JP2000500653A

JP2000500653A - ヒト癌のマウスモデル

Info

Publication number: JP2000500653A
Application number: JP9519058A
Authority: JP
Inventors: レパスキーサブジェック，エリザベス; バンパース，ハーベイ; セクリスト，ヘザー
Original assignee: コリクサコーポレイション
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 2000-01-25
Also published as: EP0866655A2; EP0866655B1; WO1997018300A3; US5986170A; WO1997018300A2; AU1158997A; US6284239B1; ATE261654T1; DE69631896D1

Abstract

(57)【要約】ヒトの乳癌、卵巣癌、前立腺癌のマウスモデルが提供される。このモデルは、性腺脂肪パッド内に移植されたヒトの一次の乳癌または卵巣癌組織を含む免疫不全マウス、あるいは免疫不全マウスの皮下に移植されたヒトの前立腺癌組織を含む免疫不全マウスのいずれかを含む。マウスモデルを使用する方法（例えば、腫瘍を増殖させ、そして乳癌、卵巣癌、および／または前立腺癌の処置をスクリーニングするための方法）がまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト癌のマウスモデル技術分野本発明は、一般に、患者の乳癌、卵巣癌、および前立腺癌の増殖についてのマウスモデルに関する。本発明は、より特に、例えば、性腺脂肪パッド（gonadal fat pad）内に移植されるヒトの一次の（primary）乳癌、卵巣癌、または前立腺癌の外科的標本を含む免疫不全マウスに関する。本発明はまた、例えば、乳癌、卵巣癌、および／または前立腺癌の処置の有効性を評価するために、または癌関連抗原（carcinoma-associated antigen）を同定するために、このような腫瘍保有マウスを使用する方法に関する。発明の背景ヒト癌の動物モデルは、癌治療の研究および開発のための価値のある手段である。しかし、いくつかのヒト癌は、動物モデルにおいて増殖させることが例外的に難しいことが証明されている。例えば、かなりの努力にも関わらず、ヒト乳癌の外科的標本は、種々の動物モデル系（モルモットの前眼房、致死的に照射したマウスまたは胸腺除去したマウス、ならびにヌードマウスおよびSCIDマウスを含む）における増殖に抵抗性であった。ヌードマウスにおいて、動物にエストロゲンを補充したときでさえ、腫瘍の生着率は低く、そして増殖するそれらの腫瘍は、予後にあまり関係しないHER-2/neu癌遺伝子の増幅を示す。従って、最良の本発明のモデルは、極度に悪性な癌の限定されたカテゴリーにのみ有効であり、ヒト乳癌の一般の実験の研究に受容可能な動物モデルは、現在利用可能でない。現在まで研究がほとんど行われていないヒトの前立腺癌および卵巣癌のための動物モデルの必要性はさらに大きい。従って、当該分野において、ヒトの乳癌、卵巣癌、および前立腺癌の研究のための改良された動物モデルの必要性がある。本発明はこれらの必要性を満たし、さらに他の関連した利点を提供する。発明の要旨簡単に述べれば、本発明は、乳癌、卵巣癌、および前立腺癌のマウスモデルを提供する。一つの局面では、ヒトの一次の乳癌、卵巣癌、または前立腺癌組織を含む免疫不全マウスが提供され、ここで癌組織は、免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に移植される。別の局面では、前立腺癌組織を皮下に移植した免疫不全マウスが提供される。関連した局面では、本発明は、乳癌、卵巣癌、または前立腺癌のマウスモデルを作製する方法を提供する。一つの実施態様では、方法は、ヒトの乳癌、卵巣癌、または前立腺癌の標本を、免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内（あるいは、前立腺癌については皮下）に移植する工程を包含する。関連した実施態様では、方法は、移植された癌標本の一部を取り出す工程、および引き続いてその一部を第２の免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内（または、皮下）に移植する工程をさらに包含する。なお別の局面では、ヒトの乳癌、卵巣癌、または前立腺癌組織を増殖させるための方法が提供され、この方法は、(a)ヒトの乳癌、卵巣癌、または前立腺癌の標本を免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に移植する工程；および(b)この癌を免疫不全マウス内で増殖させる工程を包含する。さらなる局面では、本発明は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌の治療の有効性を評価するための方法を提供し、この方法は、(a)ヒトの乳癌、卵巣癌、または前立腺癌の標本を、免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に移植する工程；(b)免疫不全マウスを候補の治療に暴露する工程；ならびに(c)移植した標本の大きさの変化、腫瘍細胞死の程度、および／またはマウスにおける転移の拡散のレベルを測定し、そしてそれから治療の有効性を決定する工程を包含する。別の局面では、腫瘍応答性のヒト細胞溶解性Ｔリンパ球を産生するための方法が提供され、この方法は、(a)ヒトＴリンパ球を含むヒトの癌標本を、免疫不全マウスの性腺脂肪パッドに移植する工程であって、ここで癌は、乳癌、卵巣癌、または前立腺癌である、工程；(b)ヒトＴリンパ球を免疫不全マウス内で増殖させる工程；(c)ヒト細胞溶解性Ｔリンパ球を、標本保有免疫不全マウスから単離する工程；および(d)リンパ球の癌細胞を殺傷する能力について評価し、そしてそれから腫瘍応答性のリンパ球を同定する工程を包含する。