JP2000500733A

JP2000500733A - 相互作用分子結合体

Info

Publication number: JP2000500733A
Application number: JP9511275A
Authority: JP
Inventors: エス．ホフマン，アラン; エス．ステイトン，パトリック
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2000-01-25
Also published as: ATE216594T1; AU7011096A; EP0851768A2; EP0851768B1; DE69620898D1; US5998588A; DE69620898T2; WO1997009068A2; CA2230557A1; AU716154B2; WO1997009068A3

Abstract

(57)【要約】種々のアッセイ、分離、プロセシング、および他の使用で有用な、部位特異的結合体を形成するためのポリマーおよび相互作用分子のような刺激応答成分の能力の組合せを開示する。ポリマー鎖構造および容量を、pH、温度、光、または他の刺激の変化により操作し得る。相互作用分子は、抗体、レセプター、もしくは酵素のようなタンパク質またはペプチド、リガンドに特異的に結合し得るポリサッカライドまたは糖タンパク質、あるいはアンチセンス、リボザイム、およびアプタマーのような核酸、あるいは環境または製造プロセスにおける有機分子または無機分子に対するリガンドのような、生体分子であり得る。刺激応答ポリマーは特異的な部位で認識生体分子に結合するので、ポリマーを、例えば、ストレプトアビジンのビオチン結合部位、抗体の抗原結合部位または酵素の活性な基質結合部位のような、近接した結合部位にてリガンド-生体分子結合を変化させるための刺激により操作し得る。結合は完全にブロックされ得る（すなわち、結合体がオン-オフスイッチとして作用する）かまたは部分的にブロックされ得る（すなわち、結合体が結合を部分的にブロックするかまたはより大きなリガンドの結合のみをブロックするための加減抵抗器として作用する）。一旦リガンドが結合したら、それはまた１つ（またはより多く）の結合ポリマーを刺激することにより結合部位から排出され得てリガンドの排出を引き起こし、そして同類の物がそれに接着する。あるいは、ポリマー-結合生体分子の選択的な分割、相分離または沈殿が、刺激応答成分の適切な環境刺激への曝露により達成され得る。

Description

【発明の詳細な説明】相互作用分子結合体発明の背景本出願は、Allan S．HoffmanおよびPatrick S．Staytonにより1995年９月１日に出願された、米国特許出願第60/003,148号に対して優先権を主張する。本出願は、一般に、アフィニティー分離、薬物送達、センサーおよび他の生体工学適用における使用のための分子結合体の領域にある。多くの技術（例えば、鍵となるデバイス成分として分子認識工程を利用する分離およびセンサー）が存在する。これらの分子認識工程は、生体分子により、または合成レセプターにより媒介され得る。生物学的認識プロセスはまた、生体分離(bioseparation)、細胞培養、診断、バイオセンサー、標的化薬物送達、ならびに酵素および細胞バイオプロセスを含む、多くの臨床上の、産業上のおよび実験室での適用で広く利用されている。これらはまた薬物の発見、生物学的科学における基礎的な研究および情報処理における重要な新規のかつ潜在的な使用を有する。認識プロセスにおける中心的な事象は、その特異性と親和性のまれな組合せのために注目に値する抗体-抗原結合反応または酵素-基質結合工程のような、レセプターとリガンドとの間の相互作用または特異的な結合に関与する。この結合工程を制御する能力は、現存している技術における改善に通じ得るだけではなく、医学、生物工学、および産業上のプロセシングにおける全く新規の適用をまた作製し得る。他の分子とのタンパク質結合体は、認識からのタンパク質の保護（例えば、PE G化(PEGylated)タンパク質）、標的化目的ならびに分離および診断技術（例えば、ビオチン-ストレプトアビジン反応および抗体-媒介アフィニティークロマトグラフィーおよびELISAにおける場合の抗体-酵素結合体）に長く使用されてきた。これらのほとんどは、PEG化タンパク質、抗体-薬物生体結合体およびポリマー- 薬物結合体のような、非部位特異的結合体の例である。ポリマーおよび低分子はまた、他の目的のためにタンパク質に部位特異的に結合している。例えば、Chilkotiら(1993)により報告されたように、刺激応答性ポリマーは、ポリマー：タンパク質化学量論を正確に制御し、そしてタンパク質活性部位からこのポリマーを離して位置させるために遺伝子操作されたタンパク質に部位特異的に結合され、その結果、物理的な相分離が認識部位結合活性を妨害することなく行われ得た。遺伝子操作されたシステイン残基を介するポリエチレングリコールのタンパク質への部位特異的な結合がまた、GoodsonおよびKaktre 、1990；およびBenharら、1994により最近報告された。これらの研究は、結合したポリマーが活性部位から離れて付着することを確実にすることにより、それらの活性を妨害することなく治療的タンパク質の循環時間および安定性を増大するように設計された。Slinkinら、1992により報告されたように、ポリリジンポリマーはまた、存在するチオール基を介して抗体フラグメントに結合して、画像化および治療的抗体のより良い生体分布およびより高い生体活性を達成した。発蛍光団または薬物のような低分子の部位特異的結合のためにシステイン残基を操作する多くの例がStaytonら、1988により記載されている。光互換性色素結合を介したいくつかのタンパク質結合部位へのリガンドの光スイッチ可能な(photoswit chable)結合がまた、WillnerおよびRubin、1992；Willnerら、1993により報告されている。２つの光-相互転換可能な異性体として存在する光互換性色素は、タンパク質のリジンアミノ部位にランダムに結合された。タンパク質活性は異性化の状態に依存することが示され、そのためこのタンパク質は色素の光異性化により活性型と不活性型との間を切り替え得る。サッカライドに結合するコンカナバリンＡは、リジン残基に対するいくつかのチオフェンフルギド(thiophenfulgide )色素の非特異的な結合により制御されている(WillnerおよびRubin，1992)。アセチルコリンエステラーゼおよびキモトリプシンの光互換性酵素インヒビターを介して光調節された活性がまた、Biethら、1969により実証されている。タンパク質の認識能力にもかかわらず、タンパク質触媒作用に基づく技術である分離または送達は、材料およびプロセシング費用によりしばしば負担となる。これらの欠点は、タンパク質認識および標的分子への結合、反応キネテックス、ならびに標的分子またはその反応副産物の分離および精製のような、いくつかの基礎的な分子プロセスを制御する必要性に関する。親和性に基づく技術における標的リガンドの連続的な結合および放出を制御するための現在の方法は、一般に、固体表面上の親和性薬剤の固定に依存する。この固体表面は標的リガンドおよび他の種を含む溶液と接触しており、リガンドの親和性薬剤への特異的な結合、ならびに標的リガンドの溶出のための、強力な変性剤である化学物質および／またはpHまたはイオン強度の大きな変化を有する溶液の使用を許容する。プロセシング工程は一般に緩慢であり、大量の高価な緩衝液混合物を用いる長々しい平衡化を必要とし、従って費用のかかる分離においてしばしば主要な障害である。非標的分子の非特異的な結合はしばしば産物を汚染する。親和性に基づく技術における発展した溶出ストラテジーの必要が、文献で言及されてきた。（Yarmushら、Biotechnol ．Prog．8：168-178(1992))。同様に、タンパク質-リガンド検出システムを用いるバイオセンサー技術（例えば、環境的または生物学的な傾向(stream)分析）は、バイオセンサーを再生するために結合した標的の溶出を必要とする。現在の免疫吸着、バイオセンサーおよびクロマトグラフィープロセシング（例えば、溶出）ストラテジーは、より速い応答時間ならびによりきれいな、より純粋なおよびより濃縮された分離傾向を提供する、制御され誘発された放出工程から大いに利益を得る。費用に対し効果の高い単離および治療的相互作用分子の送達、予防措置のための迅速な診断ストラテジー、治療的分子、生体応答物質および生体適合性物質の制御されかつ標的化された送達、ならびに酵素に基づくプロセスの慎重な制御のための、医療およびプロセシング産業における切迫した必要性が存在する。同様に、費用に対し効果の高い分離および診断技術が、食品、農業および海洋産業において、ならびに環境試験および環境改善のために必要とされる。それゆえ、本発明の目的は、例えば、生物学的分子のような分子間の親和性または認識相互作用（例えば、レセプター-リガンド相互作用、酵素-基質相互作用、および核酸-相補性核酸相互作用）を調節するかまたは「スイッチオンまたはオフする(switch on or off)」ために、あるいはホスト-ゲスト複合体のような合成レセプターにより用いられ得る物質を提供することである。本発明のさらなる目的は、プロセシング、薬学的および医学的適用、ならびに分子結合に関する他の技術のためにこれらの物質を作製および使用するための方法を提供することである。発明の要旨種々のアッセイ、分離、プロセシング、および他の使用において有用である部位特異的結合体を形成するための刺激応答性成分および相互作用分子の能力の組み合わせを開示する。ポリマーを、pH、温度、光、または他の刺激の変化により操作し得る。相互作用分子は、(a)ペプチドまたはタンパク質（例えば、抗体、レセプター、または酵素）、(b)ポリサッカライドまたは糖タンパク質、あるいは(c)核酸（例えば、アンチセンス、リボザイム、およびアプタマー）のような生体分子であり得る。これらのすべてはリガンドまたはレセプター、あるいは有機化合物または無機化合物に対するリガンド（例えば、金属キレート剤）に特異的に結合する。刺激応答性化合物は、特異的な部位で相互作用分子に結合され、その結果、刺激応答性成分が、例えば、抗体の抗原-結合部位または酵素の活性部位のような、近接するリガンド結合部位でのリガンドの結合を改変するように操作され得る。結合は完全にブロックされ得る（すなわち、結合体がオン-オフスイッチとして作用する）かまたは部分的にブロックされ得る（すなわち、結合体が結合を部分的にブロックするための加減抵抗器として作用する）。部分的なブロックは、小さなリガンドが結合することをなお許容するがより大きなリガンドを全体としてブロックすることにより、選択的な結合をもたらすために用いられ得る。これらの結合体は、親和性結合、反応（触媒作用）、または「非結合」（分離）の間に相互作用分子および標的に所望でない妨害または損害を回避する、分子の相互作用（例えば、外部シグナルによるプロセスにおけるタンパク質認識工程または酵素反応工程のような）の正確な制御を提供する。相互作用分子結合システムは、広範な種々の分離、診断、反応、酵素プロセス、および送達適用に適応し易く、そして使用するのに経済的である。実施例は、タンパク質、ストレプトアビジンを遺伝子操作して結合部位を挿入し、次いで、Ｔ-応答性ポリマーであるポリNIPAAmを結合部位へ結合することによる、部位特異的結合体の形成を実証する。ストレプトアビジンのビオチン結合部位に対するポリマーの物理的な関係（構造）は反応の温度を変えることにより制御される。すなわち、低温では、100％のビオチンが結合し、より高い温度である37℃では、ほとんどのビオチンが結合しない。図面の簡単な説明図１aは、リガンド親和性スイッチとして機能する、タンパク質へ部位特異的に結合した刺激応答性のポリマーの概略図である。図１ｂは、刺激応答を増強する、グラフトおよびブロックコポリマー、ならびにランダムコポリマーの概略図である。図１ｃは、リガンド結合体の概略図である。図１ｄは、リガンド結合体とレセプター結合体との組合せの概略図である。図２ａ〜ｄは、三角で示されるリガンドまたはリガンドの認識基との応答性ポリマー-相互作用性分子結合体の親和性スイッチ作用の４つの異なる様式の概略図である。チオールのような独特の官能基が、結合ポケットの中（図２ａおよび図２ｂ）あるいは近く（図２ｃ）の選択された部位、または活性部位に構造的に連結した離れた部位、あるいは活性部位へのリガンド結合に影響を及ぼし得る（図２ｄ）離れた部位に位置する。結合体を適切な刺激へ曝すことで、結合が生じるかまたは結合が妨げられ、あるいは図２Ｃおよび図２Ｄに示すように結合部位のコンフォメーションが変化する。図３ａ〜ｃは、表面、または界面、あるいは二相分配分離のために設計された、外因的に誘引され、かつリバースエンジニアリングされる(reverse engineere d)ポリマー-タンパク質結合体の概略図である。図３ａは、折り畳まれていないまたは弛緩した状態の刺激相互作用性ポリマーを示す。図３ｂは、刺激に曝露された後の折り畳んだ形態の刺激相互作用性ポリマーを示す。図３ｃは、図３ａの折り畳んでいないまたは弛緩した形態と図３ｂの完全に折り畳んだ形態との間の中間状態の刺激相互作用性ポリマーを有すること以外は、同一の結合体を示す。図４は、親和性スイッチと分離性スイッチとの組合せの概略図である。ここで、シグナル１(第１刺激)によりポリマーが沈澱し、最初の選択相または界面の分離を指向させ、一方でシグナル２(第２刺激)を、リガンドを放出するために使用する。同様のプロセスを、図３に示す２つの液相系における相分離およびリガンド放出のために使用し得る。図５は、分離適用における、応答性ポリマー/操作されたタンパク質結合体の使用の概略図である。支持体は、従来のクロマトグラフィー用樹脂、HPLC支持体、粒子状または多孔性の支持体（例えば、微細孔性膜または中空繊維）、バイオリアクター表面、または他の固定化手段であり得る。記載したように、レセプターは、刺激応答性ポリマーが結合されているストレプトアビジンであり、そしてリガンドは、ビオチン化タンパク質(例えば、ビオチン化された抗体、タンパク質または酵素)であり、これは、分析物または他の標的分子のための結合部位、および第２の異なる刺激に曝露した際に結合をブロックするかまたは結合を可能にし得る刺激応答性分子をさらに含む。同一の様式を、水性の二相分離に使用し得、ここでポリマー-タンパク質結合体は、１つまたは他の相、あるいはその間の界面で可逆的に分配される。図６は、溶液中で標的分析物(リガンド)および第２の標識化レセプターを複合体化するための、刺激応答性ポリマー-相互作用性分子結合体組成物を使用するイムノアッセイフォーマットを例示する。これに続く相分離で、固体界面または個別の液相または液体-液体界面でシグナルを単離し得る。図７は、ビオチン化モノクローナル抗体およびビオチン化薬物の両方により複合体化されたストレプトアビジン送達タンパク質から薬物を標的化して送達するための、結合した相互作用性分子の実施態様を例示する。ビオチン化薬物結合部位をまた刺激応答性ポリマーと結合させ、その結果、ポリマーが外部刺激(例えば、光パルス)によって誘因される場合、ビオチン化薬物は結合ポケットから排出され、標的細胞に送達される。２つのポリマーは、同一のまたは異なる刺激によって誘引され得る。図８は、薬物が、薬物に対するリンカーのpH依存的開裂によって放出される場合の、細胞への刺激応答性ポリマー-相互作用性分子結合体の送達の概略図である。図９ａ〜ｃは、表面への刺激応答性ポリマー-相互作用性分子結合体の物理的または化学的な固定化のための、３つの一般的な方法の概略図である。３つの一般的な方法の最初の１つにおいて、(ａ)最初に相互作用性分子を、非特異的吸着 (例えば、イオン性、疎水性など)によって、または表面リガンド基への親和性結合によって、または反応性表面基に化学的に結合することによって固定化し得、その後、表面に固定化した相互作用性分子に応答性ポリマーを化学的に結合する、または(ｂ)最初に、応答性ポリマーを相互作用性分子に化学的に結合し、次いで、結合体を非特異的吸着によって、または表面リガンド基への親和性結合によって、または反応性表面基への化学的結合によって、表面上に固定化する、または(ｃ)最初に、応答性ポリマーを表面に物理的に吸着させるか、または反応性表面基に応答性ポリマーを化学的に結合させ、その後、表面に固定化した応答性ポリマーに相互作用性分子を化学的に結合させる。