JP2000500388A

JP2000500388A - 粒子および重力沈降を使用するサンプルの集団または下位集団を選択する方法

Info

Publication number: JP2000500388A
Application number: JP9518895A
Authority: JP
Inventors: エイチ．コールター，ワレイス; ケイ．ツバーナー，ロバート; ジェイ．シュミッティング，ロバート; アール．ラッセル，トーマス
Original assignee: コールターインターナショナルコーポレイション
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-05
Publication date: 2000-01-18
Also published as: DE69633740D1; EP0874991B1; CA2237119A1; DE69633740T2; EP0874991A1; ATE280948T1; WO1997018474A1

Abstract

(57)【要約】比較的重い、密な粒子および重力沈降を利用して、選択された所望または非所望の集団を生物学的サンプルから分離する分離法。粒子（１４）は選択された集団に対して特異的でありかつ結合する１または２以上の反応成分を結合して有する。好ましくは、サンプルの実質的な部分を通して粒子を沈降させることによって、粒子をサンプル（１２）と混合して選択された集団に結合させる。次いで、結合された集団を有する粒子をサンプル中で優先的に沈降させ、そして選択された集団を結合して有する粒子から濃縮集団を含む上清を分離する。生物学的サンプルの上清中の濃縮集団を多数の除去工程によりさらに濃縮することができる。

Description

【発明の詳細な説明】粒子および重力沈降を使用するサンプルの集団または下位集団を選択する方法関係する米国特許出願この出願は１９９４年４月１５日提出の米国特許出願第０８／１２８，７９１号の一部継続出願である。発明の背景本発明は、一般に、サンプルから所望の集団または下位集団を分離して、所望の集団または下位集団を単独で得るか、または１または２以上の非所望の下位集団が除去された、増強された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）集団または下位集団を得ることに関する。さらに詳しくは、本発明は、集団または下位集団を比較的密な粒子に結合し、複数の分離工程を含む重力沈降を使用して、集団または下位集団を残りのサンプルの上清から分離することによって、所望または非所望の集団または下位集団、例えば、細胞を骨髄または血液から分離することに関する。サンプル、例えば造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団または下位集団の増強は、多数の型の用途に使用することができる。サンプルは骨髄の吸引物、脊椎動物の体の髄（ＶＢＭ）、血液（末梢、可動化（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）または膿帯の血液を含む）またはヒトまたは他の動物、例えば、ラット、マウス、イヌ、ブタ、雌牛または霊長類からの他の源からのものであることができる。用語「可動化」は、患者を適当な刺激因子で治療してＨＳＣ細胞の数を増大することを意味する。したがって、骨髄吸引または血液フェレーシスにより十分な集団のＨＳＣを得ることによって患者から得なくてはならないサンプルの量が減少すると、集団または下位集団の増強に加えて、非所望の集団または下位集団を除去することがしばしば必要である。例えば、骨髄において、すべての非ホジキンＢリンパ腫細胞の除去はＢ細胞リンパ腫の場合において望ましいことがある。骨髄からＢ細胞を除去して骨髄を患者に再注入すべき場合、骨髄を完全に清浄すること、およびそうでなければ骨髄は損傷されないことが重要である。現在、１つのアプローチは、典型的には比較的低い密度のポリマーに基づく磁気材料から形成された、複数の磁気微小球を使用することである。微小球は比較的低い密度を有することが望ましい。なぜなら、微小球は骨髄または血液と混合され、特異的に重力沈降により沈降しないように設計されるからである。典型的には、微小球は小さい大きさであり、一般に約１ミクロンまたはそれより小さい直径である。しかしながら、ダイナル・インコーポレーテッド（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．ｏｆＧｒｅａｔＮｅｃｋ、Ｎ．Ｙ．）から販売されている１つの製品は、２．８または４．５ミクロンの公称直径を有し、１．５ｇ／ｃｃ程度の低い微小球密度をもつ磁気ポリマー微小球を使用する。先行技術の磁気微小球はサンプル中の懸濁液の中に維持することを意図し、結局サンプルの懸濁液中の重力沈降が非常に遅いか、またはそれを実質的に排除するように設計されている。磁気微小球は除去しようとする集団または下位集団に対して特異的な少なくとも１つの抗体をそれに結合して有する。しばしば、例えば、ダイナル（Ｄｙｎａｌ）プロセスにおけるように、第１モノクローナル抗体を問題の細胞に結合させ、そして第１モノクローナル抗体に対して特異的な第２抗体を微小球に結合させる。典型的には全血または骨髄から細胞を単離し、次いでそれにモノクローナル抗体を結合させる前に洗浄し、この洗浄工程は細胞の非識別的損失を引き起こす。次いで微小球および細胞を一緒に混合して微小球を第１および第２抗体を介して細胞に結合させる。血液または骨髄を清浄するために、サンプルを複数の抗体結合微小球と混合し、次いで磁場の中に配置する。微小球を磁場の中に保持しながら、残りのサンプルまたは上清を取出す。単一の清浄工程は一般に非所望の１または２以上の集団または下位集団の十分な百分率を消耗しないので、典型的には、この手法は反復される。清浄の目標は標的とした集団または下位集団のすべて（１００％）を除去することである。これは一般に不可能であり、そしてサンプルはできるだけ１００％近くまで清浄される。磁気除去手法はいくつかの問題を提示する。また、この手法は各除去工程の間に多数の細胞を非特異的に他の集団から除去する。これは収率、すなわち、残留する所望の集団の百分率、を減少する。単一の除去工程は比較的低い百分率の変化する収率を生じ、各連続する工程もまた収率を減少させる。さらに、磁気微小球は比較的高価である。磁気微小球の手法は、また、下位集団の研究のために下位集団を増強するために使用されてきている。この場合において、磁気微小球を所望の下位集団に結合させ、そして細胞を結合して有する磁気微小球をサンプルから取出す。次いで下位集団を直接的に研究するか、または研究のために微小球から取出すことができる。この手法は約１〜６時間またはそれより長い程度の時間を消費し、そして恐らく間違いなく自然の下位集団を生じないであろう。なぜなら、下位集団は少なくとも１つの型の細胞抗原に結合した少なくとも１つのモノクローナル抗体を有したからである。清浄のための他の使用は特定の下位集団、例えば、リンパ球（Ｌ）のＣＤ４集団の研究／増強である。この場合において、微小球は１または２以上の非ＣＤ４集団に対して特異的なモノクローナル抗体を結合して有する。他の集団の除去はサンプル中の全体の残留する細胞集団中のＣＤ４細胞の数を増大させる。しかしながら、磁気微小球を使用するとき、ＣＤ４下位集団の一部分の非特異的除去はＣＤ４下位集団の残りの数に重大な影響を与えることがある。大きいサンプル体積、例えば、５ｍｌおよびそれより大きい体積を使用するとき、細胞の非特異的除去はいっそう問題となり、次いでこの体積は大きい数の磁気微小球を必要とする。次いで磁気微小球を磁場の中に配置するとき、他の非標的細胞の非特異的捕捉および除去がしばしば起こる。抗体標識化表面を含む、陽性または陰性の選択の他の方法は、異なる細胞の型の混合物から細胞の下位集団を発生するために使用されてきている。これらの方法は通常プラスチック表面またはカラム中のポリマー粒子に共有結合で取付けられた抗体を有する。一般に、混合した細胞集団は、それらをカラムに添加し、それらをインキュベートするか、またはそれらを表面上に沈降させることによって、取付けられた抗体と組み合わされる。密度勾配によりバッフィーコートまたは単核細胞調製物を調製し、細胞を洗浄し、そして細胞を抗体標識化表面と組み合わせることによって、混合した細胞集団から赤血球（ＲＢＣ）および血漿を最初に除去するとき、これらの手法は有効に働く。また、双方の方法は分離系の調製および使用前の緩衝液による洗浄を必要とし、抗体との３０〜６０分のインキュベーション時間は、カラムおよびフラスコの方法に最小３時間を要する手法を生ずる。問題の細胞集団のための陰性の選択または陽性の選択のために、これらの方法を使用することができる。