関連する局面では、抗腫瘍抗血清を生成するための方法が提供され、この方法は、(a)ヒトＢ細胞を含むヒトの癌標本を、免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に移植する工程であって、ここで癌は、乳癌、卵巣癌、または前立腺癌である、工程；(b)ヒトＢ細胞を免疫不全マウス内で増殖させ、そしてヒト抗腫瘍抗体を産生させる工程；(c)免疫不全マウスから抗血清を単離する工程；および(d)抗血清を癌細胞に結合する能力ついて評価し、そしてそれから抗腫瘍抗血清を同定する工程を包含する。さらに別の関連する局面では、抗腫瘍モノクローナル抗体を生成するための方法が提供され、この方法は、(a)ヒトＢ細胞を含むヒトの癌標本を、免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に移植する工程であって、ここで癌は、乳癌、卵巣癌、または前立腺癌である、工程；(b)ヒトＢ細胞を免疫不全マウス内で増殖させ、そしてヒト抗腫瘍抗体を産生させる工程；(c)単離されたＢ細胞からモノクローナル抗体を生成する工程；(d)モノクローナル抗体を癌細胞に結合する能力について評価し、そしてそれから抗腫瘍モノクローナル抗体を同定する工程を包含する。他の関連する局面では、本発明は、上記方法で産生される、腫瘍応答性のヒト細胞溶解性Ｔリンパ球、抗腫瘍抗血清、およびモノクローナル抗体を提供する。さらに別の局面では、本発明は、患者の癌を処置するための方法を提供し、ここで癌は乳癌、卵巣癌、または前立腺癌である。一つの実施態様では、方法は、上記の腫瘍応答性の細胞溶解性Ｔリンパ球を患者に投与する工程を包含する。別の実施態様では、方法は、上記の抗腫瘍モノクローナル抗体を患者に投与する工程を包含する。本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の詳細な説明を参照して明らかになる。本明細書中で開示される全ての参考文献は、それぞれが個々に援用されるかのように、本明細書中で参考としてその全体が援用される。発明の詳細な説明上記のように、本発明は、一般に、ヒトの癌の新規の動物モデルの作製に関する。より詳細には、本明細書中で記載される動物モデルは、ヒトの一次悪性の乳組織、卵巣組織、または前立腺組織の、免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内への移植により調製される。このようなモデルは、例えば、ヒトの乳腫瘍、卵巣腫瘍、または前立腺腫瘍を増殖させるために、あるいはこのような癌に有効な治療をスクリーニングするために使用され得る。本明細書中に記載されるモデルはまた、ヒトの癌に関連する新規の抗原を同定するために使用され得る。任意の免疫不全マウスが、本明細書中に記載される動物モデルを作製するために使用され得る。本発明の文脈における「免疫不全」は、有効な免疫応答を備える（mount）動物の能力を損なう遺伝的改変をいう。この点において、「有効な免疫応答」は、侵入する病原体（例えば、限定はされないが、ウイルス、細菌、寄生虫、悪性細胞、および／または異種または同種異系間の移植片）を破壊し得る応答をいう。一つの好ましい実施態様では、免疫不全マウスは、重篤な免疫不全（SCID）マウスであり、このマウスは、免疫グロブリンおよび機能的なＴ細胞抗原レセプターを生成するために必要なリコンビナーゼ活性を欠き、従って機能的なＢリンパ球およびＴリンパ球を産生しない。BosmaおよびCarrol、Ann.Rev.I mmunol．9:323-350(1991)。別の好ましい実施態様では、免疫不全マウスはヌードマウスであり、このマウスは、機能的な胸腺の欠如を生じ、Ｔ細胞およびＢ細胞の欠損に至る、遺伝的欠陥を含む。しかし、他の免疫不全を含むマウス（例えば、Chenら、Curr.Opin.Immunol．6:313-319(1994)およびGuidasら、J.Exp.Med. 181:1187-1195(1995)に記載のrag-1またはrag-2ノックアウトマウス、またはKol lmannら、J.Exp.Med.177:821-832(1993)に記載のナチュラルキラー細胞もまた欠くベージュヌードマウス(beige-nude mause)）もまた使用される。移植に適切な癌は、患者の一次の乳癌、卵巣癌、または前立腺癌の任意の外科的標本である。このような癌を有する患者は、当業者により容易に同定され得る。一般に、移植される標本は、過剰な脂肪および結合組織から切り取られた新鮮な生検標本であるべきであり、そして明らかに壊死または敗血症が無いべきである。好ましくは、標本は、移植の直前に１〜２mmより小さくない大きさまで切り刻まれる。標本はまた、移植前に無菌的に操作されるべきである。本明細書中に記載される一貫した腫瘍の増殖および転移を達成するために、一次乳癌については、移植は、免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内でなければならない。性腺脂肪パッドの二つの半分（half）は、雄および雌両方のマウスの腹腔の表面の多くの領域を占める。性腺脂肪パッド内への移植は、一般に、四部円下腹部切開を通して、性腺脂肪パッドの一部を外腹壁の外に引き出し、腫瘍標本の周りにマウスの性腺脂肪パッドを包み（wrapping）、縫合糸でこのような配置を確保し、そして腫瘍を含む性腺脂肪パッドを腹部へ戻すことにより、達成され得る。乳癌標本の場合において、好ましくは、エストロゲンが、例えば、除放エストロゲンペレット［体重21〜22gのcB17スキッドマウスについて１mgペレット（9 0日放出）］の皮下の挿入により、移植時にマウスに与えられる。