JP2000500341A

JP2000500341A - 組換え基質による哺乳類体細胞モザイク現象の生成

Info

Publication number: JP2000500341A
Application number: JP9519109A
Authority: JP
Inventors: フェデロフ，ハワード
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・ロチェスター
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-12
Publication date: 2000-01-18
Also published as: EP0952767A4; CA2237392A1; US6252130B1; WO1997017842A1; AU1159697A; EP0952767A1; US20010027567A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、プロモータ、ターミネータ、ターミネータに対して３’に位置し、その発現がコントロールさるべき遺伝子およびターミネータの各側に組換部位を有するリコンビネータ基質に関するものであり、当該基質が得意のリコンビナーゼで処理されると、当該遺伝子が発現するものである。プロモータとコントロールさるべき遺伝子およびリコンビナーゼで処理されると消去される、遺伝子の各側に組換部位を有するリコンビネータ基質もまた、提供される。さらにリコンビネータ基質を有する形質転換哺乳動物を創製する方法およびリコンビネータ基質を活性化する方法も包含される。

Description

【発明の詳細な説明】組換え基質による哺乳類体細胞モザイク現象の生成この出願は、１９９５年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／００６，６２２号の利益を主張する。この出願の主題は、米国政府の公衆衛生サービスからの第ＨＤ３１３００号寄金、および国立科学基金からの第ＩＢＮ−９５２２３０７号寄金の援助下になされたものである。米国政府は一定の権利を保持するものである。発明の分野本発明は、哺乳類の体細胞および／または生殖細胞中の遺伝子機能の獲得または損失を活性化し得る、組換え基質（リコンビネーター基質；recombinatorial substrate）をコードするＤＮＡ分子、組換え基質生成法、および哺乳類の組換え基質活性化方法に関する。発明の背景無処理動物において集中的な（focal）遺伝子修飾を生成させることは、組織や臓器の発達および機能の土台となる、細胞間相互作用研究の強力なアプローチである。この方法は、ショウジョウバエ（Drosophila）について、遺伝子作用の自律性、細胞寿命の制限および特定組織の生育パターンに関する研究を促進するのに極めて有利に用いられてきた。このアプローチは、機能表現型の獲得または損失のいずれかを生ずる、遺伝的モザイク、単一変異により一部の細胞が近隣の細胞と異なっている組織、の発生を含む。モザイク斑中の変異型および野生型細胞の分析により、相互作用する細胞についての、および、ある場合には、細胞間情報伝達に関与している分子およびその経路についての推論を導くことが可能である。神経系機能の研究へのモザイク分析の適用は、全系統の一部である個々の細胞中の特定遺伝子産物の機能評価を可能とするので、情報資産形成に役立つ可能性を有する。従って、機能情報がその構成の性質および数のみならず、それらが結合し合い一時的に相互作用し合う態様中にも存在する、神経系のような組織では、不用意に全系統を変化させたり、細胞構成物の一部を排除してしまわないような戦術を採用することが必須である。まとめると、理想的な戦術とは、正確な時間的ならびに立体的制御を伴う安定した遺伝子修飾を可能とするものであるべきである。遺伝的モザイク分析を使用する場合に絶対的なことは、マーカーを使用して正常細胞から変異体を識別し得ることである。好ましいマーカーは、細胞の損傷をきたさないような無害なもの、細胞自律性で細胞レベルでのモザイク現象の解消を確実にスコアできるもの、および半減期が短く遺伝子修飾後の組織の経時的分析が改善されているもの、などである。遺伝的モザイクは、有糸分裂組換えの誘導によりショウジョウバエ中で発生させられてきた（アシュバーナー、Ｍ．による総説、Drosophila: A Laboratory H andbook，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(198 9)，引用して本書の一部とする）。典型的には、放射線照射がＤＮＡ損傷を誘導するのに用いられる。ＤＮＡ合成を完了したばかりだがまだ分化していない細胞中では、損傷の修復が相同染色体交換を誘導することは滅多にない。もし、相同染色体が適切に標識されていれば、生成する組換えの結果は娘細胞中でスコアされ得る。もっと最近には、高頻度な染色体交換が、酵母ＦＬＰ／ＦＲＴシステムの使用により達成された（ゴーリック,Ｋ.、Science，252, 958(1991); ゴーリック,Ｋ.およびリンキスト,Ｓ.，Cell，59，499（1989）：ハリソン,Ｄ.およびペリモン,Ｎ.，Curr．Biolo.，424(1993)；クシュー，Ｔ.，およびルービン,Ｇ. 、Development，117，1223(1993)，引用して本書の一部とする）。このＦＬＰ遺伝子生産物は、部位特異的組換え酵素であり、ＦＲＴ標的ＤＮＡ成分における組換えを触媒するものである。ＦＬＰのハエ中での発現は、染色体上におけるＦＲＴ成分間の組換えを誘導する（ハリソン，Ｄ .およびペリモン,Ｎ.，Curr．Biol．,3，424(1993); クシュー,Ｔ,およびルービン,Ｇ.、Development，117，1223(1993),を引用して本書の一部とする）。熱ショックプロモーターによるＦＬＰの誘導的制御が、ハエ中で範囲や組換えを等級づけ、遺伝的モザイク現象の範囲を調節するのに用いられてきた（クシュー,Ｔ. およびルービン,Ｇ.、Development，117，1223(1993),引用して本書の一部とする）。ハエの遺伝的モザイクは、ＦＲＴ／ＦＬＰシステムによる分子内染色体組換え誘導によっても発生させられてきた。この戦術の一例では、導入遺伝子は、ＦＲＴ部位が側面にある（flank）停止コドンをコードするＤＮＡ配列の挿入により不活性化されるように構成される。ＦＬＰ誘導後、不活性化ＤＮＡカセットは、 “フリップ−アウト(flipped-out)”され、ｍＲＮＡの転写を可能にして翻訳可能な遺伝子産物を生産する(ストルール,Ｇ.，フィッツジェラルド，Ｋ.およびグリーンバルト,Ｉ.，Cell，73，1323(1993)，引用して本書の一部とする)。このアプローチは、転写的に活性な導入遺伝子のどの組込み部位でも、または相同的組換えの標的となる特定遺伝子の位置で、機能獲得および損失を起こさせるのに使用できる。哺乳類細胞におけるＦＬＰ／ＦＲＴシステムの使用が報告されている（オーゴーマン,Ｓ.，フォックス,Ｄ.およびウオール,Ｇ.，Science，251，1351，(1991) ，引用して本書の一部とする）が、別の組換えシステム、cre／loxＰが、より広く注目され、かつ明らかにより大なる成功をおさめてきた。このcre組換え酵素は、バクテリオファージＰ１−由来のものであり、その標的部位、loxＰ、部位特異的組換えを生じる３４塩基対成分、で相互作用するものである(サウエル,Ｂ .およびヘンダーソン,Ｎ.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85，5166(1988)；スターンベルク,Ｎ．およびハミルトン,Ｄ.，Ｊ．Mol．Biol.，150、467(1981)、引用して本書の一部とする)。トランスジェニック動物中でのバイナリーアプローチを用いて、研究者達は別々に考え、マウスの生殖系列に２種の導入遺伝子を導入した；その第一は強力なプロモーター駆動性ｃｒｅであり、第二は２種のｌｏｘＰ部位を含む組換え基質である（ラスコ,Ｍ.ら。、Proc． Natl．Acad．Sci．USA，89，6232(1992); オーバン,Ｐ.，チウ,Ｄ.およびマース ,J.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89，6861(1992)、引用して本書の一部とする）。２種のトランスジェニック系列の交差により、その組換えが高度に効果的な態様で起こるヘテロ接合体の複合が生じた。このcre／IoxＰシステムは、胚性幹（ＥＳ）細胞中で、切り出し領域に接する（flanking）loxＰ含有構築物で、相同遺伝子座を標的とすることにより、欠失対立遺伝子を生成させるために適用されてきている（グウ,Ｈ.，ゾウ,Ｙ．−Ｒ．およびラジェウスキー,Ｋ.，Cell ，73，1155(1993)，引用して本書の一部とする）。このアプローチにより、cre の一過性発現は組換え事象を高い頻度で起こした（グウ,Ｈ.，ゾウ,Ｙ.−Ｒ.およびラジェウスキー,Ｋ.，Cell，73，1155(1993)，引用して本書の一部とする）。まとめて言えば、マウスでの組換えシステムの使用は、安定な遺伝的モザイクの効果的な形成の必要性を満足するように思える。しかしながら、このアプローチは、組換え酵素を発現させるのに選択されるプロモーターの性質により賦課される束縛によって大きく制限されるものである。組換え酵素を発現するどの細胞も、組換え事象をうけることとなるのであるから、モザイク組織を発生させるためにこのシステムを使用することは困難である。遺伝子発現の正確な時間的および空間的制御が可能な、安定な遺伝的モザイクを生成させるためのシステムの必要性が存在する。発明の概要本発明は、そのＤＮＡ分子中の遺伝子の機能の獲得または損失を生じるように活性化され得る、組換え基質を有するＤＮＡ分子に関する。本発明の一態様は、（１）組換え基質中の遺伝子の転写を促進し得るプロモーター配列（element）、（２）その発現が制御されるものであり、その転写を促進するためのプロモーター配列に対して３'側に位置する遺伝子、（３）プロモーター配列に対しては３'側に、その発現がターミネーターに対して３'側の遺伝子転写を防ぐように制御されている遺伝子に対しては５'側に位置するターミネーター、（４）そのターミネーターに対して３'側および５'側に位置する２種の組換え部位、を有する組換え基質をコードするＤＮＡ分子に関する。この組換え基質は、組換え部位に特異的な組換え酵素でＤＮＡ分子を処置すると、該分子からターミネーターが取り除かれ、そのようにして組換え基質を活性化し、その発現が制御されている遺伝子の転写が起こるように配置されているものである。本発明の他の態様は、その体細胞および生殖細胞が、組換え酵素で処理するとその発現が制御されている遺伝子の転写が起こるという、組換え基質を含有しているトランスジェニック哺乳類の製法である。この組換え基質は、次いで想像妊娠哺乳類中に移植される胚中に導入する。得られる移植胚は、臨月期まで発生させる。組換え基質を保有する哺乳類を同定する。本発明の他の態様は、組換え酵素で処理すると、その発現が制御されている遺伝子の転写を起こさせる組換え基質の活性化法である。組換え酵素はトランスジェニック哺乳類中に導入し、この組換え基質が組換え部位間のターミネーターを切り出すようにする。活性化した組換え基質を含有する哺乳類を、次いで同定する。さらに本発明の他の態様は、（１）組換え基質中の遺伝子の転写を促進し得るプロモーター配列、（２）その発現が制御されるものであり、遺伝子はその転写を促進するためのプロモーター配列に対して３'側に位置する遺伝子、（３）その発現が制御される遺伝子に対して３'側および５'側に位置する２種の組換え部位、を有する組換え基質をコードするＤＮＡ分子である。この組換え基質は、組換え部位に特異的な組換え酵素でＤＮＡ分子を処理すると、その発現が制御される遺伝子をそのＤＮＡ分子から取り除き、かくして組換え基質を活性化し、そしてその発現が制御される遺伝子の機能の損失を生じるように配置しておく。