双方の方法において、直接的分離は高度に濃縮された集団を生じ、その結果非標的細胞は非特異的に損失される。解放された細胞は細胞表面上に抗体を有することがあり、しばしば分離技術により活性化され、これは望ましくない。本発明を使用する方法および装置は、種々の免疫学的反応、例えば、反応成分および細胞、ウイルスまたは生物学的粒子、例えば、血小板を含む免疫学的反応とともに使用することができる。本明細書おいて使用するとき、細胞は動物または植物の細胞として定義され、細胞の細菌、真菌を包含し、これらは別々にまたは凝集物で同定することができる。細胞は独立した単位として機能することができる生きている物体の最小の構造的凝集物である。例えば、細胞はヒトＲＢＣおよび白血球（ＷＢＣ）の集団、癌または組織、骨髄および／または血液のサンプルからの他の異常な細胞であることができる。適当に標識化された細胞は、ヒトの血球または骨髄の例と同一の方法において本発明の方法および装置により、合理的に標識化されることを期待することができる。本明細書おいて使用するとき、用語「反応成分」は、細胞の表面上に存在する、１または２以上の相補的分子、例えば、抗原を検出しかつそれと反応する、種々の１または２以上の分子、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を定義する。いくつかの例は下記の通りである：反応成分特異的分子抗体抗原薬物薬物レセプターホルモンホルモンレセプター成長因子成長因子レセプターレクチン炭水化物分子核酸配列相補的核酸配列酵素コファクターまたはインヒビター反応成分は細胞上の１または２以上の特定の分子にカップルまたは結合する。サンプル、例えば、全血または骨髄、の中の残りの集団に影響を与えないで、１または２以上の下位集団を清浄または選択する有効な方法を有することは望ましいであろう。この方法は費用がかからず、速く、多数の選択工程またはラウンド後においてさえ高い収率を生じ、そして作用させるべきサンプルの体積により制限を受けてはならない。発明の要約本発明は、生物学的流体、例えば、全血から所望または非所望の集団または下位集団を急速にかつ高い収率で分離する方法および装置を提供する。１または２以上の反応成分、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を結合して有する、複数の密な、比較的重い粒子をサンプルと混合する。粒子に結合した抗体を問題でない細胞に向けることができる。細胞を結合して有する粒子を重力により分別的に沈降させ、次いで残りのサンプルを除去する。これは粒子が標的としなかったサンプル中の問題の残りの細胞の数を増大させる。本発明は、多数の除去工程後においてさえ、問題の細胞の高い収率を提供する。また、粒子に結合した抗体を問題の細胞に対して向けることができる。次いで標的細胞を結合して有する粒子からサンプル流体の残部および非標的細胞を除去し、分析してどれだけ多くの非標的細胞が除去されたかを決定することができる。次いで、さらに分析するために、標的細胞を粒子から除去することができる。問題の好ましい粒子材料はニッケルであることができる。必要に応じて、ニッケル粒子を加熱して粒子を安定化することができる。サンプルを清浄し、ヒトの中に移植すべき場合、磁場および洗浄手法を使用してＲＢＣを除去し、すべての粒子をサンプルから確実に除去することができる。図面の簡単な説明第１図は、本発明による選択の第１態様の略ブロック線図である。第２図は、本発明による標的細胞を結合して有する粒子の概念的態様である。第３Ａ図〜第３Ｅ図は、本発明の血液バッグミキサーの前面図、側面図および端面図である。第４Ａ図および第４Ｂ図は、それぞれ、本発明に従い得られた全血対照および顆粒球が濃縮したヒストグラムである。第５Ａ図および第５Ｂ図は、それぞれ、本発明に従い得られた全血対照およびリンパ球が濃縮したヒストグラムである。第６Ａ図〜第６Ｃ図は、ローン・プーラン（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ）の磁気粒子の重力沈降を本発明の密な粒子と比較するヒストグラムである。第７Ａ図および第７Ｂ図は、それぞれ、本発明に従い得られた全血対照および血小板／顆粒球が消耗したヒストグラムである。第８Ａ図〜第８Ｃ図は、それぞれ、本発明に従い得られた全血対照および血小板および顆粒球が消耗したヒストグラムである。第９Ａ図〜第９Ｆ図は、本発明の加速された沈降と比較した本発明の重力沈降の結果を図解するヒストグラムである。第１０Ａ図〜第１０Ｆ図は、本発明の変化する重力沈降時間を図解するヒストグラムである。第１１Ａ図〜第１１Ｃ図は、本発明の加熱された粒子を非加熱粒子と比較するヒストグラムである。第１２図は、本発明による選択法の第２態様の略ブロック線図である。好ましい態様の詳細な説明第１図を参照すると、本発明による選択の方法および装置の第１態様は全体的に参照数字１０で表示されている。選択装置１０は、必要に応じて増大または除去される前もって選択された集団または下位集団を含有する流体サンプル１２を含む。集団または下位集団は下記のものを包含する細胞の集団または下位集団であることができる：骨髄、脊椎動物の体の髄（ＶＢＭ）または血液の中に見出される細胞、例えば、好中球（Ｎ）、好酸球（Ｅ）、単球（Ｍ）、リンパ球（Ｌ）、リンパ球サブセット、幹細胞から未熟細胞〜成熟白血球，および疾病細胞、例えば、ヒトまたは動物の癌細胞または生物学的粒子、例えば、血小板（ＰＬＴ）。流体サンプルは下記のものを包含する生物学的流体であることができる：全血またはその一部分、骨髄、脊髄液または尿、または集団または下位集団を含有する他の流体、例えば、前述の流体。選択装置１０は、また、粒子１４源を含む。粒子１４は選択された細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を結合して有する。抗体は粒子１４に直接的に共有結合または吸着により結合するか、または間接的に第２抗体を介して任意の慣用法により結合することができる。複数の粒子１４およびサンプル１２の少なくとも一部分は、それぞれのライン１６および１８を経て混合ステーション２０において組合わされる。組合わされたサンプルの部分および粒子１４を混合し、次いでブロック２２で示すように重力沈降により分別沈降させる。サンプル１２および粒子１４を混合して、問題の選択された細胞への粒子の急速な結合を促進する。サンプル１２および粒子１４の混合を行って、粒子１４をサンプル１２中の選択された細胞と急速に接触させる。密な粒子１４の１つの利点は、非選択または非標的細胞を実質的に捕捉しないで、混合後、サンプル１２を通して粒子１４が分別的に重力沈降することである。混合の間において、粒子１４の他の利点は、粒子１４で細胞を物理的に損傷しないで、混合を実行して粒子１４を反復的にサンプルに通過または沈降させて細胞と粒子とを結合させることである。マイクロリットル程度に小さい体積について、混合は急速であり、米国特許第５，２３８，８１２号明細書（これは引用することによって本明細書の一部とされる）に開示されているようなものであることができる。０．５ｍｌ〜数リットル程度に大きい体積について、有効な混合法は転倒方式で粒子１４およびサンプル１２をタンブルすることである。いったん粒子１４がサンプル１２と混合されたならば、粒子１４を容器（図示せず）の底部に沈降させ、次いで残りのサンプルおよび細胞をブロック２４で図解するように分離することができる。粒子１４はサンプル１２中の集団（標的および非標的の双方の）より十分に大きい密度を有するので、粒子１４およびそれらに結合した標的集団はサンプル１２を通して分別的に沈降し、結合しない／非標的集団は懸濁したまま残る。例えば、サンプル１２が血液サンプルである場合、血球は１．０５ｇ／ｃｃ程度の密度を有し、こうして粒子１４は血球よりも少なくとも２〜３倍程度密であるように、血球よりも実質的にいっそう密であるべきである。残りのサンプル流体および細胞を研究ために取出すことができ、ここで問題の選択された細胞は流体の中に残留し、増強されており、そして粒子１４に結合している。また、粒子１４から細胞を除去するために、必要に応じて、結合した細胞（ここで細胞はまた問題の細胞である）の研究または使用のために、結合した粒子１４および細胞を残りのサンプル流体から取出すことができる。また、サンプルまたは流体から排除しようとする、粒子およびそれらの結合した細胞を含まない、残りの流体および細胞を生きている生物の中に再注入することもできる。装置１０はサンプル１２および粒子１４を組み合わせ、それらをステーションの間で動かす自動装置であるか、またはマニュアル手法、例えば、ステーション２０、２２および２４のための試験管または容器を使用するオペレーターにより実施される手法であるか、または２つの手法の組み合わせであることができる。