図１０は、ビオチン結合活性の温度依存性と遊離ポリ(NIPAAm)の曇り点挙動との間の関係を示す。活性プロットは、４℃(100％結合)と比較したそれぞれの温度でのビオチン結合活性の変化の％を示す。遊離ポリマーの曇り点挙動を、４℃ (100％)から上限温度37℃までの吸光度の変化の％としてプロットする。図１１ａは、応答性コポリマーと酵素との結合体を示し、ここで、応答性コポリマーは、コポリマーが結合している同一の酵素によって分解され得る連結によってコポリマー鎖骨格に結合されたペンダント薬物分子を有する。ポリマーが刺激されてそのコイルが折り畳む場合、この酵素はオフにされ、そしてペンダント連結の酵素分解によって薬物を放出し得ない；逆の刺激を適用した場合、酵素は活性になり、そしてペンダント連結の酵素分解によって薬物分予を放出する。ゲル内に捕獲された酵素を有するハイドロゲルを図１１に示す。図１２は、応答性ポリマーをタンパク質へ「結合する」ためのssDNAフックの概略図である。図１３は、２成分開始剤(iniferter)系を使用する、２つのカルボキシル末端基を有するPNIPAAmの合成を例示する。図１４は、連鎖移動遊離ラジカル共重合による、末端水酸基を有するポリ(NIP AAm/AAc)の合成を例示する。図１５は、pH4.0および7.4でのクエン酸＋リン酸緩衝液中のポリ(NIPAAm/AAc) の0.2％溶液の吸光度対温度のグラフである。緩衝液のイオン強度は、NaClの添加によって調節した。NIPAAm/AAc/2-ME/AIBNのモル比：100/1/4/1、重合時間：2 0分、重合温度：60℃。図１６は、刺激相互作用性分子と相互作用性分子(例えば、酵素、抗体、またはレセプタータンパク質)との結合体の環境センサーとしての使用の概略図である。このセンサータンパク質は、刺激に曝露されるまで、保護されいてそして不活性である。相互作用性分子は、分析物、毒素、インヒビター、または汚染因子 (foulingagent)のような分子に結合する。センサーは、刺激の除去(または、第２の刺激への第２の刺激相互作用性分子の曝露(示さない))によって再生される。発明の詳細な説明１．刺激応答性-相互作用性分子結合体刺激応答性成分(最も好ましくはポリマー)とリガンド結合相互作用性分子とを合わせて、環境に応答性の相互作用性分子結合体を生成する。刺激応答性成分を、相互作用性分子に、その相互作用性分子の所望の機能に影響する部位(例えば、リガンドレセプター相互作用の結合ポケットの近く)で結合させる。次いで、認識、複合体化、反応、分離、および送達過程における結合体の相互作用性分子部分の機能化を、１つ以上の外部刺激(例えば、温度、pH、光、または電場)の変化によって制御し得る。この変化によって、刺激応答性成分が、結合部位で、あるいはその近くまたは遠く(アロステリック性)で構造的変移(例えば、折り畳みまたは沈澱、あるいはそれらの逆)を導き得るコンフォメーション変化または物理化学的変化を受け、それによって、この過程における相互作用性分子の活性が調節される。図１Ａは、タンパク質14に結合した刺激相互作用性分子16の結合体10の概略図である。ここで、刺激に曝露されない場合は刺激相互作用性分子16はタンパク質 14の結合部位12をブロックし、そして刺激へ曝露された際には結合部位12をブロックしない。またはその逆もある。結合部位12がブロックされない場合、リガンド18がタンパク質14に結合し得る。好ましい実施態様において、刺激応答性成分は、温度、光、pH、イオン、または圧力の変化に応答して、可逆的なコンフォメーション変化または物理化学的変化(例えば、折り畳み/展開変移、可逆的沈澱挙動、または他のコンフォメーション変化)を示す合成または天然のポリマーである。図１Ｂは、図１Ａの刺激相互作用性分子16の代表的な形態であり、線状のホモポリマーまたはコポリマー、くし状またはブロック状コポリマーのグラフト、および星型ポリマーを含む。図１Ｃは、別の実施態様の概略図であり、ここで、刺激応答性分子16はリガンド18に結合しており、このリガンドは、刺激の存在下で、タンパク質14の結合部位12への結合からブロックされるかまたはその逆である。図１Ｄは、なお別の実施態様の概略図であり、これは、本質的に図１Ａおよび図１Ｃの実施態様の組合せである。タンパク質14は、最初の刺激へ曝露した際に結合部位12をブロックする刺激応答性ポリマー20を含む。リガンド18はまた、刺激応答性ポリマー16に結合されており、このポリマーは、第２の異なる刺激へ曝露した際に結合部位12へのリガンド18の結合をブロックする。これにより、結合親和性を変化させ、ならびに結合を可能にするかまたは妨げるように作用させる手段が提供される。１．刺激応答性成分多くのポリマーが、溶液pH、イオン強度、溶媒組成、温度、光および電場などのような環境条件における小さな変化に対して、大きな物理的な変化を有して応答する。これらのポリマーは、刺激応答性、環境感受性、「知的な（intelligen t）」または「スマートな（smart）」ポリマーといわれる。Hoffman，A.S.,「医学およびバイオテクノロジーにおける知的ポリマー」,Macromol ．Symp.,98,645- 664(1995)；または：Artif ．Organs,19,458-467(1995)。本明細書中に記載される結合体を作製するために有用である刺激応答性成分は、ポリマーのコイルにおける顕著なコンフォメーション変化を引き起こす刺激に感受性がある成分、および問題の相互作用分子上の特異的な基（例えば、リガンド）と反応性である基を含有するように操作され得る成分の任意のものであり得る。本明細書中に記載される例示的なポリマーは、温度感受性、pH感受性、イオン感受性および/または光感受性のポリマーである。Hoffman，A.S．「医学およびバイオテクノロジーにおける知的ポリマー」,Artif ．Organs，19，458-467(19 95)；Chen，G.H.およびA.S．Hoffman「タンパク質結合化における可能な使用のための新たな温度応答性およびpH応答性コポリマー」Macromol ．Chem．Phys.，1 96 ，1251-1259(1995)；Irie，M.およびD．Kungwatchakun，「光応答性ポリマー。トリフェニルメタンのロイコ誘導体を有するポリアクリルアミドゲルのメカノケミストリー」Maokromol ．Chem．Rapid Commun.，5，829-832(1985)；およびIr ie,M.，「溶液およびゲル相におけるポリマーの光誘導性可逆性コンフォメーション変化」,ACS Polym ．Preprints，27(2)，342-343(1986)；これらは、本明細書中で参考として援用する。本明細書中に記載される結合体において有用な刺激応答性オリゴマーおよびポリマーは、分子量の範囲が約1,000〜30,000ダルトンであり、反応性基を鎖の一端または両端に有して合成され得る。好ましい実施態様においては、これらの合成は、本明細書中に記載のように、そして以下により記載されるビニル型（viny l-type）モノマーの連鎖移動開始（chain transfer-initiated）フリーラジカル重合に基づく。(1)Tanaka,T.，「ゲル」,Sci ．Amer.，244，124-138(1981)；2)O sada，YおよびS.B．Ross-Murphy，「知的なゲル」,Sci ．Amer.，268，82-87(199 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iloring）」を可能にする。遺伝子操作された温度感受性ペプチド配列は、結合領域の付近またはその中のタンパク質の末端において構築され得る。pH、光、温度、または化学物質感受性であるペプチド配列もまた報告されており、そしてレセプターまたはリガンドへの結合を介して、あるいはタンパク質レセプターまたは酵素への遺伝子的な組み込みを介して、分子認識工程を制御するために使用され得る。ａ．温度応答性ポリマー相互作用分子に結合され得る多くの異なるタイプの温度応答性ポリマーの例示的な実施態様は、N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAAm）のポリマーおよびコポリマーである。ポリNIPAAmは熱感受性ポリマーであり、その下部臨界溶液温度（LCST）または曇り点である32℃で水から沈澱する（HeskinsおよびGuillet,J ． Macromol．Sci.-Chem. A2:1441-1455(1968)）。ポリNIPAAmがアクリルアミドのような、より親水性のコモノマーと共重合されると、LCSTは上昇する。それがN- t-ブチルアクリルアミドのような、より疎水性のコモノマーと共重合されると、その反対が起こる。NIPAAmとより親水性のモノマー（例えば、AAm）とのコポリマーは、より高いLCST、および沈澱のより広い温度範囲を有し、一方、より疎水性のモノマー（例えば、N-t-ブチルアクリルアミド）とのコポリマーは、より低いLCSTを有し、そして通常はPNIPAAmのシャープな遷移特性をより保持しそうである（TaylorおよびCerankowski,J ．Polymer Sci. 13:2551-2570(1975)；Priest ら,ACS Symposium Series，350，255-264(1987)；HeskinsおよびGuillet,J.Macr omol ．Sci.-Chem. A2:1441-1455(1968),これらの開示は本明細書中で援用する）。より高いまたはより低いLCSTおよび沈澱のより広い温度範囲を有するコポリマーが生成され得る。例えば、米国特許第4,780,409；MonjiおよびHoffman,Appl ．Biochem．Biotech nol. 14: 107-120(1987)に記載のように、ポリ(NIPAAm)のような刺激応答性ポリマーは、モノクローナル抗体のような親和性分子とランダムに結合されている。活性化された基（例えば、タンパク質への結合のための）が、PNIPAAmの骨格に沿ってランダムに形成され、そしてモノクローナル抗体上のリジンのアミノ基へランダムに結合された。次いで、この結合体は温度誘導性相分離イムノアッセイへにおいて応用された。活性化されたPNIPAAmはまた、Hoffmanおよびその共同研究者により、プロテインＡ、種々の酵素、ビオチン、リン脂質、RGDペプチド配列および他の相互作用分子へ結合されている。ランダムポリマー-相互作用分子結合体は、熱誘導性相分離工程に基づく種々の応用において用いられている（Ch enおよびHoffman,Biomaterials 11: 631-634(1990)；Miuraら,Abstr ．17th Ann. Meet．Soc．Biomaterials (1991)；Wuら,Polymer 33: 4659-4662(1992)；ChenおよびHoffman,Bioconjugate Chem. 4: 509-514(1993)；Morrisら,J ．Anal．Bioch em. 41: 991-997(1993)；ParkおよびHoffman,J ．Biomaterials Sci．Polymer Ed . 4: 493-504(1993)；ChenおよびHoffman,J ．Biomaterials Sci．Polymer Ed. 5 : 371-382(1994)）。その他もまた、タンパク質をPNIPAAm（NguyenおよびLuong,Biotech ．Bioeng. 34: 1186-1190(1989)；Takeiら,Bioconj ．Chem. 4: 42-46(19 93)）およびpH感受性ポリマー（Fujimuraら,上記）にランダムに結合させている。これらのポリマー-タンパク質結合体の大部分は、ポリマーの骨格に沿ったランダムな活性化された基のペンダントを介してポリマーに結合しているランダムなタンパク質のリジンのアミノ基を含む。より最近には、通常一つのみの反応末端基を有する比較的低分子量（MW）のポリマー（オリゴマーと呼ばれる）を生じる連鎖移動開始重合に基づく新たな方法が用いられている（しかし、この方法は、各末端において反応性基を有するオリゴマーの合成に適応され得る）（Otsu，T ．ら(1992)Eur ．Polym．J.,28，1325-1329）（ChenおよびHoffman，1993,上記； ChenおよびHoffman，1994,上記およびTakeiら,上記）。アミノ終結（amino-term inated）ポリマーの合成は、開始剤としてのAIBNおよび連鎖移動試薬としての1- アミノエタンチオール-塩酸塩の存在下で、NIPAAmのラジカル重合により進行する。-COOHまたは-OHの末端基を有する鎖を合成するために、カルボキシル-またはヒドロキシ-チオールの連鎖移動剤が、それぞれ、アミノーチオールの代わりに用いられている。末端反応性ポリマーの合成は、連鎖移動開始および終結機構に基づいていることに留意するべきである。これは、1000と25,000〜30,000との間の分子量を有する比較的短いポリマー鎖を生じる。最も短い鎖（10,000未満の分子量）は、通常「オリゴマー」と呼ばれる。異なる分子量のオリゴマーは、単に連鎖移動試薬に対するモノマーの割合を変え、そして開始剤のレベルと共に、それらの濃度を制御することによって合成され得る。ビニルモノマーのオリゴマー一方の末端に反応性基を有するNIPAAm（または他のビニルモノマー）のオリゴマーは、NIPAAmのラジカル重合により、開始剤としてAIBN、ならびに一方の末端にチオール（-SH）基および他方の末端に所望の「反応性」基（例えば、−OH、 −COOH、−NH₂）を有する連鎖移動剤を用いて調製される。ChenおよびHoffman、Bioconjugate Chem. 4:509-514(1993)、およびChenおよびHoffman、J ．Biomater ials Sci．Polymer Ed. 5:371-382(1994)、これらのそれぞれは、参考として本明細書中に援用される。DMF中の適切な量のNIPAAm，AIBNおよび連鎖移動剤を厚壁の重合チューブ内に置き、そして混合物を、凍結および真空、次いで解凍することにより脱気する（４回）。最後に、冷却後、チューブを真空にし、次いで密封後重合する。チューブを60℃の水浴中に４時間浸す。生じるポリマーを、ジエチルエーテル中での沈澱により単離し、重量を測定し収量を決定する。ポリマーの分子量を、滴定（末端基がアミンまたはカルボキシルである場合）または気相浸透圧法（VPO）のいずれかにより決定する。pH感受性のオリゴマーまたはポリマーが所望の場合、塩基性モノマー（例えば、アミノエチルメタクリレート（ AEMA）またはビニルホルムアミド（これは、重合後、ポリビニルアミンに加水分解され得る））が使用され得るように、酸性モノマー、例えば、メタクリル酸またはアクリル酸、マレイン酸または無水物、AMPS、または上記のリン酸エステルモノマー（「Phosmer」）が使用され得る。ビニル型コポリマーの分子量は、重要な反応物の濃度および重合条件を変化させることにより制御され得る。しかし、連鎖移動開始によるビニルに基づくオリゴマー合成を用いて、約30kDを大きく越える分子量を達成することは困難である。さらに、アミノ−チオール連鎖移動剤は、ヒドロキシルチオールまたはカルボキシルチオール（これらは所望され得ない）よりも広い分子量分布を生じるので、-COOH末端ポリマーが合成され得る。そして、-COOH末端基は、カルボジイミドで活性化し、そしてジアミンを活性エステル基に結合することによりアミン基に変換される。温度感受性オリゴペプチドはまた、結合体に組み込まれ得る。ｂ．