前立腺腫瘍の移植について、一次腫瘍標本の性腺脂肪パッド内の移植または皮下の移植のいずれもが十分である。皮下の移植は、皮膚の縫合を介して確保される。雄のマウスの使用は必要であり、移植時のテストステロンのマウスへの投与は、有利である。腫瘍の増殖は、一般に、５〜７週間以内に視診または触診（palpitation）により観察され、そして腫瘍は、典型的に、移植後３ケ月までに約１〜３センチメートルの大きさの範囲になる。また、他の器官への転移の拡散は、解剖および組織学的試験のような当業者に周知の方法を用いて観察され得る。増殖後に、腫瘍は継代され得る（すなわち、一部が取り出され、そして上記の手順を用いて、第２の免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に移植され得る）。しかし、レシピエントマウスの性腺脂肪パッド内の乳房腫瘍の移植は、一次の（最初の）腫瘍が必要とされるだけである。レシピエントマウスの性腺脂肪パッド内における一次乳癌標本の増殖の後に、腫瘍は次のマウスに皮下に継代され得る。従って、本発明の一つの局面では、性腺脂肪パッド内に（または、前立腺癌の場合は皮下に）移植されたヒトの癌標本を有する免疫不全マウスが提供される。このようなマウスは、当業者に明らかな種々の目的のために使用され得る。例えば、マウスモデルは、ヒトの一次の乳癌、卵巣癌、または前立腺癌を増殖させるために使用され得、これは、大量のヒトの乳癌細胞、卵巣癌細胞、または前立腺癌細胞の単離を可能にする。この局面では、上記のように移植が行われ、そして腫瘍細胞は、十分な増殖が達成された後（一般に、約２〜３月）に収集される。本発明の別の局面において、上記のマウスモデルは、ヒトの乳癌、卵巣癌、または前立腺癌に対する治療の有効性を評価するために使用される。本明細書中で使用する、用語「治療」は、食事条件または環境条件のような外因性因子、ならびに薬学的組成物およびワクチンを包含する。１つの好ましい実施態様において、治療は免疫療法であり、これは、腫瘍応答性免疫細胞の集団での腫瘍保有動物の処置を含み得る。あるいは、治療はまた、遺伝子治療（すなわち、１つ以上の遺伝子（この産物は、抗腫瘍活性を有し得る）を発現するように操作された細胞集団での、腫瘍保有マウスの処置を含む治療）であり得る。候補治療の有効性を評価するために、ヒトの乳癌、卵巣癌、または前立腺癌の標本は、最初に、好ましくは一連の類似の免疫不全マウスに移植される。所望であれば、移植された癌組織は、多量の組織が移植に利用可能になるように上述のように継代され（passage）得る。次いで、移植された癌組織を有するマウスの１群は候補治療に曝露されるが、一方、別の群（すなわち、コントロール群）は曝露されない。次いで、腫瘍増殖が、適切な時間（例えば、２〜３ケ月）の後に、両群のマウスにおいて評価される。候補治療は、治療に曝露されたマウスにおける移植された標本のサイズ、腫瘍増殖の程度、および／または転移の拡散のレベルが、コントロール群における増殖よりも統計学的に少ない場合、ならびに/ あるいは、治療に曝露されたマウスにおける腫瘍細胞死の程度（顕微鏡的方法または他の方法により評価される）がコントロール群より統計学的に大きな場合に、有効であるとみなされる。なお別の局面において、上記の腫瘍保有免疫不全マウスは、ヒト腫瘍応答性細胞溶解性Ｔリンパ球、抗腫瘍抗体、および/または抗腫瘍抗血清の調製のために使用され得る。一般に、移植標本は、ヒトのＴ細胞およびＢ細胞を含み、これらは、免疫不全マウス内で増殖可能であり、そしてＢ細胞の場合ではヒト抗腫瘍抗体を産生し得る。このようなヒトのリンパ球および/または抗体の採集は、十分な増殖が達成された後（一般的に、約１〜２ケ月）、当業者に公知の任意の適切な技術を用いて行われ得る。好ましい実施態様において、ヒトの細胞溶解性Ｔリンパ球および/または抗体は、予めヒトリンパ組織内で再増殖されている（repop ulated）腫瘍保有マウスから単離され得る。このようなキメラマウス（例えば、 SC ID-huマウス）は容易に作製され、そしてこのようなマウス由来のヒトのリンパ球および免疫グロブリンは、当業者に公知の方法およびKaneshimaら、Curr.Opin .Immunol.6:327-33(1994)に記載の方法を用いて、スクリーニングのために使用され得る。上記の腫瘍保有免疫不全マウスから単離された腫瘍応答性ヒト細胞溶解性リンパ球、抗血清、および/またはＢ細胞は、当業者に公知の種々の方法を用いて評価され得る。例えば、このようなマウス由来のＴ細胞は、単離され、そして腫瘍応答性細胞溶解性Ｔ細胞の増殖性応答を可能にするために腫瘍細胞の存在下で増殖させ得る。腫瘍応答性細胞溶解性リンパ球は、腫瘍細胞の直接的な溶解を媒介し得るリンパ球である。このような腫瘍応答性細胞溶解性Ｔ細胞の腫瘍細胞を殺傷する能力は、当業者に公知の方法（例えば、MacDonaldら、J.Exp.Med．140:71 8(1974)に記載されるアッセイ）を用いて、例えば、⁵¹Cr放出アッセイを用いて容易に測定され得る。あるいは、細胞溶解性Ｔ細胞は、当業者に周知の方法を用いて、サイトカインを分泌するそれらの能力について試験され得る。このような評価の後、適切なヒト腫瘍応答性細胞溶解性Ｔ細胞は、インビトロで増殖させ、そして治療目的、またはこのような細胞により認識される腫瘍関連遺伝子産物の同定目的のいずれかの目的に使用され得る。抗血清は、抗血清内の抗体が癌細胞に結合し得るか否か、および/またはこのような抗体が腫瘍細胞により発現されることがわかっている抗原を認識するか否かを決定ことにより、抗腫瘍特性について評価され得る。同様に、単離されたＢ細胞は、モノクローナル抗体を作製するために使用され得、これは同様の手段により評価され得る。一般的に、モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein， Eur.J.Immunol．