JP2000500764A - ウルソデオキシコール酸の硫酸コンジュゲートと、炎症性障害及び他の用途におけるそれらの有利な使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の１態様は、３α，７β−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（ウルソデオキシコール酸又は“ＵＤＣＡ”）のスルフェートと、薬理学的に受容されるキャリヤーとを含む、薬理学的に受容される組成物に関する。好ましい組成物では、スルフェートがＵＤＣＡ−３−スルフェート、ＵＤＣＡ−７−スルフェート、ＵＤＣＡ−３，７−ジスルフェート、グリコ−ＵＤＣＡ−３−スルフェート、グリコ−ＵＤＣＡ−７−スルフェート、グリコ−ＵＤＣＡ−３，７−ジスルフェート、タウロ−ＵＤＣＡ−３−スルフェート、タウロ−ＵＤＣＡ−７−スルフェート、タウロ−ＵＤＣＡ−３，７−ジスルフェート、及びこれらの組合せである。本発明の他の態様は、哺乳動物にＵＤＣＡを投与して、障害を抑制又は治療する方法であって、ＵＤＣＡスルフェートを障害を抑制又は治療するために充分な量で哺乳動物に投与する工程を含む方法に関する。例えば、ＵＤＣＡスルフェートは例えば結腸癌、直腸癌、結腸の腫瘍、直腸の腫瘍、結腸の発癌、直腸の発癌、潰瘍性大腸炎、腺腫様ポリープ、家族性ポリポーシス等のような、胃腸管の炎症性状態の抑制又は治療のために有利に用いることができる。ＵＤＣＡのスルフェートは肝臓の炎症性障害の抑制又は治療のために投与することもできる。ＵＤＣＡスルフェートは肝疾患及び肝機能の血清生化学を改良するために、胆汁流動を高めるために、又はリン脂質若しくはコレステロールの胆汁分泌を減ずるために用いることができる。さらに他の態様では、本発明は単離された器官をＵＤＣＡスルフェートによって灌流することによる単離された器官の維持方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ウルソデオキシコール酸の硫酸コンジュゲートと、 炎症性障害及び他の用途におけるそれらの有利な使用発明の背景 ３α，７β−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（“ウルソデオキシコー ル酸”又は“ＵＤＣＡ”）は２０年間以上にわたって臨床的に用いられており、 最初は胆石症患者の治療に有効であると実証され、さらに最近では胆汁うつ滞性 (cholestatic)肝疾患の患者の治療に有望であると判明している。ＵＤＣＡの経 口投与が血清肝酵素(serum liver enzyme)の有意な改良をもたらすことが充分確 立しており、長期間の臨床試験の結果に基づいて、多数意見は、ＵＤＣＡが初期 の原発性胆汁性肝硬変の治療に有利であるということである。さらに、臨床試験 は、ＵＤＣＡが硬化性胆管炎、嚢胞性線維症及び慢性肝炎を有する患者における 肝機能の臨床的及び生化学的インデックス(index)の改良に有益であることを示 している。 肝疾患においてＵＤＣＡによって示される有望な効果にも拘わらず、その作用 機序はまだ不明である。初期の考察は、胆汁の胆汁酸プール(biliary bile acid pool)の疎水性／親水性バランスのシフトがその効力の重要な決定要素であるこ とを示唆しているが、最近のデータはこの主張を完全には支持していない；肝機 能の改良はほぼ確実に、より大きく有害と考えられる胆汁酸又は他の内因性作用 剤(endogenous agent)の胆汁排泄を促進する、ＵＤＣＡによって誘導される顕著 な胆汁分泌亢進の結果である。 多様な肝疾患を有する患者におけるＵＤＣＡの代謝に重点をおいた研究では、 尿中のＵＤＣＡのＣ−３スルフェートエステルの実質的な量(substantial amoun t)が一貫して観察されており、この特異的代謝産物はＵＤＣＡコンプライアンス (compliance)の有用なマーカーであることが実証されている。さらに、動物試験 は、胆汁酸の硫酸化が胆汁うつ滞を防止し、肝細胞損傷を制限するための重要な 代謝経路を表しうることを示唆している。 胆汁酸の細胞傷害性又は膜損傷性効果はその物理化学的性質に関係する。疎水 性胆汁酸は親水性胆汁酸よりも明らかに膜損傷性であり、細胞傷害性の相対的な インデックスが逆相高圧液体クロマトグラフィー系における胆汁酸の保持容量に 基づいて又はオクタノール／水中の分配係数から確立されている。ヒトの肝臓が 、本質的に肝傷害性である疎水性分子のケノデオキシコール酸を、その原発性胆 汁酸の１種として合成することは逆説的であり；胆汁うつ滞では、この胆汁酸の 肝臓蓄積が肝臓損傷を開始する、又は肝臓損傷に寄与し、又は肝臓損傷を悪化さ せる可能性がある。これに反して、ＵＤＣＡ、ケノデオキシコール酸の７β−エ ピマーは高度に親水性であり、疎水性胆汁酸の膜損傷性効果に反作用することが 判明している。これは多様な肝疾患の治療にＵＤＣＡを治療的に用いることの１ つの根拠である。ＵＤＣＡの経口又は静脈内投与後に、この胆汁酸は肝臓内で主 としてコンジュゲーションによって効率的にバイオトランスフォームされる。そ の結果、比較的高い用量を投与した後にも、ヒトの胆汁中には無視できるような 濃度及び割合の非コンジュゲート化ＵＤＣＡが検出されるに過ぎない。 ＵＤＣＡはまた種々な肝疾患の治療へのその使用以外にも治療的役割を有する ことができる。これに関して、ＵＤＣＡの保護的役割を示唆するデータが結腸発 癌の動物モデルから得られている。 しかし、経口投与される通常の治療用量（１０〜１５ｍｇ／ｋｇ体重／日）に おいて、ＵＤＣＡが腸から比較的良好に吸収されて、肝臓において主としてコン ジュゲーションによって効率的にバイオトランスフォームされることで、結腸へ のＵＤＣＡの実際の投与は問題である。この結果、ＵＤＣＡの有効量を結腸に特 異的に投与することは極めて困難である。 それ故、結腸への投与のこの限定を想定するならば、ＵＤＣＡを結腸に効果的 に投与することができる化合物、組成物又は方法を有することが非常に有益であ ると考えられる。胃腸管の他の部分にＵＤＣＡを効果的に投与するために用いる ことができる化合物、組成物又は方法を有することも非常に有益であると考えら れる。さらに、胃腸管又は肝臓の炎症性障害を効果的に抑制又は治療することに 用いるための化合物、組成物又は方法を有することは有利であると考えられる。発明の概要 本発明の１つの態様は、３α，７β−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸 （ウルソデオキシコール酸又は“ＵＤＣＡ”）のスルフェート(sulfate)と、薬 理学的に受容されるキャリヤーとを包含する薬理学的に受容される組成物に関す る。好ましい組成物では、このスルフェートはＵＤＣＡ−３−スルフェート、Ｕ ＤＣＡ−７−スルフェート、ＵＤＣＡ−３，７−ジスルフェート、グリコ−ＵＤ ＣＡ−３−スルフェート、グリコ−ＵＤＣＡ−７−スルフェート、グリコ−ＵＤ ＣＡ−３，７−ジスルフェート、タウロ−ＵＤＣＡ−３−スルフェート、タウロ −ＵＤＣＡ−７−スルフェート、タウロ−ＵＤＣＡ−３，７−ジスルフェート、 又はこれらの組合せである。 本発明の他の態様は、障害を抑制又は治療するために哺乳動物にＵＤＣＡを投 与する方法であって、この障害を抑制又は治療するために充分な量でＵＤＣＡの スルフェートを哺乳動物に投与することを含む方法に関する。例えば、結腸癌、 直腸癌、結腸の腫瘍(neoplasm)、直腸の腫瘍、結腸の発癌、直腸の発癌、潰瘍性 大腸炎、腺腫様ポリープ、家族性ポリポーシス等のような、胃腸管の炎症性状態 を抑制又は治療することに、ＵＤＣＡスルフェートを有利に用いることができる 。ＵＤＣＡのスルフェートはまた、肝臓の炎症性障害を抑制又は治療するために 投与することもできる。ＵＤＣＡスルフェートは、肝疾患若しくは肝機能の血清 生化学を改良するため、又は胆汁の流動を高めるため、又はリン脂質若しくはコ レステロールの胆汁分泌(biliary secretion)を減ずるために用いることができ る。 さらに他の態様では、本発明は、単離された器官を、この器官をＵＤＣＡスル フェートで灌流することによって維持する方法に関する。 本発明は先行技術を凌駕する幾つかの利益及び利点を提供する。例えば、結腸 癌等のような炎症性障害の抑制又は治療のために、結腸及び胃腸管の他の部分に 治療有効量のＵＤＣＡを投与することができる。さらに、肝疾患を抑制若しくは 治療するため又は肝機能を改良するためにＵＤＣＡスルフェートを効果的に用い ることができる。本発明の下記詳細な説明を検討するならば、上記及び他の利益 と利点が当業者に容易に明らかになると考えられる。図面の簡単な説明 図１Ａと１Ｂは、ＵＤＣＡ、ＵＤＣＡ−３Ｓ、ＵＤＣＡ−７Ｓ及びＵＤＣＡ− ＤＳの経口投与後の全空腸中のＵＤＣＡの総質量（図１Ａ）と肝組織中の濃度（ 図１Ｂ）の、対照ラットとの比較を示す。アニオン交換クロマトグラフィー後の ＧＣ−ＭＳを用いた個々の画分の分析によって、それらのコンジュゲーション形 式に応じて胆汁酸を分離した。結果は全ての動物の平均値として表す； 図２は対照ラットと、ＵＤＣＡ、ＵＤＣＡ３−Ｓ、ＵＤＣＡ７−Ｓ及びＵＤＣ Ａ−ＤＳを経口投与したラットとにおける糞便胆汁酸排泄を示す。アニオン交換 クロマトグラフィー後のＧＣ−ＭＳを用いた個々の画分の分析によって、それら のコンジュゲーション形式に応じて胆汁酸を分離した。