ｐＨ感受性ポリマー本明細書中に記載の結合体の作製に有用な合成pH感受性ポリマーは、典型的には、以下のpH感受性ビニルモノマーに基づく：例えば、アクリル酸（AAc）、メタクリル酸（MAAc）、マレイン酸無水物（MAnh）、マレイン酸（MAc）、AMPS（2 -アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸）、N-ビニルホルムアミド（N VA）、N-ビニルアセトアミド（NVA）（最後の２つは、重合後、ポリビニルアミンに加水分解され得る）、アミノエチルメタクリレート（AEMA）、ホスホリルエチルアクリレート（PEA）またはホスホリルエチルメタクリレート（PEMA）。pH 感受性ポリマーはまた、アミノ酸からポリペプチド（例えば、ポリリジンまたはポリグルタミン酸）として合成される得るか、または天然に存在するポリマーから誘導され得る。そのような天然に存在するポリマーは、例えば、タンパク質（例えば、リゾチーム、アルブミン、カゼインなど）、または多糖類（例えば、アルギン酸、ヒアルロン酸、カラゲナン、キトサン、カルボキシメチルセルロースなど）、またはDNAのような核酸である。pH応答性ポリマーは、通常、-OPO(OH )₂、-COOH、または-NH₂基のようなペンダント状のpH感受性基を含有する。pH応答性ポリマーについて、pHの小さな変化は、PNIPAAmの溶液への温度の効果（Fuj imuraら、Biotech ．Bioeng. 29:747-752(1987)）に類似して、相分離を刺激する。熱感受精NIPAAmと少量（例えば、10mol％未満）のpH感受性コモノマー（例えば、AAc）とのランダム共重合により、コポリマーは、温度およびpHの両方の感受性を示す。そのLCSTは、ほとんど影響されず、ときには、コモノマーがイオン化しないpHで数度低下さえする。しかし、LCSTは、pH感受性基がイオン化する場合、劇的に上昇する。pH感受性モノマーが高い量で存在する場合、温度感受性成分のLCST応答は、「無視され」得る（例えば、相分離は、100℃までおよび100℃ を越えると見られない）。一方、pHおよび温度に感受性モノマーのグラフトコポリマーおよびブロックコポリマーは、pHおよび温度の両方の転移を独立的に保持して合成され得る。Chen，G.H.およびA.S．Hoffman、Nature，373:49-52(1995) 。ｃ．光感受性ポリマー光応答性ポリマーは、通常、ポリマー主鎖にぶら下がった（pendant）発色基またはポリマー主鎖に沿った発色基を含み、そして適切な波長の光に曝されたとき、トランス体からシス体に異性化し得る。これは、双極性で、より親水性であり、そして可逆的なポリマーのコンホメーション変化を引き起こし得る。他の光感受性化合物はまた、光刺激により、相対的に非極性疎水性の非イオン化状態から親水性のイオン化状態に変換され得る。同じポリマーにおいて複数の環境感受性（例えば、温度および光感受性）を共重合により組み込むこともまた可能である。ペンダント状の光感受性基ポリマーの場合、光感受性色素（例えば、芳香族アゾ化合物またはスチルベン誘導体）を、反応性モノマー（例外は、既にビニル基を有するクロロフィリンのような色素である）に結合し、次いで単独重合または他の通常のモノマーと共重合し得るか、または上記の連鎖移動重合を用いて温度感受性またはpH感受性モノマーと共重合し得る。光感受性基はまた、異なる（例えば、温度）応答性ポリマーの一端に結合され得る。このような色素結合モノマー合成の多数のプロトコルが公知である。KungwatchakunおよびIrie（前掲）、およびMamadaら（前掲）。ペンダント状および主鎖の光感受性ポリマーの両方は、合成され得、そして本明細書中に記載の方法および適用に有用な組成物であるが、その好ましい光感受性ポリマーおよびコポリマーは、典型的には、ペンダント状の光感受性基を含むビニルモノマーから合成される。これらのタイプのモノマーから作られるコポリマーは、「正常な」水溶性コモノマー（例えば、アクリルアミド）を用いて調製され、そしてNIPAAmまたはAAcのような温度またはpH感受性コモノマーを用いても調製される。光感受性化合物は、特定の波長の光を吸収する場合に、異性化するかまたはイオン化される色素分子であり得る。それらは、疎水性コンホメーションから親水性コンホメーションに変換される。あるいは、光感受性化合物は、特定の波長の光を吸収する場合に、熱を放つ他の色素分子であり得る。前者の場合、異性化単独では鎖の展開または崩壊を引き起こし得る。一方、後者の場合、ポリマーは、温度感受性である場合のみ、沈澱する。光応答性ポリマーは、通常、ポリマー主鎖にぶら下がった発色基を含む。使用されている典型的な発色基は、芳香族ジアゾ色素である（Ciardelli、Biopolyme rs 23:1423-1437(1984)；KungwatchakunおよびIrie、Makromol ．Chem.，Rapid C ommun. 9:243-246(1988)；LohmannおよびPetrak、CRC Crit ．Rev．Therep．Drug Carrier Systems 5:263(1989)；Mamadaら、Macromolecules 23:1517(1990)、これらのそれぞれは参考として本明細書中で援用される）。このタイプの色素は35 0〜410nmのUV光に曝されると、芳香族ジアゾ色素のトランス体（これは、より疎水性である）は、シス体（これは、双極性で、より親水性である）に異性化する。これはポリマーのコンホメーション変化を引き起こし、骨格に対する色素結合の程度および骨格の主ユニットの水溶解度に依存して、濁ったポリマー溶液は透明になる。約750nmの可視光に曝すと、その現象は元に戻る。このような光感受性色素はまた、骨格の主鎖に沿って組み込まれ得る。その結果、色素の光誘導異性化によるコンホメーションの変化は、ポリマー鎖のコンホメーション変化を引き起こす。ペンダント状色素の親水性状態または疎水性状態への変換はまた、個々の要求を引き起こしそのコンホメーションを拡大または崩壊させる。ポリマーの主鎖が光感受性基（例えば、アゾベンゼン色素）を含む場合、光刺激された状態は、光誘導の異性化の際、実際には、収縮し、そしてより親水性になる。ｄ．特異的なイオン感受性ポリマーそのコンホメーションを、例えば、K⁺またはCa⁺⁺のような特定のイオンへの曝露の作用として、ランダムなコンフォメーションから規則正しいコンホメーションに変化するカラゲナンのような多糖類もまた、刺激応答成分として使用され得る。別の例では、アルギン酸ナトリウムの溶液は、Ca⁺⁺に曝すことによりゲル化され得る。他の特異的なイオン感受性ポリマーは、ペンダント状のイオンキレート化基（例えば、ヒスチジンまたはEDTAなど）を有するポリマーを含む。ｅ．二重または多重感受性ポリマー光感受性ポリマーがまた、熱感受性である場合、骨格に沿って結合された発色団の、より疎水性またはより親水性のコンホメーションへのUVまたは可視光の刺激による変換はまた、ポリマー組成および温度に依存して、コポリマーの溶解または沈澱を刺激し得る。色素が光を吸収して、異性化を刺激するよりはむしろ熱エネルギーに変換する場合、局在化された加熱はまた、その系の温度が相分離温度に近いとき、PNIPAAmのような温度感受性ポリマーにおける相変化を刺激する。複数の感受性（例えば、温度および光感受性）をビニルモノマー共重合により１つの骨格に沿って組み込む能力は、ポリマー−操作されたタンパク質の応答性結合体の合成および性質に大きな多様性を与える。例えば、タンパク質認識部位に結合する色素が使用され得る。そして、光誘導異性化は、結合ポケットからの色素の放出または分離を引き起こし得る（Biethら、Proc ．Natl．Acad．Sci．US A 64: 1103-1106(1969)）。これは、色素を温度応答性ポリマー（例えば、Carbi deから得られるエチレンオキシド−プロピレンオキシド（EO-PO）ランダムコポリマー）の遊離末端に結合することにより親和性プロセスを操作するために使用され得る。これらのポリマー−(CH₂CH₂O)_x-(CH₂-CHCH₃-O)_y−は、２つの反応性の末端基を有する。相分離点は、EO／PO比に依存して広い範囲にわたって変化し得る。そして、一方の末端はリガンド色素で誘導体化され得、そして他方の末端は、ビニルスルホン（VS）のような-SH反応性基で誘導体化され得る。このように、ポリマーのVS反応性末端は、結合ポケットから離れた距離に位置する特定のシステイン部位に結合され得る。その結果、ポリマーの他の末端に結合した色素は、ポリマーのコンホメーションが拡大された状態にある場合、依然として、ポケット内に到達し、そして親和性結合し得る。次いで、温度刺激または光刺激と温度刺激との組合せのいずれかは、結合ポケットから色素を除くように作用し、さらなる親和性結合のために（または、それが酵素である場合、酵素活性のために）それを再生する。この機構を図２ｃに示す。ＥＯ／ＰＯのランダムコポリマーおよびブロックコポリマーエチレンオキシド（EO）およびプロピレンオキシド（PO）のランダムコポリマーはまた、LCSTまたはCPを有し（「ポリエチレンオキシド」、F.E．BaileyおよびJ.V．Koleske Academic Press，NY(1976)）、そして２つの反応性末端基を有する。従って、それらは一方の末端により操作されたタンパク質に結合され得、そして他の反応物（例えば、図２Ｃに記載される光感受性リガンド）は、他方の末端に結合され得る。温度感受性のブロックコポリマーはまた、（BASFから）入手可能である。PEO−PPO−PEOのトリブロックは、Pluronics^TMまたはポロキサマー（poloxamer）と呼ばれ、そしてテトラブロックは、Tetronics^TMまたはポロキサミン（poloxamine）と呼ばれる。EO−POのランダムコポリマーまたはブロックコポリマーの場合、種々の反応性末端基を有する、種々の組成および分子量のこれらのポリマーを、Shearwater Polymers，Inc．（Huntsville，AL）から入手することができる。組成は、その曇点について入手できるデータに基づいて選択される。（BASFカタログ、および「ポリエチレンオキシド」、F.E．BaileyおよびJ .V．Koleske Academic Press，NY(1976)）。ビニルコポリマーの場合よりも、広い範囲の分子量のこれらのコポリエーテルが調製され得る。なぜなら、それらの合成は、遊離ラジカルの連鎖移動開始プロセスを使用しないからである。末端基の誘導体化オリゴマーの反応性末端基は、次いで、特定の基（例えば、ビニルスルホンまたはマレイミド）により誘導体化される。これらは、結合される部位特異的な基（例えば、システインのチオール官能性）と選択的に反応する。マレイミドまたはビニルスルホン基を導入するためには、アミン末端化オリゴマーが好ましい。ポリマーのアミン末端基は、チオール反応性を提供するために、マレイミドと結合され得る（Chilkoteら、1993）。ヒドロキシル末端のポリマーは、過剰のジビニルスルホンとの反応によりビニルスルホンと結合され得る。ビニルスルホンの末端基は、典型的には、タンパク質のチオール基との結合反応において、マレイミドよりも加水分解的により安定である。反応物の化学量論（stoichiometry）および反応条件の注意深い制御は、ポリマーの各末端で異なる官能基を有するニ官能性のビニル型ポリマー（例えば、ポリNIPAAm、あるいはEO／POのランダムコポリマーまたはブロックコポリマー）を生じ得る。２．相互作用分子本明細書中で使用する用語「相互作用分子」は、例えば、細胞膜上、または分子もしくは原子上の標的部位と特異的結合相互作用し得る任意の分子を含む。従って、相互作用分子は、リガンドおよびレセプターの両方を含む。ａ．相互作用分子の選択刺激応答性成分は、種々の異なる相互作用分子に結合され得る。相互作用分子として、以下が挙げられる：ペプチド、タンパク質、ポリサッカライドまたはオリゴサッカライド、糖タンパク質、脂質およびリポタンパク質、および核酸、ならびに規定された生物活性（例えば、抗生剤または抗炎症剤）を有し、そして例えば、細胞膜レセプターのような分子上の標的部位に結合する合成の有機または無機の分子。ひとつの好ましい実施態様において、相互作用分子は、所望の部位で刺激応答性成分のためのカップリング部位を挿入するために遺伝子操作されたタンパク質である。タンパク質相互作用分子の例は、抗体、レクチン、ホルモン、およびレセプター、ならびに酵素を含む、リガンド結合タンパク質である。特異的なたは非特異的に標的分子に結合する他の分子は、レセプターに結合する糖タンパク質上のポリサッカライドまたはオリゴサッカライド（例えば、炎症メディエーターのP-セレクチンおよびE-セレクチンのリガンド上の炭水化物）、および相補配列結合する核酸配列（例えば、リボザイム、アンチセンス、RNAase Pの外部のガイド配列、およびアプタマー）を含む。相互作用分子は、結合部位により特徴づけられる。それは、抗体もしくは酵素の活性部位、レセプターの結合領域、または他の機能的に等価な部位であり得る。これらの部位は、特に別に述べられない限り、相互作用分子の結合部位として集合的に呼ばれる。下記のように、刺激応答性成分を用いて、相互作用分子の結合部位への標的分子の結合を改変および／または操作する。特異的な結合パートナーとのその相互作用が刺激応答性成分の部位特異的な結合により制御され得るタンパク質の数は、非常に多い。これらは、例えば、抗体（モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、単鎖または他の組換え形態）、それらのタンパク質／ペプチド抗原、タンパク質／ペプチドホルモン、ストレプトアビジン、アビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、増殖因子、およびそれらのそれぞれのレセプター、DNA結合タンパク質、細胞膜レセプター、エンドソーム膜レセプター、核膜レセプター、ニューロンレセプター、視覚レセプター、および筋細胞レセプターを含む。改変され得るオリゴヌクレオチドは、DNA（ゲノムまたはcDNA）、RNA、アンチセンス、リボザイム、およびRNAase Pの外部のガイド配列を含み、そしてサイズは、短いオリゴヌクレオチドプライマーから完全な遺伝子までの範囲であり得る。炭水化物は、腫瘍関連炭水化物（例えば、Le^x、シアルLe^x、Le^y、および米国特許第4,971,905号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、腫瘍関連として同定された他のもの）、細胞接着レセプターと会合する炭水化物（例えば、Phillipsら、Science 250:1130-1132( 1990)）、ならびに細胞膜レセプターに特異的である他の特異的な炭水化物結合分子およびその模倣体を含む。一つの実施態様において、刺激応答性成分がポリペプチドである場合、それは、標的相互作用分子、特にタンパク質に、遺伝子操作されたチオール付着部位で結合され得るか、または結合部位または活性部位に関して適切な位置でDNA配列内に遺伝子的に融合され得る。（Angew ．Chem．Int．Ed．Engl. 32，819-841(19 93)）。タンパク質のなかで、ストレプトアビジンは、本明細書中に記載される他のリガンド結合系および基質結合系のモデルとして特に有効である。ストレプトアビジンは、ストレプトアビジン−ビオチン親和性複合体の非常に強い会合を使用する多くの分離技術および診断技術での重要な成分である。（WilchekおよびBayer 、Avidin-Biotin Technology, New York，Academic Press，Inc．(1990)；およびG reen、Meth ．Enzymol. 184:51-67）。プロテインＧ、すなわちIgG抗体と結合するタンパク質（Achariら、Biochemistry 31:10449-10457(1992)、およびAkerstr omおよびBjorck、J ．Biol．Chem. 261:10240-10247(1986)）はまた、モデル系として有用である。代表的な免疫親和性分子は、操作された単鎖Fv抗体（Birdら、Science 242:423-426(1988)、およびLadnerらの米国特許第4,946,778号（本明細書中で参考として援用される））、Fab、Fab'、およびモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む。