JP2000500648A - ニューロペプチドｙ−ｙ５受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はヒト、マウスおよびラットＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子を提供する。これらの単離されたＤＮＡ分子を用いて細胞中にＮＰＹ−Ｙ５受容体を発現させ、次に該受容体を用いてＮＰＹアゴニストおよびアンタゴニスト活性について化合物をスクリーニングすることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ニューロペプチドＹ−Ｙ５受容体 本発明は、ニューロペプチドＹ−Ｙ５受容体をコードする単離されたＤＮＡ分 子に関する。さらに、本発明は組換え技術を用いたニューロペプチドＹ−Ｙ５受 容体の生産における上記分子の使用、およびニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）アゴ ニストまたはアンタゴニスト活性に関して化合物をスクリーニングし、試験する 方法に関する。 発展した豊かな国においては、肥満の蔓延は驚くほどである。肥満は社会的に 不利であるばかりでなく、いまや罹病率および死亡率に大きく寄与している。腹 部における脂肪沈積は、11型糖尿病および心臓血管性疾患の危険と関連して特に 問題である。しかし最近まで、食欲、エネルギー消費および肥満をコントロール する分子的作用機序は驚くほど誤って理解されてきた。 肥満は、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、高血圧症、脂血症、およ び冠状動脈性心臓疾患と関連していることは周知であり、またそれほど明白でな いが変形性関節症等の疾患および種々の悪性疾患と関連を有する。肥満はまた、 運動性の低下および生活の質の低下を通じて重要な問題を引き起こす。単一遺伝 子の突然変異によって決定される齧歯動物の肥満の７つの形が同定されている。 すなわち、マウスにおけるイエロー[Ay]、脂肪の多い(adipose)[Ad]、糖尿病[db ]、太った[fat]、丸々と太った(tubby)[tub]および肥満[ob]、ならびにラットに おける脂肪質[fa]である。これらの突然変異によって引き起こされる肥満表現型 は、発症年齢、重篤度およびインスリン依存性の程度において異なる。肥満した ヒトにおいても類似の表現型が見られる。最近、これらの突然変異のいくつかに ついて分子的基礎が解明された。これらのうち、[ob]遺伝子産物である「レプチ ン(leptin)」は、最大の関心を呼び起こした。しかし、エネルギーバランスおよ び身体の脂肪分布の調節には他の多くの因子もまた関与している。４つの因子が 重要な役割を有している可能性が高いと思われる。その因子とは、ニューロペプ チドＹ（ＮＰＹ）、副腎皮質刺激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）／ＡＣＴＨ／グ ルココルチコイド、インスリンおよびガラニン(galanin)である。特にＮＹＰお よびその受容体は食欲の調節、およびそれに関連して肥満に重要な役割を果たす 。 ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）は、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）およびペプチド ＹＹ（ＰＹＹ）と共に１つのファミリー（膵臓ポリペプチドファミリーと呼ばれ る）を形成する。これらのポリペプチドは全て３６個のアミノ酸から成り、そし て共通の三次構造を有する。ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）受容体は、Ｇタンパ ク質共役受容体スーパーファミリーのメンバーであり、哺乳動物の神経系に最も 豊富に存在するペプチドの１つによって活性化され、そして精神運動活性、中枢 内分泌物分泌、不安、生殖への作用、心臓血管系への血管作用性作用、および最 も重要なものとして食欲への強力な作用を含めて、多様な範囲の重要な生理学的 パラメーターに影響を及ぼす。多数のニューロペプチドおよび古典的神経伝達物 質（ノルアドレナリンおよびセロトニンを含む）は、食物摂取挙動を変調する。 しかし、ＮＰＹは肥満を引き起こすことができるという点で食物摂取に対する実 験的効果において多くの神経伝達物質からきわ立っている。室傍核(paraventric ular nucleus)(ＰＶＮ)にＮＰＹを注射すると、用量依存的にラットの食物およ び飲物摂取挙動を増大させることが示された。