本発明のその他の態様は、その体細胞および生殖細胞が組換え基質を含有しており、それらは組換え酵素で処理すると、その発現が制御されている遺伝子の切り出しを生じるトランスジェニック哺乳類の製法である。この組換え基質は、胚盤胞中に組込まれる胚性幹細胞中に導入し、それを想像妊娠哺乳類中に移植する。得られる移植胚は、臨月期まで発生させる。組換え基質を保有する哺乳類を同定する。本発明のその他の態様は、組換え酵素で処理すると、その発現が制御されている遺伝子の切り出しを起こさせる、組換え基質の活性化法である。この組換え基質を保有するトランスジェニック哺乳類は、その発現が制御されている遺伝子を切り出し、かくして組換え基質を活性化し、そしてその発現が制御されている遺伝子の機能の損失を生じるようにするために組換え酵素で処理する。次いで、組換え基質を含有する哺乳類を同定する。図面の簡単な説明第１図は、組換え基質の構造およびその使用を要約したものである。第１Ａ図は、制御すべき遺伝子を活性化する組換え基質の図解である。第１Ｂ図は、活性化されると制御すべき遺伝子の機能損失をもたらす組換え基質を描写したものである。第２図は、ＮＧＦ−ＸＡＴ構築、および組換え駆動化切り出しを示すものである。第２Ａ図は、ｃｒｅ−媒介組換え前後のＮＧＦ−ＸＡＴの図解である。ＮＧＦ−ＸＡＴは、発現しなかった（第２Ｂおよび第２Ｃ図、１−９レーン）か、またはｃｒｅ組換え酵素を発現した（１１−２２レーン）いずれかの大腸菌中で形質転換させる。プラスミドＤＮＡを単離し、消化し、第２Ａ図中に示したプローブとハイブリダイズさせる。第３図は、ＮＧＦ−ＸＡＴトランスジェニック系列からの脳ｍＲＮＡのノーザン・ブロット分析を示す。第３Ａ図は、ＮＧＦ−ＸＡＴ組換え基質および予想される短いＭＲＮＡ産物の図解である。成体トランスジェニックマウスから単離したＮＧＦ−ＸＡＴプローブによるポリＡＲＮＡのノーザン・ハイブリダイゼーションをＮＧＦ−ＸＡＴプローブでプローブする。第３Ｂ図は、ＮＧＦ−ＸＡＴ構築物を持つ２系列のトランスジェニックマウスにおける短いＮＧＦ−ＸＡＴｍＲＮＡの発現を図解する。第４図は、ＮＧＦ−ＸＡＴ組換え基質内に含まれるｈＧＨ配列と相補的なジゴキシゲニン標識化オリゴヌクレオチドプローブ（４５量体のもの）を用い、１２ μｍ冠側切片で実施したインシツ・ハイブリダイゼーションである。第４Ａ図は、アンチセンスプローブおよび皮質、海馬、および視床の一部を取り巻く低パワービュウを使用している。海馬のＣＡ１およびＣＡ３錐体および歯状回領域を標識している。第４Ｂ図は、歯状回および錐体状細胞標識化の高パワービュウでアンチセンスプローブを使用している(４Ａ中四角く囲んだ領域)。第４Ｃ図は、センスプローブと皮質、海馬、および視床の一部を取り巻く低パワービュウを使用している。第５図は、ＮＧＦ−ＸＡＴマウスへのインビボＨＳＶｃｒｅデリバリーを示す。第５Ａ図は、ＨＳＶｃｒｅの図解である。第５Ｂ図は、ＨＳＶｃｒｅを感染させたＮＩＨ３Ｔ３細胞から単離したタンパク質抽出物のウエスタン・ブロットである。第５Ｃ図は、ＰＣＲプライマーの分布を示す、組換え前後のＮＧＦ−ＸＡＴ構築物の描写である。第５Ｄ図は、インビボでのＣＲＥ組換えをモニターするためのＰＣＲ−サザン分析である。第５Ｅ図は、組換えを追跡するための入れ子（nested）ＰＣＲ分析である。第６Ａ−６Ｃ図は、ベクター発現の位置測定を示すＸ−gal組織化学の結果である。第６Ｄ図は、ウイルス注射領域におけるＮＧＦ免疫反応性の顕著な増加を示す。第６Ｂ図は、ＨＳＶlacを用いる注射領域の組織化学である。第６Ａ図および第６Ｃ図は、注射部位の前部および後部領域である。第７図は、ＨＳＶcrelacおよびＨＳＶlac注射動物からのＮＧＦ含量を表す棒グラフである。第８図は、ＨＳＶcrelacおよびＨＳＶlacマウスに対する、各５分間の水平ならびに垂直方向活性カウントのグラフである。発明の詳細な説明各種臓器システムにおける遺伝子産物機能の研究は、体細胞のモザイク分析により促進され、機能の獲得または損失のいずれかをもたらす安定な体細胞変異が創製され、発生した変異以外は遺伝子型的に同一な細胞群中の表現型の分析を可能とした。アシュバーナーＭ.，Drosophila: A Laboratory handbook(1989)をここに引用して本書の一部とする。出産後の動物中に集中的かつ安定な遺伝的変化を生成可能にする哺乳類における関連アプローチを開発するために、本発明は、バイナリーな体細胞および生殖系列遺伝子導入戦術の組み合わせを提供するものである。本発明の一態様は、基質の活性化が基質中で遺伝子が発現できるようにすることによって機能の獲得を生じる、組換え基質とその使用に関する。本発明のこの態様は、（１）組換え基質中の遺伝子の転写を促進し得るプロモーター配列、（２）その発現が制御されるものであり、その転写を促進するためのプロモーター配列に対して３'側に位置する遺伝子、（３）プロモーター配列に対しては３'側に、その発現がターミネーターに対する３'側遺伝子の転写を防ぐように制御される遺伝子に対しては５'側に位置するターミネーター、（４）そのターミネーターに対して３'側および５'側に位置する２種の組換え部位、を有する、組換え基質をコードするＤＮＡ分子を利用する。この組換え基質は、組換え部位に特異的な組換え酵素によるＤＮＡ分子の処理が、ＤＮＡ分子からターミネーターを取り除き、かくして組換え基質を活性化させ、その発現が制御される該遺伝子の転写を可能とするように配置される。第１Ａ図は、活性化の前後における、かかるＤＮＡ分子の一例を表す。組換え前の組換え基質はプロモーターを有している。プロモーターに続いて、停止、即ち、ターミネーターが２つの組換え酵素特異的組換え部位の間に位置している。第１Ａ図中の例では、組換え部位はＬＯＸ部位である。制御する遺伝子は、エクソンで表している。レポーター遺伝子は、ポリＡ領域、転写物を安定化する３'フランキング領域の下流に位置している。組換え基質は、次いで組換え酵素により活性化する。示した例では、組換え酵素を単純ヘルペスウイルスに導入している。活性化した組換え基質を示しているが、ここではＬＯＸ部位間の領域は欠失している。これにより、その発現が制御されている遺伝子の発現とレポーター遺伝子の発現をもたらす。さらに、本発明の他の態様は、基質の活性化が、その遺伝子を取り巻く組換え部位を活性化してその遺伝子を欠失させることによりその発現が制御される、遺伝子の発現を妨げるようにすることによって機能の損失を引き起こす、組換え基質、およびその使用に関する。さらに本発明の他の態様は、（１）組換え基質中の遺伝子の転写を促進し得るプロモーター配列、（２）その発現が制御されるものであり、遺伝子はその転写を促進するためのプロモーター配列に対して３'側に位置している遺伝子、（３）その発現が制御される遺伝子に対して３'側および５'側に位置する２種の組換え部位、を有する組換え基質をコードするＤＮＡ分子を利用する。この組換え基質は、組換え部位に特異的な組換え酵素でＤＮＡ分子を処理すると、その発現が制御される遺伝子をそのＤＮＡ分子から取り除き、かくして組換え基質を活性化し、そしてその発現が制御される遺伝子の機能損失を生じるように配置しておく。第１Ｂ図は、活性化した場合に、その発現が制御される遺伝子の機能損失をもたらす組換え基質を表す。生殖系列の遺伝子は、遺伝子産物をコードするエクソンに続くプロモーターと３'フランキング領域を持つ。組換え基質は、組換えが起こると遺伝子が不活性化されるよう、遺伝子の各側に組換え部位を持つように構築する。第１Ｂ図に示した例では、組換え基質はまた、組換え部位間に位置するターミネーターまたは停止を持つ。レポーター遺伝子は、ターミネーターに対して３'側に位置しており、基質が不活性化されるとそのレポーター遺伝子は、転写的に活性化されて、活性化された組換え基質の同定が容易になる。第１Ｂ図はまた、組換え部位をＬＯＸ部位として同定しており、本発明の好ましい実施態様である。組換え基質は、第１Ｂ図に示したように相同的組換えにより生物体の生殖系列に導入する。次いで、組換え酵素を哺乳類細胞に導入することにより組換え基質を活性化できる。第１Ｂ図では、組換え酵素は単純ヘルペスウイルスを介して導入する。組換え後の活性化基質は、第１Ｂ図の下部に示して入る。組換え部位間の領域は、組換え部位を１コピーだけ残して欠失している。組換え部位間の遺伝子の損失は、基質が活性化される哺乳類細胞中でのその遺伝子の機能損失をもたらす。活性組換え基質を保有する細胞の同定を容易にするために、レポーターはターミネーターおよび組換部位の３'に位置され得る。レポーター遺伝子は容易に検出されるＲＮＡまたはペプチドのいずれかを産出する。好ましいレポーター遺伝子には、ＬａｃＺ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質、ヒトアルカリホスファターゼ、ヒグロミイ非抵抗遺伝子およびネオマイシンホスフォトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む。ＤＮＡ分子は、分子によりなされた転写を安定にし、分子からの転写を終了せしめる３'フランキング領域からもなり、これは発現されるべき遺伝子の３'に位置する（Moreira，A.，Wollerton，M.，Monks，J.，Proudfoot，N.J.，EMBOJ.， 14，3809(1995)、引用により本明細書の一部とする）。３'フランキング領域は転写ターミネーターおよびポリＡ領域などの安定化エレメントを含む。従って、３'フランキング領域は転写が終了するであろう場所に位置する。好ましい３'フランキング配列は、β−ガラクトシダーゼ、ＳＶ４０、β−グロブリン、α−グロビリンおよびヒト生長ホルモンをコードする遺伝子からの３'フランキング領域を含む。最も好ましい３'フランキング配列はヒト生長ホルモン遺伝子からの３'フランキング配列である。好ましいプロモーター・エレメントは、ミオシン重鎖α、ミオシン重鎖β、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、生長関連タンパク質４３ｋＤａ、上頚部ガングリオン・クローン１０、ノイロフィラメント−Ｌ、ノイロフィラメント −Ｍ、ノイロフィラメント−Ｈ、神経膠２本線タンパク質、ＰＯ、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、カルシトニン遺伝子関連タンパク質およびノイロン特殊エノラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターを含む。最も好ましいプロモーター・エレメントはノイロン特殊エノラーゼプロモーターである。好ましいリコンビナーゼ部位にはＦＲＴおよびＬｏｘＰ位がある。最も好ましいリコンビナーゼ部位はＬｏｘＰ位である。好ましいターミネーターは、ガストリン、Ｃ２補体およびβ−グロブリンについての転写ターミネーターを含む。最も好ましいターミネーターはβ−グロブリン転写ターミネーターである。この扱い方法は多くの遺伝子の調節に広い適用を有する。特にこの適用は、遺伝子の空間的および時間的発現が重要である遺伝子において、個別的な修飾を行ったり、研究したりするのに有用である。従って、制御されるべき遺伝子には、調節因子、シグナル導入物および生育因子を発現する遺伝子がある。いかなる遺伝子を用いようとも、発現が制御されるべき好ましい遺伝子は、ホルモン、ホルモンレセプター、神経伝達物質、神経栄養因子、神経栄養因子レセプター、ニューロン性ペプチド、細胞シグナル分子およびこれらペプチドのいずれかのレセプターを発現する遺伝子を含む。発現が制御されるべき最も好ましい遺伝子はニューロン性生長因子を発現する遺伝子である。本発明は組換え基質を含有するベクターにも関する。ベクターにはウイルスベクターとプラスミドベクターがある。一般に、選択されたＤＮＡ分子をＤＮＡ分子が異種である（すなわち正常には存在しない）発現系に挿入されることよりなる。異種ＤＮＡ分子は適当な方向性と正しいリーディングフレームで発現系すなわちベクターに挿入される。ベクターは挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有する。