結果は全ての動物の平均 値として表す； 図３は対照ラットと、ＵＤＣＡ、ＵＤＣＡ３−Ｓ、ＵＤＣＡ７−Ｓ及びＵＤＣ Ａ−ＤＳを経口投与したラットとの糞便中のリトコール酸／デオキシコール酸の 比率を示す。結果は全ての動物の平均値として表す； 図４Ａ〜４ＤはＵＤＣＡ（図４Ａ）、ＵＤＣＡ３−Ｓ（図４Ｂ）、ＵＤＣＡ７ −Ｓ（図４Ｃ）及びＵＤＣＡ−ＤＳ（図４Ｄ）を経口投与したラットの肝組織中 のＵＤＣＡ濃度を示す。アニオン交換クロマトグラフィー後のＧＣ−ＭＳを用い た個々の画分の分析によって、それらのコンジュゲーション形式に応じて胆汁酸 を分離した。結果は全ての動物の平均値として表す； 図５Ａと５ＢはＵＤＣＡとスルフェートコンジュゲートとのＩＶ注入中のＳｐ ｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットによる平均胆嚢胆汁流動(biliary bile-flow) と胆汁酸アウトプット(bile acid output)とを示す； 図６Ａ〜６ＤはＵＤＣＡとそのスルフェートコンジュゲートとの注入後の胆汁 酸分泌速度と胆汁−流動との関係を示す； 図７Ａと７ＢはＵＤＣＡとスルフェートコンジュゲートとのＩＶ注入中のＳｐ ｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットによる平均胆汁コレステロールとリン脂質アウ トプットとを示す；及び 図８Ａ〜８Ｅはラット胆汁注入前(preinfusion)（図８Ａ）、ＵＤＣＡ注入中 （図８Ｂ）、ＵＤＣＡ３−Ｓ注入中（図８Ｃ）及びＵＤＣＡ７−Ｓ注入中（図８ Ｄ）及びＵＤＣＡ−ＤＳ注入中（図８Ｅ）の負イオンＦＡＢ−ＭＳスペクトルを 示す。発明の詳細な説明 以下に出現する他の略号は下記を包含する：ＧＣ（気液クロマトグラフィー） 、ＧＣ−ＭＳ（気液クロマトグラフィー−質量分析法）、ＦＡＢ−ＭＳ（高速原 子衝撃−質量分析法）、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）、ＨＰＬＣ（高速液 体クロマトグラフィー）、ＵＤＣＡ−３Ｓ（ウルソデオキシコール酸−３−スル フェート）、ＵＤＣＡ−７Ｓ（ウルソデオキシコール酸−７−スルフェート）、 ＵＤＣＡ−ＤＳ（ウルソデオキシコール酸３，７−ジスルフェート）、ｔＢＤＭ Ｓエーテル（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル）及びｔＢＤＭＣ（ｔｅ ｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド）。 以下に示すデータはＵＤＣＡの個々の胆汁酸スルフェートの腸代謝及び挙動と 、非コンジュゲート化胆汁酸とを比較し、特に、Ｃ−７スルフェート部分の存在 がＵＤＣＡの細菌分解を防止し、ＵＤＣＡの腸吸収を抑制することを示す。 材料と方法ＵＤＣＡのスルフェートエステル(sulfated ester)の合成 ＵＤＣＡ（９９％純度）はＳｉｇｍａ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏ ｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。ＵＤＣＡのモノスルフェート及びジスルフェート エステルは、この詳細な説明における以下で段階的に詳細に説明する方法によっ て製造した。要約すると、モノスルフェートエステルの合成はＵＤＣＡ分子中の 環ヒドロキシル基の各々の選択的保護と、その後の非保護ヒドロキシル基の硫酸 化と、モノスルフェートエステルを放出するための保護基の加水分解とを含む。 ＵＤＣＡのジスルフェートコンジュゲートはＵＤＣＡとクロロスルホン酸との反 応によって製造した。ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）を用 いて、酸化、加溶媒分解及び、メチル／エステル−トリメチルシリルエーテル誘 導体への転化後の生成物の分析によってスルフェート基の位置を確認した。合成 胆汁塩のクロマトグラフィー純度は、高圧液体クロマトグラフィー、薄層クロマ トグラフィー及び毛管カラムクロマトグラフィーによって測定して、ＵＤＣＡ７ −スルフェート及びＵＤＣＡ３，７−ジスルフェートに関しては＞９７％であり 、ＵＤＣＡ３−スルフェートに関しては＞９５％であることが発見された。 動物試験 雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄ ａｗｌｅｙ社，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）（体重２１０〜２９０ｇ）を ３日間、１２時間明暗サイクルで維持し、標準実験食餌(standard Iaboratory c how)を任意に与えた。次に、これらの動物を代謝ケージ(metabolic cage)に移し 、その中にこれらの動物を個別に収容し、同じ食餌を与えた。ＵＤＣＡ、ＵＤＣ Ａ３−スルフェート、ＵＤＣＡ７−スルフェート及びＵＤＣＡ３，７−ジスルフ ェートを２５０ｍｇ／日の用量で胃管栄養によって連続４日間投与した。各群は ３〜６匹のラットを含んだ。動物の体重を毎日測定した。５日目に、動物をエー テル麻酔下で放血によって殺した。血漿を回収し、−２０℃において冷凍した。 肝臓を取り出し、通常の生理的食塩水中ですすぎ洗いし、液体窒素中でフラッシ ュ冷凍した(flash-frozen)。尿と糞便を２４時間毎に回収し、−２０℃において 冷凍した。全ての動物はＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎ ｃｅｓによって作成された“Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ”（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ出版Ｎｏ．８６−２３、１９８５年 改訂）に従ってヒューマンケア(humane care)を受けた。 胆汁酸分析腸内容物と糞便中の非コンジュゲート化胆汁酸とスルフェート胆汁酸 腸内容物を秤量して、小ピース(small pieces)に分解した。各群において、試 験の４日目に全ての動物からの糞便（１００ｍｇ）をプールし、次に磨砕して、 微細ペーストにした。全てのサンプルを超音波処理し、続いて、８０％メタノー ル中で２時間還流させ、クロロホルム／メタノール（１：１）中で１時間還流さ せた。サンプルを乾燥させ、乾燥した抽出物を８０％メタノール（２０ｍｌ）中 に再懸濁させた。メタノール抽出物（腸内容物の１／４０と、糞便サンプルの１ ／２０）の画分を取り出し、内部標準のノルデオキシコール酸（１０μｇ）を加 えた。この抽出物を０．０１ｍｏｌ／リットルの酢酸（２０ｍｌ）によって希釈 して、最初にＬｉｐｉｄｅｘ１０００カラム（床サイズ，４ｘ１ｃｍ；Ｐａｃｋ ａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，オランダ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）に通 し、次にＢｏｎｄ−Ｅｌｕｔ Ｃ₁₈カートリッジ （Ａｎａｌｙｔｉｃｈｅｍ，Ｈａｒｂｏｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に通した。 Ｌｉｐｉｄｅｘ １０００カラムとＢｏｎｄ−Ｅｌｕｔカートリッジとをメタノ ール（それぞれ、２０ｍｌと５ｍｌ）によって溶出させることによって、胆汁酸 を回収し、一緒にした抽出物を乾燥させた。ジエチルアミノヒドロキシプロピル Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（Ｌｉｐｉｄｅｘ−ＤＥＡＰ；ＰａｃｋａｇｅＩ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）上での親油性アニオン交換クロマトグラフィーに よって、非コンジュゲート化胆汁酸を中性ステロール及びコンジュゲート化胆汁 酸から単離させ、分離した。非コンジュゲート化胆汁酸の回収は７２％エタノー ル中の０．１ｍｏｌ／リットル酢酸（７ｍｌ）中による溶離と、その後の溶媒の 蒸発とによって達成した。９ｍｌの７２％エタノール中の０．３ｍｏｌ／リット ル酢酸（ｐＨ９．６）によって、総コンジュゲート化胆汁酸を回収した。ノルデ オキシコール酸（１０μｇ）の添加後にＢｏｎｄ−Ｅｌｕｔ Ｃ₁₈カートリッジ に通すことによって塩を取り出し、５ｍｌのメタノールによる溶出によって、コ ンジュゲート化胆汁酸を回収した。メタノール（１ｍｌ）と、蒸留したテトラヒ ドロフラン（９ｍｌ）と、ジオキサン中の１ｍｏｌ／リットル トリフルオロ酢 酸（０．１ｍｌ）との混合物中で加溶媒分析をおこない、４５℃に２時間加熱し た。加溶媒分析後に、非コンジュゲート化胆汁酸をＬｉｐｉｄｅｘ−ＤＥＡＰ上 でのクロマトグラフィーによって単離した。サンプルをメタノール（０．３ｍｌ ）中に溶解し、２．７ｍｌの新たに蒸留したエーテル性(ethereal)ジアゾメタン と反応させることによって、メチルエステル誘導体を製造した。試薬の蒸発後に 、メチルエステル誘導体を５０ｍｌのＴｒｉ−Ｓｉｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の添加によってトリメチルシリルエ ーテルに転化させた。