また、沈降工程２２および分離工程２４は好ましくは重力沈降単独により達成することができるが、必要に応じて、追加の工程を含めることができる。サンプル１２および粒子１４を、ブロック２６で図解するように、短時間回転して、沈降工程２２を加速させる。また、粒子１４は磁性材料から作ることができる。磁気粒子１４では、ブロック２８で図解するように、磁石または磁場を容器（図示せず）の底部に加えて沈降工程２２を加速する。さらに、磁場２８を維持するか、または容器の底部に加えて、粒子１４が分離工程２４において除去されないようにする。残りのサンプルを除去し、磁場３０付近または磁場３０に通過させて、例えば、サンプルを生きている生物、例えば、ヒトの体の中に再注入すべきとき、流体サンプルの中に粒子断片または粒子１４が残らないようにすることができる。第２図を参照すると、概念的線図は２つの異なる抗体ＡおよびＢを結合して有する１つの粒子１４を図解する。例の目的で、１対のＡ陽性細胞３２が図解されており、これらは少なくとも１つの抗原Ａ’を含み、この抗原Ａ’は粒子１４上の１つの結合した抗体Ａに特異的に結合する。１対のＢ陽性細胞３４が図解されており、これらは少なくとも１つの抗原Ｂ’を含み、この抗原Ｂ’は粒子１４上の１つの結合した抗体Ｂに特異的に結合する。現実には、細胞の結合に対して特定の順序は存在せず、一般に、粒子１４の双方の自由の側面の粒子１４の観測をブロックするＡまたはＢ陽性細胞が存在するであろう（図示せず）。また、粒子１４上のＡおよびＢ抗体はＡ’およびＢ ’抗原の双方を発現する単一の細胞に結合する。例えば、Ａ細胞がＣＤ４陽性細胞でありそしてＢ細胞がＣＤ８陽性細胞であった場合、粒子１４に結合した４または５つのＡ細胞およびわずかに１または２つのＢ細胞が存在したであろう。結合順序は存在する細胞の比率にほぼ相関するので、この比が存在する。正常のサンプルにおいて、ＣＤ４／ＣＤ８陽性細胞の比は約２／１である。２つの異なる抗体ＡおよびＢが双方とも粒子１４に結合したとして記載されるが、各抗体を必要に応じて別々の粒子１４に結合させることができる。再び、前述したように、標的または選択された細胞を粒子１４に結合したサンプル１２から除去し、次いで細胞の別の研究のために粒子１４から細胞を除去することができる。細胞は粒子１４から慣用技術、例えば、生化学的分離または機械的崩壊法により除去することができる。特定の粒子１４が決定的ではないが、高い密度の磁気粒子１４は好ましい。１つの好ましい粒子１４はカルボニルニッケル、例えば、ニッケル粉末型１２３としてＩＮＣＯにより作られたニッケル粉末から形成される。粒子１４は好ましくは約５ミクロンの公称直径で作られ、好ましい範囲は３〜３５ミクロンであるが、それらの限定されない。微細物（より小さい断片）は使用前に排除される。粒子１４は比較的重く、好ましくは９ｇ／ｃｃ程度の密度を有する。粒子が細胞よりも急速にサンプル懸濁液を通して分別的に沈降するように、粒子の密度は選択される。したがって、粒子に結合した標的細胞は、いかなる有意な単離前においても、非結合（非標的）細胞の沈降により重力で分離される。明らかなように、サンプルの集団と粒子１４との間の差が大きくなるほど、より速い分別的沈降が起こるであろう。サンプル流体の体積は実行される手法に依存して変化する。血液、骨髄または脊髄液の分析のためには、１０μｌ程度に少ない体積を使用できるが、臨床的移植のためには、体積は１００ｍｌ〜３リットルの範囲であることができる。骨髄の手法は、典型的には、骨髄液から不必要な細胞を排除する清浄手法である。全血または骨髄において、多数の手法、例えば、粒子１４の１または２以上の組に結合した１または２以上のモノクローナル抗体に他の血球を結合させて他の血球を排除することによる幹細胞の単離を使用することができる。粒子１４をサンプル１２と混合する１つの好ましい方法は、粒子１４およびサンプルの混合物をおだやかに転倒させて、サンプル１２を通して粒子１４を反復して落下させて問題の集団に結合させることである。これは好ましいと考えられるが、重い密な粒子１４による問題の細胞への損傷が回避される場合、よく知られているローラー揺動またはより強い混合の手法も有効であることがある。１つのこのような装置は、試験管または同様な容器をゆっくり転倒回転させる試験管ホルダーであることができる。これは粒子１４およびサンプル１２の「おだやかな混合」を可能とし、ここで各回転でサンプルの実質的な部分を通して粒子１４は混合しかつ沈降させて、細胞に対する明らかな物理的損傷なしに、標的細胞を粒子に結合させる。転倒回転と同様に、各端をまず上部にし、次いで底部にして、試験管を回転または前後に振動させることによって、同一の混合運動を得ることができる。また、実質的に同一の混合手法を行うように、ローラーロッカーの速度をセットすることができる。血液バッグの転倒型ミキサーの１つの態様は第３Ａ図〜第３Ｅ図に図解されており、そして参照数字４０により全体的に表示されている。上部４２および底部４４のホルダー部分を解放することによって、血液バッグ（図示せず）をミキサー４０の中に挿入する。上部４２および底部４４はそれらの部分を一緒に保持するスナップクロージャー４６を含む。また、上部４２および底部４４は好ましくはヒンジ４８により一緒に丁番付けされている。第３Ａ図および第３Ｂ図において水平位置で図解されているが、ミキサー４０を実質的に垂直に配向させてサンプル流体１２および粒子１４の所望の転倒タンブリングを提供することができる。ミキサー４０を実質的に水平のモーターシャフト軸（図示せず）上にブラケット５０（第３Ｅ図）により取付けることができる。ブラケット５０はミキサー４０の１つの部分４４に取付けられる。ブラケット５０は部分４４の中に形成された複数の開口５２（第３Ｄ図）を通して部分４４に取付けることができる。ブラケット５０は複数の嵌め合い通路５４（第３Ｅ図）を含み、これらの通路を開口５２と整合させ、次いでブラケット５０を取付け、複数のボルトまたは他のファスナー（図示せず）により固定することができる。ブラケット５０は、１または２以上のねじ込み通路５８を通してモーターシャフトと回転するように、通路５６によりモーターシャフト（図示せず）に取付けられる。ボルト（図示せず）を通路５８の中にねじ込み挿入して、モーターシャフトを支持してミキサー４０を回転させることができる。血液管と同様に、ミキサー４０中の血液バッグをゆっくり回転させ、各回転でサンプルの実質的な部分を通して粒子を混合および沈降させて、サンプル中の標的細胞に結合させる。サンプル混合物、すなわち、全血、骨髄、混合細胞集団または体液から細胞の特定の下位集団を消耗させるために有効な抗体で粒子を標識化し、そして粒子の密度のために、重力により分別的沈降が容易であり、これにより粒子と一緒に特異的に取付けられた細胞を除去する、第１のいわゆる直接的方法を後述する。材料：ニッケル粒子 − ノバメット・スペシャリティ・プロダクツ・コーポレーション（ＮｏｖａｍｅｔＳｐｅｃｉａｌｔｙＰｒｏｄｕｃｔｓＣｏｒｐ．）（Ｗｙｃｋｏｆｆ、ＮＪ０７４８１）ＩＮＣＯのロット（Ｓｕｆｆｅｒｎ、ＮＹ１０９０１）ニッケル粉末型１２３。このロットは４００メッシュを通して篩がけされて大きい粒子が除去され、そして粗大として分類された。得られるロットは５．７ミクロンでフィッシャー選別され、粒子の１ｇ当たり０．３４ｍ²の表面積を有した。緩衝液Ａ − Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ、ｐＨ７．２９．５５ｇ／ｌＴｒｉｓ４．０ｇ／ｌＮａＣｌｄＨ₂Ｏ中で組み合わせる；濃ＨＣｌでｐＨ７．２とする緩衝液Ｂ − Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ／ＢＳＡ緩衝液Ａに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．２ｇ／１００ｍｌを添加する。抗体溶液 − 粒子の標識化について表１から粒子に添加するために必要である抗体の量を決定する。必要な精製された抗体の要求量を生ずる抗体の貯蔵液の体積を計算する。貯蔵液の量を測定し、それを粒子の添加直前に緩衝液Ａに添加する。方法：１．ニッケル粒子を秤量する（１ｇの粒子／０．３４ｍ²の表面積を計算する）。２．ｄＨ₂Ｏで２回粒子を洗浄する２ａ．ｄＨ₂Ｏを粒子に添加し、渦形成により混合し、管を倒立させる。２ｂ．粒子をほぼ２分間沈降させ、流体を除去することによって、粒子を流体から分離する。３．工程２におけるように１％の漂白剤の溶液を使用して粒子を洗浄する。４．工程２におけるように緩衝液Ａで粒子を洗浄する。５．ニッケル粒子をＢＳＡに最適にマスクする。５ａ．緩衝液Ａ中の粒子の１ｇ当たり２ｍｌの体積に粒子を再懸濁させる。