ＣohenおよびＢoyerの米国特許第４,２３７,２２４号（引用により本明細書の一部とする）には、制限酵素解裂およびＤＮＡリガーゼ連結反応を用いて組換えプラスミド形態での発現系の産生が記載されている。これらの組換えプラスミドは、形質転換によって導入され、組織培養中で生育された原核生物および真核細胞を含む単細胞系培養において複製される。組換え遺伝子は牛痘ウイルスなどのウイルスに導入される。組換えウイルスはプラスミドのウイルス感染細胞へのトランスフェクトにより産生することができる。適当なベクターには、制限するものでないが、ラムダベクター系ｇｔ１１、ｇｔＷＥＳ.ｔＢ、シャロン４などのウイルスベクター、およびｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ＳＶ４０、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋／− ｏｒＫＳ＋／−（参照、“Stratagene Cloning Systems”Catalog（1993）from Stratagene，La J olla，Calif、引用により本明細書の一部とする）、ｐＱＥ、ｐＩＨ８２１、ｐＧＥＸ、ｐＥＴ series（参照、F.W．Studier et al.，“Use of T7 RNA Polyme rase to Direct Expression of Cloned Genes,”Gene Expression Technology v ol.185(1990)、引用により本明細書の一部とする）およびこれらの誘導体などのプラスミドベクターが含まれる。組換え分子は、形質転換、特に形質導入、コンジュゲーション、動態化またはエレクトロポレーションを経て細胞に導入され得る。ＤＮＡ配列は既知の標準的クローニング方法（Maniatis et al.，Molecular Cloning ：A Laborator Manual ，Cold Springs Laboratory，Cold Springs Harb or，New York(1982)、引用により本明細書の一部とする）を用いてベクター中にクローン化される。多様な宿主−ベクター系がタンパク質コード配列を発現するのに用いられる。まず、ベクター系は用いた宿主細胞に適合しなければならない。宿主−ベクター系には、制限するものでないが、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌、イーストベクターを含むイーストなどの微生物、ウイルス（例えば、牛痘ウイルス、アデノウイルス等）に感染した哺乳動物細胞系およびウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞などがある。これらのベクターの発現エレメントは、その強さおよび特異性によって様々である。用いた宿主−ベクター系に従って、適当な転写および翻訳エレメントのいずれか一つを用いる。異なる遺伝子シグナルおよびプロセシングが遺伝子発現（例えば、ＤＮＡ転写およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）翻訳）の多くのレベルを制御する。ＤＮＡの転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示するＤＮＡ配列であり、それでもってｍＲＮＡ合成が促進されるプロモーターの存在に依存する。真核プロモーターのＤＮＡ配列は原核プロモーターのそれと相違している。さらに、真核プロモーターおよび付随する遺伝子シグナルは、原核系において認識されず、機能しない。さらに、原核プロモーターは真核細胞において認識されず、機能しない。同様に、原核細胞におけるｍＲＮＡの翻訳は、適当な原核シグナルの存在に依存しており、真核細胞のものとは異なっている。原核細胞におけるｍＲＮＡの効率的な翻訳には、ｍＲＮＡにＳhine−Ｄalgarno（ＳＤ）と呼ばれるリボソーム結合部位を必要とする。この配列は、通常ＡＵＧである開始コドンの前に位置するｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列である。ＡＵＧはタンパク質のアミノ酸末メチオニンをコードする。ＳＤ配列は１６ＳｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の３’ 末に相補的であり、リボソームの正しい位置付をなすｒＲＮＡで２重化されることによりｍＲＮＡのリボソームへの結合をおそらく促進する。遺伝子発現の最大化についての綜説は、Roberts and Lauer，Methods in Enzymology，68:473（19 79）(引用により本明細書の一部とする)を参照。本発明は、組換え基質を保有する宿主細胞も含む。宿主細胞には細菌細胞および動物細胞が含まれ、これらは組換え基質を保持および繁殖するために用いられる。宿主細胞は組換え基質により形質転換されている哺乳動物細胞も包含する。本発明はまた、体細胞および生殖細胞が組換え基質を含むトランスジェニック動物も提供する。トランスジェニック動物（例えばマウス）を産生するのに用いられる一つの手段は次の通りである。雌マウスを交尾させ、得た受精卵をその卵管から採取する。卵をＭ２培地などの適当な培地(Hogan B．et al．Manipulatin g the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1 986)、引用により本明細書の一部とする)に貯蔵する。遺伝子、ミニ遺伝子または組換え基質をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡを既知技術によりベクター（プラスミドｐＣＥＸＶ−ａｌｐｈａ［ｌａ］、ｐＣＥＸＶ−ａｌｐｈａ［ｌｂ］またはｐＣＥＸＶ−ａｌｐｈａ［ｌｃ］など）から精製する。誘発し得るプロモーターをＤＮＡのコード領域と融合して、形質転換体の発現を調節する実験手段を準備する。別にまたは追加して、組織特異的調節エレメントをコード領域と融合して、形質転換体の組織特異的発現をもたらす。適当な緩衝液中のＤＮＡを微注射針（ピペット吸引器を用いて毛細管からつくり得る）に入れ、注射するべき卵を抑圧スライドに置く。針を卵の前核にさし、ＤＮＡ溶液を注入する。注入された卵は偽妊娠マウス（すなわち、妊娠を維持するのに適したホルモンで刺激されたマウスであるが、実際には妊娠していない）の卵管に移し、そこで子宮に行き着床および妊娠満期へと進行する。下記するように、微注射は卵細胞中にＤＮＡを挿入するための唯一の方法ではなく、ここでは説明目的のためにのみ使用する。本発明の好ましい実施態様では、トランスジェニック哺乳動物としてマウス、ラット、山羊、牛または豚が選択される。最も好ましい実施態様では、動物がマウスである。本発明は組換え基質を含有するトランスジェニック哺乳動物から誘導された細胞系、クローンまたは腫瘍も包含する。特に本発明は組換え基質を含有する受精幹細胞クローンを含む。本発明の他の点は、体細胞および生殖細胞が組換え基質を含むトランスジェニック動物を産生する方法である。組換え基質は、組換え部位に特異的なレコンビナーゼで処置されたときに、（ａ）ＤＮＡ分子からターミネーターを移動せしめ、発現が制御されるべき該遺伝子の転写を可能とするか、または（ｂ）該ＤＮＡ分子から発現が制御されるべき該遺伝子を移動せしめ、それによって、発現が制御されるべき該遺伝子の機能損失をもたらすものであって、胚中に導入される。胚は偽妊娠哺乳動物中に移植され、この胚は臨月期に生長する。組換え基質を保有する哺乳動物を同定する。導入工程は、微注射、すなわちＤＮＡ分子の胚未分化胚芽細胞または胚幹細胞中への導入によって行われる。本発明のさらなる実施態様は、組換え基質に同種のマウスを得る方法にも関する。組換え基質を保有する哺乳動物は同種間繁殖し、２種の対立遺伝子上に組換え基質を保有する子孫動物を同定する。本発明の好ましい実施態様は、組換え基質中に含有されたレポーター遺伝子を保有する哺乳動物を同定することにより、組換え基質を保有する動物を同定することである。同定はレポーター遺伝子で発現されたタンパク質をスクリーニングすることにより実施される。例えば、発現されたタンパク質に特異的な抗体を用いて行われる。抗体は検出が容易なように化学的にまたは放射活性的に標識される。同定はまた、レポーター遺伝子によって付与された表現型をスクリーニングすることでもっても実施される。実施例として、薬剤抵抗性または蛍光でのスクリーニングがある。同定はさらに、核酸ハイブリゼイション法を用いてレポーター遺伝子またはレポーター遺伝子によりつくられたＲＮＡ分子について直接的にスクリーニングすることにより実施される。本発明の他の点は、組換え基質を活性化する方法である。レコンビナーゼが組換え基質を保有するトランスジェニック哺乳動物に導入され、組換え基質は、組換え部位に特異的なレコンビナーゼで処置されたときに、（ａ）ＤＮＡ分子からターミネーターを移動せしめ、発現が制御されるべき該遺伝子の転写を可能とするか、または（ｂ）該ＤＮＡ分子から発現が制御されるべき該遺伝子を移動せしめ、それによって、発現が制御されるべき該遺伝子の機能損失をもたらす。次いで、活性組換え基質を含有する哺乳動物を同定する。レコンビナーゼはトランスジェニック哺乳動物中に、化学的または物理的方法を含む多くの運送方法でもって、およびベクターを経て導入される。運送の好ましい化学的および物理的方法は、ビイロソーム、リポソーム、裸のＤＮＡおよび遺伝子ガンとして知られることもある粒子爆撃を用いることを含む。好ましい方法は、ウイルスベクターの使用を経るリコンビナーゼをコードする核酸の導入である。ウイルスベクターは有機型スライス培養およびインビボにおいて領域遺伝子発現を達成する能力を有する。好ましいベクターは、アデノウイルス（“Ａｄ”）(Akli S．et al.，Nat ．Genet 3，224(1993); Bajocchi，G.， Feldman，S.，Crystal，R．and Mastrangeli，A.，Nat ．Genet.，3，229（1993 ）; Davidson，B.，Allen E.，Kozarsky，J.，Wilson，K．and Roessler，B.，N at ．Genet. ，3，219，(1993); Le Gal La Salle，G．et al.，Science，259，98 8（1993）、引用により本明細書の一部とする)、アデノ関連ウイルス（“ＡＡＶ ”）(Kaplitt，M．et al.，Nat ．Genet.，8，148(1994a)、引用により本明細書の一部とする)および単純ヘルペスウイルス（“ＨＳＶ”）(Dobson，A.，Margol is，T.P.，Sedarati，F.，Stevens，J．and Feldman，L.，Neuron，5，353(1990 ); Federoff，H.,Geller，A．and Lu，B.，Soc ．Neurosci Abstr.，16，353（19 90）; Fink，D．et al.，Hum ．Gene Ther.，4，11，(1992); Geller，A.，Curr ．Opin．Gen．Dev. ，3，81(1993); Geller and Breakefield(1988); Geller，A ．and Freese，A．Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，87，1149(1990); Geschwind， M.，Kessler，J.，Geller，A．and Federoff，H.，Brain Res ．Mol．Brain．Res . ，27，327(1994); Ho，D.，Mocarski，E．and Sapoloski，R.，Proc ．Natl．Ac ad. Sci．USA ，90，3655(1993); Kaplitt，M．et all．Mol ．Cell．Neurosci.， 2，320(1991)，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，91，8979(1994b)、引用により本明細書の一部とする)である。