6:511-519(1976)の技術およびその改良を用いて調製され得る。これらの技術には、Steinitzら、Nature 269: 420-422(1977); Zurauskiら、Sci ence 199: 1439-1441(1979); KozborおよびRoder，J.Immunol．127: 1275-1280( 1981); Irieら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79: 5666-5670(1982);およびGarz elliら、J.Clin.Invest．77: 1627-1631(1986)に記載されるように、形質転換ヘルペスウイルス、EBVでの感染による抗体産生Ｂ細胞の不死化が含まれる。いずれの場合でも、結合アッセイは、HarlowおよびLane，Antibodies: A Labora tory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988に記載される方法のような、当業者に公知の種々の方法のいずれかを用いて行われ得る。適切な方法としては、放射性免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ、およびウエスタンブロットが挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍応答性細胞溶解性リンパ球、抗血清、および抗体（またはこのような抗体を産生する細胞株）は、当業者には明らかな種々の目的、例えば、癌の免疫療法に使用され得る。この目的のために、１つ以上の細胞溶解性Ｔ細胞の集団、または１つ以上の抗体が、生理学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物として処方され得る（そうする必要はない）。一般的に、薬学的組成物は、任意の種々の経路（皮下、静脈内、腹腔内、または皮内注射による経路、または吸引による経路を含む）を介して投与され得る。当業者に公知の任意の適切なキャリアが利用され得るが、一方、キャリアの型は、投与の形式に依存して変化する。非経口投与（例えば、皮下注射）のためには、キャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、油脂、ワックス、および/または緩衝液を含む。経口投与のためには、上記のキャリアまたは固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウム）のいずれかが使用され得る。生分解性マイクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）もまた、薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。適切な生分解性マイクロスフェアは、例えば、米国特許番号第4,897,268号、および同第5,075,109号に開示される。投与および投薬の適切な頻度は、一般的に、上記の動物モデルを用いておよび後の臨床試験により決定され得る。一般的に、適切な用量は、上記のように投与される場合は、ポジティブな臨床結果を生じ得る（すなわち、癌の安定、まはた部分的なもしくは完全な緩解をもたらし得る）ような用量である。細胞溶解性Ｔ細胞の適切な用量は、代表的に、約10⁷〜約10¹⁰細胞の範囲である。モノクローナル抗体の適切な用量は、代表的に、約１〜200mg/kg体重の範囲である。腫瘍応答性細胞溶解性リンパ球はまた、このような細胞により認識される癌関連抗原を同定するために使用され得る。例えば、腫瘍細胞クラス１ MHC分子のクレフトに結合している抗原に結合したペプチドは、癌細胞クラス１ MHC分子の免疫親和性カラムクロマトグラフィーの後に分離され得る。得られたペプチドは、高速液体クロマトグラフィーによりさらに分画化され得る。次いで、分画化したペプチドは、腫瘍応答性細胞溶解性Ｔ細胞による細胞傷害活性を誘引する能力について試験され得る。細胞溶解性Ｔ細胞活性を誘引する個々のペプチドのアミノ酸配列は、標準的なタンデム質量分析により決定され得る。例えば、Boonら、An n.Rev.Immunol．12: 337-365(1994)を参照のこと。同定されたペプチドのアミノ酸配列は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Sprin g Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY(1989)（およびそこに引用された参考文献）に記載されるような当業者に周知の方法を用いて、このペプチドをコードする遺伝子を単離するために使用し得るオリゴヌクレオチドプローブを作製するために使用され得る。このような遺伝子および対応するタンパク質は、腫瘍診断および治療モニタリングのためのマーカーとして、または抗腫瘍ワクチンとして、さらに使用され得る。上記のような抗血清、モノクローナル抗体、および/またはＴ細胞はまた、抗体および/またはＴ細胞により認識される腫瘍関連抗原をコードするcDNA分子の直接発現クローニングのために使用され得る。例えば、移植された癌由来のmRNA は、cDNAに転写され得、そして哺乳動物細胞（例えば、COS細胞、CV-1細胞、アフリカミドリザル腎細胞または線維芽細胞）に挿入されたcDNAの発現を指向し得るプラスミドに挿入され得る。このようなcDNAを含むプラスミドは、E.Coliにおいて複製され、そして哺乳動物細胞、または（細胞溶解性Ｔ細胞に対するこのような抗原の提示のために）予めヒトクラス１ MHC遺伝子でトランスフェクトされた哺乳動物細胞にプールでトランスフェクトされ得る。トランスフェクションの 24〜72時間後、このような哺乳動物細胞は、挿入されたcDNAの産物の発現の検出のための標的として使用され得る。