５ｂ．５０ｍｇ／ｍｌの量のＢＳＡ（緩衝液Ｂの１：４希釈）を添加して、粒子表面積の１ｍ²当たり３ｍｇのＢＳＡの最終濃度にする。５ｃ．室温において管をローラー上に３〜６時間配置する。５ｄ．工程２におけるように、洗浄の間においてローラー上で３０〜６０分を使用して粒子を緩衝液Ａで２回洗浄する。６．抗体を粒子に添加する。６ａ．「マスクされた」ビーズを、工程５におけるように、１ｍｌ／ｇビーズに再懸濁させる。６ｂ．ビーズを超音波処理すると同時に、前に調製した抗体溶液を添加する。６ｃ．管をすすぎ、ここで抗体溶液を緩衝液Ａで調製し、これを粒子と組み合わせる。６ｄ．緩衝液Ａで体積を１ｍｌ／ｇまでにする。７．管をローラー上に配置し、室温において粒子／抗体溶液を一夜回転させる。８．標識化粒子をＢＳＡでブロックする。８ａ．工程５ｄにおけるように、粒子を緩衝液Ａで２回洗浄する。８ｂ．２ｍｌ／ｇの体積の緩衝液Ｂを粒子に添加する。８ｃ．超音波処理および渦形成により、粒子を再懸濁させる。８ｄ．粒子を１時間回転させる。８ｅ．交換の間において３０分間回転して緩衝液Ｂを２回置換する。９．標識化ビーズの貯蔵。９ａ．最終のブロッキング緩衝液Ｂを除去する。９ｂ．新鮮な緩衝液Ｂを２ｍｌ／ｇの体積まで添加する。９ｃ．室温においてキャップ付管の中に抗体コーティングしたビーズを貯蔵する。１０．抗体／粒子の調製物の試験。１０ａ．等級づけた量の抗体／粒子を試験管に、通常全血の１ｍｌ当たり１０〜２００μｌの抗体／粒子の範囲において、添加する。１０ｂ．３×体積のＩＳＴＯＮＩＩ（ＣｏｕｌｔｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）およびグルコース（４．５ｍ／ｌ）の混合物で抗体／粒子を３回洗浄する。１０ｃ．ＩＧ溶液をデカントし、１ｇの全血（ＥＤＴＡまたはヘパリン抗凝固剤の中に集めた）を添加する。１０ｄ．転倒タンブリングにより４〜５分間混合する。１０ｅ．試験管ホルダーの中に管を垂直に４〜５分間配置する。１０ｆ．粒子の上の血液をピペットで他の管に移す（ピペットをこの転移の間に磁気に抗して保持して、工程１０ｅの間に沈降しないことがあるニッケル粒子を除去することができる）。１０ｇ．最良の方法により消耗されている（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）集団について分析し、そして残留細胞をもとのサンプルの中に存在したもとの集団と比較する。１０ｈ．問題の細胞の集団を効果的に除去するために全血の１ｍｌ当たり必要である粒子の量を選択する。本発明は、微小球／粒子／ビーズを血小板（ＰＬＴ）およびＷＢＣ集団またはＷＢＣ下位集団に結合させるために特に適合する。本明細書おいて使用するとき、ＷＢＣサブセット集団は特定のモノクローナル抗体を結合させることができるＷＢＣ沈降のサブセットである。ワールド・ヘルス・オーガナイゼイション（ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）およびインターナショナル・イムノロジー・ソサイアティ（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＳｏｃｉｅｔｙ）により、命名法がモノクローナル抗体について定義された。モノクローナル抗体は、細胞または細胞のグループに対する特定の特異性を定義するクラスターの表示（ＣＤ）の命名法により定義され、そしてそのＣＤグループに対して特異的なモノクローナル抗体である。例の目的でのみ、ＣＤグループは下記表においてコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）抗体の表示者と一緒に特定されており、抗体の量は上記において言及した第１直接的標識化技術について与えられている。粒子１４の使用は、溶液を通る急速な沈降を可能とする粒子１４の密度、およびまた抗体結合粒子の特定の抗原への取付けを可能とする選択された抗体の特異性の双方に依存する。第２の改良された直接的標識化手法は、下記のように、ニッケル粒子１４上への抗体の吸着についての条件を規定する：材料：１−１Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液。１−２Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ／０．２％ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）緩衝液。１−３モノクローナル抗体濃厚物。１−４ニッケル粒子、ＩＮＣＯ１２３型。手法：２−１使用されるニッケル粒子１４の量をニッケル粒子１４の秤量により決定する（１ｇの粒子／０．３４ｍ²の粒子表面積を計算する）。２−２周期的に、例えば、１時間毎に混合しながら、粒子を２５０℃に３時間加熱し、そして使用前に粒子を冷却する。２−３ニッケル粒子１４に添加される抗体の適当な量をＴｒｉｓ／ＮａＣｌ、ｐＨ７．２緩衝液の中に希釈する（標識化の間の合計体積は１ｍｌ／ｇの粒子である）。２−４抗体濃厚物の量を測定し、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液に添加して１ｇの粒子／ｍｌの緩衝液の懸濁液を形成する（５ｍｇ／ｍ²粒子で抗体を添加する）。２−５懸濁液を適当なミキサー、例えば、ローラーミキサーの中に入れ、室温において一夜混合する。２−６粒子を懸濁液の底部に沈降させる２−７上清をデカントし、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液と置換して３ｍｌ／ｇの粒子１４の懸濁液を形成する。２−８懸濁液を適当な時間、例えば、３０分間混合して抗体を平衡化させる。２−９工程２−６〜２−８を反復することによって粒子１４を洗浄する。２−１０粒子１４を懸濁液の底部に沈降させる。２−１１粒子１４をＴｒｉｓ／ＮａＣｌ／０．２％ＨＳＡ緩衝液の中に２ｍｌ／ｇの粒子で再懸濁させる。２−１２懸濁液を３０分間混合する。２−１３工程２−１０〜２−１２をさらに２回反復して非特異的結合部位をブロックする。２−１４抗体標識化粒子を２〜８℃においてＴｒｉｓ／ＮａＣｌ／０．２％ＨＳＡ緩衝液の中に貯蔵する。また、上記手法を使用してポリクローナル抗体、例えば、ヤギ抗マウス免疫グロブリン（ＧＡＭ）で標識化された粒子を製造することができる。次いで、これらのＧＡＭ粒子をいわゆる間接的抗体標識化法において使用することができ、ここで粒子表面上のポリクローナル抗体に対するモノクローナル抗体の結合を介して、粒子１４を所望のモノクローナル抗体で標識化する。この場合において、５ μｇのモノクローナル抗体／３０μｌのＧＡＭ粒子／ｍｌの全血または細胞懸濁液を使用して標識化を実施する。１．適当な体積のＧＡＭ−ニッケル粒子をＴｒｉｓ／ＮａＣｌで３回洗浄して遊離ＧＡＭを除去する。２．Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液を選択された抗体と一緒に粒子に添加する（１００μｌ／３０μｌの粒子懸濁液）。３．適当な混合上で室温において２０分間インキュベートする。４．粒子を洗浄して結合しない抗体を除去する。５．選択された細胞集団の消耗のために粒子を使用する。２以上の抗体を単一のＧＡＭ粒子に添加することができる。１例はＭを消耗するための粒子１４上に一緒に結合したＣＤ１４およびＣＤ４であろう。ある抗体は粒子、例えば、ニッケル粒子１４によく結合しないであろう。遊離の抗体および問題の細胞集団への粒子の結合の失敗の可能性を防止するために、例えば、下記のようにしてグルタルアルデヒドを使用して、このような抗体を粒子上に固定することが好ましい：グルタルアルデヒドの固定：１．前もって標識化された粒子をＨ₂Ｏ中で２回洗浄する。２．Ｈ₂Ｏ中の０．２５％のグルタルアルデヒドの溶液で再懸濁させる（６ｍｇ／ｇの固形分を使用する）。３．適当なミキサー、例えば、ローラーミキサー上で３０分間インキュベートする。４．Ｈ₂Ｏで３回洗浄する。５．適当な緩衝液で１回洗浄する。６．緩衝液／タンパク質を使用してもとの体積（０．５ｇ／ｍｌ）に再懸濁させる（？）。７．粒子を２〜８℃において貯蔵する。粒子１４を適当な抗体で標識化する上記の改良された方法は、サンプル混合物（すなわち、全血、骨髄、ＶＢＭまたは混合された細胞集団）から細胞の特定の下位集団を消耗させるとき、いわゆる陰性選択、において有効であり、かつ、粒子の密度のために、また、特定の結合した細胞を粒子と一緒に除去するとき、いわゆる陽性の選択において、有効である。実施例１全血からの顆粒球集団の調製ＥＤＴＡの中に集められた全血の一部分をコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＳＴＫＳ計器（これはＲＢＣを溶解により除去する）上に、第４Ａ図に図解されているように、下記の消耗のための対照として流した。