ＮＰＹの１回の注射が数時間にわ たって食物摂取を数倍増大させることが可能であり、そしてラットが通常は殆ど 食物をとらない明期においても、またすでに飽食するまで食べたラットにおいて も、効果的である。したがって、ＮＰＹペプチドは食物を剥奪された動物におい ても飽食した動物においても公知の最も強力な食欲促進物質の１つである。ＰＶ Ｎに繰り返しＮＰＹを注射すると、大量でかつ持続的な食物摂取応答をもたらし 、最終的にラットは体脂肪含有量の真の増加を伴う肥満となる。食欲／肥満調節 の媒介物としてのＮＰＹの重要性は、obese遺伝子産物であるレプチンがＮＰＹ の合成および放出を阻害するというごく最近の報告によってさらに強められる。 室傍核へのＮＰＹの注射は、血漿ＡＣＴＨレベルの迅速でかつ強い上昇を引き 起こす。そして、ＮＰＹに誘導されるＡＣＴＨ分泌は副腎皮質刺激ホルモン放出 因子（ＣＲＦ）によって媒介されるという明白な証拠が存在する。しかし、脳内 におけるＮＰＹの作用機構およびＣＲＦとの相互作用は、他のホルモン（例えば インスリン）との相互関係と同様、殆ど分かっていない。しかし、食欲を増進さ せ、グルココルチコイドレベルを上昇させる作用物質は、主要な肥満を発生させ る上で重要であろう。 したがって、ＮＰＹの特異的アゴニストおよびアンタゴニストは、広範な臨床 障害の療法にとって実質的に有益であると思われる。ＮＰＹはコンパクトな三次 構造を有し、また異なるサブタイプの受容体との相互作用には分子の異なる部分 が必要とされるので、アゴニストおよびアンタゴニスト両者の理論的開発は特異 的な受容体構造の利用可能性および知識に決定的に依存する。 ＮＰＹは少なくとも５つの受容体、すなわちＹ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４およびＹ １様（または「非定型Ｙ１」）受容体と特異的に結合することが現在知られてい る。ＮＰＹ受容体はアデニル酸シクラーゼ二次メッセンジャー系とカップリング することが示されているが、ホスファチジルイノシトール代謝回転、カチオンお よびアラキドン酸もまたＮＰＹの二次メッセンジャーとして機能しうるという証 拠があるので、さらなるＮＰＹ受容体サブタイプが存在する可能性が残っている 。 ＮＰＹアゴニストおよびアンタゴニストは、例えば可能性のある抗高血圧剤、 心臓血管薬、神経成長因子、抗精神病薬、抗肥満剤および抗糖尿病剤として商業 的価値を有し得るので、組換えＤＮＡ技術によってＮＰＹ受容体を生産できるこ とは好都合であろう。この目的のため、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３およびＹ４をコードす るＤＮＡ分子が以前に単離された。 本発明者らはこの度、ヒト、マウスおよびラットＹ１様（以後ＮＰＹ−Ｙ５と 称する）受容体をコードする新規なＤＮＡ分子を単離した。ヒトおよびラットＮ ＰＹ−Ｙ５をコードする類似のＤＮＡ分子が国際（ＰＣＴ）特許明細書WO 96/16 542に記載されているが、これらはヒトＮＰＹ−Ｙ５の場合であればＮ末端に付 加的な10アミノ酸を、ラットＮＰＹ−Ｙ５の場合であればＮ末端に付加的な11ア ミノ酸を有する受容体をコードしている。数個のｃＤＮＡクローンの分析ならび にイントロンおよびエキソン配列に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを 行なった結果、本発明者らはヒト、マウスおよびラットのＮＰＹ−Ｙ５受容体は これらの付加的10/11アミノ酸を含まないことを確認した。したがって、WO 96/1 6542に記載のＤＮＡ分子は、本発明ＤＮＡ分子よりも低い発現率を示すであろ う。さらに、WO 96/16542に記載のＤＮＡ分子によってコードされる受容体は、 より低い、そして恐らく変更された活性を示すであろう。 したがって、本発明はその第１の局面において、約445アミノ酸を有するＮＰ Ｙ−Ｙ５受容体または機能的に等価なその断片をコードする単離されたＤＮＡ分 子を提供する。 好ましくは、この単離されたＤＮＡ分子はヒト、マウスまたはラットのＮＰＹ −Ｙ５受容体をコードする。 最も好ましくは、この単離されたＤＮＡ分子は下記に示すヌクレオチド配列と 実質的に一致した、または少なくとも＞80%（より好ましくは＞95%）相同のヌク レオチド配列を有する： (i) 図１のヌクレオチド6291から7625、 (ii) 図２のヌクレオチド63から1397、 (iii)図３のヌクレオチド115から1449、または (iv) 図４のヌクレオチド73から1470。 この単離されたＤＮＡ分子をプラスミドまたは発現ベクターに組み込み、次に これを適切な細菌、酵母および哺乳動物宿主細胞に導入することができる。