Ｌｉｐｉｄｅｘ５０００のカラム（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎ ｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）を用いて、誘導体化試薬(derivatizing reagent)を 取り出し、サンプルを精製した。血漿と尿中の非コンジュゲート化胆汁酸とスルフェート胆汁酸 各群において、全ての動物からの尿を回収した個々の日にプールした。１日目 (day1)は基底サンプルを表し、２日目、３日目及び４日目からのサンプルは胆汁 酸投与中に得た。ノルデオキシコール酸（１μｇ）の添加後に、Ｂｏｎｄ− Ｅｌｕｔ Ｃ₁₈カートリッジを用いて、一部の尿（３ｍｌ）と血漿（１ｍｌ）と から胆汁酸を定量的に抽出した。液体−固体抽出後に、非コンジュゲート化胆汁 酸とコンジュゲート化胆汁酸との単離及び分離をＬｉｐｉｄｅｘ−ＤＥＡＰ上で の親油性アニオン交換クロマトグラフィーによって達成した。胆汁酸コンジュゲ ートの加溶媒分解と、加水分解生成物(hydrolyzed product)の単離を上述したよ うにおこない、胆汁酸を揮発性メチルエステル−トリメチルシリルエーテル誘導 体に転化させた。肝臓と空腸内容物とにおける胆汁酸コンジュゲーション度 肝臓サンプル（１００ｍｇ）を磨砕して、微細ペーストにし、腸内容物と糞便 とに関して上述したように、還流と、Ｌｉｐｉｄｅｘ１０００カラムに通すこと によって胆汁酸を抽出した。親油性アニオン交換クロマトグラフィーによって、 胆汁酸のコンジュゲーション形式に応じた胆汁酸のグループ分け(group separat ion)を達成した。各動物からの抽出物をプールし、Ｌｉｐｉｄｅｘ−ＤＥＡＰと 、下記緩衝剤：７２％エタノール中の０．１ｍｏｌ／リットル酢酸（非コンジュ ゲート化胆汁酸）；７２％エタノール中の０．３ｍｏｌ／リットル酢酸、ｐＨ５ ．０（グリシンコンジュゲート）；７２％エタノール中の０．１５ｍｏｌ／リッ トル酢酸、ｐＨ６．５（グリシンコンジュゲート）；及び７２％エタノール中の ０．３ｍｏｌ／リットル酢酸、ｐＨ９．６（スルフェートコンジュゲート）とに よるゲル床の段階的溶出とを用いて、胆汁酸とそれらのコンジュゲートとを分離 した。緩衝剤の蒸発後に、硫酸化胆汁酸は加溶媒分解したが、アミド化コンジュ ゲート(amidated conjugate)は２．５ｍｌの０．２ｍｏｌ／リットルリン酸塩緩 衝剤、ｐＨ５．６中の５０単位のコリルグリシンヒドロラーゼ（Ｓｉｍｇａ Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）によって３７℃において一晩加水分解した。得られた 非コンジュゲート化胆汁酸をＬｉｐｉｄｅｘ−ＤＥＡＰ上で単離し、メチルエス テル−トリメチルシリルエーテル誘導体を上述したように製造した。 加溶媒分解後に、ラット腸の空腸部分からのアミド化胆汁酸をＬｉｐｉｄｅｘ −ＤＥＡＰ上で、７２％エタノール中の０．１５ｍｏｌ／リットル酢酸、ｐＨ６ ．５（６ｍｌ）によって溶出させることによって単離した。酵素加水分解を上述 したようにおこない、得られた非コンジュゲート化胆汁酸を単離し、上述したよ う に誘導体化した。ＧＣ−ＭＳ メチルエステル−トリメチルシリルエーテル誘導体を３０ｍｘ０．２５ｍｍＤ Ｂ−１融合シリカ毛管カラム（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｏｌｓｏｎ， ＣＡ）上で、２℃／分の増分による２２５℃から２９５℃までの温度プログラム を用いて、３０分間の最終等温期間によって分離した。同じ条件下で操作される 同じガスクロマトグラフィーカラムを収容したＦｉｎｎｉｇａｎ４６３５質量分 析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、ＧＣ −ＭＳ分析をおこなった。溶出する成分の反復走査によって５０〜８００ダルト ンの質量範囲にわたって、電子イオン化（７０ｅＶ）質量スペクトルを記録した 。メチレンユニット値と呼ばれる、ｎ−アルカンの同族列を基準にしたガスクロ マトグラフィー保持インデックスと、信頼できる標準と比較した質量スペクトル とに基づいて胆汁酸の同定をおこなった。胆汁酸の定量はガスクロマトグラフィ ーを用いて、個々の胆汁酸のピーク高さ反応を内標準から得られたピーク高さ反 応と比較することによっておこなった。液体二次イオン化質量分析法 ステンレス鋼プローブ上にスポットしたグリセロール／メタノールマトリック スの小滴上に約１μｌのメタノール抽出物を供給した後に、尿サンプルの液体二 次イオン化質量分析法負イオンスペクトルを得た。このプローブをＶＧ Ａｕｔ ｏｓｐｅｃ Ｑ質量分析計のイオンソース(ion source)中に導入し、セシウムヨ ウ素(cesium iodine)(３５ＫｅＶ)から発生した、高速セシウム原子のビームを サンプルを含むターゲットに発射した。５０〜１０００ダルトンの質量範囲にわ たって負イオンスペクトルが得られた。 統計分析 データは、分析前に抽出物をプールしたときの全ての動物の平均値±ＳＥＭと して又は平均値として表現する。種々な群からの結果はペアード(paired)又はア ンペアード(unpaired)両側Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を用いて比較した。＜０．０ ５のＰ値を統計的に有意と見なされた。 結果腸に沿った管腔内の胆汁酸組成 対照群の動物と、個々の胆汁酸を投与された動物とに関する腸の棄却された区 分の平均重量は同じであった。対照動物では、空腸中のＵＤＣＡの総量（０．０ ３±０．０１ｍｇ）はごく僅かであり、総胆汁酸の僅か０．３％を占めるもので あった。しかし、ＵＤＣＡ、ＵＤＣＡ３−スルフェート、ＵＤＣＡ７−スルフェ ート及びＵＤＣＡ３，７−ジスルフェートの最終用量を投与された後２４時間の 全ての動物では、空腸中のＵＤＣＡの総質量（及び総胆汁酸のその割合）はより 大きく、それぞれ、９．９５±０．４９ｍｇ（３５．９％）、３．６７±０．４ ５ｍｇ（１６．４％）、１．０９±０．３４ｍｇ（４．７％）及び０．２１±０ ．０７ｍｇ（２．０％）であった。この結果は、スルフェート基がＣ−７位置に おいてコンジュゲートされるときにＵＤＣＡが殆ど保存されないことを示す（表 １）。 ＵＤＣＡ及びＵＤＣＡ３−スルフェートを投与された動物の空腸には、△²²Ｕ ＤＣＡ、外因的に投与されたＵＤＣＡの特定の代謝産物が大きな割合で、多量に 検出された。しかし、この代謝産物は対照群では検出されず、ＵＤＣＡのＣ−７ スルフェートコンジュゲートを投与された動物の総空腸胆汁酸の＜３％を占めた （表１）。 空腸中のＵＤＣＡのコンジュゲーションパターンを親油性アニオン−交換クロ マトグラフィーによって胆汁酸の分離後に調べた場合に（図１）、ＵＤＣＡを投 与された動物は主としてグリコ−及びタウロ−ＵＤＣＡを有し、少量の非コンジ ュゲート化ＵＤＣＡ及び無視できる量の硫酸化ＵＤＣＡを有することが判明した 。ＵＤＣＡのアミド化及び非コンジュゲート化形がＣ−７スルフェートの投与後 に空腸中で検出されたが、空腸中のＵＤＣＡの総質量は非常に少なかった。ＵＤ ＣＡ−３−スルフェートを投与されたラットでは、空腸は実質的な割合のアミド 化ＵＤＣＡを含有し、このことは脱コンジュゲーション(deconjugation)及び／ 又はアミド化による有意なバイオトランスフォーメーションを実証する。 内因的胆汁酸に関しては、コール酸が対照動物の空腸中の主要胆汁酸であり、 総胆汁酸の４８．５％±２．９％（６．８２±１０１０ｍｇ）を占め、ＵＤＣＡ 投与後は、１６．８％±１．３％（４．６８±０．６５ｍｇ）に有意に低下した （Ｐ＝０．０１）。ＵＤＣＡ３−スルフェートも、ＵＤＣＡよりも低い程度にで はあるが、コール酸の割合を低下させたが（Ｐ＝０．０５）、ＵＤＣＡのＣ−７ スルフェートの投与は空腸中のコール酸の割合を増加させた（Ｐ＝０．０１）（ 表１）。 対照動物の結腸では、胆汁酸の大部分は二次的(secondary)であり、主として デオキシコール酸及びω−ムリコール酸として同定されたが、ごく少量のリトコ ール酸が検出された（表２）。ＵＤＣＡ投与はデオキシコール酸の割合を低下さ せたが（Ｐ＝０．００３）、リトコール酸は存在する主要な胆汁酸になり、総結 腸胆汁酸の３２．０％±０．８％を占めた（Ｐ＝０．０００４）。これとは対照 的に、ＵＤＣＡ７−スルフェートとＵＤＣＡ３，７−ジスルフェートの投与は、 結腸中のデオキシコール酸とリトコール酸の両方の質量と割合とを実質的に減少 させた。 糞便胆汁酸排泄 動物群の間で各日排泄される糞便重量の有意差は認められなかった。ＵＤＣＡ 、ＵＤＣＡ３−スルフェート、ＵＤＣＡ７−スルフェート及びＵＤＣＡジスルフ ェートを投与された動物における総糞便胆汁酸の排泄は、それぞれ、１４．８５ 、１０．７０、１２．６５及び１０．８８ｍｇ／ｇ糞便であった。全ての動物の 糞便はＵＤＣＡを多く含有したが；非コンジュゲート化胆汁酸を投与された動物 では、ＵＤＣＡが殆ど排他的に非コンジュゲート化形で検出された。これとは対 照的に、ＵＤＣＡ７−スルフェート及びＵＤＣＡ３，７−ジスルフェートを投与 されたラットの糞便中には無視できる濃度の非コンジュゲート化ＵＤＣＡが存在 し；これらの２種類のコンジュゲートは実際に無変化で糞便中に排泄された（図 ２）。