対照は、Ｌの６０、Ｍの６２、顆粒球（Ｎの６４およびＥの６６）の集団および破片部分６８を含む、ＤＣ（コールター体積）および光散乱（ＬＳ）パラメーターを使用する正常のＷＢＣ集団のパターンを例示する。抗体でコーティングされかつ前もって滴定されたたニッケル粒子の適量を１２×７５ｍｍのガラス試験管の中に入れ、４．５ｇ／ｌのグルコースを含有するＩＳＯＴＯＮＩＩ（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の溶液（ＩＧ緩衝液）で重力沈降により３回洗浄した。３ｍｌの全血サンプルを洗浄された粒子に添加し、試験管にキャップをした。次いで試験管を転倒ローラー上にほぼ３０回転／分において配置した。これは粒子を懸濁させて保持し、血液を通して粒子を反復的に落下させるために適当であることが見出された。血液と粒子をこのローラー上で４分間混合した。混合後、試験管を取出し、試験管ラックの中に垂直に４分間セットして分別重力沈降を行った。残留する集団を分析するために、粒子の上の血液をピペットにより他の試験管の中に移した。ある場合において、ピペットのバレルを磁気に抗して保持して、沈降しないことがあるＮｉ微細物の除去を確実にした。次いでサンプルをコールターＳＴＫＳ計器上に流し、全血対照に対して比較した。このような操作の１つの記載は米国特許第５，１２５，７３７号明細書（これは引用することによって本明細書の一部とされる）に開示されている。粒子と全血を混合し、粒子はＷＢＣの集団またはサブセット集団に結合するが、各場合におけるＲＢＣは図解した結果を得る前に溶解により除去される。ＷＢＣチャンネルから離れた計器のチャンネルにおけるコールター体積（ＤＣ）パラメーターのみを使用して、本明細書において言及する血小板およびＲＢＣの結果は得られる。下記の標識化ニッケル粒子を使用して、全血サンプルの部分を消耗させた：ＭＹ４２００μｌ／ｍｌ、Ｔ４１００μｌ／ｍｌ、Ｂ１１００μｌ／ｍｌ、ＰＬＴ−１８０μｌ／ｍｌ、Ｔ８５０μｌ／ｍｌおよび３Ａ１５０μｌ／ｍｌ。抗体結合標識化粒子のこの混合物は、第４Ｂ図に図解されているように、Ｍの６２’、Ｌの６０’および血小板の大部分を消耗して、顆粒球の濃縮された集団（Ｎの６４’およびＥの６６’）を与えた。全血（第４Ａ図）に比較したとき、消耗は消耗したサンプルにおいて血小板の８６％の減少、およびＭ６２’およびＬ６０’の集団のクリアランスを生じた。これは９８％の顆粒球６４’および６６’（これはもとの顆粒球数の９１％であった）から成る細胞集団を生じた。ＲＢＣは対照全血サンプルの９１％で保持され、細胞消耗の特異性を示す。実施例２リンパ球の分布および保持を有するニッケル粒子を使用するリンパ球の調製第５Ａ図および第５Ｂ図に図解されているように、抗体をコーティングしたニッケル粒子を使用してリンパ球調製物を作った。コールターＳＴＫＳ血液学的分析装置上に流した全血対照の結果は第５Ａ図に図解されている。正常のパターンは２７％のＬの７０、９％のＭの７２、６１％のＮの７４、および２％のＥの７６を生じた。１０ｍｌの全血についてＰＬＴ−１（７０μｌの粒子／ｍｌの血液）、ＫＣ−４８（５０μｌの粒子／ｍｌの血液）およびＭＹ−４（１００μｌの粒子／ｍｌの血液）で前もって標識化されたＮｉ粒子の適量の組合わせを１５ｍｌのポリスチレンの試験管の中に入れ、ＩＧ緩衝液で３回洗浄した。最後の洗浄からの上清を取出し、ＥＤＴＡの中に集められた全血の１０ｍｌを粒子に添加した。粒子を血液の中に再懸濁させ、転倒ローラー上に４分間配置した。混合後、試験管ラックの中に垂直にセットし、４分間放置して粒子を分別重力沈降させた。粒子を沈降させた後、消耗した血液をプラスチック転移ピペットで取出し、新しい管の中に入れた。転移の間、転移ピペットのバレルを磁気に抗して保持して、ニッケル微細物を除去した。コールターＳＴＫＳ血液学的分析装置上のリンパ球調製物の分析（第５Ｂ図）は、リンパ球の集団が９２％に増強されたことを示した。全血（第５Ａ図）に比較して細胞の他の集団の減少は、血小板の９４％、Ｎの７４’の９８％、Ｍの７２’の８０％、Ｅの７６’の９５％およびＲＢＣの１％の減少を示した。これは得られた消耗したサンプルがＬの７０’から構成され、非特異的除去は非常にわずかであることを証明した（リンパ球の９９％より多くの保持）。実施例３全血の消耗後の抗体標識化ニッケル粒子からのＴ８細胞の回収Ｔ８抗体で標識化されたニッケル粒子を最初に使用して、Ｔ８リンパ球の全血を消耗させた。消耗のために最適以下の投与量（５０μｌ／ｍｌの全血に対して１５μｌ）においてＴ８標識化ニッケル粒子をＩＧ緩衝液中で３回洗浄した。全血を粒子に添加し、転倒ローラー上に１０分間配置し、５分間垂直にセットした。消耗した血液を除去し、サンプルのもとの量の半分に等しい体積においてＩＧ緩衝液で再懸濁させ、軽く倒立することによって、粒子および結合した細胞を２回洗浄し、そして粒子および結合した細胞を沈降させた。洗浄後、粒子／細胞のペレットをＩＧ緩衝液の中に再懸濁させ、機械的崩壊のために磁気撹拌機上に約３０秒間配置した。この崩壊は細胞を粒子から分離させた。粒子を沈降させることによって上清を粒子から分離し、ピペットで取出し、フロー・サイトメトリーにより分析した。３つのサンプルを分析した：全血対照、Ｔ８標識化粒子で消耗後の血液、および粒子／細胞を撹拌し、粒子を沈降させた後における細胞を解放させた上清。プロフィルＩＩ上の結果は、リンパ球集団のわずかの１６％の減少を伴う、消耗した血液の正常の外観を示す。しかしながら、回収された細胞は高度に濃縮され、精製されたリンパ球集団を示す。蛍光表面のマーカーを使用してＴ４およびＴ８について分析後、消耗した血液は２６％から６．３％に減少したＴ８集団を有した。しかしながら、Ｔ８細胞の減少のために、Ｔ４集団は５２．５％から６６．１％に増加した。回収された集団において、細胞の９６％を越えるものはＴ８陽性であった。実施例４種々の型の密な粒子の標識化研究Ａ：表ＩＩに列挙する異なる型の密な粒子をＴ８抗体を使用する本発明の方法により標識化した。３〜３０ｍｇ／ｍ²のＢＳＡでブロックし、５ｍｇ／ｍ²のＴ８抗体で標識化することを含む、ニッケル１２３型粒子を標識化する標準的方法を種々の型の粒子に使用した。標識化および洗浄後、添加した標識化粒子の量を滴定する通常の方法において全血のＴ８消耗を実施した。血液および粒子を４分間混合した後、粒子を４分間沈降させた。次いで、得られる消耗したサンプルをフロー・サイトメーター（コールター・プロフィルＩＩ）によりＴ８細胞の百分率について分析した。全血のＴ８値と比較した残留するＴ８細胞の百分率として、消耗を計算した。ニッケル１２３型は他の実験において使用した粒子であり、そして他の型の粒子のコンパレーターであった。滴定後、全血の１ｍｌ当たり２５μｌの１２３型粒子はＴ８細胞の９６％を越える消耗を生じた。ステンレス鋼粒子は、１００μｌの粒子／ｍｌの全血においてさえ、消耗しなかった。Ｔ８抗体で標識化した亜鉛ダストは全血を凝固させた。これは多分亜鉛ダストがＥＤＴＡ抗凝固剤と相互作用し、サンプル中のカルシウムを遊離させることによってフィブリノゲンを活性化させるためであろう。他の型のニッケル粒子は事実消耗を生じたが、１２３型ほど有効ではなかった。研究Ｂ：Ｔ４抗体で標識化したが、ＢＳＡの予備コート工程を使用しない、いくつかの異なる型の粒子を、細胞に結合するそれらの能力を測定することによって、標識化について試験した。この方法により測定して、すべての粒子は抗体に結合した。ＰｄおよびＶＭ６３−Ｎｉは細胞への結合において１２３型Ｎｉに等しいか、またはそれよりもわずかにすぐれるが、ゆっくり沈降した。ＴｉＯ₂ 、ＰｂおよびＶＭ６３−Ｎｉのすべては微視的同定のための細胞の標識化において有効であった。Ｔａのみは、抗体で標識化後、細胞への結合において無効であることが示された。研究Ｃ：１２３型Ｎｉ粒子について標準的手法により、粒子を好中球に対して特異的なＫＣ−４８抗体で標識化した。次いで粒子を全血と混合し、血液スミアを作り、染色し、顕微鏡で検査した。すべてのこれらの粒子は好中球に対する特異的結合を示した。要約すると、試験した金属粒子のほとんどすべては少なくともある程度の抗体の吸着を提供した。しかしながら、消耗能力の関係において、１２３型Ｎｉはその表面の性質および密閉速度のために最も有利であった。１例として、パラジウムおよびマンガンの二酸化物粒子はよく消耗するが、本発明において重力沈降を有効するために十分に急速に沈降することができなかった。二酸化チタン粒子に吸着した抗体は、微視的同定について効率よい細胞の標識化を提供するが、大きさが小さいために、全血中で有意な分別沈降を生じなかった。＊全血に添加した亜鉛は凝固を生じた。