この ような宿主細胞を用いて、その単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＮＰ Ｙ−Ｙ５受容体を発現させることができる。 したがって、第２の局面において、本発明は第１の局面のＤＮＡ分子によって 形質転換された哺乳動物、酵母または細菌宿主細胞を提供する。 第３の局面において、本発明はそのＤＮＡ分子の発現を可能とする条件下で第 ２の局面の宿主細胞を培養する工程、及び必要に応じてＮＰＹ−Ｙ５受容体を回 収する工程を包含する、ＮＰＹ−Ｙ５受容体の生産方法を提供する。 好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞または細菌細胞である。細胞が哺乳動物 細胞である場合は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓 293細胞または昆虫Ｓｆ９細胞であることが好ましい。 好ましい実施態様においては、ＮＰＹ−Ｙ５受容体は宿主細胞の表面に発現さ れる。 本発明のＤＮＡ分子はＮＰＹ受容体を表す。この受容体は身体の多数の領域に おいて発現され、そしてＮＰＹは多くの系に影響を及ぼすので、その受容体は臨 床的にも商業的にも興味がもたれ得る。 本発明の核酸分子を用いることにより、ニューロペプチドＹ−Ｙ５受容体タン パク質を実質的に純粋な形で得ることが可能である。 したがって第４の局面として、本発明はＮＰＹ−Ｙ５受容体を実質的に純粋な 形で提供する。 好ましくは、精製されたＮＰＹ−Ｙ５は図５に示すアミノ酸配列のいずれか１ つに実質的に一致するアミノ酸配列を有する。 第５の局面において、本発明はＮＰＹ−Ｙ５受容体に特異的に結合することが できる抗体を提供する。 第６の局面において、本発明は本発明の第１の局面のＤＮＡ分子によって形質 転換された非ヒト動物を提供する。 第７の局面において本発明は、ＮＰＹ−Ｙ５受容体の活性化を可能とする条件 下でＮＰＹ−Ｙ５受容体、または第１の局面のＤＮＡ分子によって形質転換され これを発現する細胞を試験作用物質と接触させる工程、及びＮＰＹ−Ｙ５受容体 活性の増大または減少を検出する工程を包含する、ＮＰＹ−Ｙ５受容体のアゴニ ストまたはアンタゴニスト作用物質を検出する方法を提供する。 さらなる局面において本発明は、第１の局面のＤＮＡ分子内の独特な配列に特 異的にハイブリダイズすることができる、10個以上のヌクレオチドからなるヌク レオチド配列を含む核酸プローブを提供する。 さらなる局面において本発明は、ＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードするｍＲＮＡ分 子に特異的にハイブリダイズして該ｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止することができる ヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸分子を提供する。このようなアンチセ ンス核酸分子は、自らがそこにハイブリダイズするｍＲＮＡを触媒的に不活性化 するリボザイム領域を含むことができる。 図１および２に示すヌクレオチド配列に関連して本明細書に使用する「実質的 に一致する」という表現は、遺伝暗号の縮重によってコードされるタンパク質に は変化をもたらさない、ヌクレオチド配列における重要でない変異を包含するこ とを意図している。さらに、この表現は特定の系において発現を促進させるため に必要とされうるが、コードされるタンパク質の生物活性の低下をもたらさない 、その配列における他の重要でない変異を包含することを意図している。 アミノ酸配列との関連において本明細書に使用する「実質的に一致する」とい う表現は、ＮＰＹ−Ｙ５受容体の生物活性の低下をもたらさない、アミノ酸配列 における重要でない変異を包含することを意図している。これらの変異はアミノ 酸の保存的置換を含みうる。想定される置換は： Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ； Ｄ、Ｅ； Ｎ、Ｑ； Ｓ、Ｔ； Ｋ、Ｒ、Ｈ； Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ；およびＰ、Ｎα-アルカルアミノ酸(alkalamino acid)である 。 下記の非限定的実施例およびさらに添付の図に言及しながら本発明を以下に説 明する。図面の簡単な説明 図１は、ヒトＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードするゲノムＤＮＡ分子のヌクレオチ ド配列を示し、予測されるアミノ酸配列をも含む。 