糞便中に排泄される主要な二次的胆汁酸(secondary bile acid)の濃度は 動物群の間で変化した。ＵＤＣＡ群では、リトコール酸が対照値から顕著に増加 するが、ＵＤＣＡ７−スルフェート及びＵＤＣＡ３，７−ジスルフェートの投与 後のリトコール酸の糞便排泄は減少した。デオキシコール酸排泄でも同様な傾向 が見られた。標準のラット糞便と比較すると、リトコール酸／デオキシコール酸 のレイション(ration)は、ＵＤＣＡを投与したときは２０倍より大きく増加し、 ＵＤＣＡ３−スルフェートを投与したときには１１倍に増加したが、ＵＤＣＡ７ −スルフ ェートを投与したときには増加しなかった（図３）。肝組織の胆汁酸組成 肝組織中の個々の胆汁酸の濃度と割合とを表３に要約する。対照動物では、Ｕ ＤＣＡ濃度は１２．０ｎｍｏｌ／ｇであり、総肝臓胆汁酸の２．８％を占めた。 ＵＤＣＡとＣ−３スルフェートの投与は肝組織ＵＤＣＡの濃度と割合とを増加さ せた（図１）。さらに、△²²ＵＤＣＡが肝臓中に比較的高い割合で検出された。 これに反して、動物にＣ−７スルフェート胆汁酸を投与したときには、総ＵＤＣ Ａ濃度と組成％との顕著な低下が生じた。ＵＤＣＡ投与は肝臓リトコール酸濃度 を増加させたが、スルフェートコンジュゲートの投与後は、リトコール酸の減少 が生じた。全ての群において、胆汁酸の投与によってデオキシコール酸濃度は減 少し、この減少はＣ−７スルフェートに関して大きかった。肝組織コール酸濃度 はＵＤＣＡを投与したときにほぼ１／４に減少したが、Ｃ−７スルフェートコン ジュゲートの投与後にはやや増加した。 個々の胆汁酸の投与後に、肝組織中のＵＤＣＡのコンジュゲーションは、非コ ンジュゲート化ＵＤＣＡとそのＣ−３スルフェートが主としてタウリンとのコン ジュゲーションによって両方ともバイオトランスフォームされることを確立した 。投与した胆汁酸に関係なく、無視できる濃度と割合の非コンジュゲート化ＵＤ ＣＡと硫酸化ＵＤＣＡとが全ての動物の肝組織中に存在した（図４）。血漿及び尿の胆汁酸組成 ＵＤＣＡを投与された動物中の非コンジュゲート化血漿ＵＤＣＡ濃度は４．８ ±２．２μｍｏｌ／リットルであり、この値はＵＤＣＡ３−スルフェート（０． ９±０．４μｍｏｌ／リットル）、ＵＤＣＡ７−スルフェート（０．７±０．５ μｍｏｌ／リットル）及びＵＤＣＡジスルフェート（１．０±０．２μｍｏｌ／ リットル）を投与された動物に関して検出された値よりも有意に大きかった。硫 酸化ＵＤＣＡ濃度は全ての動物群において同じであり、＜０．３μｍｏｌ／リッ トルであった。 ＵＤＣＡの尿排泄は、全ての動物に関して胆汁酸投与前は無視できる程度（＜ ０．４ｎｍｏｌ／リットル）であった。ＵＤＣＡ後に、尿の非コンジュゲート化 ＵＤＣＡ排泄は６４２．７ｎｍｏｌ／日であった。これはスルフェートコン ジュゲート（ＵＤＣＡ３−スルフェート，５．２ｎｍｏｌ／日；ＵＤＣＡ７−ス ルフェート，１．８ｎｍｏｌ／日；及びＵＤＣＡ３，７−ジスルフェート，１． ３ｎｍｏｌ／日）を投与された動物の尿中に排泄されるＵＤＣＡ濃度よりも有意 に大きかった。ＵＤＣＡのスルフェートコンジュゲートは非コンジュゲート化Ｕ ＤＣＡ（４．６ｎｍｏｌ／日）、ＵＤＣＡ３−スルフェート（２．７ｎｍｏｌ／ 日）、ＵＤＣＡ７−スルフェート（３１７．８ｎｍｏｌ／日）及びＵＤＣＡ３， ７−ジスルフェート（２１７．１ｎｍｏｌ／日）の投与後の尿中にも検出された 。これは一日投与量の＜０．０５％に相当するが、これらの胆汁酸コンジュゲー トを液体二次イオン化質量分析法によって検出することが可能であった。 考察 肝組織ＵＤＣＡ濃度はＵＤＣＡの経口投与によって顕著に増加したが、この胆 汁酸は主としてアミド化によってコンジュゲート化された。無視できる量の非コ ンジュゲート化ＵＤＣＡが検出され（図４）、これに関して、その代謝はヒトの 代謝に類似する。これとは対照的に、Ｃ−７スルフェート及びジスルフェートコ ンジュゲートを投与した場合には、ＵＤＣＡの肝臓濃度は対照動物に比べて低く 、このことはこれらのコンジュゲートが腸から吸収されないために、ＵＤＣＡの 保存が無視できる程度であることを実証した。肝臓ＵＤＣＡ濃度はＣ−３スルフ ェートの投与後に増加したが、これが主としてアミド化されるという事実は、Ｕ ＤＣＡ３−スルフェートの有意な脱硫酸化(desulfation)とアミド化とがおこな われたことを実証した。空腸におけるＵＤＣＡのコンジュゲーションのパターン は肝組織の同パターンに匹敵するが、ＵＤＣＡ投与群とＵＤＣＡ３−スルフェー ト投与群では高い割合の非コンジュゲート化ＵＤＣＡが存在した（図１）。胆汁 酸供給(feeding)の以前の研究は、胆汁酸プールの最大の富化が４日間までに得 られ、供給を持続しても胆汁酸組成の他の変化がもはや生じないことを確立して いる。 ＵＤＣＡのＣ−７スルフェートの腸吸収が無いことは糞便の胆汁酸組成にさら に表れる。ＵＤＣＡ７−スルフェート及びＵＤＣＡ３，７−ジスルフェートを投 与された動物におけるＵＤＣＡの総量の糞便濃度は、ＵＤＣＡ又はＵＤＣＡ３− スルフェートを投与された動物の糞便中に検出されるＵＤＣＡ濃度よりも顕著に 大きかった。さらに、ＵＤＣＡのＣ−７スルフェートは主として無変化で糞便中 に排泄された。これらの研究結果は、Ｃ−３胆汁酸スルフェートに対してのみ活 性であることが既に判明している細菌スルフェート(bacterial sulfate)の基質 特異性によって説明することができる。ＵＤＣＡ投与は主要な二次的胆汁酸とリ トコール酸及びデオキシコール酸との糞便排泄に対して顕著な影響を及ぼした。 非コンジュゲート化ＵＤＣＡ及びＵＤＣＡ３−スルフェートを投与した場合には 糞便リトコール酸濃度の大きな増加が生じたが、ＵＤＣＡ７−スルフェート及び ＵＤＣＡ３，７−ジスルフェートの投与はこれらの二次的胆汁酸の糞便アウトプ ットに有意な影響を与えなかった。 糞便及び肝臓のリトコール酸濃度の増加はＵＤＣＡとこれより軽度ではあるが そのＣ−３スルフェートとの腸細菌バイオトランスフォーメーションによって説 明することができる。ＵＤＣＡからリトコール酸へのバイオトランスフォーメー ションはラットとヒトの両方において同じような程度に生ずる。ＵＤＣＡを投与 された動物の糞便中のデオキシコール酸の増加は末端回腸におけるコール酸吸収 の既知の競合阻害と一致し、このコール酸吸収の競合阻害は結腸への溢流(spill -over)の増加と、その結果の７α−デヒドロキシレーション(dehydroxylation) とをもたらし、デオキシコール酸を形成する。興味深いことには、ＵＤＣＡ Ｃ −７スルフェートは逆の効果を有するように思われる；肝組織中のコール酸濃度 は対照動物に比べてやや増加し、糞便コール酸とデオキシコール酸濃度は減少し た。 ＵＤＣＡが有意なバイオトランスフォーメーションを受けてリトコール酸にな り、糞便デオキシコール酸濃度を高め、これらの両方が高度に疎水性の胆汁酸で あるという事実を考慮すると、化学的に誘導された結腸癌の動物モデルにおいて ＵＤＣＡの有益な効果が示されていることは恐らく意外であろう。これらのモデ ルでは、疎水性胆汁酸が腫瘍の成長を促進することが決定的に確立されている。 胆汁酸の直腸投与と経口投与、盲腸への胆汁転換(diversion)、コレスチラミン 供給、食餌の脂肪及びある種の繊維（全てが結腸を通しての胆汁酸の流動を高め る条件）は、促進効果と一致して、腫瘍形成を増強する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究 は、デオキシコール酸とリトコール酸がコマイトジェン性(comitogenic)であり 、 結腸上皮細胞増殖速度を高めることを実証する。オルニチンデカルボキシラーゼ 活性とＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ抗原とに対する他の効果も判明している。 ＵＤＣＡの化学予防効果(chemopreventive effect)に関しては幾つかの可能な 説明が存在する。膜傷害性である疎水性胆汁酸と共にｉｎ ｖｉｔｒｏで同時イ ンキュベートする又はｉｎ ｖｉｖｏで同時注入するときのＵＤＣＡの細胞保護 効果と同様な形式で、結腸におけるリトコール酸形成の増加の如何なる有害な効 果も比較的高濃度のＵＤＣＡの存在によって緩衝されることができる。或いは、 保護効果は結腸デオキシコール酸濃度の低下の結果である可能性があり、このこ とはデオキシコール酸が結腸癌の促進において非常に重要であることを意味する と考えられる。硫酸化胆汁酸の投与によって結腸デオキシコール酸が同様に減少 するにも拘わらず、ＵＤＣＡのＣ−７スルフェート類は、これらのコンジュゲー トがより大きく疎水性の胆汁酸にバイオトランスフォームされないので、原則と してＵＤＣＡよりも優れている。さらに、小腸においてＣ−７スルフェートの吸 収が無いことは小量の使用によって同様な化学的予防効果を得ることを可能にす ると考えられる。 ヒトの結腸発癌における胆汁酸の役割はあまり明らかにされていない。初期の 研究は、糞便胆汁酸排泄、特にリトコール酸とデオキシコール酸の排泄が結腸癌 患者、腺腫ポリープ患者及び家族性ポリポーシス患者において増加することを示 唆しているが、これらの研究結果は数人の他の研究者によっては実証されていな い。対照と比較して、結腸癌患者又は腺腫ポリープ患者は糞便中の増大した水相 リトコール酸及びデオキシコール酸濃度を有すると報告されており、これらの濃 度は結腸細胞の増殖度と相関した。