実施例５抗体標識化ニッケル粒子を使用する全血のＴ４およびＴ８下位集団の消耗抗体標識についての前述の手法により、ニッケル粒子をＴ４またはＴ８抗体で標識化した。消耗のために、粒子（５０μｌ／ｍｌの全血）を試験管に移し、ＩＧ緩衝液で３回洗浄した。第３回の洗浄液を除去した後、全血を粒子に添加し、組合わせを転倒法において４分間混合した。混合後、試験管を直立位置に配置し、粒子を４分間沈降させた。次いで消耗した血液をＴ４−ＲＤ１／Ｔ８−ＦＩＴＣ蛍光性抗体（ＣｏｕｌｔｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣｏｕｌｔｅｒＣｙｔｏｓｔａｔ、ｐａｒｔ．ｎｏ．６５０３８０２）で標識化し、フロー・サイトメーター（コールター・プロフィルＩＩ）でアッセイした。すべてのサンプルを１分間計数し、異なる四分円の集団をＴ４およびＴ８リンパ球について比較した。全血対照に比較して、Ｔ４粒子を使用したとき、Ｔ４集団の９４％が消耗したが、Ｔ８のわずかに１８％が除去された。Ｔ８粒子を使用したとき、Ｔ８集団の９６％が消耗したが、Ｔ４のわずかに４％が除去された。実施例６分別沈降第６Ａ図〜第６Ｃ図は、先行技術のローン・プーランの磁気粒子と比較した本発明の密な粒子の分別沈降の結果を図解する。再び、第６Ａ図は、Ｌの８０、Ｍの８２、Ｎの８４およびＥの８６の正常集団のパターンを含む、ＳＴＫＳについての対照ヒストグラムドを図解する。第６Ｂ図は、ＫＣ４８モノクローナル抗体の標識を有する粒子を使用して、ニッケル粒子の消耗から得られるパターンを図解する。Ｎの８４は第６Ａ図に図解されているＷＢＣ対照集団の結果の５９．６％であったが、Ｎの８４’は第６Ｂ図に図解されているＷＢＣ集団の２．３％に減少した。ローン・プーランの粒子を同様な方法においてニッケル粒子として使用した。これらの粒子は第６Ｃ図のヒストグラムドにより示されるように重力沈降を事実上示さなかった。特に、結合したＮおよびローン・プーランの粒子はパターン８８を示すが、結合しないローン・プーランの粒子はノイズまたは破片のパターン９０として出現する。ローン・プーランの刊行物において、「磁場が存在しないと、数時間の間において有意な沈降は起こらない」と主張されており、再び、これらの粒子は重力沈降を防止するように設計されていることが示される。実施例７混合時間サンプルの体積および所望のインキュベーション時間に従い、混合時間および方法を変化させることができる。０．５ｍｌまたはそれより小さい程度の体積について、細胞集団に対する物理的損傷なしに、密な粒子の急速混合、例えば、渦形成または回転（ｎｕｔａｔｉｏｎ）および転倒沈降の双方を効果的に使用することができる。別々の抗体結合粒子ＫＣ４８−ニッケル（５０μｌ／ｍｌＷＢ）およびＰＬＴ−ニッケル（１００μｌ／ｍｌＷＢ）を使用して渦形成を達成した。コールターＳＴＫＳの結果を表ＩＩＩに示す。表ＩＩＩおよび他の同様な表、例えば、表Ｖ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩＩにおいて、血小板およびＷＢＣは１０³／μｌの単位で要約されているが、ＲＢＣは１０⁸／μｌで要約されている。実施例Ａは粒子の非存在において３０秒間渦形成した対照であり、実施例Ｂは１５秒間渦形成した粒子を含み、そして実施例Ｃは３０秒間渦形成した粒子を含み、そして各場合において、４分間沈降させた。結論すると、１５秒の渦形成で好中球は５０％消耗し、血小板は６０％消耗したが、追加の１５秒は好中球の消耗を７５％に増加し、血小板の消耗を７５％に増加した。また、他の細胞集団は非特異的損失なしに保持されることが認められた。同一血液サンプルを表ＩＶに示す変化する時間の間転倒混合した。表ＩＶの混合手法により得られた消耗の結果を表Ｖに示す。ＳＴＫＳ計器が０．０の結果を報告するとき（表Ｖ、ＦまたはＧにおけるＮ）、実際の結果は０．０５以下であり、一般に９９％より大きい。これらの粒子および抗体について、最小混合時間は約４分であるように見える。他の粒子および抗体について、混合時間は本発明の範囲内で変化することができる。明らかなように、最小時間を越える最小混合はある場合において望ましいことがあり、そして本発明にとって有害ではない。実施例８小さいサンプル体積小さい体積の２０μｌの全血を５μｌのＫＣ４８ニッケル粒子とともに４分間回転させた。表ＶＩに示す慣用の全血スミアアッセイから、Ｎの９５％の排除を示す結果が得られた。第２の小さい体積の１０μｌの全血を１μｌのＫＣ４８および２μｌのＰＬＴ −１とともに４分間回転させた。プロフィルＩＩのフロー・サイトメーターで、顆粒球の８２％の消耗が得られた。実施例９サンプル調製物からの顆粒球および／または血小板の除去血小板は、細胞懸濁液の調製の間に種々の方法により除去される全血および骨髄の１成分である。創傷の修復において血小板を有効とする血小板の属性は、細胞調製作業において欠点である、すなわち、血小板の凝集および他の細胞への非特異的接着である。全血中の白血球当たりのほぼ２０〜５０血小板が存在するので、分離作業の前の血小板の除去は白血球の回収可能性を増加し、全血のそれにいっそう密接に類似する白血球のプロフィルを生じ、そして調製時間を減少する。なぜなら、細胞懸濁液が単離された後における血小板を除去する最も普通の方法は３回の別々の低速遠心分離によるからである。患者に投与すべき調製物において、凍結前の血小板の除去は注入すべき細胞の非特異的損失を減少し、そして血小板の凝集を排除するであろう。さらに、成熟顆粒球は解放されたとき注入時に患者に対するショックを生ずることがある顆粒を含有する。成熟顆粒球および血小板の双方を除去することによって、直ちのまたは凍結後の注入のための細胞調製物は安全であり、そして患者に対する問題が少ないであろう。第７Ａ図は、Ｌの１００、Ｍの１０２、Ｎの１０４、Ｅの１０６および血小板（図示せず）を含有する対照全血集団を図解する。対照における血小板は２７６ ×１０³血小板／μｌであったが、顆粒球（ＮおよびＥ）は３．２×１０³／μｌであった。２組の密な粒子を組合わせ、血液と４分間混合し、そして４分間沈降させた。１つの組の粒子はＰＬＴ−１標識化粒子を８０μｌ／ｍｌで含み、そして第２組の粒子はＫＣ４８標識化粒子を５０μｌ／ｍｌで含んだ。第７Ｂ図に図解されているように、Ｌの１００’およびＭの１０２’は非常にわずかに影響を受けたが、Ｎの１０４’およびＥの１０６’は約９９．９％だけ減少した。血小板は約２×１０³／μｌに減少した。また、血小板および顆粒球を別の血液サンプルの部分において除去することができる。第８Ａ図はＬの１１０、Ｍの１１２、Ｎの１１４、Ｅの１１６および血小板（図示せず）を含有する対照全血の集団を図解する。第８Ｂ図は、再びＰＬＴ−１標識化された密な粒子を使用する、血小板の消耗後のサンプル部分を図解する。血小板は対照全血集団における２３１×１０³血小板／μｌから消耗したサンプル部分における３×１０³血小板／μｌに減少した。残留する集団Ｌの１１０’、Ｍの１１２’、Ｎの１１４’およびＥの１１６’は比較的影響を受けなかった。第８Ｃ図は、ＫＣ４８標識化された密な粒子を使用する、Ｎの１１４およびＥの１１６の消耗後のサンプル部分を図解する。Ｎの１１４”およびＥの１１６” は２．８×１０³／μｌの合計のＮの１１４および１１６から本質的にゼロに減少した。血小板は比較的影響を受けなかった。実施例１０増強された重力沈降第９Ａ図〜第９Ｆ図は、本発明の粒子を使用する短時間の加速された沈降に比較した重力沈降のヒストグラムドを図解する。第９Ａ図〜第９Ｄ図は、表ＶＩＩに列挙する標識を有する粒子を使用するＮ調製物を図解する。図９Ａ図は、再びＬの１２０、Ｍの１２２、Ｎの１２４、Ｅの１２６、血小板（図示せず）およびＲＢＣ（図示せず）の対照全血集団を図解する。表ＶＩＩの標識化粒子を使用するＮの調製は濃縮されたＮ調製物１２４’を生じ、ここでＷＢＣのＮの百分率は５９．７％から８９．６％に増加した。第９Ｂ図に図解されているように、Ｌは３２．１％から４．９％に減少し、そしてＭは５．５％から０．８％に減少した。第９Ｃ図は、Ｌの１３０、Ｍの１３２、Ｎの１３４およびＥの１３６の対照全血集団を図解する。この実施例において、重力沈降の代わりに、サンプル部分および粒子を小型の遠心機、例えば、フィッシャー・サイエンティフィック・マイクロ−セントリフーグ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＭｉｃｒｏ−Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）５９Ａで設定Ｎｏ．２で１５秒間遠心した。得られた短時間の遠心または増加した／増強された重力沈降は、重力沈降として、必要に応じてより短い期間を生ずる。Ｎの百分率は５９．５％から８９．１％に増加した。第９Ｄ図に図解されているように、Ｌは３１．５％から５．