図２は、ヒトＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を 示し、予測されるアミノ酸配列をも含む。 図３は、ラットＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列 を示し、予測されるアミノ酸配列をも含む。 図４は、マウスＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードするゲノムＤＮＡ分子のヌクレオ チド配列を示し、予測されるアミノ酸配列をも含む。 図５は、ヒト、マウスおよびラットＮＰＹ−Ｙ５受容体タンパク質の予測され るアミノ酸配列間の同一性の程度を示す。 図６a〜fは、ＮＰＹ−Ｙ５を発現するＣＨＯ細胞を用いて実施した結合アッセ イの結果を示すグラフである。アッセイしたＹ５リガンドは、ＮＰＹ、Leu 31 P ro 34 NPY、ＰＰ、ＰＹＹ、NPY 2-36およびPYY 13-36であった。 図７は、ＮＰＹ−Ｙ５を発現するＣＨＯ細胞において、リガンドＮＰＹ、Leu3 1 Pro 34 NPY、ＰＰ、ＰＹＹおよびNPY 2-36を用いて実施したｃＡＭＰアッセイ の結果を示すグラフである。実施例 実験手順 ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーのスクリーニング ヒトＮＰＹ−Ｙ１遺伝子のエキソン１Ｃに隣接する632 bpの³²Ｐ標識化EcoRI/ Pst1断片を用いて、ヒトゲノムＰ１ ＤＮＡライブラリー（Genome-Systems）、 ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー(P．Seeburg，University of Heidelberg)およ びラット視床下部ｃＤＮＡライブラリー(Stratagene)をスクリーニングした。6x SSC、5xデンハート溶液、0.1% SDSおよび100mg/mlの変性し、剪断したサケ精子 ＤＮＡを含有する溶液中で、上記プローブとのハイブリダイゼーションを60℃で 16時間実施した。2xSSC/0.1% SDSを用いて60℃でフィルターを15分間２回洗浄し 、次に0.1xSSC/0.1% SDSを用いて60℃でフィルターを15分間洗浄し、増感板を用 いて70℃で16時間Ｘ線フィルム(Kodak，X-Omat)に暴露した。陽性クローン由来 のＰ１ ＤＮＡを製造者のプロトコールにしたがって単離した。次いで、このＤ ＮＡをEcoRI、HindIII、BamHIおよびPstIで消化し、ヒトＹ１およびＹ５遺伝子 のすべてをカバーするクローンを生じるように、Bluescript SK ベクター(Strat agene)にサブクローン化した。ヌクレオチド配列の決定 スーパーコイルプラスミドＤＮＡをアルカリ変性し、T7ポリメラーゼ(Promega )を用いてジデオキシチェーンターミネーション法(Sambrookら，1992)により配 列決定した。オリゴヌクレオチドプライマーは、最初はベクターの両側の領域に 相補的なものを用い、次いで配列分析を完成させるために得られた配列に基づい たものを用いた。制限酵素地図の決定 制限酵素EcoRI、BamHI、HindIIIを単独および可能なあらゆる組合せで用いて Ｐ１ ＤＮＡを消化し、0.8%アガロースゲルを用いて電気泳動にかけ、アルカリ 変性し(0.4M NaOH)、0.4M NaOHを用いてHybond N⁺メンブレーンに毛管転写し 、数個の特定のオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡおよび上記のサブクローン化によ って得たゲノムＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。In situ ハイブリダイゼーション分析 DIG ＲＮＡラベリングキット(SP6/T7)(Boehringer Mannheim)を用いてヒトＮ ＰＹ−Ｙ５受容体に対するセンスおよびアンチセンスリボプローブを合成した。 ヒトＮＰＹ−Ｙ５受容体のコード領域に対応するｃＤＮＡを線状化し、T7（アン チセンスリボプローブ用）またはSP6（センスリボプローブ用）ＲＮＡポリメラ ーゼのいずれかを製造者の指示にしたがって用いて、ジゴキシゲニン標識化dUTP を用いて転写した。 神経性疾患をもたない若い成人男性から死後脳組織を得た。特定の脳領域を解 剖し、ホルマリンに36時間浸漬することにより固定し、パラフィンに包埋した。 ６mmの連続した切片をスライド上に集め、クロムミョウバンを塗り、使用時まで ４℃で保存した。