酵素は別の重要なモデル系を表す。なぜなら、それらの活性が活性部位での刺激応答性成分の制御された折り畳みによりオンまたはオフになるかあるいは調節され得るからである。生物工学におけるそれらの十分に確立された使用に加えて、ストレプトアビジン、プロテインＧ、単鎖抗体および酵素は、いくつかの他の重要な理由で理想的なモデル系である。これらのタンパク質の遺伝子操作系は確立しており、簡便な位置指定変異誘発、およびE.coliのような宿主での大量の各タンパク質の発現を可能にする。リガンド結合部位の分子「道路地図（road map）」を提供する高分解能の結晶構造が、入手可能である（Achariら、前掲；Hendricksonら、Proc ．N atl．Acad．Sci．USA 86:2190-2194(1989)；Weberら、Science 243:85-88(1992) ；DerrickおよびWigley，Nature，359:752-754(1992)；Mianら、J ．Mol．Biol. 217:133-151(1991)）。この構造情報は、親和性または活性スィッチの位置指定変異体の設計の合理的な基礎を提供する。もちろん、刺激応答性成分を付着するのに都合のよい部位に位置する１つ、または２つ以上のシステイン残基を既に有するタンパク質は、刺激応答性成分の付着に十分であり、そして（別のチオール基が特定の部位で所望されない限り、あるいは野生型-SH基の無用な反応がタンパク質の生物活性を望ましくなく変化させない限り）そこで操作された他のシステイン残基を有する必要はない。タンパク質上の他の部位はまた、使用され得る。それは、非天然のアミノ酸で置換されたアミノ酸を含む。 E.coli中でコアストレプトアビジンおよびプロテインＧの高レベルの発現を指揮する合成遺伝子が構築されている。例えば、米国特許第4,839,293号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。遺伝子は、発現を最大にするE.co liの偏ったコドン使用、カセット変異誘発のための都合のよい制限部位、開始メチオニン、および停止コドンを取り込む。合成遺伝子は、E.coliに有利なコドン使用を取り込み、発現を最大にし得る。そしていくつかの制限酵素部位が、遺伝子内の唯一の部位で取り込まれて変異誘発効果を容易にし得る。NMRによる溶液構造が報告されているプロテインＧの形態をコードする遺伝子配列（Gronenborn ら、Science 253:657-661 (1991)）がまた、構築されている。単鎖Fv抗体遺伝子はまた、親の抗体Ｓ５からクローン化され、そして構築されている。それは、CD 44レセプター抗原を認識する（Sandmaierら、Blood 76:630-635(1990)）。単鎖抗体は、短いペプチドリンカーにより結合された可変重鎖および可変軽鎖からなり、そして単鎖Fv抗体を生成するためにポリメラーゼ連鎖反応技術を使用することにより構築される（Birdら、前掲；Orlandiら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86:3833-3837(1989)；およびDavisら、Bio/Technol. 9:165-169(1991)）。これらのそれぞれは、本明細書中で参考として援用される。ｂ．分子を結合する部位の選択または作出刺激応答性成分は、それらの末端基により、１つ以上の選択した部位（一般に、本明細書中では「結合部位」という）において分子に共有結合し、その結果、一旦、刺激応答性成分が分子に結合されると、刺激応答性成分コイルは可溶性水和状態で留まる。環境性シグナルまたは刺激（あるいは、異なる刺激応答性成分が結合されているか否かに依存する刺激）誘因された場合、刺激応答性成分はより疎水性になり得、そして刺激応答性成分コイルは、結合部位内またはその近傍で緊縮し、そしていくつかの場合において、「相分離」（例えば、折り畳み）し得る。いくつかの場合（光の刺激によるような場合）、刺激応答性成分は、刺激応答性成分中に組み込まれる色素の異性体化に誘導される構造変化のために、緊縮し得かつより親水性になり得る。さらに、Ca⁺⁺感受性ポリマー構造変化をなし得る成分のようなイオン感受性刺激応答性成分が使用され得る。さらに、一本鎖DNA（その１つの末端が相互作用分子上の特定の部位に結合され、一方で塩基対の相補配列が刺激応答性成分の１つの末端上で結合されている）が使用され得、その結果、DNA対が解離し、刺激応答性成分がタンパク質上の特定の部位につなげられる（hooking）場合、スマートな刺激応答性成分結合の、タンパク質の活性部位からの距離が制御される。代表的には、１つまたは複数の結合部位は、(a)分子の結合部位のちょうど外側、(b)結合部位から離れた、選択した距離、(c)結合部位のちょうど内側、(d) 結合ポケットの深部の内側、および／または(e)結合部位からある距離にある選択した部位、(f)結合部位から離れたアロステリック部位である。分子の結合部位の近傍の所望の部位に置かれた場合、十分な障害、立体的配置などは、緊縮したまたは折り畳まれた刺激応答性成分により提供されて、リガンド結合平衡に逆に作用する。一方、刺激応答性成分が伸びた状態にある場合、分子の結合ポケットまたは活性部位についてのリガンドの親和性に最少に作用する。このように、刺激の際に、ポリマーコイルの構造変化または折り畳みは、タンパク質結合ポケットまたは酵素の活性部位へのリガンドの進入を直接またはアロステリック的に阻害するか、かつ／または部位内で既に結合されているリガンドに干渉するかのいずれかを行い、そのことにより、結合ポケットからのその完全な排除または親和性の減少をもたらす。ポリマーはまた、漸次的に折り畳まれるように操作され得、このことは、ポリマーの構造が環境状態の漸次的で小さな改変、または変化により制御されることを可能にし、このことにより、反応阻害の程度が中間体の親和性または反応性の範囲にわたり制御されることを可能にする。分子の結合親和性または酵素活性の回復が、可溶性であり、伸びて、および水和したランダムポリマーコイルを好む環境状態に戻すことによりなされ得る。あるいは、図２ｂに示されるように、ある場合において、水和したコイルが、折り畳まれたコイルよりも効果的に結合ポケットをブロックし得る。さらに、結合部位のより良いブロッキングを提供するためにポリマー骨格上のペンダント反応性基を用いることに対する利点が存在し得る。所望の応答に対するポリマーおよび１つまたは複数の結合部位の最適な組み合わせを決定するために、ポリマー組成物および分子量を変化させ得る。これは、刺激および１つまたは複数の特定の結合部位のタイプおよび大きさを変化させ得るのと同様である（例えば、２つの異なるまたは２つの類似の刺激応答性成分を２つの異なる部位に結合し得る）。光感受性基が主鎖にある場合、それは、親水性状態において、色素の異性体化により短くされ得る。相互作用分子上の刺激応答性成分の共有結合のための部位は、分子の性質に依存して、既に存在し得るか、または種々の技術により作出され得る。例えば、分子が所望の部位（例えば、酵素の活性部位または近傍）に既にシステイン残基を含む認識タンパク質である場合、刺激応答性成分の酵素中に既に存在し得る任意の他のシステイン残基への結合が、活性部位において刺激応答性成分によりもたらされる酵素活性または制御に悪影響しない限り、この天然の部位は結合のために使用され得る。分子がタンパク質または核酸の場合、刺激応答性成分を結合するために適切な部位が天然分子中に１つも存在しなければ、組換えDNA技術が、部位を提供するために使用され得る。代表的には、チオール側鎖（例えば、１つ以上のシステイン残基）が、タンパク質のリガンド結合部位のまたは近傍の、あるいはアロステリック部位のような離れた部位の、予め決定された表面位置において一般に操作される（刺激の所望の作用に依存する）。部位特異的変異誘発のような技術が使用され得、そして、例えば、ZollerおよびSmith、DNA 3:479-488 (1984)、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY(1989)により記載され、そして有用なポリメラーゼ連鎖反応媒介性部位指向性変異誘発手順が、St appertら、Nucleic Acid ．Res. 20 :624，(1992)により記載される。同様の技術がまた、天然または野生型のタンパク質に生じ得る所望でない部位を除去するために使用され得る。他の反応性アミノ酸がまた操作され得、そして非天然アミノ酸がまた独特の結合部位として与えられ得る。親和性分子がオリゴヌクレオチドである場合、刺激応答性成分結合のためのチオール化オリゴヌクレオチドが、合成の間に、Edeら、Bioconj ．Chem. 5:373-376(1994)（本明細書中において参考として援用される）に記載されるように挿入され得る。合成相互作用分子により、チオール、アミン、またはヒドロキシルのような独特の化学フック（hook）が、認識部位の近傍の適切な位置に合成的に組み込まれる。挿入部位は、応答性刺激応答性成分（または刺激応答性成分-リガンド結合体）のその位置における刺激が、所望の様式でリガンド結合親和性を変化させるように選択される。２つのシステイン残基が、親和性が結合部位の近傍の２つの刺激応答性成分の沈降により変化させられるように結合部位の近傍で操作され得るか、または１つのシステイン残基が活性部位の近傍に配置され、そして１つがストレプトアビジンのモノマー単位間の界面内に配置されて、２つがともに作用することにより組み合わされた効果を提供する。３つのタンパク質の高解像度Ｘ線結晶学的構造が使用されて部位指向性変異誘発のための適切な位置が決定される。モデリング技術により、位置が、刺激応答性成分との反応のための適切な溶媒接近性を有して配置され、そして結合のために部分的な展開を必要とする結合ポケットのより深い位置が同定される。ストレプトアビジンおよび単鎖Fv抗体におけるサブユニット-サブユニット界面において部位が選択されて、離れた部位で結合したポリマーの構造変化を刺激することによりタンパク質構造を変化させることによって親和性がアロステリック的に減少する。３つのタンパク質の結合部位のまわりおよび結合部位から離れた適切なアロステリック部位の両方の多くの部位が使用され得る。ここでは、結合親和性が刺激応答性成分沈降により減少される。部位はまた、活性部位から特定の距離にあるように選択され得る；次いで、リガンドはスマートな刺激応答性成分の１方の末端で結合され、そして他方の末端は選択された離れた部位に結合される。適切な刺激は部位のリガンド親和性を低減し得る、および／またはそれが部位から引かれることをもたらす；両方の作用は、リガンド部位親和性が１つの刺激により影響され、そして刺激応答性成分が異なる刺激により影響されれば、いくつかの場合において生じ得、そして２つの刺激は連続しておよび／または同時に適用される。一旦部位が選択されると、カセットまたはPCR部位指向性変異誘発技術が使用されてそれらの位置にシステイン残基が導入される。操作されたタンパク質はE ．coli中で生産され、次いで、特徴付けられて（２次構造のCDキャラクタリゼーションおよび結合親和性の測定を含む）、変異自体がタンパク質構造、安定性、および／または活性に悪影響しないことが確認される。次いで、変異タンパク質が、以下の刺激応答性成分に結合するために使用される。結合ポケットまたは他の所望の部位にまたはその近傍に刺激応答性成分結合部位を配置することを容易にするために、部位指向性結合ポケット変異体が生産されて、特に刺激応答性成分とともに使用するために熱力学的および動力学的特性が最適にされ得る。このような変異体は改変されたリガンド親和性を示し、従って、刺激応答性成分一分子結合体を最適にするためにタンパク質機能についてのさらなるコントロールを提供する。部位指向性親和性変異体のライブラリーが使用され得る。例えば、いくつかのリガンド結合部位変異体がストレプトアビジン中で構築され、これは重要なビオチン結合相互作用を改変し、このことは同時係属米国特許出願第08/387,055号に記載される（これは本明細書中において参考として援用される）。これは、最初のリガンド結合熱力学特性のための選択を提供し、その結果、刺激応答性成分により誘因された親和性における変化が操作されて有用かつ所望の範囲内に入り得る。刺激応答性成分の組成、分子量、および分子上の結合部位の位置に依存して、環境刺激が以下に作用するように適用される：(a)漸次的なまたは迅速な、および、所望であれば、可逆的な分子結合相互作用のスイッチのオンおよびオフ、(b )刺激応答性成分一分子結合体（それらの親和性標的を伴ってまたは伴わず）の選択的表面、界面、または第２水相への分割または分離、および(c)(a)および(b )の組み合わせ、ここで結合体は最初に特定の表面、界面、または相へ指向され、次いで、結合リガンドが局所的な微小環境へ「スイッチオフ」（放出）される。(c)の場合、２つの工程は順序を逆転され得る。温度および／またはpHおよび／または光のような環境刺激の小さな変化を系に適用することにより、刺激応答性成分-分子微小環境についての環境制御を達成し得る。これは、親和性タンパク質を有する異なるサイズおよび組成のリガンド、または酵素（選択的に分子の特定の生物活性を制御する）を有する異なるサイズおよび組成の基質の認識および結合能力の分子レベルの制御を可能にする。刺激応答性成分の構造における変化はまた、酵素の活性部位を露呈し得るかブロックし得る。この作用は、スマートな刺激応答性成分への薬剤の結合の酵素溶解によって生物化学薬剤または化学薬剤を放出することである。このように、刺激応答性成分のための結合部位は、よく特徴付けられた各タンパク質のリガンド結合部位に関連する位置に指向され得る。システイン結合部位は、結合部位のちようど外側、結合部位から離れた選択した距離、結合部位のちょうど内側、結合ポケットの深部の内側、および／または結合部位から離れた潜在的なアロステリック部位で容易に操作され得る。例えば、ストレプトアビジンのAsn49残基は、ビオチン結合部位の境界上の溶媒に接近可能な位置に存在し、そしてこの残基は部位指向性変異誘発技術を用いてシステイン（N49C）に変異されている。大量のこのタンパク質が発現および精製され、そしてビニルスルホン改変ポリ（NIP AAm）温度応答性刺激応答性成分がこの位置に結合されている。ストレプトアビジンは、その天然の配列中にシステインを含まないので、それに独特のチオール側鎖を導入することは簡便である。本明細書に記載されるようにその認識プロセスを制御することが目的とされる例示的な部位指向性変異体を設計するためには、チオールが置換された原子において有意な水溶液露呈を有するビオチン結合部位の近傍の部位を選択することに一般的な基準は集中する。１つの目的は十分な溶媒露呈を有するチオールを、刺激応答性成分の折り畳みがリガンド結合を立体的に干渉すべき部位において導入すること（比較的容易な応答性刺激応答性成分への結合を可能にするため）である。ストレプトアビジンのビオチン結合部位は、リガンド遊離状態において極度に可撓性および不規則であるループにより覆われている。ビオチンが結合された場合、このループは、結合部位にわたって規則付けられ、そして「リッド」を形成する。このループは、刺激応答性成分結合のための標的を示す。部位指向性変異体は、システインを位置49（Asn49Cys）に配置する（ここはリッドの境界である）。ストレプトアビジンのように、プロテインＧはシステイン残基を天然構造中に含まない。プロテインＧは、IgG抗体およびFc誘導体について高い親和性を有するマルチドメインタンパク質として天然に存在する。小さい（55アミノ酸）ドメインが遺伝的に構築され、これはIgGについての天然の親和性（Ka＞10⁷M^-1）を保持し、そして極度に高い安定性およびより高い可逆的折り畳み/展開平衡を示す（Alexanderら、Biochemistry 31:3597-3603(1902)）。同時結晶解析は、プロテインＧが抗体の重鎖c1ドメインのその２番目のβ鎖と最後のβ鎖との間で逆平行相互作用を形成することによりIgGを認識することを示唆する（Derrickおよび Wigley、Nature 359:752-754(1992)）。