結腸癌の動物モデルとｉｎ ｖｉｔｏ細胞系 とにおいてＵＤＣＡの化学保護(chemoprotective)／細胞保護効果を支持する先 行データにも拘わらず、ＵＤＣＡ投与後のリトコール酸形成の増加は結腸におけ るＵＤＣＡの総合的効力を限定すると考えられる。糞便中のリトコーレート／デ オキシコーレートのレイションはＵＤＣＡ投与後及びＵＤＣＡ３−スルフェート 投与後は対照に比べて顕著に増加する（図３）。このことは、結腸癌患者及び結 腸癌の高い危険性状態にある患者では糞便リトコーレート／デオキシコーレート の比率が増加し、この比率は診断価値があると提案されているので、あまり望ま しくない。他方では、ＵＤＣＡ７−スルフェート及びＵＤＣＡ３，７−ジスルフ ェートの投与はリトコーレート／デオキシコーレートのレイションを変化させな かった。統計的に有意ではないが、このレイションの減少傾向が観察されたが、 これらの二次的胆汁酸の量的な糞便排泄は対照動物と同じであった。 さらに、上記で考察したように、ＵＤＣＡのＣ−７位置におけるスルフェート 基の導入はこの分子の親水性を高め、腸吸収を防止することによって、結腸への ＵＤＣＡの部位特異的投与を容易にする。リトコール酸に転化することによって 、糞便のリトコール酸／デオキシコール酸比率を高め、結腸疾患の危険因子と見 なされる非コンジュゲート化ＵＤＣＡとは対照的に、Ｃ−７スルフェートは代謝 的に不活性である。それ故、これらのコンジュゲート化胆汁酸は結腸においてＵ ＤＣＡよりも有効な化学保護剤であると考えられる。ラットにおける胆汁流動(bile-flow)と胆汁脂質分泌に対するデオキシコール酸 のスルフェートエステルの代謝と効果 ＵＤＣＡのＣ−３及びＣ−７スルフェートエステルとジスルフェートコンジュ ゲートをすぐ下記で段階的に詳述するように製造した。続いて、胆道フィステル (bile fistula)中のこれらの胆汁酸の肝臓代謝を試験し、これらの胆汁酸をＵＤ ＣＡと比較して、胆汁流動と胆汁脂質分泌に対するこれらの効果を確認した。 材料と方法ウルソデオキシコール酸３−スルフェート（ＵＤＣＡ−３Ｓ）の合成 イミダゾール（３．５ｇ）とｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１． ６ｇ）とを、無水ジメチルホルムアミド（１．５ｍｌ）−ピリジン（０．７５ｍ ｌ）中のＵＤＣＡ（２ｇ）の氷冷(ice-cold)溶液に加え、この混合物を３０分間 撹拌した。次に、この反応混合物を氷水（２０ｍｌ）中に注入して、酢酸エチル （１００ｍｌ）によって抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾 燥させ、蒸発させた。得られた油性残渣をヘキサン−酢酸エチル（３：１容量％ 、２５０ｍｌ）中に溶解し、４０ｇのシリカゲルカラム（２８−２００Ｍｅｓｈ 、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）。溶液 を蒸発させた後に、残渣をエタノール中に溶解し、生成物のＵＤＣＡ−３−ｔＢ ＤＭＳエーテル（２．１５ｇ、収率８３％）を結晶 化した。室温における無水酢酸（２０ｍｌ）とピリジン（２０ｍｌ）とによるＵ ＤＣＡ−３−ｔＢＤＭＳエーテル（２．０ｇ）の５の処理は、油性生成物として ＵＤＣＡ７−アセテート３−ｔｂＤＭＳエーテルを生じた。アセトン（２４ｍｌ ）中のＵＤＣＡ７−アセテート３−ｔｂＤＭＳエーテルの溶液に、１８％ＨＣｌ （２．４ｍｌ）を加え、混合物を室温において３０分間撹拌した。得られた生成 物を酢酸エチル中に抽出し、水によって洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、 溶媒を蒸発させて、ウルソデオキシコール酸７−アセテートを油性生成物として 得た。無水ピリジン（１２ｍｌ）中のクロロスルホン酸（１．２ｍｌ）をＵＤＣ Ａ７−アセテート（１．２ｇ）の氷冷溶液に加え、この溶液を５０℃に加熱した 。３０分間後に、水（４００ｍｌ）を加えて反応混合物の反応を停止させ、生成 物をオクタデシルシラン結合シリカの大型カートリッジ、ＭＥＧＡ−ＢＯＮＤ− ＥＬＵＴ（Ｖａｒｉａｎ、Ｈａｒｂｏｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）上に吸収させ、メタ ノールによる溶出によって回収した。次に、メタノール抽出物を蒸発乾固させ、 次に、ＵＤＣＡ７−アセテート３−スルフェートのピリジニウム塩を０．２ＭＮ ａＯＨメタノール溶液（４０ｍｌ）中に溶解することによって二ナトリウム塩に 転化させ、濾過した。濾液を冷エーテル（４００ｍｌ）によって希釈して、沈殿 を回収し、冷エーテルによって洗浄し、乾燥させた。固体（１．０ｇ）をＭｅＯ Ｈ（１０ｍｌ）中に溶解し、３．５Ｍ ＮａＯＨ（１０ｍｌ）を加え、溶液を室 温において１８時間撹拌した。水（５００ｍｌ）によって希釈した後に、生成物 をＭＥＧＡ−ＢＯＮＤ−ＥＬＵＴによって抽出した。カートリッジからのメタノ ール抽出物を蒸発乾固させ、０．２Ｍ ＮａＯＨメタノール溶液（３０ｍｌ）中 に溶解して、濾過した。濾液を冷エーテル（３００ｍｌ）によって希釈し、得ら れた沈殿を回収し、エーテルによって洗浄した。この操作をメタノール（２０ｍ ｌ）とエーテル（２００ｍｌ）とによって３回繰り返して、ＵＤＣＡ−３−スル フェートの二ナトリウム塩（０．６２ｇ、収率５０％）を得た。ウルソデオキシコール酸７−スルフェート（ＵＤＣＡ−７Ｓ）の合成 無水ピリジン（９ｍｌ）中のクロロスルホン酸（０．９ｍｌ）をＵＤＣＡ３− ｔｂＤＭＳエーテル（９００ｍｇ）の氷冷溶液に加え、混合物を５０℃に加熱し た。３０分間後に、水（４００ｍｌ）を加えて、反応を停止させた。沈殿の、Ｕ ＤＣＡ３−ｔｂＤＭＳ７−スルフェートのピリジウム塩を水によって洗浄し、真 空下で乾燥させ、ＨＣｌによって上述したように加水分解した。生成物をＭＥＧ Ａ−ＢＯＮＤ−ＥＬＵＴのカートリッジによって抽出し、メタノール抽出物を蒸 発乾固させ、０．２Ｍ ＮａＯＨメタノール溶液（３０ｍｌ）中に溶解した。メ タノール溶液を冷エーテル（３００ｍｌ）によって希釈して、沈殿した二ナトリ ウム塩を上述したように単離して、ＵＤＣＡ７−スルフェートの純粋な二ナトリ ウム塩（６４０ｍｇ、収率７６％）を得た。ウルソデオキシコール酸３，７−ジスルフェート（ＵＤＣＡ−ＤＳ）の合成 ピリジン（１０ｍｌ）中のクロロスルホン酸（１ｍｌ）を無水ピリジン（１０ ｍｌ）中のＵＤＣＡ（１ｇ）の氷冷溶液に加え、混合物を５０℃に加熱した。６ ０分間後に、水（５００ｍｌ）を加えて、反応を停止させた。生成物をＭＥＧＡ −ＢＯＮＤ−ＥＬＵＴによって抽出し、上述したように単離して、ＵＤＣＡ−ジ スルフェートのニナトリウム塩（１．１ｇ、収率９１％）を得た。 酸化、加溶媒分解及び、メチル−トリメチルシリル（Ｍｅ−ＴＭＳ）エーテル 誘導体への転化後の全ての合成した化合物中のスルフェート基の位置を、ガス− クロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）を用いて確認した。合成化合物 のクロマトグラフィー純度は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層ク ロマトグラフィー（ＴＬＣ）及び毛管カラムガスクロマトグラフィー（ＧＣ）に よって測定して、＞９７％であることが判明した。動物試験 成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重２００〜２３０ｇ）をペン トバルビタール（Ｎｅｍｂｕｔａｌ、７．５ｍｇ／１００ｇ体重）の腹腔内注入 によって麻酔させ、追加の投与量によって鎮静状態に維持した。右頚静脈と総胆 管とに、ＰＥ−５０ポリエチレンチューブ（Ｃｌａｙ−Ａｄａｍｓ，Ｐａｒｓｉ ｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いてカニューレを挿入した。実験を通して、直腸プ ローブとサーモスタット制御加熱パッド（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｃｏ．社，Ｍｉｌｌｉｓ，Ｍａｓ．）とを用いて、体温を３７℃に維持した。 Ｈａｒｖａｒｄポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｃｏ．社）を用 いて、生理的食塩水を１．０ｍｌ／時の速 度で、頚静脈中に２時間の対照期間(control period)にわたって注入した。基底 分析(base-line analysis)のために２つの１０分間胆汁サンプルを回収した後に 、胆汁酸を個々に、段階的に投与量を増加させて（０．５、１．０及び２．０μ ｍｏｌ／分／１００ｇ体重）３０分間にわたって静脈内（ｉ．ｖ．）注入した。 胆汁酸溶液は０．４５％生理的食塩水中３％ヒトアルブミン中に調製した。各実 験に６匹の動物を用いて、胆汁を予め秤量した管中に１０分間毎に回収した。実 験の終了時に、心臓穿刺によって血液を採取し、膀胱の吸引によって尿を採取し た。全ての生物学的標本は−２０℃において保存した。この動物試験プロトコー ル（＃１Ｂ１００４４）はＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉ ｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）のＢｉｏｅｔｈｉｃ ｓ委員会によって認可された。