最も好ましいウイルスはＨＳＶで、約７０遺伝子を含有する１５０ｋｂＤＮＡウイルス（Roizman，B.，Virology，2nd Edn.，1787(1990)、引用により本明細書の一部とする）である。ＨＳＶは広い宿主範囲を有し、大部分の型の哺乳動物分化細胞に感染する能力を有するようである。野生型ＨＳＶゲノム内の多くの遺伝子は組織培養におけるその生長にあまり必要でない。Roizmanとその協力者が最初にこれをみつけ、異種遺伝子の移転のための運搬体として組換えＨＳＶウイルスを開発した（Roizman，B.，Jenkins，F.J．Science，229，1208(1985); Roi zman，B．and Sears，A.，Virology，2nd Edn.，1795(1990)、引用により本明細書の一部とする）。その後、この組換えＨＳＶベクター法は多数の研究者により用いられており、ＨＳＶアンプリコン・ベクター法（Andersen，J.，Garber， D.，Meaney，C．and Breakefield，X.，Hum ．Gene．Ther.，3，487(1992); Dobs on，A.，Margolis，T.P.，Sedarati，F.，Stevens，J．and Feldman，L.，Neuro n ，5，353(1990); Fink，D．et al.，Hum ．Gene．Ther.，4，11(1992)、引用により本明細書の一部とする）を補完する有力な遺伝子転換方法である。アンプリコン・ベクターの考えは、欠損干渉性ＨＳＶ粒子(Spaete，R．and Fr enkel，N.，Cell，30，305(1982); Stow，N．and McManagle，E.，Eucaryotic V iral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N Y，199(1982)、引用により本明細書の一部とする)のゲノム分析から生まれた。この粒子は高度の感染時でのＨＳＶ株に蓄積した。このゲノムは、野生型ＨＳＶゲノムからのＤＮＡ配列のサブセットの比較的単純な繰り返しからなる。主に、ゲノムはＤＮＡ複製の源（ｏｒｉ）および解裂／封入部位（ｐａｃ）を含有した（Spaete，R．and Frenkel，N.，Cell，30，305(1982)，Spaete，R．and Frenk el，N．Proc.Natl ．Acad.Sci．USA，82，694(1985); Stow，N．and McManagle， E.，Eucaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，199(1982)、引用により本明細書の一部とする）。ｏｒｉおよびｐａｃがプラスミドにクローンされたときは、プラスミドが細胞中にトランスフェクトされ、超感染野生型ウイルスによりＨＳＶ複製およびビリオン集合の機能が供給されると、プラスミドは複製されビリオン中に封入され得た。これらのアンプリコン株におけるゲノム分析は、プラスミド誘導配列が元のプラスミドの集約ユニットからなる主として１５０ｋｂの分子であることを示した(Spaete ，R．and Frenkel，N.，Cell，30，305(1982)，Spaete，R．and Frenkel，N．Pr oc ．Natl．Acad．Sci．USA ，82，694(1985); Stow，N．and McManagle，E.，Euc aryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，199(1982); Vlazny，D.，Kwong，A．and Frenkel，N．Proc ．Natl ．Acad．Sci．USA ，79，1423(1982)、引用により本明細書の一部とする)。アンプリコンベクターの産生には、共増殖ＨＳＶヘルパーウイルスを必要とする。大部分の研究者は、基本的な即時型初期（ＩＥ）ＨＳＶ遺伝子、典型的にはＩＥ３における突然変異をもたらすヘルパーウイルスを用いる（Geller，A．and Freese，A.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，87，1149(1990); Paterson，T．an d Everett，R．J ．Gen．Virol.，71，1775(1990)、引用により本明細書の一部とする）。ＩＥ３遺伝子内でのミスセンス変異を有するヘルパーウイルスは温度感受性表現型を有する。すなわち、複製は３４℃でおきるが、３９℃ではおきない（Preston，C.，J ．Gen．Virol.，71，1775(1979a)，PrestonC.，J ．Virol.，29 ，275，(1979b)、引用により本明細書の一部とする）。ＩＥ３遺伝子の全部または部分的な欠失は、正常な組織培養細胞では生育し得ないが、ＩＥ３遺伝子の組み込みコピーを安定的に発現する細胞系で生長し得るウイルスを産生する。これらの相補的細胞系は異なる細胞型において、そして異なるトランスフェクトの遺伝子セグメントを有して産生されている（DeLuca，N.，McCarthy，A．and Schaf fer，P.，J ．Virol.，56，558(1985); DeLuca，N．and Schaffer，P.，Nucleic AcidsRes .，15，4491，(1987); Paterson，T．and Everett，R．J ．Gen．Virol. ，71，1775(1990)、引用により本明細書の一部とする）。ＩＥ３遺伝子の部分的欠失を有するヘルパーウイルスは、相補的細胞系において生育すると、組換え野生型粒子の発生がおきる。この粒子が生じる度数（１０^-5−１０^-6）は、ヘルパーウイルスゲノムにおける組み込み遺伝子と欠失の両側にある残渣ＩＥ３配列との間の重複する相同性の程度に関係するようである（DeLuca，N.，McCarthy，A ．and Schaffer，P.，J ．Virol.，56，558(1985); DeLuca，N．and Schaffer，P .，NucleicAcidsRes.，15，4491，(1987); Paterson，T．and Everett，R．J ．G en．Virol. ，71，1775(1990)、引用により本明細書の一部とする）。典型的なアンプリコン株は、アンプリコン感染粒子１−１０×１０⁶およびヘルパーウイルス・プラーグ形成単位０.１−５×１０⁷の力価を有する。典型的アンプリコンベクターは：Col E1起点および大腸菌中で生育するための医薬耐性遺伝子(典型的にβ−ラクタマーゼ)を有するプラスミド骨格；複製のＨＳＶ起点；開裂／パッケージング配列；および転写単位を含む。最初のアンプリコンベクターは、ウイルスプロモーター、通常ＨＳＶＩＥプロモーター(本明細書に引用して包含させる、Ho，D.，Mocarski，E.およびSapoloski，R.，Pro c．Natl．Acad．Sci．USA，90，3655(1993);Kaplitt，M．et al.，Mol．Cell．N eurosci.，2，320(1991))は、興味の対象の遺伝子の発現を推進するように構築した。近年、遺伝子発現の程度および特異性をコントロールするのに有用な多重遺伝子(本明細書に引用して包含させる、Geschwind，M.，et al.，Hum．Gene Th er.，7，173(1996))、調製プロモーター(本明細書に引用して包含させる、Lu，B .およびFederoff，H.，Hum．Gen．Ther.，6，421(1995))および細胞性プロモーター(本明細書に引用して包含させる、Kaplitt，M.，et al.，Nat．Genet.，199 6，8，148(1994a))のアンプリコンベクターの構築を開始した。アンプリコンベクターは、分離細胞培養、オルガノタイピックスライス培養および無傷脳中で有糸分裂後ニューロンに有効に遺伝子を移入できる(引用して本明細書に包含させるAndersen，J.，Garber，D.，Meaney，C.およびBreakefield ，X.，Hum．Gene．Ther.，3，487(1992);Bergold P.，Casaccia-Bonnefil，P.， Federoff，H.およびStelzer，A.，Soc．Neurosci．Abstr.，19，21(1993a)，Ber gold，P.，Cassaccia-Bonnefil，P.，Xiu-Liu，Z.およびFederoff，H.，Proc．N atl．Acad．Sci．USA，90，6165(1993b); Dobson，A.，Margolis，T.P.，Sedara ti，F.，Stevens，J.およびFeldman，L.，Neuron，5，353(1990);Federoff，H. ，Geller，A.およびLu，B．Soc．Neurosci．Abstr.，16，353(1990)，Federoff ，H.，Geschwind，M.，Geller，A.およびKessler，J.，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，89，1636(1992);Fink，D.，et al.，Hum．Gene．Ther.，4，11（1992）; GellerおよびBreakefield，1988;Geller，A.およびFreese，A.，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA，87，1149(1990); Geschwind，M.，et al.，Hum．Gene Ther.，7 ，173(1996); Ho，D.，Mocarski，E.およびSapoloski，R.，Proc．Natl．Acad． Sci．USA，90，3655(1993);Huang，Q．et al.，Exp．Neurol.，115，303(1992); KaPlitt，M.，et al.，Mol．Cell．Neurosci.，2，320(1991)，Kaplitt，M.，et al.，Nat．Genet.，8，148(1994a); Wolfe，J.，Deshmane，S.およびFraser，N .，Nat．Genet.，1，379(1992))。殆どのデータは、移入遺伝子のアンプリコベクターからのインビボ発現が一月以内に減少することを示すが(Federoff，未公開データ)、ある実験は少数の一年間の発現細胞を報告する(引用して本明細書に包含させる、During，M.，Naegele，J.，O’Malley，K.およびGeller，A.，Scie nce，266，1399(1994))。これらの実験において、遺伝子発現はHSVプロモーターにより操作されていた。どの程度減少発現がアンプリコンゲノムの損失、ウイルスプロモーター転写の下方制御または両方の過程を反映しているかは明らかでない。異なるタイプのベクターにおけるウイルスプロモーター由来遺伝子の研究は、下方制御が共通の問題であることを示し、従って、アンプリコンベクターと同等の機構を操作するという仮説を導く。空間的および一時的遺伝子発現の制御の要求を満たすために、アンプリコンはスライス培養の領域感染を製造し、予定された時間経過で発現できることを必要とする。ウイルスの溶液(Bath)投与は、広範囲な遺伝子移入および、主にスライス培養の端のグリアにおける発現および神経の少しの発現をもたらす(Casaccia- Bonnefil，P.，et al.，J．Neurosci．Methods，50，341(1993)，引用して本明細書に包含させる)。マイクロピペットを使用して、ウイルスのナノリットル量を直接スライス培養製造領域感染の領域に送達させた。このような培養における遺伝子生産物発現の分析は、微少投与部位に限定されていることを示した。この方法で、適用したビリオンの数と形質導入細胞の数の間の直線相関がある(Casac cia-Bonnefil，P.，et al.，J．Neurosci．Methods，50，341（1993），引用して本明細書に包含させる)。更に、アンプリコン内のHSV IE 4/5プロモーターは、急速に、ウイルス微少適用後４時間以内に活性化した(Casaccia-Bonnefil， P.，et al.，J．