一方、NMR解析研究は、ヘリックスが中心的に関与することを示唆する。従って、変異体は、導入される独特のシステイン残基が両方の部位の近傍に存在するように作製されている。３つの最初のシステイン変異体が、位置11、21、および37にチオール側鎖が導入されて構築されている。３つすべてのタンパク質は、チオール特異的刺激応答性成分への結合のために大量に発現および精製されている。抗体ファミリー中の１次アミノ酸配列は、大きな程度のホモロジーを示す。大きなライブラリーの結晶化した抗体についての高解像度Ｘ線構造は、最終的に、これらの１次配列ホモロジーが、可変ドメインにおいてさえも、より高度に保存された３次元折り畳みへと翻訳されることを示した（PadlanおよびKabat，Meth ．Enzymol. 203:3-21 (1991)）。この可変ドメインの中でさえ、ほとんどの可変性が、抗原結合接触を構成する６つの良く特徴付けられた超可変ループに限定されている。残りの可変ドメインは、より高度に保存されたβシートフレームワークを構成する。このフレームワークは、良く知られる抗体βバレル折り畳みに寄与する。従って、Ｘ線結晶構造解析をすることなく公知配列を有する単鎖抗体の高解像度分子モデルを生成することが可能であり（Martinら、Meth ．Enzymol. 2 03:121-153(1991)）、そしてチオール側鎖を導入するためのいくつかの位置が同定され得る。ｃ．結合のための方法および薬剤最適解析条件が、部位特異的に分子を遺伝的に操作されたシステインに結合させるために使用される。化学的な反応性求核原子はチオレートアニオンである。従って、還元された側鎖を保持すること、および結合pHを最適にすることが重要である。pHおよび刺激応答性成分の活性化末端基はまた、リジン側鎖のアミノ基への競合する結合が回避されるように選択されなければならない。pHはまた、刺激応答性成分上のチオール特異的求電子性官能基の加水分解の速度を決定する。 -SH基への結合反応は、代表的には、pH６〜7.5の間で行われ、これは、リジンアミノ基が最も反応性であるpH未満である。タンパク質-操作されたシステインのチオール基は、しばしば、溶液中において自発的に架橋するので、これは、プロテインＧなどのジスルフィド結合したダイマーにより開始される。これらのジスルフィドは、結合の前に、ジチオトレイトール、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）、または類似の薬剤を用いて還元される。TCEPは、チオール特異的な求電子原子（本明細書では、例えば、ビニルスルホンが使用されるべきである）と反応せず、従って、結合解析において直接使用されてチオールが活性な酸化状態で保持されていることを確実にし得る。代表的な反応開始条件は、50 mMリン酸緩衝液（pH7.0）、100-300μMタンパク質、１mM TCEP（少なくとも２回添加する）、50倍モル過剰量の刺激応答性成分（タンパク質に対して）、室温、２時間である。通常変更されるのは、温度および時間である（例えば、４℃で一晩）。ｄ．結合体の分離および精製次いで、結合体混合物が、Sephadex^TMG-50ゲル濾過カラムを通過される。刺激応答性成分-タンパク質結合体が、刺激応答性成分の温度沈降により未反応タンパク質から分離される。これは、結合体および任意の未反応の刺激応答性成分を溶液から排除することをもたらす。次いで、結合体および任意の未反応の刺激応答性成分は緩衝液中に再溶解され、そしてSDS-PAGE電気泳動により特徴付けられる。結合体はまた、GPCカラムにおけるHPLC分析により特徴付けられる。この分析では、結合体が遊離のタンパク質または刺激応答性成分とは異なる分子量で泳動する。MALDI-TOFS質量分析技術はまた、結合体を特徴付けるために用いられる。これは、1：1の化学量論の強い証拠である高解像度分子量分析を提供する。コントロール実験が野生型タンパク質とともに行われ、この実験では刺激応答性成分の結合体が存在せず、結合体の変異タンパク質の遺伝的に操作されたシステインに対する特異性が確認される。ペプチドマッピングがまた、どの残基（すなわち、操作されたシステイン）が改変を受けているかを正確に特徴付けるために行われ得る。ｅ．結合反応の最適化操作されたチオールの反応性はタンパク質表面上のそれらの位置に依存して広範に変化し得るので、上記の基本的なプロトコルに対して別の反応条件が結合反応の効率を増大するために存在する。例えば、反応効率は、しばしば、低濃度でタンパク質変性物を添加することにより著しく増大される。これらの変性物は、タンパク質をわずかに展開し、そしてチオール官能基の接近性を増大する。先に概説したように、反応の長さ、温度、およびpHもまた変化されて、結合反応の効率を増大し得る。上記のプロトコルにおいて、未反応の刺激応答性成分の分離は存在しない。活性測定において、洗浄工程が用いられて過剰の刺激応答性成分を結合親和性の定量の前に除去し得る。しかし、過剰の刺激応答性成分が、いくらか、最初の結合工程を干渉することがあり得る。従って、未反応の刺激応答性成分を除去することが望まれ得る。これは、ストレプトアビジンおよびプロテインＧを用いて、結合混合物をアフィニティカラムに通過させることにより行われる。ストレプトアビジン結合体は標準的なイミノビオチンカラムを通過し得るので、刺激応答性成分-タンパク質結合体は結合する。しかし、任意の遊離の刺激応答性成分は洗い流される。同様に、プロテインＧは、市販のIgGアフィニティカラムを通過し得、カラムへの結合体結合および刺激応答性成分を洗浄し得る。刺激応答性成分が遺伝的に操作されたシステインに加えてリジン残基に結合している場合、イオン交換クロマトグラフィが使用されて、結合体を異なる化学量論で分離し得る。刺激応答性成分は、当該分野において利用可能であり、そして、例えば、Tayl or編、「タンパク質の固定化」、Marcel Dekker，New York，1991;およびScoute n、「アフィニティクロマトグラフィ」、J．Wiley % Sons，New York，1981に記載される結合方法を用いて分子に結合され得るｆ．刺激応答性成分と分子との間のリンカー（スペーサー）上記の記載は、刺激応答性成分の分子への直接結合に焦点をあてたが、リンカーまたはスペーサー基もまた刺激応答性成分を分子上の所望の部位に連結するのに使用され得る。核酸は、標的に相補的にされ、そしてまた刺激応答性成分と組み合わせて標的化するために使用され、結合部位への接近を調節し得るというさらなる利点を提供する。好ましい実施態様において、刺激応答性成分は、操作されたタンパク質上の特異的部位に結合されたオリゴヌクレオチドに対して配列が相補的である、介在するヌクレオチドを介してタンパク質に結合され得る（図１２）。例えば、オリゴヌクレオチドは操作されたタンパク質チオールに部位特異的に結合され得、そしてその相補的配列は末端反応性刺激応答性成分に結合され得る。（DNAはまた、刺激応答性成分の骨格にそって、反応性ペンダント基に結合され得る）。次いで、二重鎖DNAを形成する２つの相補的オリゴヌクレオチドの間の塩基対合は、刺激応答性成分の操作されたチオール結合部位の近位でのタンパク質への結合を生じる。二重鎖形成の登録（register）は２つのオリゴヌクレオチドの配列によって厳密に特定され得るので、刺激応答性成分のチオール結合部位との結合距離は、二重鎖相補性の開始部位によって容易に特定され得る。この距離はタンパク質結合部位または酵素活性部位における刺激応答性成分のゲート活性およびスイッチング活性の制御のために使用され得る。ｇ．標的リガンド本明細書中で定義される標的リガンドは、上記で定義した分子により結合される分子をいう（ここで結合反応は分子に結合した刺激応答性成分分子の相互作用を通じて修飾されるか、さもなくば操作され得る）。これらは基質（分子が酵素である場合）、レセプターにより結合されるリガンド、または相補的核酸であり得る。リガンド上の特異的部位、すなわち基質、レセプターリガンドまたは相補的DNAはまた、タンパク質上の特異的部位に結合した第１の刺激応答性成分の感受性と同一または異なる刺激に対する感受性を有する、応答性刺激応答性成分に結合され得る。３．固体表面における分子および／またはリガンドの固定化いくつかの実施態様において、標的相互作用分子は固体支持体に固定化され得る。これは多孔質または成形された固体、微粒子、クロマトグラフィー媒体、または当業者に公知の他の固体表面の任意の形態であり得る。分子は、市販の試薬および標準的技術を使用して、通常は支持体と分子との間の共有結合または親和性相互作用の形成を介して結合され得る。図５および図６の両方に示されるように、相互作用結合体は分離における使用のために理想的である。図５に示されるように、１つの刺激応答性分子が支持体への結合を制御するために使用され、分析物のような標的に結合するビオチン化タンパク質のようなタンパク質の溶液または混合物から分離され得る。分析物のための第２の結合部位は、刺激に対する暴露に際して結合を許可能にするかまたはブロックする、第２の刺激応答性分子の使用を通じてさらに制御され得る。これは標的分子を検出し、そしてこの分子を精製し、次いで出発材料を再生してこれらが再使用され得るようにするための手段を提供する。図６はこの方法の変形を提供し、ここで標的分子は指示分子に連結した抗体に結合される。この指示分子は、活性化された場合に、刺激に結合分子であるストレプトアビジンを暴露する信号として作用し、これは刺激応答性分子を崩壊させて、基質へのストレプトアビジン−抗体−標的結合体の結合および固定化を可能にする。刺激応答性成分支持体に、刺激応答性成分／部位特異的タンパク質結合体を固定化するために、タンパク質リジン基の活性化ポリマー支持体表面への共有結合が使用され得る。反応性基（例えば、-OH、-COOH、-NH₂）は、微細孔性メンブラン、微粒子、または96ウェルのマイクロタイタープレートのようなポリマー支持体の表面上に必要とされる。アミン基は通常、-OH基または-COOH基よりも反応性が高い。図９に示すように、アミン基がポリマー表面上に形成され得るいくつかの方法がある：（ａ）アミン基を含むポリマーの酸化表面、オゾン化表面、または他の負に荷電した表面上への物理的吸着（ここでポリマーはほとんどイオン性相互作用によって結合するか、またはポリマーが主に疎水性相互作用によって結合している疎水性表面上に結合する）；（ｂ）アミノモノマー（例えば、アルキルアミン、ヘプチルアミンなど）ガス吐出からのアミノ基を含む「ポリマー」の物理化学的析出；（ｃ）アルゴンガス吐出を使用した疎水性基材上への長鎖アルキルアミンの化学的カップリング；（ｄ）アミノポリマーもしくはその前駆体の、反応性表面基に反応性ポリマー基を共有結合させることによるか、またはポリマーの物理的吸着およびそれに続く紫外線照射（uv）、高エネルギー照射、もしくはガス吐出での処理による化学的固定化；あるいは（ｅ）オゾン、ガス吐出、高エネルギー照射、またはUVを使用して重合を開始させる、アミノモノマー（例えば、アミノエチルメタクリル酸）のグラフト重合。ビニルホルムアミド（これはそのペンダントホルムアミド基が重合後に容易にアミノ基に加水分解される重合可能なモノマーである）は、同様に表面グラフト重合され得る。アクリル酸またはメタクリル酸、およびAAmまたはHEMAは、グラフト共縮重合されて、変動する含量のカルボキシル官能基またはヒドロキシル官能基を有する表面を形成し得る。カルボキシル化表面はまた、イオン−イオン相互作用によって、ポリエチレンイミン（PEI）またはポリビニルアミンのようなポリカチオンを物理的に結合するために使用され得る。これらの表面修飾に加えて、反応性微粒子および微細孔性メンブランが、例えば、Bangs Laboratories、 Sigma、Polysciences、Millipore、Pall、Gelman、Sigma、Cole-Parmer、Alltec hなどから購入され得る。例えば、その上に最初に種々のポリアミン（またはその前駆体）が物理的に吸着された親水性PVDF微細孔性メンブランは、固定されたメンブランのメンブラン孔を通してプラズマを移動させてポリアミン（またはその前駆体）を共有結合的に固定化することによって、「素通り（flow-through）」ガスプラズマ中で処理された。（いくつかの場合には、メンブランは反応性表面基を有して購入され得る）。アミン基を有する表面の修飾を参照して記載したが、表面上のカルボキシル基およびヒドロキシル基の形成のためのプロセスは、同様なプロセスである。反応性表面基の活性化およびそれに続くタンパク質リジン基の活性化ポリマー支持体表面への共有結合による、刺激応答性成分／部位特異的タンパク質結合体の固定化は、十分に確立された固定化化学方法を使用して達成される。 II．相互作用分子結合体の使用方法相互作用分子のための刺激応答性成分指向性の親和性および分配スイッチの使用は、相互作用分子自体の生物工学的、医学的、研究的、および工業的使用と同じく、多数および多様である。従って、刺激応答性成分−相互作用分子結合体は、広範に種々の分離、センサー、診断、バイオプロセス、生体相互作用（bioint eraction）、および薬物送達系に直接に適用可能であり、そして酵素速度プロセスの制御、刺激誘導性相分離イムノアッセイ、環境センサーおよびバイオセンサーの再生／再循環、外来界面でのタンパク質および細胞の相互作用の制御、ならびに情報の貯蔵、検索、およびシグナリングのような新たな技術の設計および応用にもまた適用され得る。１．親和性スイッチ溶液ベースの親和性系の実施態様（「親和性スイッチ」、これは、目的の相互作用分子と特異的に相互作用する標的リガンドの、可逆的な結合および放出をトリガーする外部刺激応答性である）を図1aに示す。ここで単一のチオール官能基 10は、リガンド結合タンパク質14の結合ポケット12の近位に位置し、そしてスルヒドリル特異的ポリマー鎖16（「蛇様」リボン構造として例示される）はタンパク質14に結合されて、リガンド結合平衡の外部的にトリガーされる立体障害を提供する。標的リガンドの放出は制御可能であり、そして溶液中（代表的には、標的分子を放出した後に、刺激応答性成分−親和性分子結合体の同時沈殿を伴う）で、あるいは特異的な表面、相または界面（それが界面における表面に固定化され得るか、またはヒドロゲルの内部、カプセル、ホローファイバー、または多孔性固体の孔の中に取り込まれ得る場合）で生じ得る。応答性ポリマー相互作用分子結合体の親和性スイッチ作用の４つの異なる実施態様を図2a〜dに示す。ポリマーの刺激は結合リガンドの排出を引き起こし得るか（図2a）、あるいは結合ポケットの立体的ブロッキングまたは脱ブロッキングを引き起こし得（図2b）、あるいはこれはタンパク質表面上の別の部位に束縛されたリガンドを、結合ポケットから引き出すことを引き起こし得るか（図2c）、あるいは結合ポケットの内部の親和性結合平衡のアロステリック修飾を引き起こし得る（図2d）。結合されたポリマーの任意のこれらの作用を増強するために、１つより多いポリマーをタンパク質表面の異なる特異的部位に結合するか、または１つのポリマーの部位特異的結合を他のポリマー鎖の同一タンパク質への非特異的結合と組み合わせることもまた可能である。図2cは以下の実施態様を示す。刺激感受性ポリマー（例えば、光感受性リガンド色素）が刺激されて（例えば、光で）、リガンド結合ポケットに対するその親和性を低減するコンホメーション変化を引き起こし、その一方で相互作用分子に結合されたポリマー鎖が温度のような異なる刺激によって刺激されて、それが収縮するかまたは相分離することを引き起こし、これらの作用の組合せが、より低い親和性リガンド色素をポケットから「引っぱられる」ことを引き起こす。いずれかの刺激が最初に適用され得るか、または２つが同時に適用され得る。作用の組合せは、リガンドによるその後の親和性結合のために開いた結合ポケットの暴露を生じ得る。刺激の逆転は逆の挙動を可能にするはずである。ポリマーが、温度を上昇させることにより折り畳まれるか、または温度を低下させることにより伸長させられる場合の、各々の特定の組成物についてのポケット内の至適部位およびリガンドの排出のためのポリマー（例えば、ストレプトアビジンの場合、ビオチン誘導体）の分子量は、まず、異なる分子量のPNIPAAmポリマーのような異なる分子量のポリマーを利用することにより決定される（図14 ）。