 治癒を促進する方法が提供される。 solＢＧは、創傷または線維症の部位に投与することができる。 solＢＧは、約１００μｌのアリコートにて投与することができる。 solＢＧは、創傷形成または発症の直前または直後のいずれかに投与すること ができる。“発症”とは、線維性疾患の発症を意味する。solＢＧは、創傷形成 または発症の約１２０時間以内、たとえば創傷形成または発症後約４８時間また は２４時間に投与することができる。 solＢＧは、少なくとも２回投与することができる。たとえば、３回投与する こともできる。たとえば、創傷形成または発症の直前、もしくは創傷形成または 発症後約２４時間および約４８時間に投与することができる。 本発明を次の記載によりさらに詳しく説明するが、これは例示のみにすぎず、 瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するために用 いるsolＢＧおよびそれを用いる促進方法の一形態にすぎない。 実験例 実験動物を用いて、実験動物に創傷を形成し、それを種々の濃度のsolＢＧで 治療し、創傷を分析することにより、創傷治癒における可溶性ＢＧ（solＢＧ） の効果をテストした（“材料および方法”を参照）。結果から、特に約０．０１ 〜１μＭの濃度、より特定には約０．１μＭの濃度において、可溶性ＢＧが抗瘢 痕形成剤として効果が高いことが示される。創傷形成後（post-wounding:ｐｗ） ７、４０および８０日の時点で創傷を分析すると、コントロール創傷と比較した 場合、瘢痕形成が有意に改善されていること（すなわち瘢痕形成の減少）および 創傷の治癒が増強されていること（すなわち促進されていること）の両方が明ら かである。 材料および方法： F.Lopez-Casillasによって作製された組換えsolＢＧ（Lopez-Casillasら、1991、 Cell,67:785-795；Lopez-Casillas,F.ら、1993、Cell,73:1435-1444；およびLope z-Casillas,F.ら、1994、J.Cell Biol.,124:557-568を参照）をＭＥＭ（最少必須 培地）（無血清）に溶解した。solＢＧ２５０ngは、ＴＧＦ−βに対する中和抗 体（ＮＡＢ）５０μgに等価である。適当なsolＢＧの用量は、公知のＴＧＦ−β に対するＮＡＢの有効濃度から算出した（Shah,M.ら、1994、J.Cell Sci.,107:113 7-1157；Shah,M.ら、1995、J.Cell Sci.,108:985-1002；およびLopez-Casillas,F. ら、1994、J.Cell Biol.,124:557-568を参照）。成体の雄性スプラーグドーリーラ ット（２００〜２５０ｇ）にハロタン、酸化窒素および酸素吸入によって麻酔を 施した。４カ所の切開（長さ１ｃｍで皮筋層の深さのもの）を、背面の皮膚上に 、正中線から等距離で四肢に隣接した部分で行った。創傷は、次の過程で治癒す るための、最大の瘢痕を創成させるために縫合せずにおいた。各動物のひとつの コントロール創傷は、非処置のものであり、ビヒクルコントロールとして、ひと つの創傷に、ＭＥＭ単独を注入により浸透させた。残りの２つの創傷には、sol ＢＧを０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭおよび２μＭの濃度 で、創傷形成の直前、創傷形成後１日目および２日目に注入した。solＢＧは、 １００μｌのＭＥＭとともに皮内注入により、各創傷の縁の長さに沿って適用し た。実験動物４匹／用量／時点において、それぞれ０．００１μＭおよび２μＭ をテストし、実験動物２匹／用量／時点において、それぞれ０．００１μＭ、０ ．１μＭおよび１μＭを試験した（総ｎ＝４８）。創傷形成後それぞれ３、５、 ７および８０日間動物を飼育した。クロロホルムの過剰投与により、実験動物を 屠殺し、周囲の組織から創傷を切除して取り出した。各創傷を２等分し、創傷の 半分 は、凍結薄切および免疫細胞化学用にＯＣＴ内で急速に凍結し、半分は、ワック ス包埋および組織学用にホルムアルデヒド中で固定した。 結果： 組織学 創傷形成から５日後、低用量のsolＢＧ（０．００１〜０．１μＭ）で処置さ れた創傷およびコントロールまたはビヒクルコントロール創傷の間には組織学的 差異は少ししかなかった。しかし、１および２μＭのsolＢＧで処置した創傷は 、コントロールよりも創傷が狭くなっていたが、炎症細胞浸潤の程度が高く、創 傷の底部において新規血管がより多く見られた。創傷後７日に採取した創傷にお いても同様の知見が得られた。 瘢痕形成の程度を創傷後８０日において審査した。０．００１μＭまたは０． ０１μＭの処置では、コントロールと比較した場合、明らかな改善は見られなか った。創傷内のコラーゲン線維は薄く、密度が濃く、方向性が強く、通常表皮と 平行であり、典型的な瘢痕を形成していた。しかし、創傷に適用したsolＢＧの 用量が０．１μＭの場合、瘢痕の形成は有意に改善された。処置された創傷内の コラーゲン線維は、非常に厚く、より間隔があいており、その方向性がコントロ ールの瘢痕よりも、よりランダムであり、正常な真皮に見られるコラーゲン線維 の“篭の網目”状の方向性に、より類似していた。