Neurosci．Methods，50，341(1993)，引用して本明細書に包含させる)。本発明に関して、哺乳類中の組換えを促進できる任意の部位特異的リコンビナーゼが使用できる。好ましいリコンビナーゼは酵母由来のFLPおよびcreを含む。最も好ましいリコンビナーゼはcreである。以下の実施例において、体細胞モザイク研究がマウスのために開発され、そこで休眠生殖細胞系トランスジーンが体細胞送達により活性化され、creリコンビナーゼを発現する。組換え基質、生殖細胞系伝達神経生育因子除去活性化トランスジーン(NGF-XAT)を担持するトランスジェニックマウスが製造された。creリコンビナーゼ発現ウイルスベクターのNGF-XATマウスへの体細胞送達は、ＤＮＡレベルでＰＣＲおよびタンパク質レベルで免疫化学的およびELISAの両方で証明されるように、トランスジーンの領域的組換えおよび活性化をもたらした。この研究は、背面海馬形成内の一側NGFモザイク減少の行動的関連を評価するために開発された。creリコンビナーゼの発現により活性化されたNGF-XATマウスは、大腸菌β−ガラクトシダーゼを発現する対照ウイルスで形質導入したNGF-XATマウスと比較して、増加した移動活性を示した。以下の非限定的実施例は、シナプスネットワークの一部におけるNGFの焦点的に増加した発現は、恐らく、ＮＧＦ−反応性神経回路構成要素の全体的変化の改変により、行動の変化を誘発できることを示す。実施例実施例１ −実験プロトコール NGF XATトランスジェニック系由来の全脳mRNAのノーザンブロット分析 NGF-X ATをｐＢＳから除去し、受精卵の前核に注入し、短く培養し、擬似妊娠している雌の卵管に移した。６匹の開祖(founders)を得た。ポリＡ＋ＲＮＡを５つの別のトランスジェニック系(番号30，2，25，3および10)の成熟マウスから、Fast Tra ck Kit(In Vitrogen，Torrance，CA)により製造した。各約２μgのRNAをホルムアルデヒド含有１.２%アガロースゲルで分画した。ゲルをナイロン膜にブロットし、予備ハイブリダイズし、次いで³²Ｐ標識プローブに関してハイブリダイズした。ブロットをストリンジェントな条件下で洗浄し、フィルムに１４時間さらした。プローブが内因性NSE mRNAの５'ＵＴＲに相補的な約９０bpのプローブを含むため、それはまたＲＮＡ充填の内部対照としても働いた。入れ子型PCRおよびサザンブロット分析全ＰＣＲ反応を、５０mM TrisHClｐＨ９.０、１６ｍＭ(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、２.２５ｍＭＭｇＣｌ₂、２％ＤＭＳＯおよび０.１％トゥイン−２０を含む修飾緩衝液を使用して完了させた。１μgのゲノムＤＮＡ、各オリゴヌクレオチド１ｎＭ、５０μｍＤＮＴＰ(Boehringer)および１μgのTaqポリメラーゼ(Perkin-elmer)を反応各１００μｌに添加した。センスプライマー１(5'GCTCGTACGTGCGTCTCCGCCTGCAGCTCTE')およびアンチセンスプライマー２(5'AACGCTGTGATCAGAGTGTA3')を４０サイクルのＰＣＲ(Perkin-Elmer960 0)に、６１℃で４５秒のアニーリング温度および２分、７２℃の伸長時間で付した。各生産物をセンスプライマー３(5'CATGCGCTCGCTCGGCTCTA3')およびアンチセンスプライマー４(5'GACTCACCGATGCGCGTCCCCTCCGGCTCCA3')を使用して、再増幅させた。入れ子型反応を、４０サイクルのＰＣＲに、６６℃、４５秒のアニーリング温度および２分間、７２℃の伸長時間で付した。サンプルを１％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド蛍光(Fotodyne)で可視化した。プライマーペア１／２由来のＰＣＲ生産物を１％アガロース現で電気泳動し、ナイロン膜(MSI)に移した。ブロットを予備ハイブリダイズし、³²Ｐ標識Loxプローブでハイブリダイズした。１２３bp loxPフラグメントをSK-loxから、Pst 1と共に単離し、³²Ｐ dCTＰ(S.A．3000 Ci/mmol；Dupont)で標識した。ブロットをストリンジェントな条件下で洗浄し、フィルムに７時間さらした。ウエスタンブロット１０×１０⁶ ３Ｔ３細胞を１００mmプレートに播いた。翌日、細胞を、HSVCreまたはHSClacの約１×１０⁶の感染粒子で５時間感染させた。ウイルスを除去し、細胞を洗浄し、新鮮培地を２４時間毎に添加した。翌日、培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、０.５mlのLaemmli緩衝液(Laemm li，U．Nature 227，680(1970)，引用して本明細書に包含させる)で１５分、氷上で融解させた。ウェル当り２５０ngの融解物を４−２０％勾配ゲル(Bio-Rad) に、標準としての１５μlの低分子量マーカー(Amersham)と共に流した。ゲルを３５分、１００ボルトで流した。ゲルのニトロセルロースフィルター(Protran BA 83 ，S&S)への移動は、一晩で完了した。５％ミルクおよびＰＢＳ中のCre抗体の１／１０,０００希釈(DuPont，Inc.から提供)をブロットに添加し、一晩、４℃でインキュベートした。ブロットを、製造者(Amersham)の推薦に従って、２次抗体を使用して、ＥＬＣウエスタンブロッティング法に従い発展させた。ブロットをフィルム(XAR，Kodak)に１０−２０秒暴露し、次いで現像した。定位固定注射マウスを、誘導麻酔チャンバー中で７０％Ｎ₂Ｏおよび３０％Ｏ₂中の３％ハロタンで麻酔し、定位固定大脳内注射中、２％ハロタンで維持した。Kopf定位固定装置に固定後、頭蓋骨を正中線切開により暴露し、穿穴をドリルで開けた。ＮＧＦ免疫化学のための前頂に関する整合性は、−２.０mm、側面２.５mm、および深さ１.８mm；および行動実験に関するそれらは、−２.０mm、側面１.５mmおよび深さ１.５mmであった。３３ＧＡ針を所望の深さに徐々に進め、２−３μl(約１０５感染粒子)をゆっくり５分にわたり浸透させた。４日後、マウスの半分をハロタン過投与により殺し、X-gal染色した。１４日後、残りのマウスをβ−ＮＧＦ免疫化学のために調製した。 X-gal染色 HSVcrelacおよびHSVlac注射動物由来の凍結切片(２０μm)をサブベッドスライドの上にマウントし、−２０℃で貯蔵した。切片を１％グルタールアルデヒドで５分間後固定した。スライドを１×ＰＢＳで洗浄し：５ｍＭフェロシアンカカリウム、５ｍＭフェロシアンカカリウム、０.０２％NP-40、０.０１％ジコール酸ナトリウム、２ｍＭＭｇＣｌ₂および１μgのX-Gal(Gibco)を含む溶液に浸した。スライドを一晩３７℃でインキュベートし、チオニンで３分、対応染色させた。染色後、β−ＮＧＦ免疫染色法に記載のように、脱水し、カバースリップした。 β−ＮＧＦ免疫化学成熟マウスをFluotec ３蒸発機を使用して、７０％Ｎ₂ Ｏおよび３０％Ｏ₂中の３.０％ハロタンで麻酔した(Colonial Medics，Amherst ，NH)。２４GA血管カテーテル(Angiocath，Deseret Medical Inc．，Sandy，UT) を左心室の頂点に置き、心臓内環流を１０mlのヘパリン化食塩水(５,０００Ｕ／食塩水リットル)、続いて、０.２％パラベンゾキノン中の２０mlの０.０７５Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.５，Mallinckrodt UN 2213)中の２％パラホルムアルデヒドの冷却溶液で開始した。脳を抽出し、パラホルムアルデヒド−パラベンゾキノン溶液に、更に２−３時間、４℃で固定した。それに続いて、脳を、０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ＝７.５)中のエチレングリコール(３０％)およびシュークロース(２０％)の１０mlの凍結防止溶液に２４時間入れた。４０ミクロン連続切片を、Amercian Opticalスライディングミクロトームを使用して、粉末化ドライアイス上で切断し、０.０６％アジドを含むリン酸緩衝液中で、＋４℃でβ−ＮＧＦ免疫化学のために処理するまで貯蔵した。マウス脳の代表的冠領域をコースター入れ子型ウェル(VWR)に入れ、０.１Ｍトリス緩衝食塩水(ｐＨ＝７.６)で１０分インキュベートし、続いて２回のＴＢＳ中の０.２５％トリトン(T-8787，Sigm a)での１０分の洗浄をした。ブロックを、６０分、ＴＢＳ中の２％結晶性グレードウシ血清アルブミン(A-8022，Sigma)および５％正常ヤギ血清の溶液で行い、続いてＴＢＳ中の０.２５％トリトンで短く５分洗浄した。マウスβ−ＮＧＦに対するウサギポリクローナル(親和性精製)抗体(１：１０００希釈または１μg／ ml)を、Conner et al，Muir，D.，Varian，S.，Hagg，T.およびManthorpe，M．J ．Comp Neurol 319，454（1992）(引用して本明細書に包含させる)が推薦するように、＋４℃で、６０−６４時間、行った。結合抗体を、０.２５％トリトンのＴＢＳ溶液中の１.５μg／mlのビオチニル化ヤギ抗ウサギ抗体(Vectastain Elit e，rabbit IgG ABC kit，PK-6101，Vector labs，Burlingame，CA)と、０.５％ヤギ血清で、３時間、室温でインキュベートすることにより測定した。次いで、切片を室温で９０分、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ試薬中で、製造者の推薦に従ってインキュベートした。ＴＢＳおよびトリス−ＨＣｌ中の１０分の連続した濯ぎの後、切片を７分、０.１ＭトリスＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７.４)中の０ .０４％ジアミノベンジジン(D-5637，Sigma)、０.０６％塩化ニッケル(N 5756， Sigma)および０.０６％過酸化水素の濾液中に置いた。次いで、切片をリン酸緩衝液で濯ぎ、スーパーフロストコートスライド(Fisher)に細絵筆でマウントし、９５％および１００％アルコール中で脱水し、組織学的グレードのキシレン中で、過マウントによりカバースリップし、インキュベートして２４時間放置して乾燥させた。 NGF ELISA 注射部位を含む脳領域をHSVcrelacおよびHSVlacのいずれかを注射した動物から外科的に単離した。それらは、ＰＢＳ、０.４ＭＮａＣｌ、０.０５％トゥイン２０、０.５％ＢＳＡ、０.１ｍＭ塩化ベンゼチオニウム、１ｍＭＰＭＳＦおよび３.５μg／mlのアプロチニンを含む緩衝液中で、１：１重量／容量比率で抽出した。サンプルをマイクロガラス組織粉砕機(Wheaten)で均質化した。サンプルを次いで４０％出力でのカップ超音波処理に５回付した。均質物を１６,０００×ｇ、４℃で６０分、遠心した。上清を連続して５０ｍＭトリス−塩酸、２００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ₂、１％ＢＳＡ、０.１％トリトンＸ−１００および０.１％ナトリウムアジドを含む緩衝液で希釈し、下記のように調製したHigh Binding ELISAプレート(Costar)に添加した。ELISAプレートを抗−rhNGF(Dr．Dominick Sinicropi博士より提供)の１μg／ml溶液でコートし、２時間、３７℃でインキュベートし、続いて１時間、３７℃でブロックさせた。上清およびマウスＮＧＦ標準を添加し、一晩、４℃でインキュベートした。抗-NGF-βgal接合体(Boehringer Mannheim)を４時間、３７℃で添加し、製造者のプロトコール(Boehringer Mannheim)に従ってアッセイを展開した。サンプルを５９５nm(Bio-Rad)で読み取り、標準曲線をマウスＮＧＦコントロールから導いた。HSVcrelacおよびHSVlac注射動物の両方からの脳サンプルを標準曲線に対して測定した。 