抗体の場合、検出は、放射性標識抗体の結合を測定することによるか、または酵素結合免疫吸着アッセイにより達成され得る。Ｔ細胞の場合、腫瘍応答性細胞溶解性Ｔ細胞によるサイトカイン放出を誘発するトランスフェクトされた細胞の能力が検出され得る。いずれの場合でも、適切な検出方法は、当業者には容易に明らかである。一旦cDNAのプール（その産物は腫瘍応答性Ｔ細胞または抗体のいずれかによる検出を導く）が同定されると、このようなプールはサブプールにさらに分けられ、サブプールは、E.coliにおいて増幅され得、そして標的細胞に再度トランスフェクトされ得、そして検出アッセイは、最終的に単一のcDNA（その発現産物は腫瘍応答性抗体またはＴ細胞のいずれかにより検出される）が単離されるまで、上記のように繰り返され得る。このようなcDNA分子ならびに対応する完全長遺伝子およびコードされるタンパク質は、腫瘍診断および治療モニタリングのためのマーカーとして、または腫瘍ワクチンとしてさらに使用され得る。以下の実施例は、限定のためではなく、例示のために提供される。実施例実施例１免疫不全マウスにおけるヒトの乳癌細胞または卵巣癌細胞の移植本実施例は、ヒトの乳癌または卵巣癌のためのマウスモデルの作製を例示する。ヒトの乳癌または卵巣癌の新鮮な生検標本を、手術の後に間もなく受ける。腫瘍を、SCIDマウスの性腺脂肪パッドへの移植の直前に、メスで１〜２mmより小さくならない大きさまで、（RPMI 1640および109aヒト血清中で）無菌的に細かく切り刻む。マウスを、0.35〜0.5mLのAvertinの腹腔内注射により麻酔し、そして手術用の金属十字台におく。典型的には、剃刀で右下腹部に３mmの縦方向に切開し、そして性腺脂肪パッドの右部分を、切開部から引き出す。腫瘍の一片を、性腺脂肪パッドの表面におき、次いで腫瘍の周りを性腺脂肪パッドで包み、そして 6-0 Dexon^TMで適所に固定することにより封入する。次いで、腫瘍/性腺脂肪パッドを、腹部に再配置する。腹膜切開を、縫合糸で閉じる。ホチキスのクリッピングを用いて、皮膚の切開を閉じる。乳癌組織の移植時に、エストロゲンペレットを、マウスの頚部の後ろに皮下的に与える。手術の後、マウスが覚醒するまで暖める。腫瘍増殖を、移植後の５〜７週間、下腹部領域を視覚的に調べるか、またはこの領域を触診することにより識別する。最初の移植の３ケ月後までに、腫瘍は、約１〜３平方センチメートルの大きさの範囲になる。表１は、上記のSCIDマウスに移植された32の一連の乳癌について得られた結果を示す。それぞれの場合において、一次腫瘍の２〜10の標本を、個々のマウスに移植し、そして増殖が観察された移植標本の数を、移植標本の総数と共に提供する。 ^a 数は、明らかな増殖が元の手術生検材料の小片で移植された総数以外の第１の継代において得られた、動物を示す。^b II型ケラチンを発現し、そしてヒトDNA特異的プローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションによりヒトであると証明された、腫瘍。^c 例外的に急速な増殖の証拠を示した。^d ヌードマウスにおいても増殖した。（＃7356、＃7418、および＃7628は、ヌードマウスにおいて増殖しなかった）^e 後の継代において、他の器官への転移の証拠を示した。^f 第２の継代の間に、リンパ腫として生じた。これらの結果は、上記の移植方法が、免疫不全マウスにおいて一次ヒト乳癌組織を増殖させることに高度に有効であることを示す。実施例２免疫不全マウスにおけるヒト前立腺癌細胞の評価本実施例は、ヒト前立腺癌のマウスモデルの作製を例示する。ヒト前立腺癌の新鮮な生検標本を、手術後間もなく受ける。腫瘍を、雄CB17 SCIDマウスの皮下移植の直前に、メスで１〜２mmより小さくならない大きさまで、培地（RPMI 164 0および10％ヒト血清）中で無菌的に細かく切り刻む。マウスを、0.35〜0.5mLの Avertinの腹腔内注射により麻酔する。典型的には、胸壁の中心に２〜３mmの水平方向に切開し、そしてピンセットを用いて、穏やかに皮膚を下にある肋骨の前方にある結合組織から引き離す。一片の腫瘍を、開口部から十分に離して皮膚下に挿入する。皮膚の切開を縫合糸で閉じ、そしてテストステロンペレットを、同様の様式でマウスの頚部の後ろに皮下的に与える。手術後、マウスが覚醒するまで、マウスを暖める。腫瘍増殖を、乳癌および卵巣癌と同じ様式で識別する。実施例３薬学的薬剤の抗腫瘍活性についての評価実施例１に記載したような、最初の手術サンプルの３平方センチメートルを超える領域への増殖の後、動物を屠殺し、そして腫瘍組織を摘出する。次いで、単離された腫瘍組織を、複数の１〜２mmの小片に切り裂き、次いでこのような小片を、実施例１に詳述されるように複数の免疫不全マウスの性腺脂肪パッドに移植する。所望であれば、上記のように移植組織を増殖させ、摘出し、そしてこの組織を切り裂き、そしてこの小片をさらなる免疫不全マウスに移植することにより、腫瘍組織をさらに連続的に移植し得る。一次手術標本または連続的に移植された腫瘍組織を受けた動物における腫瘍発生の後、腫瘍保有レシピエント動物を、複数のコホートに分け、そして抗腫瘍応答性を有すると推測される薬学的薬剤または薬学的薬剤の組合せを用いた処置に供する。このような処置は、皮下、静脈内、腹腔内、または皮内注射による、エアロゾル吸入による、または経口による経路を含む複数の経路を介して投与され得る。治療の経過の後、効力は、処置なしかまたは偽薬での処置のいずれかを受ける腫瘍保有マウスに対する治療を受ける腫瘍保有マウスのコホートの、相対的な生存および腫瘍増殖速度の測定により評価され得る。実施例４養子的に移入された免疫細胞集団の抗腫瘍活性についての効力の評価実施例１に記載のように、最初の手術サンプルの３平方センチメートルを超える領域までの増殖の後、動物を屠殺し、そして腫瘍組織を摘出する。