７％に減少したが、Ｍは５．８％から０．５％に減少した。単一の集団または下位集団は、例えば、第９Ｅ図および第９Ｆ図に図解されているように、同一手法を使用して除去することができる。第９Ｅ図は、Ｌの１４０、Ｍの１４２、Ｎの１４４およびＥの１４６の対照全血集団を図解する。この実施例において、Ｎの１４４はサンプルおよび粒子の増強された重力回転を使用して除去される。Ｎは対照における６１．４％から第９Ｆ図において１４４’で示されているように０．７％に減少したが、残りの集団は比較的影響を受けない。本発明の主要な面は密な粒子の重力沈降に関する。しかしながら、増強された重力沈降を密度勾配系、例えば、フィコールにおいて細胞とともに使用することができ、この場合において、粒子は細胞および勾配系よりもわずかにより密であることが要求されるだけであろう。増強された重力沈降（回転）では、わずかにより密な粒子および粒子結合細胞をフィコール勾配系において分離することができるであろう。実施例１１沈降時間第１０Ａ図〜第１０Ｆ図は、表ＩＸに要約されている、本発明の種々の重力沈降時間の結果を含むヒストグラムドを図解する。３ｍｌの部分の同一全血集団のサンプルを４つの別々の管または容器に添加することによって、表ＩＸの結果は得られた。第１の管は対照管であり、そして他の３本の管の各々はそれらに添加された１２０μｌのＫＣ４８標識化粒子を有した。次いですべての４本の管を４分間転倒混合し、次いでそれぞれ４分、２時間および３時間の間重力沈降させた。次いで粒子の上のサンプル部分を取出し、混合し、分析した。次いで対照部分（第１０Ａ図、第１０Ｃ図および第１０Ｅ図）を、それぞれの消耗したサンプル（第１０Ｂ図、第１０Ｄ図および第１０Ｆ図）と比較した。図面および表ＩＸにより示されるように、対照部分の全血集団は４分から３時間の範囲にわたって事実上未変化であった。また、示すように、各沈降時間について消耗した部分は実質的に同一であった。４分の沈降サンプルについて、Ｎの１５０（第１０Ａ図）は４２．９％からＮの１５０’（第１０Ｂ図）の２．５％に減少した。同様に、２時間の沈降サンプルにおいて、Ｎの１５２（第１０Ｃ図）は４３．５％からＮの１５２’（第１０Ｄ図）の１．１％に減少した。３時間の沈降サンプルにおいて、Ｎの１５４（第１０Ｅ図）は４２．７％からＮの１５４’（第１０Ｆ図）の０．８％に減少した。実施例１２粒子の加熱第１１Ａ図〜第１１Ｃ図は、また、表Ｘにおいて示すように、非加熱１２３型 −Ｎｉ粒子と加熱した１２３型−Ｎｉ粒子との比較を図解する。再び、ＫＣ４８標識化粒子を使用して結果を得た。他の集団は比較的影響を受けなかったが、非加熱粒子（第１１Ｂ図）および加熱粒子（第１１Ｃ図）の結果は本質的に同一であった。抗体の吸着の前に、特に処理したサンプルの患者の中への再導入に使用するために、粒子を２５０℃に３時間加熱して安定化し（微生物を除去した）そして粒子からエンドトキシンを除去した。また、粒子の加熱は粒子の表面上に酸化物を形成することによって粒子からのＮｉイオンの可溶化を減少する。前述したように４分間混合した後、粒子を４分間沈降させた。Ｎの１５６（第１１Ａ図）は６１．８％から、非加熱粒子を使用したときＮの１５６’ （第１１Ｂ図）の１．４％に減少し、そして加熱した粒子を使用したときＮの１５６”（第１１Ｃ図）の１．７％に減少した。一般に、１２３型−Ｎｉ粒子は２５０℃〜２８０℃の範囲の温度に３〜４時間の範囲の間加熱することができる。加熱粒子および非加熱粒子の結果は本質的に同等であるので、他の実施例は反復されなかった。これらの実施例は非加熱粒子の使用を反映する。実施例１３移植のための改良された細胞調製物本発明の粒子は、また、骨髄調製物（ｐｒｅｐ）中の血小板を消耗させるために使用できる。慣用の骨髄プロセシング法を、表ＸＩに示されているような本発明の粒子除去技術と比較した。慣用の骨髄調製法は、フィコールの上の分離および引き続く再懸濁および血小板を除去するための３低速遠心を使用する収獲されたプロゲニター（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）の洗浄を使用する。慣用技術の実施例は、骨髄の融解後の２９％の回収を生じ、それらのうちの９５％は生活可能であり、そしてコロニー形成単位（ＣＦＵ）の５６％が回収された。対照的に、本発明の粒子の消耗は、非常により速くかつ複雑性が少なく、融解後の４６％の回収を生じ、９９％は生活可能であり、そしてＣＦＵの７１％が回収された。フィコール分離の前に、血小板は粒子で骨髄から分離された。これは慣用の遅い遠心洗浄を排除し、血小板／細胞の凝集を減少し、これによりＣＦＵ回収が増大された。表ＸＩに示す実施例において、３０ｍｌの骨髄を６００μｌのＰＬＴ−１標識化ニッケル粒子で消耗させ、各々４分間転倒混合し、沈降させた。次いでサンプルをフィコールの上で層状にし、次いで６００Ｇにおいて３０分間遠心した。次いで界面を収獲し、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ＋０．０５％ＢＳＡ中の遠心により濃縮した。回収された細胞を培地ＲＰＭＩ１６００＋１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）の中に再懸濁させた。次いでプロセシングしたサンプルを凍結させ、融解して慣用技術と比較した。それ以上のＣＦＵ濃縮として、１５μｌのＫＣ４８粒子、５０μｌのＴ１１粒子、５０μｌのＢ１およびＢ４標識化粒子、および５０μｌのＭＹ４およびＭＹ９標識化粒子で標識された粒子を使用して、小さい部分（１．３ｍｌ）の第１の血小板消耗骨髄のサンプルをさらに消耗させた。これは実質的にすべての系列陽性（成熟）細胞を骨髄から除去した。成熟細胞を消耗させることによって、高度に濃縮された集団のプロゲニター／幹細胞（ＣＦＵ）を分析のために回収した。凍結前にサンプルにおいて得られたＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球、単球）／１０⁵細胞は、慣用ｐｒｅｐを使用したとき１４３ＣＦＵ−ＧＭであり、そして本発明の粒子血小板消耗を使用したとき１４７ＣＦＵ−ＧＭであったが、本発明のそれ以上の粒子系列消耗を使用したとき６２０ＣＦＵ−ＧＭであった。実施例１４凍結乾燥された粒子表ＸＩＩに示すように、本発明の凍結乾燥された粒子は、また、ＮおよびＰＬＴの消耗において有効であった。２組の粒子、すなわち、ＫＣ４８で標識化された粒子およびＰＬＴ−１で標識化された粒子を組合わせてＮおよびＰＬＴを消耗させた。結論すると、凍結乾燥粒子は非凍結乾燥粒子と同程度に有効であるように見える。凍結乾燥粒子は粒子を溶液中に維持することが不必要であるので、キットまたは他の用途において使用することができる。実施例１５クラスＩＩ集団の除去表ＸＩＩＩに示すように、１３および／または１２抗体を用いて、ＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ陽性細胞、例えば、Ｂ細胞を全血から除去するために、粒子１４を使用することができる。１２および１３抗体の双方は、第２図に図解されているように、単一のニッケル粒子１４に結合した。ここで第１２図を参照すると、本発明による選択の方法および装置の第２態様は全体的に参照数字１６０で表示されている。第１図における選択装置１０に関して説明したように、選択装置１６０は同一の工程および要素１２〜３０を含む。さらに、選択装置１６０は追加の除去工程１６２を含む。除去工程１６２は、工程２４においてサンプル部分から前もって除去された細胞の集団または下位集団の残留細胞の除去を含むことができ、および／またはサンプル部分から除去しようとする１または２以上の異なる集団または下位集団の除去を含むことができる。分離工程２４からの増強または濃縮された集団または下位集団を含む、上清またはその一部分をライン１６４を経て除去工程１６２に供給し、この除去工程は第１図における選択装置１０に関して説明した工程と実質的に同一であることができる。追加の除去工程１６２が完結したとき、それ以上の濃縮された集団または下位集団を含む得られるサンプルの上清を再び分離工程１６６において粒子１４から分離することができる。再び、濃縮された集団または下位集団をそのまま研究するか、または、例えば、ライン１６８で示すように工程１６２および１５６を反復することによって、さらに濃縮することができる。再び、残留するか、または異なる集団または下位集団を必要に応じて得られるサンプルから除去することができる。実施例１６妨害性集団表ＸＩＶに示すように、妨害する１または２以上の集団または下位集団を分離工程２４において除去し、次いで工程１６２および１６６において残留する集団または下位集団の陽性または陰性の選択を実施することができる。