次いで、より高い（低い）親水性のコポリマー組成物が用いられる。これらの変量は、温度にともなうポリマー鎖のコンホメーション変化の程度に影響を及ぼす。束縛リガンドアプローチ（tethered ligand approach）の場合（図2c）、ポリマーが、例えば、温度を上昇させることにより、折り畳まれる場合の、結合部位からリガンドを「コルク栓抜き（uncorking）」するために至適な部位を決定するために、異なる分子量の２機能性応答性ポリマーが使用され得る。「コルク栓抜き」は、結合部位における色素リガンド結合親和性に影響する光刺激の存在下または非存在下で試験され得る（図４もまた参照のこと）。同様のストラテジーがプロテインＧおよびモノクローナル抗体に適用され得る。親和性に基づく環境センサー、バイオセンサーまたは分離システムの場合におけるように、親和性部位に結合し、そしてふさいでいる（fouled）物質を置換するために刺激応答性成分が使用される場合、親和性スイッチは特に有用である。類似の考察が、上記の適用領域におけると同様に、生体プロセスにおける酵素活性部位をふさぐこと（fouling）に適用される。遊離のタンパク質結合部位（例えば、抗体の抗原結合部位または酵素の活性部位）は、センサー、分離および酵素技術における使用のために、再生される必要がある。例えば、環境毒素を認識する抗体は、光センサーの表面上に固定化され得、ここで標的毒素の結合は光信号を導き、これは検出器に送られる。再度使用されるセンサーについては、標的毒素は、抗体または光センサーを損傷することなく、抗体結合部位から除去されなければならない。１つの実施態様において、刺激応答性ポリマー−抗体結合体が光センサー上に固定化され得、そして最初の結合工程および検出工程の後、標的毒素は、苛酷な溶出条件の必要なしに、ポリマーを刺激して毒素を結合ポケットから外に切り換えることにより、除去され得る。また、結合している生成物を固定化酵素の活性部位から除去する必要がある（これは、バイオリアクター触媒作用を、生成物阻害を介して阻害する）。第２の実施態様において、刺激応答性ポリマー−酵素結合体がバイオリアクター中に固定化され得、そして生成物阻害が問題となる場合、酵素活性部位は、ポリマーを刺激して生成物を活性部位から外に切り換えることにより、再生され得る。第３の実施態様において、プロドラッグが活性薬物の酵素誘導性放出により活性化され得る。その結果、ふさがれた酵素活性部位の再活性化が、薬物送達の回復を導き得る。いくつかの場合において、プロドラッグまたはポリマー性プロドラッグがランダムにまたは特異的に酵素に結合され得、その結果、酵素活性部位が刺激物により再生されると、これは薬物放出の突発を引き起こす。上記のように、図2cに記載の「コルク抜き（cork -pulling）」作用はまた、ポリマーの刺激に際して酵素活性を再生するために使用され得、そして結合しているリガンドは活性部位である。刺激応答性ポリマー−操作タンパク質結合体と標的リガンドとの結合親和性および／または結合反応速度は、温度変化、pH変化、または光（UVまたは可視）曝露の強度、時間および波長の関数として測定される。結合アッセイとしては、EL ISAアッセイ、放射標識に基づくアッセイ（例えば、平衡透析）、および吸光度／蛍光に基づくアッセイが挙げられる。放射標識されたビオチンのオフ速度（of f-rate）を測定するための十分に確立されたアッセイは、同時係属特許出願USSN 08/387,055に記載されており、そして従って、刺激応答性ポリマー−ストレプトアビジン結合体についての増加したオフ速度が、直接的に測定され得る。２．分配スイッチ刺激応答性刺激応答性成分はまた、図3a、bおよびcに一般的に示すように、ポリマー−タンパク質結合体の選択的沈澱または分配（後者の場合、液−液界面への、第２の水相への、または選択されたポリマー表面への）のためのトリガーを提供し得る。刺激応答性成分は、相互作用分子のリガンド認識部位から離れた特異的部位に結合され得、その結果、沈澱は、本明細書において「分配スイッチ（ partition-switching）」という相分離のみを引き起こし、「親和性スイッチ（a ffinity-switching）」を引き起こさない。個々のポリマー鎖の外部にトリガーされる沈澱が生じた後、PNIAAmの親和性タンパク質へのランダム結合について一般的に記載されるように、結合体は一緒に凝集し、そして溶液から沈澱する。これは、例えば、PNIPPAm−抗体／抗原／第２抗体結合体／複合体分子の溶液からの沈澱の場合、MonjiおよびHoffman，Appl ．Biochem．Biotechnol. 14: 107-1 20（1987）により、そしてまたPNIPPAm−プロテインＡ−IgG結合体／複合体分子の溶液からの沈澱の場合、ChenおよびHoffman，Biomaterials 11:631-634(1990) に記載される。本明細書に記載のようなポリマーの認識タンパク質への部位特異的結合は、タンパク質上の（例えば、リジンアミノ基への）ランダムな結合よりも高い、タンパク質の認識許容量の保持を導くはずである。選択されたポリマー表面の存在下において、沈澱するポリマー鎖は、特異的な表面に選択的に結合し得る。ポリマー−タンパク質結合体およびポリマー−分子結合体の第２水相への相分配はまた、沈澱したポリマーにより指向させられ得る（DiamondおよびHsu，Adv ．Biochem．Eng．Biotechnol. 47: 89-135(1992); Wal terら、Anal ．Biochem. 197: 1-18(1991); Hoffman，J ．Biomat．Sci．Polymer Ed. ，5:555-568(1994)）。これらのアプローチは、従来の方法論を超える以下の少なくとも２つの重要な利点を提供する：環境シグナルを使用するタンパク質認識プロセスおよび／またはタンパク質分離プロセスの迅速な可逆性、ならびに相互作用分子の従来の支持体表面への大いに減少された非特異的結合。３．組み合わせ分配および親和性スイッチａ．異なる機能を有する２つ以上の刺激応答性刺激応答性成分の使用親和性トリガーおよび分配トリガー能力はまた、２つの異なる刺激応答性成分が２つの異なる位置で結合されるように、同一の相互作用分子と組み合わされ得る。分配は、リガンドのブロッキング／脱ブロッキング作用または結合／放出作用をトリガーするシグナルとは異なる外部シグナルによりトリガーされる。例えば、図４に示すような二重トリガー能力については、相互作用分子−刺激応答性成分結合体（結合しているその標的リガンドを有する）は、結合部位から離れて結合されている刺激応答性成分をトリガーすることにより、先ず相分離され得、続いて、親和性スイッチをトリガーし、そして所望の相中にまたは所望の表面でリガンドを放出する第２のシグナルを使用する。これは、リガンド結合ポケットの付近に１つのクラスの刺激応答性成分（例えば、光感受性ポリマー）を、そして分配トリガー部位において別のポリマー鎖（例えば、温度感受性ポリマー）を付着することにより達成され得る。あるいは、同一のクラス内であるが、別々の異なる刺激応答性コンホメーション変化を有する（例えば、２つの異なる相分離温度を有する）２つの刺激応答性成分が使用され得る。ｂ．混合機能結合体の使用非同一単量体からストレプトアビジン四量体を精製する能力は、混合機能特性を必要とするポリマー−タンパク質結合体の独特な使用を可能にする。例えば、サブユニットの２つが、結合部位の付近のシステイン付着部位を有して個々に操作され得る。次いで、これらの部位は、例えば、温度応答性ポリマーと結合され得、それにより温度制御親和性スイッチを提供し得る。残りの２つのサブユニットは、異なる刺激応答性成分（例えば、沈澱のような選択的pH応答性を指向させるpH感受性ポリマー）の結合のための、あるいはpH感受性分配スイッチを提供する、結合部位から離れて位置する操作されたシステイン残基を含むように、個々に操作され得る。このように、混合機能ポリマー−ストレプトアビジン結合体は、温度感受性リガンド親和性結合スイッチをpH感受性選択的分配トリガーと組み合わせる。類似の混合二重応答結合体は、異なる曇り点温度を有する２つの異なる温度感受性ポリマーから作製され得る（図５および６を参照のこと）。ポリマー自体はまた、温度およびpH両方の成分、または異なる感受性成分の他の組み合わせからなり得る。ｃ．速度または親和性制御スイッチ先に論じたように、刺激応答性成分の大きさおよびコンホメーションは、結合をブロックするため、すなわち、結合を「オン」または「オフ」するためのみに使用され得るのではなく、結合の速度および程度（または親和性）を制御するため、ならびに特定の大きさより下のリガンドのみが結合部位に接近することを選択的に可能にし得る。一旦結合部位または活性部位の大きさおよび親和性リガンドまたは酵素が決定されれば、ポリマーの分子量、組成、および構造が選択され得、これは部位がブロックされる程度を決定する刺激応答性成分の刺激誘導性コンホメーション変化を規定する。例えば、異なる分子量または組成の一連の刺激応答性成分を相互作用分子に結合させ、そして刺激応答性成分のコンホメーションを変化させる刺激への曝露の前および後に結合を測定することにより、所望されるブロッキングの程度を最適化することは慣例的である。ポリマー組成、分子量および構造の影響、ならびにポリマーにかけられる刺激の型および程度は、各々の標的リガンドまたは細胞について、固定化された刺激応答性成分／部位特異的タンパク質結合体に対して、決定され得る。３つの親和性認識タンパク質各々の最も制御可能な、そして再現性のある「オン−オフ」応答のための刺激応答性成分特性および部位特異的システイン位置（単数または複数）は、それにより各々のリガンドについて最適化され得る。４．具体的な応用相互作用分子と、標的リガンドとの間のアフィニティ相互作用を制御する能力のために、本願で記載する結合体は、分離、診断、環境センサーおよびバイオセンサーなどのセンサー、薬物送達、バイオリアクター、固定化酵素技術、生体適合性、等において広範囲に用いられている。例えば、酵素の場合、酵素活性の刺激応答性「オン−オフ」または調整制御（例えば、ターンオーバーレート（turn over rate）および基質サイズ特異性の制御）が成し遂げられ得る。即ち、バイオリアクター、バイオセンサーおよび環境センサーなどのセンサー、分離、および薬物送達において有用な特徴が成し遂げられ得る。ａ．分離への応用分離の応用において、刺激応答性成分／部位特異的相互作用分子結合体は、例えば、低圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、アフィニティ沈降分離、膜分離、免疫吸着分離、および二相水性分離システムにおいて有用である。本願で例示するストレプトアビジン、プロテインＧ、およびモノクローナル抗体などの部位特異的結合分子は、現在のアフィニティ分離システムにおいて最も広範囲に用いられているアフィニティタンパク質である。ストレプトアビジン、抗体、およびプロテインＧの広範囲な使用は、Wilchek、1990、上述；Harboe ら、J ．Clin．Microbiol. 28: 913-921(1990)；KatzおよびSiewierski、J ．Chro matogr. 624: 403-409（1992）；Meyerら、Exp ．Hematol. 19: 710-713(1991)； Paganelliら、Int ．J．Cancer 45: 1184-1189(1990)；およびYarmushら、Biotec hnol ．Prog. 8: 168-178(1992)に記載されている。ストレプトアビジンと、ビオチン化抗体、プロテインＧおよびIgGとは、しばしば共に用いられるため、刺激応答性成分と、これらのうちの１つまたは両方と結合させることにより、各成分のアフィニティを連続して（および一時的に）制御することが可能となる。各タンパク質は、異なるまたは１つの刺激に応答するように刺激応答性成分で改変され得、刺激の選択によって特定の界面および分子相互作用をスイッチオンまたはスイッチオフすることができる。図５は、代表的な二重アフィニティトリガー分離の応用を概略的に示す。図５に示すように、支持体への結合を制御し、分析物などの標的に結合するビオチン化タンパク質などのタンパク質を溶液または混合物から分離するために１つの刺激応答性分子が用いられ得る。分析物に対する第２の結合部位は、第２の刺激応答性分子を用いてさらに制御され得、これにより、刺激に曝されたときに結合が可能になるか、または阻止される。これにより、標的分子を検出し、分子を精製し、次いで出発物質が再使用できるようにこれらを再生する手段が提供される。例えば、ストレプトアビジン−ビオチン化抗体相互作用は、温度で制御され得るが、抗体−標的抗原相互作用は、ｐＨによって制御され得る。２つの異なる温度応答性ポリマーもまた使用され得る。この場合、例えば、外部温度は、まず、ビオチン化抗体−標的リガンドをストレプトアビジンから放出するように上昇され、次に、標的分子は、温度をさらに数度上昇させることによって抗体から分離される。反応用の固体支持体は、例えば、従来のクロマトグラフィー樹脂、HPLC 支持体、膜、バイオリアクター表面、等を用いて使用され得るが、アフィニティスイッチは、沈降または二相水性分離法にも応用され得る。通常疎水性である部分的または全体的に折り畳まれたポリマーの物理特性は、通常水和されかつ親水性である延長コイルとはかなり異なり、２つの水性相間で可逆的に分配するための駆動力を提供する。他の実施例において、最適化された刺激応答性成分で操作されたタンパク質結合体システムは、リンパ球または細胞レセプタータンパク質もしくは炭水化物に結合したビオチン化モノクローナル抗体を有する他の細胞を選択的に分離できるように設計されている。刺激応答性成分／部位特異的タンパク質（ストレプトアビジン）結合体は、Bi o-Radアクリルアミドアクリル酸ゲルビーズ上に固定される。このビーズは、現在では、選択的なリンパ球細胞分離プロトコルに用いられている。ビーズは、カルボキシル官能性を有し、アビジンは、従来のカルボジイミド活性化プロトコルを用いてビーズに固定される。細胞選択は、骨髄もしくは末梢血、または積極的に選択される細胞内に存在する幹細胞CD34膜レセプターに結合するビオチン化CD 34抗体を用いるモデルシステム調製物を用いて実施される。カラムに結合することによって選択される細胞は、可撓性カラムをゆるやかに圧搾し、その後分離された細胞をカラムから溶出することによって除去される。細胞はカラムから離れ、ビオチン化CD34抗体を後に残し、この抗体は、固定されたストレプトアビジン結合体に結合されたままとなるので、刺激応答性成分／ストレプトアビジン結合体を刺激すると、ビオチン化抗体は排出され、カラムは再使用できるようになる。カラムを再使用する能力は、骨髄分離以外の分離の応用に有用である。固定された刺激応答性成分−プロテインＧ結合体を用いた抗体の分離さらに他の実施例において、最適化された刺激応答性成分／部位特異的タンパク質結合体システムは、固定された刺激応答性成分−プロテインＧ結合体を用いた抗体の分離に用いられる。ビオチン化刺激応答性成分／プロテインＧ誘導体（リシン側鎖からのアミノ基を介してビオチン化されている）を、ストレプトアンでコーティングしたマイクロタイターウェルに固定する。刺激応答性成分−プズ上に共有結合で固定され得る。次に、このシステムを、IgG抗体の分離に適用する。IgGを含有する溶液（例えば、全血、血漿、血清、またはバイオプロセス生成物流）は、セファロースアフィニティビーズと反応し、IgGは、プロテインＧに結合する。まず、抗体を、刺激応答性成分が、結合が可能な物理的状態にある環境条件下で結合する。ビーズをすすぎ、IgG分子を適切な温度、ｐＨ、光、または他の刺激スイッチで放出する。条件は、純粋な抗体調製物、ならびに全血、血漿、および抗体を含有する全細胞抽出物を含む、抗体ならびに他のタンパク質の混合物を用いて、連続的な結合および放出について決定する。初期の流しは、非特異的相互作用を最小にするイオン強度の関数として実施する。