次いで、単離された腫瘍組織を、複数の１〜２mmの小片に切り裂き、次いで、このような小片を、実施例１に詳述されるように複数の免疫不全マウスの性腺脂肪パッドに移植する。所望であれば、上記のように移植組織を増殖させ、摘出し、そしてこの組織を切り裂き、そしてこの小片をさらなる免疫不全マウスに移植することにより、腫瘍組織を、さらに連続的に移植し得る。一次手術標本または連続的に移植された腫瘍組織を受けた動物における腫瘍発生の後、腫瘍保有レシピエント動物を、複数のコホートに分け、そして抗腫瘍応答性を有すると推測される免疫リンパ球の集団、もしくはこのような細胞集団の組合せ、またはこのような細胞集団と抗腫瘍活性を有すると推測される薬学的薬剤との組合せを用いた処置に供する。このような細胞として、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞、または以前にサイトカインに曝露された類似の細胞が挙げられる。このような細胞は、抗腫瘍免疫応答性を有すると推測される、バルク集団、細胞株、またはクローンとしてのいずれかで存在し得る。このような細胞はまた、治療実験におけるそれらの使用前に、遺伝情報のこのような細胞へ移入することによりさらに操作され得る。処置は、皮下、静脈内、腹腔内、または皮内注射による経路を含む複数の経路を介して投与され得る。治療の経過の後、効力は、処置なしかまたは偽薬での処置のいずれかを受ける腫瘍保有マウスに対する細胞の治療を受ける腫瘍保有マウスのコホートの、相対的な生存および腫瘍増殖速度の測定により評価され得る。実施例５癌の処置のための遺伝子治療の効力の評価実施例１に記載のように、最初の手術サンプルの３平方センチメートルを超える領域までの増殖の後、動物を屠殺し、そして腫瘍組織を摘出する。次いで、単離された腫瘍組織を、複数の１〜２mmの小片に切り裂き、次いで、このような小片を、実施例１に詳述されるように複数の免疫不全マウスの性腺脂肪パッドに移植する。所望であれば、上記のように移植組織を増殖させ、摘出し、そしてこの組織を切り裂き、そしてこの小片をさらなる免疫不全マウスに移植することにより、腫瘍組織を、さらに連続的に移植し得る。一次手術標本または連続的に移植された腫瘍組織を受けた動物における腫瘍発生の後、腫瘍保有レシピエント動物を、複数のコホートに分け、そして種々の遺伝子（この産物は抗腫瘍活性を有し得る）を発現するように操作された細胞の集団を用いた処置に供する。このような細胞は、バルク集団または細胞株としてのいずれかで存在し得、そして線維芽細胞様、造血起源、肝起源、皮膚起源、またはリンパ様の細胞を含み得る。あるいは、抗腫瘍活性を有すると推測されるタンパク質をコードするプラスミド、または裸のDNAもしくはリポソームにカプセル化された裸のDNAは、このモデル系における処置として使用され得る。処置は、皮下、静脈内、腹腔内、または皮内注射による経路を含む複数の経路を介して投与され得る。治療の経過の後、効力は、処置なしかまたは偽薬での処置のいずれかを受ける腫瘍保有マウスに対する遺伝子治療を受ける腫瘍保有マウスのコホートの、相対的な生存および腫瘍増殖速度の測定により評価され得る。実施例６腫瘍増殖に対する異なる食事療法の効果の評価実施例１に記載のように、最初の手術サンプルの３平方センチメートルを超える領域までの増殖の後、動物を屠殺し、そして腫瘍組織を摘出する。次いで、単離された腫瘍組織を、複数の１〜２mmの小片に切り裂き、次いで、このような小片を、実施例１に詳述されるように複数の免疫不全マウスの性腺脂肪パッドに移植する。所望であれば、上記のように移植組織を増殖させ、摘出し、そしてこの組織を切り裂き、そしてこの小片をさらなる免疫不全マウスに移植することにより、腫瘍組織を、さらに連続的に移植し得る。一次手術標本または連続的に移植された腫瘍組織を受けた動物における腫瘍発生の後、腫瘍保有レシピエント動物を、複数のコホートに分け、そして、後の腫瘍増殖および発生に対する特定の食事変化の効果を調べるために、このような食事療法に供する。食事療法は、単一のおよび複合の炭水化物、脂肪、およびタンパク質の組成および濃度により変え得る。治療の経過の後、効力は、処置なしかまたは偽薬での処置のいずれかを受ける腫瘍保有マウスに対する食事療法を受ける腫瘍保有マウスのコホートの、相対的な生存および腫瘍増殖速度の測定により評価され得る。実施例７癌ワクチンの効力の評価実施例１に記載のように、最初の手術サンプルの３平方センチメートルを超える領域までの増殖の後、動物を屠殺し、そして腫瘍組織を摘出する。次いで、単離された腫瘍組織を、複数の１〜２mmの小片に切り裂き、次いで、このような小片を、実施例１に詳述されるように複数の免疫不全マウスの性腺脂肪パッドに移植する。所望であれば、上記のように移植組織を増殖させ、摘出し、そしてこの組織を切り裂き、そしてこの小片をさらなる免疫不全マウスに移植することにより、腫瘍組織を、さらに連続的に移植し得る。一次手術標本または連続的に移植された腫瘍組織を受けている動物における腫瘍発生の前または後に、腫瘍保有レシピエント動物を、ヒトリンパ様組織を用いて再増殖させ、当業者にSCID-huマウスとして公知であるものを作製し得る。このような動物は、本質的にキメラ動物を示す。ここで宿主動物は、マウス起源であるが、動物のＴリンパ球およびＢリンパ球はヒト起源である。従って、このような動物は、患者を免疫応答を刺激することが推測される薬剤に曝露する必要なく、ヒト免疫応答の研究において有用である。腫瘍保有SCID-huマウスを、複数のコホートに分け、そして抗腫瘍免疫応答を刺激することが推測される１つ以上のタンパク質もしくはペプチド、またはこのようなタンパク質またはペプチドをコードする１つ以上のDNA分子（裸もしくはベクター中のいずれか）でのワクチン接種に供する。このようなタンパク質、ペプチド、またはDNA分子は、種々の水性処方物もしくは非水性処方物中に存在し得るか、あるいはマイクロカプセルもしくはリポソーム中に処方され得る。