Histoclear（National Diagnostics）中で切片を５分間脱ワッ クスし、100%、70%および50%アルコール中で各２分間再水和化し、次にリン酸緩 衝化生理食塩水(PBS)を用いて５分間洗浄した。 ５mg/mlプロテイナーゼＫ(Boehringer Mannheim)を用いて、50mM Tris，pH7.5 ，５mM EDTA中で切片を室温で10分間前処理した。次に、切片を0.1M グリシン(P BSに溶解)を用いて２分間２回洗浄し、PBSで１回洗浄し、次にハイブリダイゼー ション緩衝液[2xSSPE、50%ホルムアミド、5%デキストラン硫酸、1xデンハート試 薬、100mg/ml tRNA型 X-SA(Sigma)]中で室温で１時間インキュベートした。75μ lのハイブリダイゼーション緩衝液に溶解したセンスおよびアンチセンスＤＮＡ に対するジゴキシゲニン標識化リボプローブ(500ng)を上記切片に加え、42℃で1 8時間、湿環境下で、Hybaid Omnislide PCR Thermal Cycler（Integrated Scien ces）を用いてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、切片を室温 で洗浄し、2xクエン酸ナトリウム生理食塩水(SSC)緩衝液（0.15M NaCl/0.015Mク エン酸ナトリウム、pH7.0）を用いて10分間室温で洗浄し、次に0.2xSSCを用いて 30分間洗浄した。その後、10mM Tris，pH7.5，15mM NaClに溶解した20mg/ml Ｒ Ｎase(Sigma)を用いて切片を室温で15分間処理した。Ｒ Ｎase処理後、2xSSCを用いて室温で５分間スライドを洗浄し、次に0.2xSSCを用 いて37℃で30分間洗浄した。 組織を緩衝液Ａ（100mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl）で10分間洗浄し、2% ブロッキング溶液(Boehringer Mannheim)、0.3% Triton X-100と共に緩衝液Ａ中 で30分間インキュベートすることにより、免疫学的検出のために処理した。次に 、アルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗血清（Boehringer Mannheim 、緩衝液Ａおよび0.5%ブロッキング試薬を用いて1/500に希釈）と共に切片を２ 時間インキュベートし、緩衝液Ａを用いて各５分間２回洗浄し、その後100mM Tr is-HCl，pH9.5，100mM NaCl，50mM MgCl₂で２分間洗浄した。基質としてニトロ ブルーテトラゾリウムおよびブロモクロロインドイルホスフェートを用いて、標 識化プローブを18時間暗中で可視化した。10mM Tris-HCl，pH8.0，１mM EDTAを 用いて切片を10分間洗浄し、次に蒸留水を用いて３回素早く洗浄し、Aquamount[ Gurr]を用いてマウントし、Nomarsky光学素子を備えたZeiss Axiophot顕微鏡で ブルーのフィルターを用いて検査した。ＮＰＹ Ｙ５の発現 ラットＹ５受容体タンパク質を以下のように発現させた。すなわち、ラットＮ ＰＹ Ｙ５ ｃＤＮＡの全コード領域および全３’非翻訳領域の殆どを含む1.9k b断片をpPRC/CMVベクター（Invitrogen）にサブクローン化することにより、哺 乳動物用発現構築物rpHz17を作製した。この構築物は、CMVプロモーターの制御 下にあり、そして選択のためネオマイシン遺伝子を含む。改変したリン酸カルシ ウムトランスフェクション法を用いて、この発現構築物rpHz17を哺乳動物細胞系 CHO-K1およびHEKにトランスフェクトした。ＮＰＹ−Ｙ５結合アッセイ ＮＰＹ−Ｙ５受容体のコード領域をpRC/CMV発現ベクター中にサブクローン化 し、改変したリン酸カルシウムトランスフェクション法を用いてチャイニーズハ ムスター卵巣(CHO)K1細胞系にトランスフェクトした。CHO細胞を5%ＣＯ₂のもと で、２mMグルタミンおよび10%ウシ胎児血清を含む、ダルベッコ改変イーグ ル培地(EMEM)/ハム(Ham)F-12培地(1:1)中で維持した。ネオマイシンを用いて安 定にトランスフェクトされた細胞を選択し、ＮＰＹ／ＰＹＹアナログに結合する 能力を試験した。トランスフェクトされた細胞(1x10⁶個)を0.5mlのアッセイ緩衝 液［50mM Tris-HCl，pH7.4，2mM CaCl₂，5mM KCl，120mM NaCl，1mM MgCl₂，0.1 %ウシ血清アルブミン］中で、0.05nM¹²⁵I標識化ＮＰＹおよび徐々に濃度を上げ たヒトＮＰＹおよび関連ペプチドの存在下で、インキュベートした。