分析方法 プレコートした(precoated)シリカゲルＧプレート（Ｍｅｒｃｋ，０．２ｍｍ 厚さ）上でｎ−ブタノール−酢酸−水（１０：１：１、容量比）の溶媒系を用い て、ＴＬＣをおこなった。ホスホモリブデン酸の１０％エタノール溶液を吹き付 けた後に１２０℃において５分間加熱することによって、スポットを可視化した 。 可変波長ＵＶ検出器を装備し、２５ｘ０．４６ｃｍのＨｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤ Ｓカラム（５μｍ粒度；Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｅｌｌｅ ｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を収容するＶａｒｉａｎ ５０００ＨＰＬＣ機器（Ｖａｒｉ ａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、ＨＰＬ Ｃをおこなった。このカラムは周囲温度において操作し、溶離用溶媒は、ｐＨ６ ．８に調節し、Ｒｏｓｓｉ等の方法［「ヒト胆汁中のコンジュゲート化胆汁酸の 高圧液体クロマトグラフィー分析：硫酸化及び非硫酸化リトコリルアミデートの 同時分解(simultaneous resolution)と、総コンジュゲート化胆管(common conju gated bile duct)」，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２８：５８９〜５９５（１９８ ７）］から改良した、メタノール−０．０１Ｍリン酸塩緩衝剤（６５：３５、容 量比）であった。流速度は１．０ｍｌ／分であり、胆汁酸は２０５ｎｍにおける 吸収によって検出された。 ＧＣは３０メートルＤＢ−１（４ｍｍ内径；０．２５μｍフィルム）融合シリ カ毛管カラム（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社，Ｒａｎｃｈｏ Ｃｏｒｄｏｖ ａ，ＣＡ）を収容するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ５８９０ガス クロマト グラフ上で、２℃／分の増分による２２５℃から２９５℃までの温度プログラム と、それぞれ、２分間と３０分間の初期と最終の等温期間とを用いて、実施した 。ヘリウムをキャリヤーガスとして１．８ｍｌ／分の流速度で用いた。 ＧＣ−ＭＳは、同じＧＣカラムを収容して、同じクロマトグラフィー条件下で 操作されるＶＧ Ａｕｔｏｓｐｅｃ Ｑ磁気セクター機器(magnetic sectorinst rument)又はＦｉｎｎｉｇａｎ４６３５クァドルプルＧＣ−ＭＳ−ＤＳ機器上で 実施した。電子イオン化（７０ｅＶ）質量スペクトルを５０〜１０００Ｄａ／ｅ の質量範囲にわたって溶出成分の反復走査によって記録した。 胆汁サンプル、尿及び合成化合物の負イオン高速原子衝突−質量分析法（ＦＡ Ｂ−ＭＳ）スペクトルを、ＦＡＢプローブの銅ターゲット上にスポットしたグリ セロールマトリックスの小滴上に、等量の約１μｌのオリジナル胆汁抽出物と、 １０μｌ〜５０μｌの尿抽出物と、メタノール中に溶解したμｇ量の合成胆汁酸 とを供給した後に得た。このプローブを質量分析計のイオンソース中に直接導入 し、８ｋＶ及び２０μＡで操作されるサドル フィールド 原子ガン(saddle fi eld atom gun)（Ｉｏｎ Ｔｅｃｈ，Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅ ｘ，ＵＫ）によって発生したキセノン、又はセシウム ヨウ素（３５ｋＶ）から 発生したセシウムのいずれかの高速原子ビームを、サンプルを含むターゲットに 発射した。５０〜１０００Ｄａ／ｅの質量範囲にわたって負イオンスペクトルが 得られた。胆汁分析 胆汁量を１ｇ／ｍｌの密度を想定して、重量分析によって測定した。加溶媒分 解前（非硫酸化胆汁酸）と加溶媒分解後（総胆汁酸）とに、胆汁中の総３α−ヒ ドロキシ胆汁酸濃度を酵素的に測定した（Ｍａｓｈｉｇｅ，Ｆ．等，「血清中の 総胆汁酸の直接分光測定法」，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２７：１３５２〜１３５６ （１９８１））。胆汁流動速度に胆汁酸濃度を乗ずることによって、胆汁酸アウ トプットを算出した。胆汁リン脂質(biliary phospholipid)をコリンオキシダー ゼ方法（Ｎｉｐｐｏｎ Ｓｈｏｊｉ社，日本、大阪）に基づく酵素的方法によっ て測定した（Ｇｒａｎｔｚ，Ｄ．等，「胆汁中のコリン含有リン脂質の酵素によ る測定」，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２２：２７３〜２７６（１９８１））。コ レステロールも酵素的に測定した（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｅｈｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）（Ｆｒｏｍｍ，Ｈ．等，「ヒト胆汁中のコレ ステロール分析のための単純酵素アッセイの使用」，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ２１：２５９〜２６１（１９８０））。胆汁及び尿の胆汁酸分析 注入した胆汁酸の肝臓バイオトランスフォーメーションを測定するために、６ 匹の動物からの胆汁回収物(bile collections)をプールし、抽出、加溶媒分解、 加水分解及び誘導体化後に、胆汁の胆汁酸をＧＣ−ＭＳによって測定した。胆汁 酸の定量はＧＣを用いて、個々の胆汁酸のピーク高さ反応を、最初の胆汁サンプ ルに加えた内標準のノルデオキシコール酸から得られたピーク高さ反応に比較す ることによって、達成した。胆汁酸の同定はメチレンユニット値（ＭＵ）と呼ば れる、ｎ−アルカンの同族系列に比較して、保持インデックスに基づいておこな った、質量スペクトルの分画パターン(fragmentation pattern)を信頼できる標 準と比較した。信頼できる胆汁酸標準の１００を越える質量スペクトルと保持イ ンデックスとのリストが最近、基準ソース(reference source)として編集された （Ｌａｗｓｏｎ，Ａ．Ｍ．等，「胆汁酸の質量分析法」，Ｔｈｅ Ｂｉｌｅ Ａ ｃｉｄｓ，４巻，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１６７ 〜２６７頁（１９８８））。６匹の動物からの尿回収物をプールし、胆汁酸をＢ ｏｎｄＥｌｕｔ−Ｃ₁₈カートリッジを用いた液体−固体抽出によって抽出し、胆 汁酸を加溶媒分解、加水分解及び誘導体化後に、ＧＣ−ＭＳによって胆汁酸を分 析した。親油性アニオン交換クロマトグラフィーを用いた胆汁酸のグループ分け ＵＤＣＡ−３Ｓを注入した動物の場合に、胆汁酸注入（１．０μｍｏｌ／分／ １００ｇ体重）の最終期間中に胆汁を回収した。胆汁酸を加溶媒分解し、親油性 アニオン交換ゲル、ジエチルアミノヒドロキシプロピルＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ −２０（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，オラ ンダ）を用いて、それらのコンジュゲーション形式に基づいてグループに分離し た。加水分解と、Ｍｅ−ＴＭＳエーテルの調製後に、各画分中の胆汁酸組成をＧ Ｃ−ＭＳによって測定した。統計的方法 結果は平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表現した。胆汁流動と胆汁 脂質アウトプットとは、それぞれ、μｌ／分／ｇ肝臓とｎｏｍｏｌ／分／ｇ肝臓 として表す。統計分析はＩＮＳＴＡＴプログラム（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔ ｗａｒｅ社，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いておこなった。グループ間のパ ラメトリックデータ(parametric data)をＳｔｕｄｅｎｔ ｔ−検定を用いて分 析した。異なるグループ間の統計的比較は一方向分散分析(one way analysis of variance)（ＡＮＯＶＡ）によっておこなった。これらの数値が異なる胆汁塩の 注入に関して有意であることが判明し、任意の２グループの比較をＢｏｎｆｅｒ ｒｏｎｉ ｔ−検定によっておこなった。線形回帰分析をおこなった。各胆汁酸 の胆汁分泌促進活性を胆汁酸分泌速度と胆汁流動との間の相互関係の回帰線の勾 配から判定し、μｌ／μｍｏｌとして表現した。勾配間の比較は一方向ＡＮＯＶ Ａによっておこなった。 結果胆汁流動と胆汁酸分泌 胆汁流動と胆汁酸分泌速度とに対するＵＤＣＡ、ＵＤＣＡ−３Ｓ、ＵＤＣＡ− ７Ｓ及びＵＤＣＡ−ＤＳのｉ．ｖ．注入の効果を図５Ａと５Ｂに示し、表４に要 約する。全ての胆汁酸は顕著に胆汁分泌促進性であり、最大胆汁流動の順序はＵ ＤＣＡ−３Ｓ＜ＵＤＣＡ＜ＵＤＣＡ−７Ｓ＝ＵＤＣＡ−ＤＳであった。胆汁の胆 汁酸分泌速度は全ての動物において、ＵＤＣＡ−３Ｓ、ＵＤＣＡ、ＵＤＣＡ−Ｄ Ｓ及びＵＤＣＡ−７Ｓの注入中に、それぞれ、１３８．