In situハイブリダイゼーション In situハイブリダイゼーションを、Boehri nger Mannheim Digoxigenin標識および検出システムを使用して、１２μmの冠切片で行った。hGH Exon IIに相補的なオリゴヌクレオチドプローブ(４５マー）を１０分、３'末端標識し、１：５０希釈を使用した。凍結切片を室温にし、４％パラホルムアルデヒドで１５分固定した。固定の後、切片を１×ＰＢＳで洗浄し、室温で２×ＰＢＳ中でインキュベートした。次いで、切片を２回１×ＰＢＳで濯ぎ、プロテイナーゼＫ(２０μg／ml)で３７℃で２０分消化させた。切片を４％パラホルムアルデヒドで５分間、後固定し、次いでＰＢＳで洗浄した。予備ハイブリダイゼーションの前に、切片をアセチル化し、プローブの非特異的結合を減少させた。切片をトリエタノールアミンおよび０.５％酢酸無水物中で１０分インキュベートし、続いて２×ＳＳＣで１０分洗浄した。５０％脱イオン化ホルムアミド、４×ＳＳＣ、１×デンハルト、１０％デキストランスルフェート、３０μg／mlサケ精子ＤＮＡおよび２５μg／ml酵母ｔＲＮＡからなる予備ハイブリダイゼーション溶液を切片に添加し、室温で１時間インキュベートした。予備ハイブリダイゼーションの後、切片を２×ＳＳＣで簡単に濯いだ。プローブを５分、９５℃で変性させ、１：５０の比で予備ハイブリダイゼーション溶液に添加し、一晩、３７℃でインキュベートした。切片を段階的に増加させたストリンジェントな洗浄液(ＳＳＣ：２×、１×、０.５×)で、最初に室温で、次いで３７ ℃で３時間にわたり洗浄した。抗−ジゴキシゲニンを１：５００希釈で、１％ヒツジ血清および０.００３％トリトンＸ−１００存在下、切片に添加し、室温で４時間インキュベートした。数回トリス−ＨＣｌで洗浄した後、色検出溶液(NBT & X-Phosphate)をスライドに亜し、一晩、展開させた。運動活性水平および垂直運動活性測定を、一日の９０分実験期間の間の５分間隔の赤外線ビーム消散(Opto-Varimex Minor，Columbus Instruments Internat ional Corporation)を基本にした自動装置で行った。各ビームを２５.４mmで、各ビームの広さが直径で３mmになるように分けた。水平または垂直ビームの中断は、Opto-Mデータソフトウエアを使用して回収される電気的インパルスを発生させた。水平ビームは、マウスが試験ケージの水平面を移動した場合にのみ記録され、飛び跳ねや立ち上がりは、垂直ームにより記録された。統計的分析を変化するグループ間としてのトランスジーンおよびグループ内変化としての時間間隔変化の分析の２方向反復測定を使用して行った(SuperANOVA，Abacus Concepts，In c．)。実施例２ −生殖細胞系伝達組換え置換の設計生殖細胞系伝達組換え基質、ＮＧＦ切除的活性化トランスジーン(NGF-XAT)を設計し、体細胞的に発現するcreリコンビナーゼによる活性化により、非活性化カセットがＮＧＦ発現のために除去される、ニューロン特異的非コーディング転写を合成した。NGF-XAT(図２Ａ)を、β−グロブリン転写ターミネーターに融合したヒト成長ホルモン(“hGH”)遺伝子のloxP結合変異フラグメント、ＮＧＦミニ遺伝子およびＩＲＥＳ開始ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(“I RESNpt”)およびｈＧＨ遺伝子由来の３'フランキング配列を含む、１.８kb ニューロン特異的エノラーゼ(“NSE”)プロモーターにより誘導した。実施例３ −大腸菌における組換え誘導除去の証明不活性化カセットの除去の効果および忠実性の証明のために、NGF-XATをcreリコンビナーゼを構造的に発現する細菌(図２Ｂおよび２Ｃ、レーン１−９)およびまたリコンビナーゼを欠く対照細菌(レーン１１−２２)に挿入した。両方の株からの独立した形質転換体由来のプラスミドミニプレプＤＮＡを製造し、BamHIで消化し、アガロースゲルでサイズ分画してサザンブロットした。個々の細菌プラスミドのサザンブロット分析は、除去の高い効果を証明した：全てのコロニーは不活性化カセットに対応する制限フラグメントを欠失した。対照NGF-XAT ＤＮＡのBamHI消化をレーン１０で流した。結果を図２Ｂに示す。図２Ｂにおいて、ブロットをプローブとハイブリダイズした(図２Ａ参照)。creリコンビナーゼを欠く細菌から製造したプラスミドのみがこのフラグメントを含んだ(フラグメントＢ)；creリコンビナーゼを発現する細菌由来の全てのプラスミドは、このフラグメントを欠失した。図２Ｃにおいて、ブロットをプローブ２および３とハイブリダイズし、細菌の両方のタイプ由来のプラスミドが発現フラグメントから解放されていることを証明した(フラグメントＡ、Ａ１およびＣ)。フラグメントＡ１は、組換えが新規３’BamHI部位を製造するため、フラグメントＡより僅かに大きい。“共消滅”構築物の直接配列決定は、カセットの除去を示した。対照してみると、無傷NGF-XATが、creリコンビナーゼを発現しない全細菌から回収された。実施例４ −形質転換マウスの発生ＮＧＦ−ＸＡＴをｐＢＳから摘出し、受精卵の前核に注射し、短時間培養し、偽妊娠雌の卵管中に移植した。６ファウンダーが得られた。５独立形質転換ライン（＃３０，２，２５，３および１０）の成人マウスから、ファースト・トラック・キット（ＩｎＶitrogen，Ｔorrence，ＣＡ）により、ＰolyＡ＋ＲＮＡを調製した。各ＲＮＡ約２ｕｇを１.２％アガロースゲル（ホルムアルデヒド含有）上で分画した。ゲルをナイロン膜にブロッテイングし、プレハイブリダイズし、³² Ｐ標識プローブにハイブリダイズした（図３Ａのノーザンプローブ１）。ブロットをストリンゼントな条件下で洗浄し、１４時間フィルムにさらした（図３Ｂ）。プローブは、内因性ＮＳＥｍＲＮＡの５'ＵＴＲに相補的な９０ｂｐを含んでいるので、ＲＮＡローディングを内部的にコントロールした。発生した形質転換マウスの５独立ラインのうち、２つは予測された端部切断転写物を発現した。（ライン＃３０と１０の発現におけるより小さなＮＧＦ−ＸＡＴ転写物の所在は、図３Ａに示される。）この２つのうち、ライン＃３０はより大量の転写物を産生したが、これはプローブ相補性の長さを天然ＮＳＥｍＲＮＡの量の約１５％に補正後に対応する（図３Ｂ）。端部を切断した不活性転写物に対して相補的なアンチセンスプローブを使用する、in situ hybridization研究は、ニューロンパターンにおける広範な標識化を示したが（図４Ａおよび４Ｂ）、センスプローブでプローブした形質転換切片は陰性であった（図４Ｃ）。加えてバックグラウンド上の標識は、非形質転換マウスからの切片にハイブリダイズさせたとき、アンチセンスプローブで観察されなかった。ブロットのノーザンプローブ（図４Ａ）に対する再ハイブリダイゼーションは、ＮＧＦ形質転換転写物を示さず、効率の良い転写終末を確認する。実施例５ −creリコンビナーゼの体細胞伝達によるイン・ビボ組換の促進 creリコンビナーゼの体細胞伝達がイン・ビボ組換を促進することが出来るか否かを決定させるため、リコンビナーゼを発現する若干のヘルペス・シンプレックス・アンプリコン（ＨＳＶ）ウイルスベクターを発生させた（図５Ａ；ＨＳＶ cre）。ＨＳＶcreをcre(Ｇu，Ｈ.，Ｚou，Ｙ．−Ｒ.and Ｒajewsky，Ｋ.，Ｃell ．，73，1155(1993))のＨＳＶＰｒＰＵＣ（Ｂattleman,Ｄ.，Ｇeller，Ａ．and Ｃhao，Ｍ.，ＪＮeurosci.，13(3)，941（1993），Ｂergold，Ｐ.，Ｃassaccia -Ｂonnefil，Ｐ.，Ｘiu−Ｌiu，Ｚ.and Federoff，Ｈ.，Ｐroc．Ｎatl.Ａcad．Ｓci.ＵＳＡ，90，6165(1993)；これらを参照文献として本願明細書中に加える。）中へのクローニングにより、構成させた。遺伝子ＨＳＶcreをウイルス中に封入し(Ｇeschwind，Ｍ.，Ｌu，Ｂ．and Federoff，Ｈ.，Ｐroviding pharmacol ogical access to the brain；Ａ volume of Ｍethods in Ｎeuroscience，Ｃon ned．1994；これを参照文献として本願明細書中に加える。)、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を感染させるために使用し、リコンビナーゼ発現を検出した。３０時間後、細胞を集め、蛋白質抽出物を調製し、ウエスタンブロット分析に付した(Ｈassankhan i，Ａ.，Ｓteinhelper，Ｍ.，Ｓoonpaa，Ｍ.，Ｋatz，Ｅ.，Ｔaylor，Ｄ.，Ｒoz enthal，Ａ.，Ｆactor，Ｓ.，Ｓteinberg，Ｊ.，Ｆield，Ｌ.and Federoff，Ｈ. ，Ｄev Ｂiol.，169,309(1995)；これを参照文献として本願明細書中に加える。 )。ｃｒｅリコンビナーゼを発現し（図５Ｂ，レーン１）、リコンビナーゼ（レーン２）、ＨＳＶcre感染３Ｔ３細胞（レーン３）、ＨＳＶｌａｃ（β−ガラクトシダーゼを発現）感染３Ｔ３細胞（レーン４）および非感染３Ｔ３細胞（レーン５）を発現しない、大腸菌からの蛋白質抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ブロットし、ｃｒｅリコンビナーゼに対するラビット・ポリクローナル抗体でプローブした。ｃｒｅ特異性バンド（矢印）がリコンビナーゼ（レーン１）とＨＳＶｃｒｅ感染３Ｔ３細胞（レーン３）を発現するバクテリアにのみ観察される。（図５Ｃ）ＮＧＦ−ＸＡＴ構成物は、組換前（頂部）および組換後（底部）に描かれ、ＰＣＲプライマーの所在が示される。（図５Ｄ）ＰＣＲは、Ｃｒｅイン・ビボ組換をモニターするのに使用された。ＨＳＶcreであって、コントロールウイルスＨＳＶlac（β−ガラクトシダーゼを発現する。）ではないもののライン＃３０マウスの背側の海馬への焦点伝達は、直接のＰＣＲサザーンブロット分析（図５Ｄ）およびネステッドＰＣＲ（図５Ｅ）で証明されるように、ＮＧＦ−ＸＡＴ生殖系列構成物（図５Ｃ）からの不活性カセットの切除を結果した。ライン＃３０ＮＧＦ−ＸＡＴマウスにＨＳＶcreとＨＳＶlacを注射し、注射部位からの脳領域および他の非注射領域を集めた。ＤＮＡを調製し、Ｃ（Ｂattleman，Ｄ.，Ｇeller，Ａ．and Ｃhao，Ｍ.，ＪＮeuros ci.，13（3），941（1993）；これを参照文献として本願明細書中に加える。）に示されたプライマーによるＰＣＲに付した。ＰＣＲ生成物をブロットし、³²Ｐ標識ｌｏｘＰプローブでハイブリダイズし、ストリンゼントに洗浄し、上記したようにフィルムにさらした。完全長３１００ｂｐ生成物を非組換ＮＧＦ−ＸＡＴを含むプラスミド鋳型から観察した（図５Ｄ；レーン１）。７８５ｂｐの破壊したＰＣＲ生成物（矢印）は、ＨＳＶcreウイルスを注射した脳領域においてのみ認められ（図５Ｄ；レーン３）、これはcreリコンビナーゼを発現するバクテリアによって産生された破壊鋳型上のＰＣＲによって誘導された生産物（図５Ｄ；レーン２）と同じ大きさである。破壊されたＰＣＲ断片はＨＳＶｌａｃ感染ライン＃３０動物からのＤＮＡ（図５Ｄ；レーン４）または非注射の動物からのＤＮＡ（図５Ｄ；レーン５）中には観察されなかった。ＮＧＦミニ遺伝子(Ｆederoff ，Ｈ.，Ｇeschwind，Ｍ.，Ｇeller，Ａ.and Ｋessler，Ｊ.,Ｎatl.Ａcad．Ｓci. ＵＳＡ，89，1636（1992），Ｈassankhani，Ａ.，Ｓteinhelper，Ｍ.，Ｓoonpaa ，Ｍ.，Ｋatz，Ｅ.，Ｔaylor，Ｄ.，Ｒozental，Ａ.，Ｆactor，Ｓ.，Ｓteinber g，Ｊ.，Ｆield，Ｌ.and Ｆederoff，Ｈ.，Ｄev Ｂiol.，169，309(1995))に対するＨＦ３７／４７によるＰＣＲ増幅は陽性であったが、完全長生成物は、形質転換ライン＃３０動物からは効率的に生産されなかった。（図５Ｅ）ネステッドＰＣＲ分析：ウイルス感染動物から抽出されたＤＮＡをプライマー１／２で増幅し、プライマー３／４で再増幅し、エチジウムブロミドアガロースゲル上で分画した(Ｂattleman，Ｄ.