細胞は15℃ で３時間インキュベートし、次に0.5mlのウマ血清上に重層してから４分間微小 遠心機にかけペレット化した。γカウンターを用いて１分間放射能を測定した。 ＮＰＹ−Ｙ５受容体を発現するCHO細胞を用いた結合アッセイの結果を、特異的 に結合した放射標識ＮＰＹの最大値に対する百分率として表１に示す。これらの 結果は、３組の点をもつ３つの独立した結合曲線に由来するプールされたデータ である。 ｃＡＭＰアッセイ ＮＰＹ−Ｙ５受容体を発現するCHO細胞を増殖させ、150cm³のフラスコ中で、 ２mM L-グルタミンおよび10%(v/v)ウシ胎児血清を含む、ダルベッコ改変イーグ ル培地：ハムF-12培地(1:1 v/v)で、37℃で10%ＣＯ₂雰囲気下で、湿潤空気中で 維持した。細胞がコンフルエンスに達したならば、24ウエルクラスターディッシ ュを用いて実験をおこなった。フォルスコリン(forskolin)刺激[³H]-ｃＡＭＰ蓄積の阻害 ウエルあたり１mlの、[³H]-アデニン(74kBq/ウエル）を含有するHEPES緩衝化 ハンク溶液(HBH; 20mM，pH7.4)中で細胞単一層を37℃で2時間インキュベートし た。アゴニストの添加に先立って、ウエルあたり１mlの、ホスホジエステラーゼ 阻害剤Ro 20-1724を含有するHBH中で細胞を30分間インキュベートした。フォル スコリン(10μM)の添加後、アゴニスト(10μlのHBHに溶解）をアッセイ系に添加 し、インキュベーションを10分間継続した。これらの操作の間、インキュベーシ ョン培地の温度は37℃に維持した。各ウエルに50μlの濃塩酸を加えてインキュ ベーションを終止させ、細胞を溶解させた。各ウエル由来の上清緩衝液中の[³H] -ｃＡＭＰを連続イオン排除Dowex-アルミナクロマトグラフィーによって単離し た。乳化剤シンチレーター(15ml)の添加後、液体シンチレーション計測によって 放射能を測定した。結果を表２に示す。 結果 ＮＰＹ−Ｙ５受容体遺伝子の同定 ヒトＮＰＹ−Ｙ１受容体遺伝子の５’上流領域のクローン化および特徴付けは 、Ｙ１遺伝子の数個の別個な５’エキソンの存在を確認(Ballら、1995)すると共 に、エキソン１Ｃにおいて方向が逆向きの部分的オープンリーディングフレーム を含む、Ｇタンパク質共役受容体と広範な相同性を有する領域を明らかにした。 第３細胞内ループおよび膜貫通ドメインVIおよびVIIの部分を含むこの200アミノ 酸配列をGenbankデータベースと比較した結果、37%同一性を有する最も密 接に関連する受容体としてヒトＮＰＹ−Ｙ１受容体が同定された。Ｙ１遺伝子の エキソン１Ｃおよびエキソン１Ｂの間の全7kbの領域をサブクローン化し、配列 決定することにより、Ｙ５と称する新規なＮＰＹ受容体サブタイプをコードする 遺伝子の存在が確認された（図１）。632bpヒトゲノムＹ５断片を用いて高スト リンジェンシー条件下でヒト胎児脳およびラット視床下部ｃＤＮＡライブラリー をスクリーニングすることにより、両方の種について全長ｃＤＮＡクローンが同 定した。これらの配列は、長さが445アミノ酸のＹ５受容体をコードしていた（ 図２および３）。ヒトゲノム配列（図１）は２個のイニシエーターＡＴＧコドン 候補を示しているが、数個のｃＤＮＡクローンの解析ならびにイントロンおよび エキソン配列に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、これらＡＴＧ コドンの一方（他のＡＴＧの30ヌクレオチド上流に位置する）がイントロン内に 位置することが立証された。この訂正を行なった後のヒトおよびラットＮＰＹ− Ｙ５受容体間の全般的同一性は89%である。図５はヒトおよびラットＮＰＹ−Ｙ ５受容体の予想されるアミノ酸配列の間の同一性の程度を示す。 ヒトＹ５遺伝子の５’非翻訳領域をコードするエキソンは、2.7kbのイントロ ンによってエキソン２から隔てられ、ＮＰＹ−Ｙ１遺伝子のエキソン１Ｂの約2. 8kb上流に位置している。反対方向を向いた、これら２つの５’エキソンの顕著 な近接性は、共通のプロモーター領域を介する両遺伝子の転写の同時調節の可能 性を示唆している。 しかし、ヒトＹ５遺伝子の興味深い特徴は、ＮＰＹ−Ｙ５遺伝子のコード領域 内にＮＰＹ−Ｙ１遺伝子のエキソン１Ｃを担持していることである。長さ100bp のエキソン１Ｃは、その反対側の鎖において、受容体タンパク質の３番目の細胞 内ループの殆どを含むＹ５配列の一部をコードする。この細胞質ループはＧタン パク質共役受容体の間で大きさが非常に異なり、異なるＧタンパク質複合体への 結合の特異性の決定に関与していると考えられる。他の公知のＮＰＹ受容体サブ タイプの全てと対照的に、Ｙ５受容体におけるこの領域は通常大きく、約150ア ミノ酸からなる。