１μＭのsolＢＧの用量では 、瘢痕の形成において明確な改善が得られず（処置された創傷の幾らかは改善さ れたが）、２μＭの用量では、改善が得られないかまたはコントロール創傷に見 られる瘢痕と同程度の悪さの瘢痕が形成されるかのいずれかであった。 免疫細胞化学 創傷形成後３日目に採取した創傷を審査した。創傷形成後３日目の時点での創 傷のフィブロネクチン含量においては、コントロール創傷および種々の濃度のso lＢＧで処置した創傷の間には確たる差異はなかった。処置創傷およびコントロ ール創傷において、単球／マクロファージにおいて顕在しているＴＧＦβ₁に対 する染色を行ったが、濃度１または２μＭのsolＢＧを適用したもの以外は、こ のサイトカインの量は類似していた。これらの創傷中のＴＧＦβ₁レベルは、コ ントロールとくらべて増加されいるようであった。興味深いことには、これまた 単球／マクロファージに顕在しているＴＧＦβ₃に対する染色は、異なるパター ンを示した。０．００１μＭのsolＢＧでは、ＴＧＦβ₃のレベルにおいて明らか な効果は見られなかったが、瘢痕の形成において最高の効果が得られた、０．０ １μＭ、特に０．１μＭという用量では、創傷内のＴＧＦβ₃染色が増加した。 逆に、１μＭおよび２μＭのsolＢＧ用量では、創傷内のＴＧＦβ₃のレベルは、 コントロールよりも低かった。創傷内のＴＧＦβレセプターのレベルに関する初 期の研究では、１および２μＭのsolＢＧで処置した創傷において、創傷縁およ び隣接真皮におけるＩ型レセプターの発現量の増加を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６２５Ｂ 27/02 ６２７Ａ 43/00 ６４３Ｂ Ａ６１Ｋ 31/715 31/715 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．瘢痕の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するのに使用 する可溶性ベータグリカンまたはそのフラグメントもしくは一部修飾体。 ２．組換え可溶性ベータグリカンを特徴とする請求項１に記載の可溶性ベータ グリカンまたはそのフラグメントもしくは一部修飾体。 ３．創傷または線維性疾患の加速された治癒を促進するのに使用する請求項１ または２に記載の可溶性ベータグリカンまたはそのフラグメントもしくは一部修 飾体。 ４．濃度が約０．０１〜１μＭである上記請求項のいずれかひとつに記載の可 溶性ベータグリカンまたはそのフラグメントもしくは一部修飾体。 ５．濃度が約０．１μＭである請求項４に記載の可溶性ベータグリカンまたは そのフラグメントもしくは一部修飾体。 ６．ＴＧＦβ₁およびＴＧＦβ₃よりもＴＧＦβ₂に対する結合親和性が大きい 上記請求項のいずれかひとつに記載の可溶性ベータグリカンまたはそのフラグメ ントもしくは一部修飾体。 ７．それぞれ約２：７：２の比率でＴＧＦβ₁、ＴＧＦβ₂およびＴＧＦβ₃に 結合する、請求項６に記載の可溶性ベータグリカンまたはそのフラグメントもし くは一部修飾体。 ８．細胞表面レセプターに結合するＴＧＦβ₂の量を減少させる、上記請求項 のいずれかひとつに記載の可溶性ベータグリカンまたはそのフラグメントもしく は一部修飾体。 ９．ＴＧＦβ₂による細胞表面レセプターの活性化を減少させる、上記請求項 のいずれかひとつに記載の可溶性ベータグリカンまたはそのフラグメントもしく は一部修飾体。 １０．医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに用いる、上記請 求項のいずれかひとつに記載の可溶性ベータグリカンまたはそのフラグメントも しくは一部修飾体。 １１．瘢痕の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進する組成物 とともに用いる、上記請求項のいずれかひとつに記載の可溶性ベータグリカンま たはそのフラグメントもしくは一部修飾体。 １２．慢性の創傷の治癒を促進するための組成物とともに用いる、上記請求項 のいずれかひとつに記載の可溶性ベータグリカンまたはそのフラグメントもしく は一部修飾体。 １３．上記請求項のいずれかひとつに記載の可溶性ベータグリカンまたはその フラグメントもしくは一部修飾体の使用を特徴とする、瘢痕の減少をともなって 創傷または線維性疾患の治癒を促進する方法。 １４．創傷または線維症部位へ可溶性ベータグリカンまたはそのフラグメント もしくは一部修飾体を投与する、請求項１３に記載の方法。 １５．可溶性ベータグリカンまたはそのフラグメントもしくは一部修飾体を約 １００μｌのアリコートで投与する、請求項１４に記載の方法。 １６．創傷生成／発症の直前または直後のいずれかに可溶性ベータグリカンま たはそのフラグメントもしくは一部修飾体を使用することを特徴とする、請求項 １３〜１５のいずれかひとつに記載の方法。 １７．創傷生成／発症後の１２０時間以内に該組成物を使用することを特徴と する、請求項１３〜１６のいずれかひとつに記載の方法。