，Ｇeller，Ａ．and Ｃhao，Ｍ., ＪＮeurosci.，13（3），941（1993）；これを参照文献として本願明細書中に加える。)。完全長２７００ｂｐ断片が非組換ＮＧＦ−ＸＡＴを含むプラスミド鋳型から観察された（図５Ｅ；レーン１）。３１８ｂｐの破壊されたＰＣＲ生産物（矢印）はＨＳＶcreウイルスを注射した脳領域においてのみ観察された（図５Ｅ；レーン３）。これはcreリコンビナーゼを発現するバクテリアによって産生された破壊された鋳型上のＰＣＲによって誘導された生産物と同じ大きさであった（図５Ｅ；レーン２）。破壊されたＰＣＲ断片はＨＳＶｌａｃ感染ライン＃３０動物からのＤＮＡ（図５Ｅ；レーン４）または非注射の動物からのＤＮＡ（図５Ｅ；レーン５）中には観察されなかった。ＮＧＦミニ遺伝子（Ｆederoff，Ｈ. ，Ｇeschwind，Ｍ.，Ｇeller，Ａ.and Ｋessler，Ｊ.,Ｎatl.Ａcad．Ｓci.ＵＳＡ，89，1636（1992），Ｈassankhani，Ａ.，Ｓteinhelper，Ｍ.，Ｓoonpaa，Ｍ .，Ｋatz，Ｅ.，Ｔaylor，Ｄ.，Ｒozental，Ａ.，Ｆactor，Ｓ.，Ｓteinberg，Ｊ.，Ｆield，Ｌ.and Ｆederoff，Ｈ.，Ｄev Ｂiol.，169，309（1995）；これを参照文献として本願明細書中に加える。）に対するＨＦ３７／４７によるＰＣＲ増幅は陽性であったが、完全長生成物は、形質転換ライン＃３０動物からは効率的に生産されなかった。実施例６ −cre発現ＨＳＶベクターの局所伝達本実施例は、リコンビナーゼの体細胞発現が、免疫細胞化学による導入遺伝子生成物ＮＧＦの必要分析のためのＮＧＦ−ＸＡＴ構成物を活性化したことを証明するものである。ライン＃３０マウスに対して、ＨＳＶlacまたはＨＳＶcrelac （核限局性Ｃｒｅとβ−ガラクトシダーゼの両方を発現する）ウイルス（約２× １０⁵感染粒子）のいずれかを定位的に片側に注射した。若干の動物を４日後に分析してＸ−ｇａｌ組織化学によるβ−ガラクトシダーゼの発現を局在化させ、ベクター発現の局在化を確認した(Ｇeschwind，Ｍ.，Ｌu，Ｂ.and Ｆederoff，Ｈ.，Ｐroviding pharmacological access to the brain；Ａ volume of Ｍetho ds in Ｎeuroscience，Ｃonn ed.1994；これを参照文献として本明細書中に加える)。ＨＳＶlacとＨＳＶcrelac両者からのセクションはウイルス注射部位に限定された強いβ−ガラクトシダーゼ発現を示した。別のグループの動物に両ウイルスを注射し、１４日後にＮＧＦ免疫細胞化学により分析した。ＨＳＶlac注射動物（図６Ｃ）は、コントロール側または非注射動物（図６Ａ、６Ｂ）と比較して、注射側（矢印）について免疫反応性の強さやパターンに変化を示さなかった。ＨＳＶcrelac感染動物（図６Ｄ）は、ＮＧＦ免疫反応性の分布における著しい増強を証明した。その分布はウイルス注射領域（矢印）に局在しており、ウイルス注射部位に対する前方でも後方でもなかった（データ示さず）。実施例７ −ＥＬＩＳＡによるＮＧＦ免疫反応性の定量化ＮＧＦ免疫反応性の直接的定量化を、ウイルス注射後、１４日経過してからＥＬＩＳＡにより行った。ライン＃３０マウスをＨＳＶlacまたはＨＳＶcrelac（核限局性Ｃｒｅおよびβ−ガラクトシダーゼの両方を発現する）ウイルス（約２ ×１０⁵感染粒子）のいずれかを定位的に片側に注射し、１４日後に屠殺した。注射部位を含む組織ブロックを集め、ホモゲナイズし、ＥＬＩＳＡによって分析した。ＮＧＦ含量の大かつ顕著な増加（＊Ｐ＜０.００１，ｔ−ｔｅｓｔ）が、ＨＳＶlac注射動物（図７、ハッチングなしのバー、ｎ＝３）と比較して、ＨＳＶcrelacにおいて認められた（図７、ハッチング付きのバー、ｎ＝５）。ＨＳＶ crelac注射動物は、ＨＳＶlacおよび非注射対象動物と比較して、注射領域内でＮＧＦ濃度における約１５倍の増加を示す。実施例８ −cre活性化ＮＧＦ−ＸＡＴ形質転換遺伝子を有するマウスにおける増強自発活性海馬の末端の神経支配分野内におけるＮＧＦ−ＸＡＴ遺伝子のＣｒｅ介在活性化を用いて増強した局所的ＮＧＦ機能が自発的挙動を変化させるものであるか否かを決定した。ＮＧＦ−ＸＡＴマウスに対し背側の海馬中に定位的にＨＳＶcrel acまたはコントロールベクターＨＳＶlacのいずれかを注射した。２週間以内にＨＳＶcrelacを注射した後注射動物は、まずより活性であることが注目された。４〜６ケ月の後注射における挙動の研究が実施された。水平および垂直運動活性の測定を赤外ビームブレイクスに基づく自動装置を使用し、１日に９０分の実験期間の間に５分間隔で赤外ビームを適用した（Ｏcto −Ｖarimex Ｍinor，Ｃolumbus Ｉnstruments Ｉnternational Ｃorporation）。各ビームは幅が直径３mmで２５.４mmに分離された。水平または垂直ビームの中止は、電気的パルスを発生し、これはＯｃｔｏ−Ｍデータソフトウエアを用いて集められた。水平ビームはマウスが試験篭の水平面に動いた時のみ記録され、ジャンプや裏返りは垂直ビームによって記録された。統計的解析を２回繰り返し分析を行って実施した。導入遺伝子による変動をグループ間の変動として、時間的間隔をグループ内の変動として測定を繰り返した(SuperＡＮＯＶＡ，Ａbacus Ｃ oncepts，Ｉnc)。ライン＃３０マウスをＨＳＶlacまたはＨＳＶcrelac（核限局性Ｃｒｅおよび β−ガラクトシダーゼの両方を発現する）ウイルス（約２×１０⁵感染粒子）のいずれかを定位的に片側に注射し、４〜６ケ月後に動物の挙動を観察した。結果を図８に要約する。全水平（頂部）と垂直（底部）活性を、ＨＳＶlac（黒丸）およびＨＳＶcrelac（白丸）マウスに対して、９０分間にわたり５分間隔で数えた。各データ・ポイントは、５分間隔で、グループの平均±Ｓ．Ｅ．値と８匹のマウスを表す。グループは年令をマッチさせ、かつ６匹の雄と２匹の雌から構成された。ＨＳＶcrelacとＨＳＶlacマウスの水平活性レベルは、一般に期間の最初の３０分間にわたって均等であったが、その後は次の６０分間にわたり低下し、ＨＳＶlacマウスよりもＨＳＶcrelacにおいてより遅い低下を示した。結果としてＨＳＶcrelacマウスにおいて顕著に高い水平活性レベルが認められた（導入遺伝子活性化の主効果、Ｆ＝８.１７７、ｄｆ＝１、１４、ｐ＝.０１２；時間相互反応による導入遺伝子活性化、Ｆ＝２.５８、ｄｆ＝１７、２３８、ｐ＝.０００８）。垂直活性レベルも同様にＨＳＶcrelacマウスにおいて顕著な増加を示し（導入遺伝子活性化の主効果、Ｆ＝３３.２９、ｄｆ＝１、１４、ｐ＝.０００１）、この増加は９０分の期間中維持された（導入遺伝子活性化相互反応による時間、Ｆ＝１.５７、ｄｆ＝１７、２３８、ｐ＝.０７２）。垂直活性における差異が特に注目され、ＨＳＶlac値の１１３９〜１３８２％のオーダーでＨＳＶcrelacマウス（タイムポイント７〜９）において垂直活性におけるピークの増加が認められた。活性におけるこれらの増加は、ＨＳＶcrelacマウスが僅かに重い体重を有していたにも拘わらず（ＨＳＶcrelac ３６.１７±Ｓ．Ｅ．１.９１；ＨＳＶlac ３１.２５±Ｓ．Ｅ．１.８１；ｐ＝０.４１）、認められた。通常はこのような場合運動活性レベルが減少することが予測される。この挙動の差異に関係した神経解剖学的かつ生理学的変化は未だ明らかではないが、海馬形成内に局所的に増強したＮＧＦ発現は、初めて見いだされたことである。好ましい実施態様を詳細に記載したが、当業者にとって、発明思想から離れることなく種々の修飾、付加、置換等をなし得ることは明らかであり、従ってそれらもまた、以下のクレームで定義された発明の範囲に含まれるものと理解さるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．組換え基質（リコンビネーター基質；recombinatorial substrate）における遺伝子転写を促進することが出来るプロモータエレメントと、当該プロモータエレメントに対する３'位に存在してその転写を容易ならしめる、発現がコントロールされるべき遺伝子と、上記プロモータに対する３'位であって、その発現がコントロールされるべき上記遺伝子に対する５'位に位置しており、それに対する３'位の遺伝子の転写を妨げるターミネータと、上記ターミネータに対する３'位に位置する第１の組換え部位および上記ターミネータに対する５'位に位置する第２の組換え部位とを含む、組換え基質をコードするＤＮＡ分子であって、当該ＤＮＡ分子を上記組換え部位に特異的なリコンビナーゼで処理することにより当該ＤＮＡ分子から上記ターミネータが除去され、それによって組換え基質が活性化され、その発現がコントロールされるべき遺伝子の転写を可能にする、ＤＮＡ分子。２．容易に検出することが出来るＲＮＡまたはペプチドを産生することにより、活性化された組換え基質の検出を容易ならしめる、ターミネータに対して３' 位に位置するレポータ遺伝子をさらに含んでいる、請求項１記載のＤＮＡ分子。３．レポータ遺伝子が、ＬａｃＺ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、緑蛍光タンパク質、ヒトアルカリ性ホスファターゼ、ハイグロマイシン抵抗因子およびネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子から選択されたものである、請求項２記載のＤＮＡ分子。４．転写物を安定化させ、その発現がコントロールされるべき遺伝子に対して３’位に位置する遺伝子または断片の転写を終了させる、３'フランキング配列をさらに含んでいる、請求項１記載のＤＮＡ分子。５．３'フランキング配列が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ＳＶ４０、β− グロビン遺伝子、α−グロビン遺伝子およびヒト成長ホルモン遺伝子からの３’ フランキング領域から選択されたものである、請求項４記載のＤＮＡ分子。６．プロモータエレメントが、ミオシン重鎖α、ミオシン重鎖β、インシュリン、ソマトスタチン、グルカゴン、成長関連タンパク質４３ｋＤａ、上頸神経節クローン１０、ニューロフィラメント−Ｌ、ニューロフィラメント−Ｍ、ニューロフィラメント−Ｈ、グライアル・ビフィラリイ・タンパク質、Ｐ０、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、カルシトニン遺伝子関連ペプチドおよびニューロン特異性エノラーゼを発現する遺伝子に対するプロモータから選択されたものである、請求項１記載のＤＮＡ分子。７．リコンビナーゼ部位が、ＦＲＴおよびｌｏｘＰ部位から選択されたものである、請求項１記載のＤＮＡ分子。８．ターミネータが、ガストリン転写ターミネータ、Ｃ２コンプレメント転写ターミネータおよびβ−グロビン転写ターミネータから選択されたものである、請求項１記載のＤＮＡ分子。９．その発現がコントロールされるべき遺伝子が、ホルモン、ホルモン受容体、神経伝達物質、神経栄養因子、神経栄養因子受容体、神経細胞ペプチド、細胞信号分子およびこれらペプチドのいずれかに対する受容体から選択されたものである、請求項１記載のＤＮＡ分子。１０．その発現がコントロールされるべき遺伝子が、神経細胞成長因子である、請求項１記載のＤＮＡ分子。１１．請求項１記載のＤＮＡ分子を含む、ベクター。１２．請求項１記載のＤＮＡ分子を有する、宿主細胞。１３．その体および生殖細胞が、請求項１記載のＤＮＡ分子を含む、形質転換哺乳動物。１４．動物が、マウス、ラット、ヤギ、ウシおよびブタから選択されたものである、請求項１３記載の形質転換哺乳動物。１５．請求項１３記載の形質転換哺乳動物から誘導された、セルライン、クローンまたは腫瘍。１６．請求項１記載のＤＮＡ分子を含む、胚幹細胞クローン。１７．