９±１１．８、１４５． １±１７．３、２２２．４±２４．３及び２５５．４±１８．２ｎｍｏｌ／分／ ｇ肝臓の最大値まで増加した。比較のために、基底胆汁酸分泌は平均して４０． ４±４．２ｎｍｏｌ／分／ｇ肝臓であった。各胆汁酸の注入後の胆汁酸分泌速度 と胆汁流動との関係を図６に示す。回帰線の勾配から算出された、ＵＤＣＡ、Ｕ ＤＣＡ−７Ｓ、ＵＤＣＡ−３Ｓ及びＵＤＣＡ−ＤＳの見かけの胆汁分泌促進活性 は、それぞれ、１６±２、１５±１、１３±１及び１６±１μｌ／μｍｏｌであ った。胆汁酸に依存しない胆汁流動を実証する回帰線のインターセプト(interce pt)は全ての動物群に関して同じ大きさ（１．７μｌ／分／ｇ肝臓）であった。胆汁脂質分泌 コレステロールとリン脂質との胆汁アウトプットに対するＵＤＣＡとそのスル フェートコンジュゲート注入の効果を図７Ａと７Ｂに示す。ＵＤＣＡとＵＤＣＡ −７Ｓ注入の最初の４０分間にわたって、胆汁コレステロールは増加し、それぞ れ、１．８８±０．１９と１．７６±０．２１ｎｍｏｌ／分／ｇ肝臓の最大分泌 速度に達し、コレステロール分泌はＵＤＣＡ−７Ｓによって維持されたが、ＵＤ ＣＡをさらに投与量を段階的に高めながら注入した場合には顕著な低下を示した 。注入前の期間(pre-infusion period)では、コレステロールの対応する分泌速 度は平均して、それぞれ、１．４６±０．１と１．４２±０．１６ｎｍｏｌ／分 ／ｇ肝臓であった。これに反して、ＵＤＣＡ−３ＳとＵＤＣＡ−ＤＳの注入は胆 汁コレステロールアウトプットを基底値に比べて有意に低下させて、それぞれ、 ０．４０±０．０５と０．３７±０．１２ｎｍｏｌ／分／ｇ肝臓にした。胆汁リ ン脂質分泌はＵＤＣＡとＵＤＣＡ−７Ｓの注入によって有意に増加したが、これ に反して、ＵＤＣＡ−３ＳとＵＤＣＡ−ＤＳは胆汁リン脂質を有意に減少させた （表４）。胆汁及び尿の胆汁酸の負イオンＦＡＢ−ＭＳ分析 非コンジュゲート化ＵＤＣＡの注入前（基底期間）と注入中に回収したプール されたラット胆汁の負イオンＦＡＢ−ＭＳスペクトルを図８Ａと８Ｂに示す。基 底胆汁サンプル中のｍ／ｚ５１４とｍ／ｚ４９８とのイオンは、それぞれ、トリ ヒドロキシ−及びジヒドロキシ−コラノエートのタウリンコンジュゲートを表し 、ラット胆汁中の主要な種である原発性胆汁酸を表す。ＵＤＣＡの注入中に、ス ペクトル中の主要なイオンはｍ／ｚ４９８とｍ／ｚ４４８になり、このことは注 入されたＵＤＣＡが殆ど排他的にタウリン及びグリシンとコンジュゲートしたこ とを示す。ｍ／ｚ４７１のイオンはジヒドロキシコラノエート（ＵＤＣＡ）スル フェートを表し、ｍ／ｚ５６７とｍ／ｚ５８９（ナトリウムアダクツ）のイオン は ＵＤＣＡのフルクロニドコンジュゲートを表す。 ＵＤＣＡ−７Ｓの注入中に、スペクトル（図８Ｄ）中の主要なイオンはｍ／ｚ ４７１であり、そのナトリウムアダクツはｍ／ｚ４９３であり、これらのイオン は無変化ＵＤＣＡ−７Ｓを表す。ＵＤＣＡ−７Ｓのさらなる代謝転換を示す、他 の有意なイオンは存在しなかった。 ＵＤＣＡ−３Ｓの注入中に、ｍ／ｚ４７１とｍ／ｚ４９３（ナトリウムアダク ツ）におけるイオンは無変化胆汁酸の胆汁分泌を確証し、ｍ／ｚ５５０とｍ／ｚ ６００におけるイオンはグリシン及びタウリンによるアミド化を表す（図８Ｃ） 。 ＵＤＣＡ−ＤＳの注入中に、主要なイオンはｍ／ｚ４７１とｍ／ｚ４９３（ナ トリウムアダクツ）とｍ／ｚ５７３とであった。ｍ／ｚ５７３のイオンはＵＤＣ Ａ−ＤＳを表し、ｍ／ｚ４７１とｍ／ｚ４９３はフラグメントイオンである。Ｕ ＤＣＡ−ＤＳのさらなる代謝転換を示す、他のイオンは存在しなかった（図８Ｅ ）。胆汁の胆汁酸のＧＣ−ＭＳ分析 表５は、ＵＤＣＡの注入後の胆汁中の個々の胆汁酸と、種々なスルフェートコ ンジュゲートとの相対的％組成を要約する。基底状態において、コール酸、α− ムリコール酸及びβ−ムリコール酸がラット胆汁の主要な胆汁酸であった。全て の化合物の注入中に、ＵＤＣＡが主要な胆汁中胆汁酸になり、％組成は全ての群 で同じであり、このことは硫酸化胆汁酸の全てが肝臓によって吸収されて、胆汁 中に効率的に分泌されたことを示した。 ＵＤＣＡのＣ−７スルフェートとジスルフェートエステルとのアミド化を含め たバイオトランスフォーメーションを支持する証拠は存在しなかったが、非コン ジュゲート化ＵＤＣＡとＵＤＣＡ−３Ｓの両方は、恐らく側鎖において、さらな るヒドロキシル化によって代謝された、しかし、ヒドロキシル化代謝産物の正確 な構造はまだ明確に確立されていない。 ＵＤＣＡ−３Ｓの注入中に胆汁中に分泌された胆汁酸コンジュゲートの分離は 、等しい割合（２５％）の注入された胆汁酸がタウリンコンジュゲート及びグリ シンコンジュゲートとして回収され、ＵＤＣＡが殆ど排他的にタウリン及びグリ シンによってコンジュゲートされたことを実証した。ＵＤＣＡ−７ＳとＵＤＣＡ − ＤＳのバイオトランスフォーメーションが無いことがＦＡＢ−ＭＳによって確認 されたので、さらなるコンジュゲート分離試験は不必要であると思われた。尿の胆汁酸分析 全ての尿サンプルの負イオンＦＡＢ−ＭＳ分析は、ＵＤＣＡのスルフェートエ ステルが全て尿中に排泄されたことを示し、これはＧＣ−ＭＳ分析によって確証 された。しかし、量的には、尿中に排泄されたＵＤＣＡスルフェートの相対的割 合は、排除の主要な経路であった胆汁排泄に比べて小さかった。ＵＤＣＡを注入 した場合には、総投与量の無視できる割合（０．０１％）が尿中に出現した。Ｕ ＤＣＡ−３スルフェート、ＵＤＣＡ−７スルフェート及びＵＤＣＡ−ジスルフェ ートに関しは、尿中に出現した、投与量の対応する割合は、それぞれ、２．８％ 、０．９％及び２．２％であった。 考察 上述した結果は、ＵＤＣＡと同様に、スルフェートコンジュゲートの全てが明 らかに胆汁分泌促進性であり、胆汁酸分泌を高めることを実証する。個々の胆汁 酸に関する最大胆汁流動の順序はＵＤＣＡ−ＤＳ＝ＵＤＣＡ−７Ｓ＞ＵＤＣＡ＞ ＵＤＣＡ−３Ｓであり、ＨＰＬＣ保持インデックスから評価された、それらの相 対的な疎水性／親水性特性に直接関係しなかった。 胆汁酸核のＣ−７位置におけるスルフェート部分の存在は、ＵＤＣＡによって 誘導されるよりも有意に高い胆汁流動を生じ、Ｃ−３スルフェートは、胆汁分泌 促進性であるが、胆汁流動の刺激に関しては、非コンジュゲート化ＵＤＣＡより も効果的ではなかった。これらの差異は、Ｃ−３スルフェートの有意なアミド化 が初回通過肝臓クリアランス中におこなわれるが、Ｃ−７位置のスルフェート部 分がバイオトランスフォーメーションを妨害するという事実によって説明される ことができる。アミド化スルフェートが低い胆汁分泌促進性を有することも考え られる。興味深いことには、胆汁中に出現するＵＤＣＡの相対的割合は、これら の化合物の間に胆汁流動の有意差が存在したとしても、試験した全ての胆汁酸に 関して同じであった。 コレステロールとリン脂質の分泌に関しては、明確な傾向が認められた。最大 に極性である胆汁酸（それらのＨＰＬＣ保持インデックスによって証明）が胆汁 コレステロールとリン脂質のアウトプットを有意に低下させることが判明した。 胆汁酸の疎水性／親水性と、コレステロール及びリン脂質の分泌との間のこの関 係は、恐らく分子の洗浄力(detergenicity)に関連すると思われる、即ち、低洗 浄性で高度に極性の胆汁酸スルフェートはより大きく疎水性の胆汁酸よりも低い 膜傷害性である。 非コンジュゲート化ＵＤＣＡに比べて、ＵＤＣＡの高親水性３−スルフェート と３，７−ジスルフェートコンジュゲートによって誘導される、低いコレステロ ール及びリン脂質の分泌と大きい胆汁分泌亢進(hypercholeresis)との複合効果 は、これらの特定の胆汁酸スルフェートが胆汁分泌停止性肝疾患の治療のための より高い効力の薬剤でありうることを示唆する。 個々のＵＤＣＡスルフェートの肝臓バイオトランスフォーメーションの明白な 差異が観察された。例えば、核中のＣ−７位置におけるスルフェート部分の置換 は肝臓バイオトランスフォーメーションを妨害するので、ＵＤＣＡ−７スルフェ ートとＵＤＣＡ−ジスルフェートとは両方とも無変化で胆汁中に分泌された。こ のことはＵＤＣＡのＣ−３スルフェートには該当せず、このＣ−３スルフェート は胆汁中に限定された程度で無変化分泌されるのみでなく、タウリン及びグリシ ンによる知覚されうるアミド化と、恐らく側鎖におけるさらなるヒドロキシル化 とをも受けた。他方では、非コンジュゲート化ＵＤＣＡは主としてタウリンによ ってコンジュゲート化され、これより軽度に、グリシンコンジュゲート、スルフ ェートコンジュゲート及びフルクロニドコンジュゲートに転化されてから、胆汁 分泌される。 比較的高濃度を注入した後にも、無視できる量のＵＤＣＡスルフェートが尿中 に排泄された。このことは、尿中の胆汁酸の大部分がスルフェートコンジュゲー トであることを考えるときに、特に意外であった。それ故、胆汁分泌停止性肝疾 患を有する患者に胆汁の胆汁酸スルフェートが存在しないことと、硫酸化した尿 中胆汁酸の高い割合と高濃度という研究結果とは腎臓硫酸化によってのみ説明さ れることができ、胆汁酸の肝臓硫酸化によっては説明されない。これらの観察は 、硫酸化胆汁酸が肝臓によって容易に吸収され、胆汁中に運ばれることを明確に 実証するが、肝臓硫酸化が胆汁うつ滞における重要な代謝経路であるという一般 に 受容された考えを支持するとは思われない。これに関して、腎臓は胆汁うつ滞中 に肝臓を胆汁酸の有害性から保護するために重要な代謝器官である。 