ワクチン接種は、皮下、静脈内、腹腔内、もしくは皮内注射による経路を含む複数の経路、または経口経路の投与を介して投与され得る。治療の経過の後、効力は、処置なしかまたは偽薬での処置のいずれかを受ける腫瘍保有マウスに対するワクチン治療を受ける腫瘍保有マウスのコホートの、相対的な生存および腫瘍増殖速度の測定により評価され得る。このようなワクチン接種の結果として誘発されたヒト抗腫瘍免疫応答はまた、このモデルにおいて評価され得る。本発明の特定の実施態様は、例示の目的のために本明細書中で記載されたが、種々の改変は、本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得ることが、前述から理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 ＺＮＡＣＣ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｅ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バンパース，ハーベイアメリカ合衆国ニューヨーク 14215, バッファロ，グライダーストリート 462，エリーカウンティーメディカルセンター，ディーケイミラーメディカルビルディング，デパートメントオブサージェリー内 (72)発明者セクリスト，ヘザーアメリカ合衆国ワシントン 98119，シアトル，12ティーエイチアベニューダブリュー．ナンバー３ 2207

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトの一次乳癌組織を含む免疫不全マウスであって、ここで該癌組織が該免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に移植され、そして該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、免疫不全マウス。２．ヒトの一次前立腺癌組織を含む免疫不全マウスであって、ここで該癌組織が該免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内または皮下に移植され、そして該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、免疫不全マウス。３．ヒトの一次卵巣癌組織を含む免疫不全マウスであって、ここで該癌組織が該免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に移植され、そして該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、免疫不全マウス。４．前記マウスがヌードマウスである、請求項１から３のいずれか一つに記載の免疫不全マウス。５．前記マウスがSCIDマウスである、請求項１から３のいずれか一つに記載の免疫不全マウス。６．免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に、ヒトの乳癌標本を移植する工程を包含する、乳癌のマウスモデルを作製する方法であって、ここで該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、方法。７．免疫不全マウスの皮下または性腺脂肪パッド内に、ヒトの前立腺癌標本を移植する工程を包含する、前立腺癌のマウスモデルを作製する方法であって、ここで該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、方法。８．免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に、ヒトの卵巣癌標本を移植する工程を包含する、卵巣癌のマウスモデルを作製する方法であって、ここで該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、方法。９．前記マウスがヌードマウスである、請求項６から８のいずれか一つに記載の方法。１０．前記マウスがSCIDマウスである、請求項６から８のいずれか一つに記載の方法。１１．前記方法が、前記免疫不全マウスにエストロゲンを投与する工程をさらに包含する、請求項６に記載の方法。１２．ヒトの乳癌組織を増殖させる方法であって、以下の工程： (a) 免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に、ヒトの乳癌標本を移植する工程であって、ここで該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、工程；および (b) 該癌を該免疫不全マウス内で増殖させる工程、を包含する、方法。１３．ヒトの前立腺癌組織を増殖させる方法であって、以下の工程： (a) 免疫不全マウスの皮下または性腺脂肪パッド内に、ヒトの前立腺癌標本を移植する工程であって、ここで該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、工程；および (b) 該癌を該免疫不全マウス内で増殖させる工程、を包含する、方法。１４．ヒトの卵巣癌組織を増殖させる方法であって、以下の工程： (a) 免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に、ヒトの卵巣癌標本を移植する工程であって、ここで該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、工程；および (b) 該癌を該免疫不全マウス内で増殖させる工程、を包含する、方法。１５．前記マウスがヌードマウスである、請求項１２から１４のいずれか一つに記載の方法。１６．前記マウスがSCIDマウスである、請求項１２から１４のいずれか一つに記載の方法。