組換え基質における遺伝子転写を促進することが出来るプロモータエレメントと、当該プロモータエレメントに対する３'位に存在してその転写を容易ならしめる、発現がコントロールされるべき遺伝子と、その発現が上記プロモータにコントロールされるべき上記遺伝子に対する３’と５’位に位置しており、それに対する３’位の遺伝子の転写を妨げるターミネータと、上記ターミネータに対する３’位に位置する第１の組換え部位および上記ターミネータに対する５ ’位に位置する第２の組換え部位とを含む、組換え基質であって、上記ＤＮＡ分子を上記組換え部位に特異的なリコンビナーゼで処理することにより当該ＤＮＡ分子から上記ターミネータが除去され、それによってその発現がコントロールされるべき遺伝子の転写を可能にする、組換え基質を用意し、当該組換え基質を胚または胎児に導入し、上記の胚または胎児を偽妊娠哺乳動物に移植して、この移植された胚または胎児を成育させ、組換え基質を有する哺乳動物を同定することを特徴とする、その体および生殖細胞が組換え基質を含む形質転換哺乳動物を製造する方法。１８．導入が、ミクロインジェクションによって行われる、請求項１７記載の方法。１９．導入が、組換え基質を胚の胚盤胞中に導入することによって行われる、請求項１７記載の方法。２０．導入が、組換え基質を胚の幹細胞中に導入することによって行われる、請求項１７記載の方法。２１．さらに組換え基質を有する哺乳動物を交配させ、二つの対立遺伝子上に組換え基質を有する子孫哺乳動物を同定する、請求項１７記載の方法。２２．同定が、組換え基質に含まれるレポータ遺伝子を有する哺乳動物を同定することを含む、請求項１７記載の方法。２３．同定が、レポータ遺伝子によって発現されるタンパク質を検出することによって行われる、請求項２２記載の方法。２４．同定が、レポータ遺伝子によって付与される表現型をスクリーニングすることによって行われる、請求項２２記載の方法。２５．同定が、レポータ遺伝子にハイブリダイズすることによりまたはレポータ遺伝子によってコードされたＲＮＡ分子により行われる、請求項２２記載の方法。２６．動物が、マウス、ラット、ヤギ、ウシおよびブタから選択されたものである、請求項２２記載の方法。２７．組換え基質における遺伝子転写を促進することが出来るプロモータエレメントと、当該ターミネータエレメントに対する３’位に存在してその転写を容易ならしめる、発現がコントロールされるべき遺伝子と、上記プロモータに対する３’位であって、その発現がコントロールされるべき上記遺伝子に対する５’ 位に位置しており、それに対する３'位の遺伝子の転写を妨げるターミネータと、上記ターミネータに対する３’位に位置する第１の組換え部位および上記ターミネータに対する５'位に位置する第２の組換え部位とを含む、組換え基質であって、上記ＤＮＡ分子を上記組換え部位に特異的なリコンビナーゼで処理することにより当該ＤＮＡ分子から上記ターミネータが除去され、それによって組換え気質が活性化され、その発現がコントロールされるべき遺伝子の転写を可能にする、組換え基質を有する、形質転換哺乳動物を用意し、組換え基質の中で上記第１の組換え部位から上記第２の組換え部位へＤＮＡの切除を促進するリコンビナーゼを上記形質転換哺乳動物の中へ導入し、活性化された組換え基質を含む哺乳動物を同定することを特徴とする、組換え基質中で発現されるべき遺伝子を活性化する方法。２８．導入が、リコンビナーゼを発現するベクターを用意し、当該ベクターを形質転換哺乳動物の細胞の中へ導入することを含む、請求項27記載の方法。２９．ベクターが、ウイルスである、請求項２８記載の方法。３０．ウイルスが、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、シンビスウイルスおよびレトロウイルスから選択されたものである、請求項２９記載の方法。３１．導入が、リコンビナーゼを発現する核酸分子をウイロソーム、リポソーム、裸のＤＮＡまたは粒状ボンバードメントの使用により形質転換哺乳動物細胞の中へ導入することによって行われる、請求項２７記載の方法。３２．リコンビナーゼが、ＦＬＰおよびｃｒｅから選択されたものである、請求項２７記載の方法。３３．動物が、マウス、ラット、ヤギ、ウシおよびブタから選択されたものである、請求項２７記載の方法。３４．組換え基質における遺伝子転写を促進することが出来るプロモータエレメントと、当該プロモータエレメントに対する３'位に存在してその転写を容易ならしめる、発現がコントロールされるべき遺伝子と、その発現がコントロールされるべき遺伝子に対する３'位に位置している第１の組換え部位およびその発現がコントロールされるべき遺伝子に対する５'位に位置している第２の組換え部位とを含む、組換え基質をコードするＤＮＡ分子であって、当該ＤＮＡ分子を上記組換え部位に特異的なリコンビナーゼで処理することにより当該ＤＮＡ分子からその発現がコントロールされるべき上記遺伝子が除去され、それによって組換え基質が活性化され、その発現がコントロールされるべき上記遺伝子の機能損失が結果される、ＤＮＡ分子。３５．プロモータに対する３’位に位置しており、それに対する３'位に位置し、組換え部位の間の遺伝子の転写を妨げるターミネータと、当該ターミネータに対する３'位に位置するレポータ遺伝子および上記組換え部位であって、容易に検出することが出来るＲＮＡまたはペプチドを産生することによって活性化された組換え基質の検出を容易ならしめるものをさらに含んでいる、請求項３４記載のＤＮＡ分子。３６．レポータ遺伝子が、ＬａｃＺ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、緑蛍光タンパク質、ヒトアルカリ性ホスファターゼ、ハイグロマイシン抵抗因子およびネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子から選択されたものである、請求項３５記載のＤＮＡ分子。３７．転写物を安定化させ、その発現がコントロールされるべき遺伝子に対して３'位に位置する遺伝子または断片の転写を終了させる、３'フランキング配列をさらに含んでいる、請求項３４記載のＤＮＡ分子。３８．３'フランキング配列が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ＳＶ４０、β ーグロビン遺伝子、α−グロビン遺伝子およびヒト成長ホルモン遺伝子からの３ 'フランキング領域から選択されたものである、請求項３７記載のＤＮＡ分子。３９．プロモータエレメントが、ミオシン重鎖α、ミオシン重鎖β、インシュリン、ソマトスタチン、グルカゴン、成長関連タンパク質４３ｋＤａ、上頸神経節クローン１０、ニューロフィラメント−Ｌ、ニューロフィラメント−Ｍ、ニューロフィラメント−Ｈ、グライアル・ビフィラリイ・タンパク質、Ｐ０、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、カルシトニン遺伝子関連ペプチドおよびニューロン特異性エノラーゼを発現する遺伝子に対するプロモータから選択されたものである、請求項３４記載のＤＮＡ分子。４０．リコンビナーゼ部位が、ＦＲＴおよびｌｏｘＰ部位から選択されたものである、請求項３４記載のＤＮＡ分子。４１．ターミネータが、ガストリン転写ターミネータ、Ｃ２コンプレメント転写ターミネータおよびβ−グロビン転写ターミネータから選択されたものである、請求項３５記載のＤＮＡ分子。４２．その発現がコントロールされるべき遺伝子が、ホルモン、ホルモン受容体、神経伝達物質、神経栄養因子、神経栄養因子受容体、神経細胞ペプチド、細胞信号分子およびこれらペプチドのいずれかに対する受容体から選択されたものである、請求項３４記載のＤＮＡ分子。４３．その発現がコントロールされるべき遺伝子が、神経細胞成長因子である、請求項３４記載のＤＮＡ分子。４４．請求項３４記載のＤＮＡ分子を含む、ベクター。４５．請求項３４記載のＤＮＡ分子を有する、宿主細胞。４６．その体および生殖細胞が、請求項３４記載のＤＮＡ分子を含む、形質転換哺乳動物。４７．動物が、マウス、ラット、ヤギ、ウシおよびブタから選択されたものである、請求項４６記載の形質転換哺乳動物。４８．請求項４６記載の形質転換哺乳動物から誘導された、セルライン、クローンまたは腫瘍。４９．請求項３４記載のＤＮＡ分子を含む、胚幹細胞クローン。５０．組換え基質における遺伝子転写を促進することが出来るプロモータエレメントと、当該プロモータエレメントに対する３’位に存在してその転写を容易ならしめる、発現がコントロールされるべき遺伝子と、その発現がコントロールされるべき遺伝子に対する３'位に位置している第１の組換え部位およびその発現がコントロールされるべき遺伝子に対する５'位に位置している第２の組換え部位とを含む、組換え基質であって、当該ＤＮＡ分子を上記組換え部位に特異的なリコンビナーゼで処理することにより当該ＤＮＡ分子からその発現がコントロールされるべき上記遺伝子が除去され、それによってその発現がコントロールされるべき上記遺伝子の機能損失が結果される、組換え基質を用意し、当該組換え基質を胚または胎児に導入し、上記の胚または胎児を偽妊娠哺乳動物に移植して、この移植された胚または胎児を成育させ、組換え基質を有する哺乳動物を同定することを特徴とする、その体および生殖細胞が組換え基質を含む形質転換哺乳動物を製造する方法。５１．導入が、ミクロインジェクションによって行われる、請求項５０記載の方法。５２．導入が、組換え基質を胚の胚盤胞中に導入することによって行われる、請求項５０記載の方法。５３．導入が、組換え基質を胚の幹細胞中に導入することによって行われる、請求項５０記載の方法。５４．さらに組換え基質を有する哺乳動物を交配させ、二つの対立遺伝子上に組換え基質を有する子孫哺乳動物を同定する、請求項５０記載の方法。５５．同定が、組換え基質に含まれるレポータ遺伝子を有する哺乳動物を同定することを含む、請求項５０記載の方法。５６．同定が、レポータ遺伝子によって発現されるタンパク質を検出することによって行われる、請求項５５記載の方法。５７．同定が、レポータ遺伝子によって付与される表現型をスクリーニングすることによって行われる、請求項５５記載の方法。５８．同定が、レポータ遺伝子にハイブリダイズすることによりまたはレポータ遺伝子によってコードされたＲＮＡ分子により行われる、請求項５５記載の方法。５９．動物が、マウス、ラット、ヤギ、ウシおよびブタから選択されたものである、請求項５０記載の方法。６０．組換え基質における遺伝子転写を促進することが出来るプロモータエレメントと、当該プロモータエレメントに対する３'位に存在してその転写を容易ならしめる、発現がコントロールされるべき遺伝子と、その発現がコントロールされるべき遺伝子に対する３'位に位置している第１の組換え部位およびその発現がコントロールされるべき遺伝子に対する５'位に位置している第２の組換え部位とを含む、組換え基質であって、当該ＤＮＡ分子を上記組換え部位に特異的なリコンビナーゼで処理することにより当該ＤＮＡ分子からその発現がコントロールされるべき上記遺伝子が除去され、それによって組換え基質が活性化され、その発現がコントロールされるべき上記遺伝子の機能損失が結果される、組換え基質を有する、形質転換哺乳動物を用意し、組換え基質の中で上記第１の組換え部位から上記第２の組換え部位へＤＮＡの切除を促進するリコンビナーゼを上記形質転換哺乳動物の中へ導入し、活性化された組換え基質を含む哺乳動物を同定することを特徴とする、組換え基質中で発現されるべき遺伝子を活性化する方法。６１．導入が、リコンビナーゼを発現するベクターを用意し、当該ベクターを形質転換哺乳動物の細胞の中へ導入することを含む、請求項６０記載の方法。６２．ベクターが、ウイルスである、請求項６１記載の方法。６３．ウイルスが、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、シンビスウイルスおよびレトロウイルスから選択されたものである、請求項６２記載の方法。６４．導入が、リコンビナーゼを発現する核酸分子をウイロソーム、リポソーム、裸のＤＮＡまたは粒状ボンバードメントの使用により形質転換哺乳動物細胞の中へ導入することによって行われる、請求項６０記載の方法。６５．リコンビナーゼが、ＦＬＰおよびｃｒｅから選択されたものである、請求項６０記載の方法。６６．動物が、マウス、ラット、ヤギ、ウシおよびブタから選択されたものである、請求項６０記載の方法。