例えば、問題の集団が非常に後期の抗原（ＶＬＡ）のベータ鎖（これは接着分子である）である場合、Ｌ、ＭおよびＰＬＴは妨害性集団である。Ｌ、ＭおよびＰＬＴの各々はＶＬＡを有し、したがってすべてはＣＤ２９（４Ｂ４）抗体に対して陽性であるので、それらは妨害性である。したがって、４Ｂ４粒子を使用するとき、ＰＬＴは所望の（非ＰＬＴ）集団の陽性および陰性の双方の選択を妨害する。全血サンプルからのＰＬＴの除去および非除去の効果を表ＸＩＶに示す。表ＸＩＶから理解できるように、多数のＰＬＴ（数が他の４Ｂ４陽性集団よりもかなり大きい）はＭの消耗（または選択）を妨害し、４Ｂ４粒子の除去後２．７の百分率を生ずる。したがって、ＰＬＴは５０μｌ／ｍｌの全血の濃度において第１組のＣＤ４１粒子１４で最初に除去される。次いで４Ｂ４陽性細胞は順次に第２組の粒子１４で、再び５０μｌ／ｍｌの全血の濃度において、除去される。妨害性ＰＬＴは実質的に減少されるので、４Ｂ４粒子はここでＭを０．２％に減少させることができる。また、ＰＬＴの除去は使用する４Ｂ４の数（濃度）をより低くすることができる。実施例１７多数の選択ラウンド本発明の技術により濃縮された特定の下位集団の高い回収百分率は、例えば、Ｔ４について、表ＸＶに示されている。消耗または選択のラウンドの数は数または除去すべき集団または下位集団において制限されない。表における消耗の数に関すると、下記の集団および／または下位集団を、それぞれの消耗において、１０ｍｌの全血のもとのサンプルから除去した。消耗Ｎｏ．１はＣＤ１５（ＫＣ−４８）、ＣＤ４１（ＰＬＴ−１）、ＣＤ２０（Ｂ１）、ＣＤ８（Ｔ８）およびＣＤ１４（ＭＹ４Ａ）であった。消耗Ｎｏ．２および３はＣＤ８およびＣＤ１４であった。消耗Ｎｏ．４および５はＣＤ１５であったが、消耗Ｎｏ．６はＣＤ１５、ＣＤ８およびＣＤ１４であった。前述したように、集団または下位集団は順次にまたは一度に除去することができる。この実施例において、各抗体を別々の組の粒子１４に結合し、次いですべての組を各消耗について１つの除去操作において一緒に使用した。表ＸＶから明瞭に理解できるように、Ｔ４下位集団は４７．８％から約７１％に増強され、絶対計数は６消耗ラウンド後に６６９から６４１または約９６％の回収率にわずかに減少しただけであった。Ｔ８は３消耗ラウンド後に完全に除去されたが、ＰＬＴは１消耗ラウンドにおいて９０％より多く減少された。実施例１８Ｂ細胞調製物全血からＢ細胞の調製または増強を表ＸＶＩに示す。この調製において、まずバッフィーコートをヘパリン全血サンプルから調製し、ＰＢＳで１回洗浄した。第１の消耗はＣＤ１５（ＫＣ４８）およびＣＤ４１（ＰＬＴ−１）であった。第２の消耗はＣＤ７（３Ａ１）およびＣＤ５（Ｔ１）について単一のＧＡＭ粒子上の間接的抗体標識を使用した。第３の消耗は、再び、ＣＤ１４（ＭＹ４Ａ）およびＣＤ３３（ＭＹ９）について単一のＧＡＭ粒子を使用した。この調製物はＢ細胞を５１６から５４５に増強した（統計学的変動）が、他の消耗された集団の各々を９１％より多く減少させた。Ｇまたは顆粒球はＮおよびＥを含む。本発明の多数の変更および変化は上記の教示に照らして可能である。したがって、添付した請求の範囲の範囲内で、本発明は特定的に記載した以外の方法において実施できることを理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４１Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４１Ａ 33/553 33/553 (72)発明者ツバーナー，ロバートケイ. アメリカ合衆国，フロリダ 33330，フォートローダーレール，サウスウエストワンハンドレットサーティサードアベニュ 4811 (72)発明者シュミッティング，ロバートジェイ. アメリカ合衆国，フロリダ 33328，クーパーシティ，サウスウエストワンハンドレットアンドファーストテラス 5110 (72)発明者ラッセル，トーマスアール. アメリカ合衆国，フロリダ 33186，マイアミ，サウスウエストワンハンドレットイレブンスストリート 14000

Claims

【特許請求の範囲】１．流体サンプル中の問題の細胞の選択された集団または下位集団を増強する方法であって、分別重力沈降を行うために十分な密度を有する複数の粒子を供し、ここで前記粒子はクラスＩＩの細胞または生物学的粒子の少なくとも１つの前もって選択された集団または下位集団に特異的に結合する反応成分をそれらに結合して有し、少なくとも１ｍｌの体積を有する前記サンプルの一部分を前記粒子と混合して、増強すべき前記集団または下位集団を実質的に物理的に損傷させないで、前記粒子を前記前もって選択された集団または下位集団に結合させ、前記サンプルの部分中の前記結合した集団または下位集団を有する前記粒子を分別重力沈降させ、そして前記増強された集団または下位集団を含む前記サンプルの部分の生ずる上清の少なくとも一部分を前記粒子および前記結合した集団または下位集団から分離することを含む方法。２．流体サンプル中の問題の細胞の選択された集団または下位集団を増強する方法であって、分別重力沈降を行うために十分な密度を有する複数の粒子を供し、ここで前記粒子はポリクローナル抗体をそれらに結合して有し、ここで細胞または生物学的粒子の少なくとも１つの前もって選択された集団または下位集団に特異的に結合する反応成分が前記ポリクローナル抗体に結合しており、少なくとも１ｍｌの体積を有する前記サンプルの一部分を前記粒子と混合して、増強すべき前記集団または下位集団を実質的に物理的に損傷させないで、前記粒子を前記前もって選択された集団または下位集団に結合させ、前記サンプルの部分中の前記結合した集団または下位集団を有する前記粒子を分別重力沈降させ、そして前記増強された集団または下位集団を含む前記サンプルの部分の生ずる上清の少なくとも一部分を前記粒子および前記結合した集団または下位集団から分離することを含む方法。３．流体サンプル中の問題の細胞の選択された集団又は下位集団を増強する方法であって、分別重力沈降を行うために十分な密度を有する複数の粒子を供し、ここで前記粒子は細胞または生物学的粒子の少なくとも１つの前もって選択された集団または下位集団に特異的に結合する反応成分をそれらに結合および固定して有し、少なくとも１ｍｌの体積を有する流体サンプルの一部分を前記粒子と混合して、増強すべき前記集団または下位集団を実質的に物理的に損傷させないで、前記粒子を前記前もって選択された集団または下位集団に結合させ、前記サンプルの部分中の前記結合した集団または下位集団を有する前記粒子を分別重力沈降させ、そして前記増強された集団または下位集団を含む前記サンプルの部分の生ずる上清の少なくとも一部分を前記粒子および前記結合した集団または下位集団から分離することを含む方法。４．複数の細胞の集団を有する流体サンプル中の問題の細胞の選択された集団又は下位集団を増強する方法であって、分別重力沈降を行うために十分な密度を有する複数の粒子を供し、ここで前記粒子は少なくとも１つの前もって選択された問題でない集団または下位集団の細胞または生物学的粒子に特異的に結合する反応成分をそれらに結合して有し、前記サンプルの一部分を前記粒子と混合して、前記問題の選択された集団または下位集団の細胞を実質的に物理的に損傷させないで、前記粒子を前記前もって選択された集団または下位集団の前記細胞または生物学的粒子に結合させ、前記サンプルの部分中の前記結合した集団または下位集団の細胞を有する前記粒子を分別重力沈降させ、前記問題の選択された集団または下位集団の前記細胞を含む前記サンプルの部分の生ずる上清の少なくとも一部分を、前記粒子および前記結合した集団または下位集団の細胞または生物学的粒子から除去し、分別重力沈降を行うために十分な密度を有する第２の複数の粒子を供し、ここで前記粒子は少なくとも１つの問題でない前もって選択された集団または下位集団の細胞または生物学的粒子に特異的に結合する反応成分をそれらに結合して有し、問題の前記選択された集団または下位集団の細胞を含む前記サンプルの部分の前記除去された上清の少なくとも一部分を前記第２の複数の粒子と混合して、問題の前記選択された集団または下位集団の前記細胞を実質的に物理的に損傷させないで、前記第２の複数の粒子を前記第２の前もって選択された集団または下位集団の前記細胞または生物学的粒子に結合させ、前記上清のサンプルの部分中の前記結合した集団または下位集団の細胞または生物学的粒子を有する前記第２組の粒子を分別重力沈降させ、そして前記問題の選択された集団または下位集団の細胞を含む生ずる第２の上清の少なくとも一部分を、前記第２組の粒子および前記結合した集団または下位集団の細胞または生物学的粒子から除去し、そして前記上清のサンプルの部分の中に本来存在する前記選択された集団または下位集団の少なくとも５０％を回収することを含む方法。