１７．乳癌の治療の有効性を評価する方法であって、以下の工程： (a) 免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に、ヒトの乳癌標本を移植する工程であって、ここで該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、工程； (b) 該免疫不全マウスを候補治療に曝露する工程；および (c) 移植された標本の大きさの変化、腫瘍細胞死の程度、および／または該マウス内の転移の拡散のレベルを測定し、そしてそれから該候補の治療の有効性を決定する工程、を包含する、方法。１８．前立腺癌の治療の有効性を評価する方法であって、以下の工程： (a) 免疫不全マウスの皮下または性腺脂肪パッド内に、ヒトの前立腺癌標本を移植する工程であって、ここで該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、工程； (b) 該免疫不全マウスを候補治療に曝露する工程；および (c) 移植された標本の大きさの変化、腫瘍細胞死の程度、および／または該マウス内の転移の拡散のレベルを測定し、そしてそれから該候補治療の有効性を決定する工程、を包含する、方法。１９．卵巣癌の治療の有効性を評価する方法であって、以下の工程： (a) 免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に、ヒトの卵巣癌標本を移植する工程であって、ここで該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、工程； (b) 該免疫不全マウスを候補治療に曝露する工程；および (c) 移植された標本の大きさの変化、腫瘍細胞死の程度、および／または該マウス内の転移の拡散のレベルを測定し、そしてそれから該候補治療の有効性を決定する工程、を包含する、方法。２０．前記マウスがヌードマウスである、請求項１７から１９のいずれか一つに記載の方法。２１．前記マウスがSCIDマウスである、請求項１７から１９のいずれか一つに記載の方法。２２．前記治療が免疫療法である、請求項１７から１９のいずれか一つに記載の方法。２３．前記治療が遺伝子治療である、請求項１７から１９のいずれか一つに記載の方法。２４．前記治療が食事療法である、請求項１７から１９のいずれか一つに記載の方法。２５．ヒトの癌のマウスモデルを作製する方法であって、以下の工程： (a) 第１の免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に、ヒトの癌標本を移植する工程であって、ここで癌は、乳癌、卵巣癌、または前立腺癌である、工程； (b) 移植された癌標本の一部を取り出す工程；および (c) 次に、第２の免疫不全マウス内に該一部を移植する工程、を包含し、ここで第１および第２の免疫不全マウスは機能的Ｔ細胞を欠く、方法。２６．腫瘍応答性のヒト細胞溶解性Ｔリンパ球を産生する方法であって、以下の工程： (a) 免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に、ヒトＴリンパ球を含むヒトの癌標本を移植する工程であって、ここで、癌は、乳癌、卵巣癌、または前立腺癌であり、該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、工程； (b) 該免疫不全マウス内で、該ヒトＴリンパ球を増殖させる工程； (c) 該標本を保有する免疫不全マウスからヒト細胞溶解性Ｔリンパ球を単離する工程；および (d) 該細胞溶解性Ｔリンパ球を癌細胞を殺傷する能力について評価し、そしてそれから腫瘍応答性のヒト細胞溶解性Ｔリンパ球を同定する工程、を包含する、方法。２７．前記移植工程の前に、前記免疫不全マウスが、ヒトリンパ組織と共に再増殖される、請求項２６に記載の方法。２８．抗腫瘍抗血清を産生する方法であって、以下の工程： (a) 免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に、ヒトＢ細胞を含むヒトの癌標本を移植する工程であって、ここで癌は、乳癌、卵巣癌、または前立腺癌であり、そして該免疫不全マウスが機能的T細胞を欠く、工程； (b) 該免疫不全マウス内で、該ヒトＢ細胞を増殖させ、そしてヒト抗腫瘍抗体を産生する工程； (c) 該免疫不全マウスから抗血清を単離する工程；および (d) 該抗血清を癌細胞に結合する能力について評価し、そしてそれから抗腫瘍抗血清を同定する工程、を包含する、方法。２９．抗腫瘍性モノクローナル抗体を産生する方法であって、以下の工程： (a) 免疫不全マウスの性腺脂肪パッド内に、ヒトＢ細胞を含むヒトの癌標本を移植する工程であって、ここで癌は、乳癌、卵巣癌、または前立腺癌であり、そして該免疫不全マウスが機能的Ｔ細胞を欠く、工程； (b) 該免疫不全マウス内で、該ヒトＢ細胞を増殖させ、そしてヒト抗腫瘍抗体を産生する工程； (c) 該免疫不全マウスからヒト抗体産生Ｂ細胞を単離する工程； (d) 単離されたＢ細胞からモノクローナル抗体を生成する工程；および (e) 該モノクローナル抗体を癌細胞に結合する能力について評価し、そしてそれから抗腫瘍モノクローナル抗体を同定する工程、を包含する、方法。３０．前記移植工程の前に、前記免疫不全マウスがヒトリンパ組織と共に再増殖される、請求項２８または２９のいずれかに記載の方法。３１．患者の癌を処置する方法であって、ここで該癌は、乳癌、卵巣癌、または前立腺癌であり、請求項２６に記載の方法に従って産生された腫瘍応答性細胞溶解性Ｔリンパ球を患者に投与する工程を包含する、方法。３２．患者の癌を処置する方法であり、ここで該癌は乳癌、卵巣癌、または前立腺癌であり、請求項２９に記載の方法に従って産生された抗腫瘍モノクローナル抗体を患者に投与する工程を包含する、方法。