IgGを全血または血漿から分離する場合、まず、IgGを低温沈降によって全血から濃縮し、次に再溶解するように再び暖め、上記のようにプロテインＧカラム上でアフィニティ精製してもよい。これにより、プロテインＧカラムにおいて大量の血液または血漿を取り扱う必要がなくなる。特異的抗原を有する細胞の選択的な分離固定された刺激応答性ポリマー−scFv抗体部位特異的結合体システムは、CD44 細胞などの特異的抗原を有する細胞の選択的な分離にも用いられる。上記と同様の固定化法は、刺激応答性ポリマー−scFv抗体結合体をBio-Radアクリルアミド −アクリル酸ゲルビーズに架橋するのに用いられる。S5scFv抗体は、結合アフィニティを変更せずにリシン基を介してビオチン化され得るので、アビジンでコーティングされたビーズは、scFv結合体を固定するのにも用いられ得る。例えば、アフィニティスイッチは、次に、CD44抗原を発現し、純粋なPBMC細胞から出発し、より複雑な混合物に移行するヒト末梢血単核細胞（PBMC）、および識別され得る少量のCD44を発現する細胞を単離するのに用いられ得る。分離に関する一般的な利点上記のような刺激応答性成分／部位特異的なタンパク質結合体には、分離において、多くの大きな利点がある。例えば、１）タンパク質活性部位付近で結合する刺激応答性成分によって提供される結合標的リガンドの逐次的または迅速な定量的な溶出；２）刺激応答性成分の沈降および結合体の相分配の誘発に用いられる外部刺激が、現在必要とされる溶出条件と比べてゆるやかであり、そのため、標的分子の完全な状態をより保持しやすいこと；３）より多様で経済性に優れる分離システムを提供するオン結合状態とオフ結合状態との間の逐次的または迅速な可逆性；４）選択性および分離効率の矛盾する要因が、必要に応じて、刺激応答性成分結合部位をタンパク質もしくは酵素の結合部位または活性部位に近づけるか、またはさらに離すことによって最適化され得ること、さらに、ポリマーの組成が、刺激のレベルの関数としてそのコンホメーションを制御し、特定のサイズのリガンドのみが、例えば、温度を上昇（但し、ポリマーが完全に折り畳む温度未満となるように）させ、ポリマー鎖を部分的に折り畳ませ、大きなリガンドの結合を阻止し、次に、さらに温度を上昇させ、小さな結合リガンドを排出および回収または廃棄することによって、複合混合物に曝されている間にこの混合物に結合し得るように、改変され得ること；５）刺激応答性成分が、溶液中または表面上でアフィニティタンパク質を安定化させるように動作し、それによって、分離プロセスに対してより長い動作時間およびより大きな経済的利点を提供し得ること；６）標的リガンドとしてビオチンを用いる刺激応答性成分−ストレプトアビジン結合体の場合、ビオチンが、抗体、薬物分子、酵素、ペプチドリガンド、および細胞レセプターなどの広範囲な相互作用分子に結合され得、これらはすべて、刺激応答性成分／部位特異的タンパク質結合体システムに対して無数の潜在的な応用を可能にすること；７）刺激応答性成分組成および分子量が調整され、各結合部位に一致され、所望の応答（例えば、折り畳んでいるポリマーが、同一のアフィニティリガンド構築物を用いて小さなリガンドおよび大きなリガンドを選択的に分離するのに用いられる場合、タイプ、大きさ、レート、等）を最適化し得ることである。他の利点としては、刺激が反転するまで結合部位へのリガンドアクセスを阻止し、ポリマーコイルを伸張および水和する能力が挙げられる。ｂ．診断への応用刺激応答性成分／操作タンパク質結合体を用いるインビトロ診断法が設計され得る。例えば、刺激応答性ポリマー相互作用分子結合組成物を用いる免疫アッセイ形式を例示する図６に示す１つの実施態様において、タンパク質は、ストレプトアビジンであり、ビオチン化モノクローナル抗体と関連して用いられる。例示的なアッセイは、ビオチン化モノクローナル抗体と分析物溶液との均質な溶液相インキュベーションで開始する。分析物溶液は、抗原および抗原上の異なるエピトープに対する添加された標識モノクローナル抗体を含有し、免疫複合体サンドイッチを形成する。次に、刺激応答性ポリマー／ストレプトアビジン結合体を加える。この結合体は、ビオチン結合体に結合し、その後、ポリマーを刺激し、物理的分離を行い、分析物および分析物に複合体化するシグナル抗体を単離する。この均質インキュベーション／相分離技術は、従来の固相ELISA技術に対して大きな利点を提供する。その利点としては、１）均質なインキュベーション工程において大きな分析物を複合体化する能力；２）溶液相結合工程で結合する固体表面上での標識されたモノクローナル抗体の非特異的結合により大きく減少したバックグラウンドシグナル；３）ELISAにおけるように好ましくない固体表面上の配向における物理的吸着から生じるAb認識部位の部分的損失の回避；および４）洗浄要件が大幅に減少したことを含む処理要件の減少と共に、より迅速に結果が得られるようになったこと。これらの診断プロトコルは、モノクローナル抗体と共に用いられ得るので、任意の特異的な抗原標的と共に用いられ得る。これらの診断プロトコルはまた、迅速で効率的な最適モノクローナル抗体／抗原結合を提供する。なぜなら、認識工程は溶液中で発生するからである。テスト結果のプロセシングはまた、従来の方法に対して大きな利点を有する。即ち、制御されたレートまたは光もしくは温度などの外部シグナルに対する迅速な応答、および比色定量をベースとしたアッセイ（例えば、マイクロタイターウェル表面を用いて、表面上への相分離を誘発することによって、ポリマー／ストレプトアビジン／ビオチン−モノクローナル抗体／抗原／二次的な標識MAb結合体／複合体を収集する）を用いて多数の試料をテストする能力である。この技術の他の応用では、ポリマーが折り畳まれた状態にあるとき、センサー動作は、停止する。なぜなら、分析物リガンドは、認識タンパク質に結合し得ないからである。この「オフ」状態はまた、タンパク質の活性部位を環境内の様々な物質による汚染から保護するように作用する。この場合、環境センサーを特定の時間だけ「オン」にし、この特定の時間における環境内の特定の分析物の濃度をサンプリングし、残りの時間はセンサータンパク質を保護状態に保持することができることが所望され得る。さらに、異なる感知要素を含有する様々な感知チャネルを通して多数の分析物を含有するテスト溶液のフローによって動作する廃棄可能なセンサーパケットが存在する。この場合、テスト溶液が、最も効率的な方法で認識タンパク質チャネル内に到達し分布する場合にのみ、センサータンパク質を「オン」にすることが所望され得る。これらの両例においては、感知が完了した後、認識タンパク質の動作は、刺激（例えば、加熱）を反転させることによって再開され、活性部位から分析物が除去され、その後分析物は再び必要とされるまで「オフ」状態に保持される。ｃ．薬物送達への応用本願で記載する刺激応答性成分−タンパク質結合体は、薬物標的化能力を組み合わせる有用な手段または送達を誘発するインビボ診断法を提供する。ストレプトアビジンは、まず、ストレプトアビジンを細胞膜レセプターまたは抗体用の炭水化物リガンドなどの標的化部分に結合し、そしてこの結合体を注射して、特異的な細胞まで送達し、次に、この結合体を排出し、放射性同位元素または抗癌剤などのビオチン化撮像剤または治療剤に結合させることによって、標的化薬物送達システム内で用いられている。Bickel、1993；Pardridge、1992；Sheldon、19 92；およびPaganelliら、Int ．J．Cancer 45：1184-1189(1990)。本願では、それぞれ、参考のために援用する。あるいは、２および３工程予備標的化方法は、より毒性の強い治療剤または撮像剤のより高度な特異性およびより迅速な浄化の効果を提供し得る。この方法では、まず、ビオチン化炭水化物または抗体が注射され、次いで、ストレプトアビジン−ビオチン化治療複合体が投与される（２工程）、または次いでストレプトアビジンが投与され、その後続いて、ビオチン化治療剤が注射される（３工程）（Paganelliら、上述）。ストレプトアビジンの有用性は、多数の結合部位（およびビオチンに対する高いアフィニティ）から生じるので、タンパク質を標的化するのに１つの結合部位が用いられ、ビオチン化治療剤または撮像剤を複合体化するのに他の部位が用いられ得る。刺激応答性成分−ストレプトアビジン結合体の場合、ビオチン化薬剤は、ストレプトアビジン−モノクローナル抗体（SA-MAb）結合体に複合体化したストレプトアビジン結合部位において複合体化され得、その放出は、後に刺激によって誘発され、ポリマーを折り畳み、ビオチン化薬剤を排出する。光誘発アフィニティスイッチは、薬物送達の応用において特に有用である。この応用では、標的化後の治療剤の放出は、図７に示すように、ポリマーを折り畳むことによって刺激される。この方法は、レーザ光源および光ファイバーを備えたカテーテルを用いる、部位特異的な放出を刺激する局所送達、眼用薬物送達、および内部送達に特に有用である。ポリマー鎖の折り畳みは、その結合体が細胞膜レセプターに複合体化している間にも成し遂げられ得る。これは、レセプター介在エンドサイトーシスを刺激し得る。このような場合、薬物の送達は、例えば、ポリマー−抗体−薬物結合体（ポリマー免疫結合体）を誘発することによって、エンドソーム内で細胞に直接誘発され得る。本実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体の結合部位から離れたポリマーに対する反応性-SH部位を提供するように操作される。薬物は、モノクローナル抗体にランダムに結合され得るか、またはポリマーに結合され得る。薬物は、例えば、図８に示すように、ポリマーと薬物との結合が、約４または５のｐＨ（即ち、エンドソームのｐＨ）によって変化する、エンドソームの内部で放出される。図８は、刺激応答性ポリマー相互作用分子結合体の細胞への送達を模式的に示す。ここで、薬物放出は、薬物に対するリンカーのｐＨ依存性開裂による。酵素介在薬物送達は、プロドラッグ（即ち、エステル化酸性薬物などの不活性薬物前駆体）の酵素分解によって起こる。粘膜送達システムにおけるような細胞バリア全体にわたる薬物浸透を向上させるこのアプローチは、製薬会社によって用いられている。薬物を酵素分解性結合を介して酵素阻害剤に結合させることによってプロドラッグが合成される場合、そのプロドラッグ−阻害剤結合体を酵素に複合体化すると、酵素分解が阻害される。刺激応答性ポリマーが酵素の活性部位付近で特異的に結合される場合、ポリマーを誘発して阻害剤を排出すると、プロドラッグの酵素分解および活性薬物の放出が誘発される。プロドラッグは、プロドラッグを酵素分解性結合を介してポリマーバックボーンに沿って懸垂基(pen dant group)として結合させることによって合成され得る。酵素阻害剤はまた個別にポリマーに結合される。次に、プロドラッグポリマー阻害剤が、その活性部位付近で酵素に結合したポリマーを刺激することによって活性部位から排出されると、多数の薬物分子が酵素分解によって放出される。酵素または酵素−プロドラッグ複合体はまた、例えば、上記のようにビオチン−ストレプトアビジン複合体化を用いて、特異的な部位に標的づけられ得る。図９ａ〜ｃは、刺激応答性ポリマー相互作用分子結合体を表面に物理的または化学的に固定化する３つの一般的な方法の概略図である。３つの一般的な方法の第１の方法において、（ａ）相互作用分子は、まず、非特異的吸着（例えば、イオン性、疎水性、等）またはアフィニティ結合によって表面リガンド基に固定され得るか、または化学的に反応性表面基に結合され、その後、応答性ポリマーは表面に固定された相互作用分子に化学結合される、または（ｂ）応答性ポリマーは、まず、相互作用分子に化学的に結合され、次に、結合体は、非特異的吸着によって表面に固定されるか、もしくはアフィニティ結合によって表面リガンド基に結合されるか、もしくは反応性表面基に化学結合によって結合される、または（ｃ）まず、応答性ポリマーを表面に物理的に吸着させるか、もしくは応答性ポリマーを反応性表面基に化学的に結合させ、次いで、相互作用分子を表面に固定された応答性ポリマーに化学結合させる。図11aは、応答性コポリマーと、酵素との結合体を示し、ここで、応答性コポリマーは、コポリマーが結合する同一の酵素によって分解し得る結合によってコポリマー鎖バックボーンに結合された懸垂薬物分子を有する。ポリマーを刺激してコイルを折り畳むと、酵素はオフになり、懸垂結合の酵素分解によって薬物を放出することができない。逆の刺激を与えると、酵素は活性となり、懸垂結合の酵素分解によって薬剤分子を放出する。図11は、ゲル内に酵素が捕捉されているヒドロゲルを示す。図12は、応答性ポリマーをタンパク質に「結合」するための ssDNAフックの概略図である。図16は、刺激相互作用分子と、酵素、抗体、またはレセプタータンパク質などの相互作用分子との結合体の、環境センサーとしての使用の概略図である。センサータンパク質は、刺激に曝されるまで保護され、不活性のままである。相互作用分子は、分析物、毒素、阻害剤、または汚損剤などの分子と結合する。センサーは、刺激を除去することによって再生される。あるいは、アフィニティスイッチに関して上述したように、結合部位は、第２の刺激に曝されると、センサーを再生する第２の刺激相互作用分子を含み得る。本発明は、発明を限定しない以下の実施例を参照することによってさらに理解される。実施例１：ビニルスルホン終端されたポリNIPAAmのSAv変異体への結合唯一のシステインチオール基を、ビオチンの吉草酸炭化水素側鎖の末端カルボン酸に水素結合された49位でAsnをCysで置換することにより、未変性システイン残基を有さないストレプトアビジンの結合ポケット近傍に導入した。カセット式部位特異的変異誘発法を用いてN49C変異体ストレプトアビジンを生成し、これにより、操作されたポリマー結合部位をビオチン結合ポケットの外縁近傍に配置した。 N49C部位特異的ストレプトアビジン変異体を、細菌発現のために設計された合成「コア」ストレプトアビジン遺伝子を用いて、カセット式変異誘発技術によって構築した。ストレプトアビジン遺伝子を、KpnI部位とXbaI部位との間で切断し、続いて所望のAsnからCysのコドン変化を導入する合成カセットをこの部位の間に連結した。N49Cストレプトアビジン変異体配列を、自動ジデオキシ配列決定により確認し、そしてE．coli BL21(DE3)株での発現のためのpET11(Novagen，Madi son，WI)にサブクローン化した。過剰発現されたタンパク質を、0.5mMのDTTの添加を用いて、Stayton（上記）のプロトコルを用いてリフォールディングし、チオール酸化状態を維持した。１つのチオール反応性末端基／鎖を有するPNIPAAmを２工程で合成した。第１の工程では、2-メルカプトエタノールを連鎖移動剤として、そして2,2'-アゾイソブチロニトリルをイニシエータとして使用して、連鎖移動重合によって-OH末端基を有するPNIPAAmポリマーを調製した。浸透圧計を用いて、MW(Mn)が3800であることを測定した。第２の工程では、トリエチルアミン（５モル％過剰）の存在下で、-OH末端基をジビニルスルホン（５モル％過剰）と反応させた。ポリマーをエチルエーテル中での沈殿により回収した。生成物は、プロトンNMRスペクトル（d₆-DMSO中）において、6.21 ppm(２つのH = CH₂）および6.97 ppm(１つの H = -SO₂CH=)で、特徴的なビニルスルホンピークを示した。ビニルスルホン−ポリ(NIPAAm)のN49Cストレプトアビジンへの結合を、pH 7.0 のPBSにおいて、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)をジスルフィド還元剤(Burnsら、J ．Org．Chem. 56: 2648-2650(1991))として用い、大幅に過剰なポリマー（ポリマー：タンパク質モル比 50:1）を使用して行った。ポリマー −タンパク質結合体を、ポリ(NIPAAm)および結合体の37℃での熱沈殿によって、未反応のタンパク質から分離した。GPCおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動( SDS-PAGE)による特性付けは、この様式で精製されたストレプトアビジンのすべてがポリ(NIPAAm)に結合されたことを実証した。