ＮＰＹ−Ｙ１遺伝子の対応する領域においては、５番目の膜貫 通ドメインのすぐ後で、フレーム内停止コドンを含む小さい97bpのイントロンが コード領域を中断しており（図１）、この非コード領域が複製後２つの付加的 機能を獲得したことを示唆している。１つは、Ｙ５タンパク質配列の一部をコー ドすることであり、もう１つはＹ１遺伝子の選択的にスプライシングされた５’ エキソンとして組織特異的転写において調節機能を果たすことである。エキソン １Ｃの転写活性化はＹ５発現に確実に影響を及ぼし、ｍＲＮＡの産生を阻害する 可能性が非常に高い。しかし、このような作用機構は、これら２つの受容体遺伝 子間の調節相互作用の１側面しか表していないのかもしれない。Ｙ１遺伝子のエ キソン１ＢおよびＹ５遺伝子のエキソン１の顕著な近接性は、一方または他方の 遺伝子の特異的転写活性化のためのさらに別な制御機構を示唆している。Ｙ５受容体の薬理学的特徴付け ラットＹ５受容体サブタイプを安定に発現するCHO細胞系のＮＰＹ結合分析は 、Ｙ１様の薬理学を有し、かつフィーディング(feeding)特異的リガンドＮＰＹ[ 2-36]に強く応答するＮＰＹ受容体を表す、リガンド特異性および効力の順位（ ＮＰＹ＝ＮＰＹ＞ＰＹＹ［Leu³¹，Pro³⁴］＝ＮＰＹ[2-36]＝ＰＰ＞＞ＰＹＹ[13- 36]）を示す（図６ａ〜ｆ）。これらの異なるＮＰＹアナログに対する選択性と 同一のプロフィールを、アデニル酸シクラーゼの活性阻害を測定する実験から得 られた結果に見ることができる。In situ ハイブリダイゼーション分析 ヒト視床下部の視床下部領域におけるＹ５受容体ｍＲＮＡの分布を総合的に試 験した。Ｙ５に対するセンスプローブを用いたハイブリダイゼーションは特異的 標識化を全く示さなかったが、アンチセンスプローブは室傍核の大きいニューロ ンに見いだされるＹ５受容体ｍＲＮＡの極めて高い発現を示した。背内側核、視 索上核および乳頭体、ならびに正中線視床核においても高レベルが見いだされる 。核内では、分布は必ずしも均一ではなかった。例えば、背内側核では、標識さ れたニューロンに混ざって明らかに標識されていない大きいピラミッド型ニュー ロンが見いだされ、機能的特殊化を示唆している。Ｙ１受容体に関する予備試験 の結果は、ヒトＮＰＹ−Ｙ１受容体がＹ５受容体と類似の分布を有することを示 唆しているが、これら２つの遺伝子の同時調節的(co-regulatory)転写活性化と いう説を支持する同定可能な幾つかの相違点が存在する。ＮＰＹ−Ｙ５の発現 発現されたＹ５受容体タンパク質は、ユニークな分布および異なるＮＰＹ／Ｐ ＹＹ／ＰＰアナログに対する相対的親和性を有するように思われる。他のＮＰＹ 受容体に比べてＹ５受容体は機能的にユニークであること、そして、例えば食欲 ／肥満障害、高血圧症、運動障害、記憶喪失、睡眠障害、偏頭痛、並びに胃腸(G I)および心臓血管性障害のような多くの障害に対する薬物の開発において非常に 重要でありうることもまた予想される。 当業者には、実施例に示す本発明に、広く記述された本発明の精神または範囲 から逸脱することなく多数の変更および／または改変が可能であることが理解さ れるであろう。それゆえ、本発明の実施態様はいずれの側面においても例示的な ものであり、限定的なものではない。参照文献 1．Ball，H.J.，Shine，J.およびHerzog，H．(1995)、多重プロモーターはヒト ＮＰＹ−Ｙ１受容体遺伝子の組織特異的発現を調節する、J．Biol．Chem．270， 27272-27276。 2．Sambrook，J.，Fritsch，E.F.およびManiatis，T．(1992)，Molecule clonin g(A Laboratory Manual)，第２版（Cold Spring Harbor Laboratory Press，Col d Spring Harbor，New York)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約４４５アミノ酸を有するＮＰＹ−Ｙ５受容体または機能的に等価なその断 片をコードする、単離されたＤＮＡ分子。 ２．前記ＤＮＡ分子がヒト、マウスまたはラットＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードす る、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ分子。 ３．前記ＤＮＡ分子がヒトＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする、請求項２に記載の 単離されたＤＮＡ分子。 ４．ＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子であって、下記に示 すヌクレオチド配列と少なくとも80%相同である該ＤＮＡ分子： (i) 図１のヌクレオチド6291から7625、 (ii) 図２のヌクレオチド63から1397、 (iii)図３のヌクレオチド115から1449、または (iv) 図４のヌクレオチド73から1470。 ５．ＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子であって、下記に示 すヌクレオチド配列と少なくとも95%相同である該ＤＮＡ分子： (i) 図１のヌクレオチド6291から7625、 (ii) 図２のヌクレオチド63から1397、 (iii)図３のヌクレオチド115から1449、または (iv) 図４のヌクレオチド73から1470。 ６．ＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子であって、図１のヌ クレオチド6291から7625に示すヌクレオチド配列に実質的に一致するヌクレオチ ド配列を有する該ＤＮＡ分子。 ７．ＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子であって、図２のヌ クレオチド63から1397に示すヌクレオチド配列に実質的に一致するヌクレオチド 配列を有する該ＤＮＡ分子。 ８．ＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子であって、図３のヌ クレオチド115から1449に示すヌクレオチド配列に実質的に一致するヌクレオチ ド配列を有する該ＤＮＡ分子。 ９．ＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子であって、図４のヌ クレオチド73から1470に示すヌクレオチド配列に実質的に一致するヌクレオチド 配列を有する該ＤＮＡ分子。 10．上記の請求項のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含むプラスミドまたは発 現ベクター。 11．請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子によって形質転換された 宿主細胞。 12．前記細胞が哺乳動物細胞または細菌細胞である、請求項11に記載の宿主細胞 。 13．前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（Ｈ ＥＫ）293細胞または昆虫Ｓｆ９細胞である、請求項12に記載の宿主細胞。 14．前記細胞が細胞表面にＮＰＹ−Ｙ５受容体を発現する、請求項11から13のい ずれか一項に記載の宿主細胞。 15．実質的に純粋な形態のＮＰＹ−Ｙ５受容体。 16．前記受容体が約445アミノ酸からなる、請求項15に記載のＮＰＹ−Ｙ５受容 体。 17．前記ＮＰＹ−Ｙ５が図５に示すアミノ酸配列のいずれか一つに実質的に一致 するアミノ酸配列を有する、請求項15または16に記載のＮＰＹ−Ｙ５受容体。 18．請求項15から17のいずれか一項に記載のＮＰＹ−Ｙ５受容体に特異的に結合 することができる抗体。 19．請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子によって形質転換された 非ヒト動物。 20．ＮＰＹ−Ｙ５受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト作用物質を検出する 方法であって、請求項15から17のいずれか一項に記載のＮＰＹ−Ｙ５受容体また は請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子によって形質転換され、そ して該分子を発現する細胞を、ＮＰＹ−Ｙ５受容体の活性化を可能とする条件下 で被験作用物質に接触させる工程、及びＮＰＹ−Ｙ５受容体活性の増大または減 少を検出する工程を包含する、方法。 21．請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子内の独特な配列に特異的 にハイブリダイズすることができる、10個以上のヌクレオチドからなるヌクレオ チド配列を含む核酸プローブ。 22．ＮＰＹ−Ｙ５受容体をコードするｍＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズし て該ｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止することができるヌクレオチド配列を含むアンチ センス核酸分子。