次にポリ(NIPAAm)−ストレプトアビジン結合体を、ビオチン標識した微孔性膜上に固定した。まず親水性ポリ（ビニリデンジフルオライド）(PVDF)膜(Millipo re，Bedford，MA)を、50 kD PEIの物理的な吸着によって、第一級アミン含有ポリマーであるポリエチレンイミン(PEI)でコートした。次にビオチン標識した表面を、ビオチンのN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルをPEI第一級アミン基に結合させることによって調製した。N49Cストレプトアビジン−ポリ(NIPAAm)結合体を、100mMのリン酸緩衝液(pH 7.0)中でストレプトアビジンをビオチン標識した膜にアフィニティー結合させることにより吸着させた。コントロールとして、野生型ストレプトアビジンおよびN49Cストレプトアビジン変異体もまた、（吸着させたストレプトアビジン表面への³H ビオチン結合により定量化されるように）同等の負荷密度で、結合体でコートしたビオチン標識した膜に吸着した。次いで、膜の³H ビオチン結合能力を、４℃および37℃で三連で測定した。４℃では、ポリ(NIPAAm)はその相転移温度32℃を下回り、そしてポリマーは水和物のコイルである。この温度では、膜上のN49Cストレプトアビジン結合体のビオチン結合能力は、野生型またはN49C変異体ストレプトアビジンコントロールと本質的に同一であった。しかし、温度を37℃に上昇させたとき、膜上の結合体のビオチン結合能力に急激な低下が観察され、このときポリマーは折り畳んだ小球である。野生型およびN49Cストレプトアビジンコントロールは、顕著な温度依存性のビオチン結合能力を全く示さなかった。４℃と比較して、37℃では結合体のビオチン会合に84％の低下が観察され、一方、野生型コントロールは、４℃に対して37℃ では、わずか３％のビオチン結合能力の低下しか示さなかった。ビオチン結合のコントロールと結合したポリ(NIPAAm)の温度応答性の相挙動との間の直接的な関連を支持する更なる証拠を、４℃と37℃との間の温度の関数としてビオチン会合の％遮断を測定することによって得た。図１０は、ストレプトアビジンに結合したポリ(NIPAAm)鎖の、折り畳み（開環し）ながらビオチン結合部位を遮断する能力、および減少する光の透過（閉環）によって測定されるような、同一の緩衝条件における遊離のポリ(NIPAAm)の相分離に対する温度の効果を示す。両方の曲線が、ほぼ同一の中間点を有し、同じ温度範囲にわたって減少することを見ることができる。結合体の遮断活性の開始は、遊離のポリマーの急な曇り点転移に先行し、これはおそらくビオチン結合ポケットでの個々のポリ(NIP AAm)鎖の段階的な折り畳みの開始を反映している。一方、溶液中の遊離のポリ(N IPAAm)鎖は、結合した水を放出する際に疎水性の臨界レベルに達しなければならず、この状態でこれらは凝集し、そして沈殿し、これが協同的な相分離および光の透過において観察された急激な減少を導く。臨界凝集点に先行するポリ（NIPA A m)鎖の最初の折り畳みは、結合体の活性アッセイにおいて、（溶液中の遊離のポリマーのLCSTをはるかに下回る）20〜25℃付近のビオチン結合の初期の遮断として見ることができる。従って、これらの結果は、ストレプトアビジン−ビオチン会合の遮断が、ポリ (NIPAAm)ランダムコイルの折り畳みと直接的に相関することを実証し、アフィニティー認識プロセスが実際は、N49Cストレプトアビジン結合ポケットで特異的に結合したポリマーコイルの大きさの厳密な環境制御によって制御されているということを示す。従って、このような相可逆性ポリマーの遺伝子操作された認識タンパク質への部位特異的結合は、リガンド−タンパク質認識プロセスの非常に敏感な環境制御を提供する。実施例２：２つの反応性末端基を有する温度感受性鎖の調製２つのカルボキシル末端基を有するPNIPAAmは、２成分iniferterシステムを使用することにより合成し得る。図１３に示す化学作用を、Otsu，T.ら、（1992）Eur ．Polym．J., 28，1325-1329に記載されるように発生させた。このシステムでは、4,4-アゾビス-4-シアノ吉草酸(ABCVA)をイニシエータとして使用し、3,3' -ジチオジプロピオン酸(DTDPA)を連鎖移動因子として使用した。 N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm，Eastman Kodak，Rochester，NY，USA )をn-ヘキサンから再結晶により精製した。ABCVA(PFATZ & BAUER INC.)およびDT DPA(Aldrich)を受け取ったままで使用した。 11.3 gのモノマーであるNIPAAmに0.1モル％のABCVAおよび５モル％のDADPAを加えたものを50 mlのDMFに溶解した。溶液を３回凍結および排気および解凍することにより脱気し、その後シールした。60℃で３時間で重合を行った。ポリマーをジエチルエーテル中での沈殿により回収し、減圧で乾燥させた。ポリマーの分子量を、蒸気圧浸透圧測定(Knauer，GermanのVPO，model OSV111)で測定し、そしてポリマーのカルボキシル基の含量を逆滴定で測定した。実施例３：pHおよび温度感受性ポリマーの合成ならびに２種類のpHでのそのLC ST行動 N-イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm，Eastman Kodak，Rochester，USA)をn -ヘキサンから再結晶により精製し、減圧で乾燥させた。ジメチルホルムアミド (DMF)および2-メルカプトエタノール(ME)を更なる精製なしで使用した。アクリル酸(AAc，Aldrich，Milwaukee，USA)を使用前に真空で再蒸留させた。2-2'アゾイソブチロニトリル(AIBN，J.T．Baker，Phillisburg，USA)をメタノールから再結晶させた。使用したすべての他の試薬は分析グレードのものであった。連鎖移動剤であるME(0.478g、6mmol)およびフリーラジカルイニシエータであるAIBN(0.246G，1.5mmol)を使用して、DMF(60ml)中で、60℃で２０分間、NIPAAm (16.95g、150mmol)およびAAc(0.108g、1.5mmol)を連鎖移動フリーラジカル共重合によって、末端ヒドロキシル基を有するポリ(NIPAAm/AAc)を合成した。生成物を、ジエチルエーテル中で反応溶液を沈殿させることによって入手し、焼結ガラスフィルターを通して濾過し、ジエチルエーテルで繰り返し洗浄し、そして40℃ で２４時間、減圧で乾燥させた。図１４に合成を示す。コポリマーの温度およびpH感受性挙動を、様々な温度およびpHでポリマー溶液 (2.0mg/ml)の濁度を一定の波長(500nm)で分光光度的に測定することによって研究した。クエン酸−リン酸緩衝液を使用して、pHのコポリマーの温度感受性行動に対する効果を調べた。緩衝溶液のイオン強度を、Naclを添加することにより調整した。ポリマー溶液の吸光度が10％である温度をLCSTと定義した。図１５は、pH 4.0および7.4でクエン酸＋リン酸緩衝液におけるポリ(NIPAAm/A Ac)の0.2％溶液の吸光度対温度を示す。緩衝溶液のイオン強度は、NaClを添加することにより調整した。NIPAAm/AAc/2-ME/aibnのモル比：100/1/4/1、重合時間：20分、重合温度：60℃。先の発明は、明確に理解する目的のために、説明および例示の方法によってある程度詳細に記載したが、特定の変更および改変を添付の請求の範囲内で実施し得ることが明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 45/00 39/395 Ｃ０７Ｋ 1/16 45/00 17/00 Ｃ０７Ｋ 1/16 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｚ 17/00 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ０８Ｆ 8/36 33/566 20/54 // Ｃ０８Ｆ 8/36 Ａ６１Ｋ 37/02 20/54 37/48 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ【要約の続き】が結合を部分的にブロックするかまたはより大きなリガンドの結合のみをブロックするための加減抵抗器として作用する）。一旦リガンドが結合したら、それはまた１つ（またはより多く）の結合ポリマーを刺激することにより結合部位から排出され得てリガンドの排出を引き起こし、そして同類の物がそれに接着する。あるいは、ポリマー-結合生体分子の選択的な分割、相分離または沈殿が、刺激応答成分の適切な環境刺激への曝露により達成され得る。

Claims

【特許請求の範囲】１．刺激応答性分子であって：標的に特異的に結合し得る親和性相互作用領域；および刺激に応答して該親和性相互作用領域の該標的への結合を調節し得る刺激応答領域を含み；ここで、該刺激応答性分子は天然に存在するアロステリック酵素でない、刺激応答性分子。２．前記刺激応答領域が、温度、光、pH、特定のイオン、イオン強度、電場および溶媒から成る群から選択される刺激に応答して前記親和性相互作用領域の前記標的への結合を調節し得る、請求項１に記載の刺激応答性分子。３．前記親和性相互作用領域が、タンパク質、ペプチド、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、核酸、糖タンパク質、脂質および合成レセプターまたはリガンドから成る群から選択される、請求項１に記載の刺激応答性分子。４．前記親和性相互作用領域が、抗体、抗原、細胞膜レセプター、細胞膜レセプターに結合し得るリガンド、酵素、酵素基質、および補因子から成る群から選択される、請求項１に記載の刺激応答性分子。５．前記標的が、抗体、抗原、細胞膜レセプター、細胞膜レセプターに結合し得るリガンド、酵素、酵素基質、および補因子から成る群から選択される、請求項１に記載の刺激応答性分子。６．前記親和性相互作用領域が、治療剤、診断剤、または触媒剤を含む、請求項１に記載の刺激応答性分子。７．前記親和性相互作用領域が、抗生物質剤、抗炎症剤、抗ガン剤、抗ウイルス剤、および抗酵素剤から成る群から選択される治療剤を含む、請求項１に記載の刺激応答性分子。８．前記刺激応答性分子が表面上またはヒドロゲル内に固定化される、請求項１に記載の刺激応答性分子。９．前記親和性相互作用領域と前記刺激応答領域との間にスペーサーを含む、請求項１に記載の刺激応答性分子。１０．刺激応答性分子を作製するための方法であって：刺激に応答して親和性相互作用領域の標的への結合を調節し得る刺激応答領域と、標的に特異的に結合し得る親和性相互作用領域とを共有結合する工程を包含し；ここで、該刺激応答性分子は天然に存在するアロステリック酵素でない、方法。１１．前記刺激応答領域が、温度、光、pH、特定のイオン、イオン強度、電場および溶媒から成る群から選択される刺激に応答して前記親和性相互作用領域の標的への結合を調節し得る、請求項１０に記載の方法。１２．前記親和性相互作用領域が、タンパク質、ペプチド、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、核酸、糖タンパク質、脂質およびレセプターまたはリガンドから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。１３．前記親和性相互作用領域が、抗体、抗原、細胞膜レセプター、細胞膜レセプターに結合し得るリガンド、酵素、酵素基質、および補因子から成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。１４．前記標的が、抗体、抗原、細胞膜レセプター、細胞膜レセプターに結合し得るリガンド、酵素、酵素基質、および補因子から成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。１５．前記親和性相互作用領域が、治療剤、診断剤、または触媒剤を含む、請求項１０に記載の方法。１６．前記親和性相互作用領域が、抗生物質剤、抗炎症剤、触媒剤、抗ガン剤、抗ウイルス剤、および抗酵素剤から成る群から選択される治療剤を含む、請求項１０に記載の方法。１７．前記標的が、治療剤、診断剤、または触媒剤を含む、請求項１０に記載の方法。１８．前記刺激応答性分子が表面上またはヒドロゲル内に固定化される、請求項１０に記載の方法。１９．前記刺激応答性分子が固体表面上に固定化される請求項１８に記載の方法であって、そしてここで、該方法が、低圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、アフィニティー沈殿、膜分離、二相分離および免疫吸着分離から成る群から選択される分離方法で該刺激応答性分子を用いて、混合物から前記標的を分離する工程をさらに包含する、方法。２０．表面上に固定化された前記刺激応答性分子が前記標的の検出のためのセンサーデバイス内に提供される請求項１８に記載の方法であって、該方法がサンプル中の該標的を該センサーで検出する工程をさらに包含する、方法。２１．混合物から標的を分離する方法における請求項１に記載の刺激応答性分子の使用であって、該方法が： i)該混合物を該刺激応答性分子と接触させる工程； ii)該標的の、該刺激応答性分子の前記親和性相互作用領域への結合を許容し、それにより該標的を該混合物中の他の成分から単離および分離する工程；および iii)該結合した標的を、該標的を該刺激応答性分子から放出させる条件に供する工程、を包含する、使用。２２．前記刺激応答領域が、前記刺激に応答して前記標的の前記親和性相互作用領域への結合の親和性を増大または低減し得る、請求項２１に記載の使用。２３．工程iii)が刺激を前記刺激応答性分子に付与し、それにより前記標的の前記親和性相互作用領域への結合の親和性を低減し、そして該標的を放出させる工程を包含する、請求項２１に記載の使用。２４．前記刺激応答性分子が固体表面上に固定化され、そしてここで、該方法が、低圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、アフィニティー沈殿、膜分離、二相分離および免疫吸着分離から成る群から選択されるプロセスで、前記標的を混合物から分離する工程を包含する、請求項２１に記載の使用。２５．サンプル中の標的を検出するための方法における請求項１に記載の刺激応答性分子の使用であって、該方法が： i)該サンプルを該刺激応答性分子と接触させる工程； ii)該標的の前記親和性相互作用領域への結合を許容する工程；および iii)該標的の該親和性相互作用領域への該結合を検出する工程、を包含する、使用。２６．前記標的の前記親和性相互作用領域への結合が、該親和性相互作用領域へ結合する該標的に結合された標識モノクローナル抗体を検出することにより検出される、請求項２５に記載の使用。２７．前記親和性相互作用領域がストレプトアビジンを含み、そしてここで、工程ii)において該ストレプトアビジンが前記標的に結合されたビオチン化モノクローナル抗体に結合し、そしてここで、該標的が該標識モノクローナル抗体にさらに結合される、請求項２６に記載の使用。２８．前記標的が環境毒素である、請求項２５に記載の使用。２９．前記方法が前記サンプル中の前記標的の量を定量する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の使用。３０．請求項１に記載の刺激応答性分子の使用であって、ここで、前記標的が、薬物を患者に送達するための方法における治療剤であって、該方法が： i)該刺激応答性分子の前記親和性相互作用領域と、治療剤から成る該標的とを複合体化する工程； ii)該治療剤から成る標的および該刺激応答性分子の複合体を、該治療剤が必要な患者に投与する工程；および iii)該患者における該複合体を刺激して該患者において該標的を放出させる工程、を包含する、使用。３１．前記複合体が静脈投与される、請求項３０に記載の使用。