ラットは、胆汁酸を有意に６β−ヒドロキシル化する種であり、ＣＤＣＡ及び ＵＤＣＡの６β−ヒドロキシル化が生ずることが判明している。この試験では、 例えばムリコール酸異性体のような、ＵＤＣＡのヒドロキシル化生成物の有意な 量を検出することができなかった。胆道フィステルラットにおいてタウロケノデ オキシコール酸ジスルフェートとグリコケノデオキシコール酸ジスルフェートと が９０％まで代謝されて、３α，７α−ジスルフェート、６β−ヒドロキシ５β −コラン酸（α−ムリコール酸の３α，７α−ジスルフェート）になることが報 告されている。本発明に関して実施された実験では、ＵＤＣＡ−７ＳもＵＤＣＡ −ジスルフェートもヒドロキシル化されなかった。これらの実験は、スルフェー ト基の存在が核の肝臓バイオトランスフォーメーションを防止することを強度に 示唆する。しかし、ヒドロキシル化を担当する酵素が基質としてのアミド化胆汁 酸に選択的に作用することが可能であると考えられる。 胆汁酸とタウリンとのコンジュゲーションは酵素（胆汁酸ＣｏＡ：グリシン／ タウリン−Ｎ−アシル−トランスフェラーゼ）の基質アフィニティと、肝臓中の タウリンの供給とに依存することが考えられる。ＵＤＣＡ−３Ｓの一部がタウリ ン及びグリシンによってアミド化されることを示したＦＡＢ−ＭＳとＧＣ−ＭＳ の出願人の結果は、スルフェートエステルが非スルフェート胆汁酸に比べて酵素 に対して低いアフィニティを有することを実証する。ＵＤＣＡ−７ＳとＵＤＣＡ −ＤＳがタウリン又はグリシンによってアミド化されなかったという観察は、７ β−スルフェート部分の存在が酵素活性を妨害することを実証する。 本発明の幾つかの特定の態様を上記で詳述したが、本発明の範囲はこれらの態 様に限定されず、その代わりに、下記請求の範囲によって決定されるべきである 。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年８月１３日（１９９７．８．１３） 【補正内容】 【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/24 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５ 47/24 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＮＷ，ＮＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ 【要約の続き】 態の抑制又は治療のために有利に用いることができる。 ＵＤＣＡのスルフェートは肝臓の炎症性障害の抑制又は 治療のために投与することもできる。ＵＤＣＡスルフェ ートは肝疾患及び肝機能の血清生化学を改良するため に、胆汁流動を高めるために、又はリン脂質若しくはコ レステロールの胆汁分泌を減ずるために用いることがで きる。さらに他の態様では、本発明は単離された器官を ＵＤＣＡスルフェートによって灌流することによる単離 された器官の維持方法に関する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．３α，７β−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（ＵＤＣＡ）のスル フェートと、薬理学的に受容されるキャリヤーとを含む、薬理学的に受容される 組成物。 ２．前記スルフェートがＵＤＣＡ−３−スルフェート、ＵＤＣＡ−７−スルフ ェートＵＤＣＡ−３，７−ジスルフェート、グリコ−ＵＤＣＡ−３−スルフェー ト、グリコ−ＵＤＣＡ−７−スルフェート、グリコ−ＵＤＣＡ−３，７−ジスル フェート、タウロ−ＵＤＣＡ−３−スルフェート、タウロ−ＵＤＣＡ−７−スル フェート、タウロ−ＵＤＣＡ−３，７−ジスルフェート、及びこれらの組合せか ら成る群から選択される、請求項１記載の薬理学的に受容される組成物。 ３．前記スルフェートがＵＤＣＡ−３−スルフェート、ＵＤＣＡ−７−スルフ ェート、ＵＤＣＡ−３，７−ジスルフェート及びこれらの組合せから成る群から 選択される、請求項１記載の薬理学的に受容される組成物。 ４．前記スルフェートがＵＤＣＡ−７−スルフェート、ＵＤＣＡ−３，７−ジ スルフェート及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項１記載の薬 理学的に受容される組成物。 ５．前記スルフェートが胃腸管の炎症性状態を抑制又は治療するために有効な 量で存在する、請求項１記載の薬理学的に受容される組成物。 ６．前記炎症性状態が小腸の炎症性状態、大腸の炎症性状態、及びこれらの組 合せから成る群から選択される、請求項５記載の薬理学的に受容される組成物。 ７．前記炎症性状態が結腸癌、直腸癌、結腸の腫瘍、直腸の腫瘍、結腸の発癌 、直腸の発癌、潰瘍性大腸炎、腺腫様ポリープ、家族性ポリポーシス及びこれら の組合せから成る群から選択される、請求項５記載の薬理学的に受容される組成 物。 ８．前記スルフェートが肝臓の炎症性状態を抑制又は治療するために有効な量 で存在する、請求項１記載の薬理学的に受容される組成物。 ９．前記スルフェートが哺乳動物の大腸にＵＤＣＡを投与するために有効な量 で存在する、請求項１記載の薬理学的に受容される組成物。 １０．前記スルフェートがＣ−７炭素上にスルフェート部分を含み、前記スル フェートが、ＵＤＣＡによる又はＣ−７炭素上にスルフェート部分を有さないＵ ＤＣＡスルフェートによる大腸へのＵＤＣＡ投与に比べて、哺乳動物の大腸への ＵＤＣＡ投与を改良するために有効な量で存在する、請求項９記載の薬理学的に 受容される組成物。 １１．ＵＤＣＡの腸吸収を阻害するための、請求項１記載の薬理学的に受容さ れる組成物。 １２．ＵＤＣＡとその代謝産物との腸転換を阻害するための、請求項１記載の 薬理学的に受容される組成物。 １３．細菌分解による、ＵＤＣＡとその代謝産物との腸転換を阻害するための 、請求項１２記載の薬理学的に受容される組成物。 １４．７α−デヒドロキシレーションによる、ＵＤＣＡとその代謝産物との腸 転換を阻害するための、請求項１３記載の薬理学的に受容される組成物。 １５．前記スルフェートがＣ−７炭素上にスルフェート部分を含み、結腸中の リトコール酸又はその塩、及びデオキシコール酸又はその塩の量を減ずるための 、請求項１記載の薬理学的に受容される組成物。 １６．前記スルフェートがＣ−７炭素上にスルフェート部分を含み、結腸にお けるリトコール酸又はその塩の、デオキシコール酸又はその塩に対する比率を実 質的に高めることなく、結腸にＵＤＣＡを投与するための、請求項１記載の薬理 学的に受容される組成物。 １７．肝疾患及び肝機能の血清生化学を改良するための、請求項１記載の薬理 学的に受容される組成物。 １８．前記血清生化学がアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパルテート アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、γ−グルタミルトランス ペプチダーゼ及びこれらの組合せから成る群から選択される酵素の血清濃度を包 含する、請求項１７記載の薬理学的に受容される組成物。 １９．胆汁流動を高めるための、請求項１記載の薬理学的に受容される組成物 。 ２０．リン脂質、コレステロール及びこれらの組合せから成る群から選択され る脂質の胆汁分泌を減ずるための、請求項１記載の薬理学的に受容される組成物 。 ２１．前記組成物が単離された器官を灌流するために製剤化されている、請求 項１記載の薬理学的に受容される組成物。 ２２．前記単離された器官が肝臓、肺、腎臓及び腸から成る群から選択される 、請求項２１記載の薬理学的に受容される組成物。 ２３．経口投与、局所投与又は静脈内投与用に製剤化されている、請求項１記 載の薬理学的に受容される組成物。 ２４．静脈内投与用に製剤化されている、請求項８記載の薬理学的に受容され る組成物。 ２５．哺乳動物に３α，７β−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（ＵＤ ＣＡ）を投与して、障害を抑制又は治療する方法であって、ＵＤＣＡのスルフェ ートを前記障害を抑制又は治療するために充分な量で前記哺乳動物に投与する工 程を含む方法。 ２６．前記スルフェートがＵＤＣＡ−３−スルフェート、ＵＤＣＡ−７−スル フェート、ＵＤＣＡ−３，７−ジスルフェート、グリコ−ＵＤＣＡ−３−スルフ ェート、グリコ−ＵＤＣＡ−７−スルフェート、グリコ−ＵＤＣＡ−３，７−ジ スルフェート、タウロ−ＵＤＣＡ−３−スルフェート、タウロ−ＵＤＣＡ−７− スルフェート、タウロ−ＵＤＣＡ−３，７−ジスルフェート、及びこれらの組合 せから成る群から選択される、請求項２５記載の方法。 ２７．前記スルフェートがＵＤＣＡ−３−スルフェート、ＵＤＣＡ−７−スル フェート、ＵＤＣＡ−３，７−ジスルフェート及びこれらの組合せから成る群か ら選択される、請求項２５記載の方法。 ２８．前記スルフェートがＵＤＣＡ−７−スルフェート、ＵＤＣＡ−３，７− ジスルフェート及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項２５記載 の方法。 ２９．前記障害が胃腸管の炎症性状態である、請求項２５記載の方法。 ３０．前記炎症性状態が小腸の炎症性状態、大腸の炎症性状態、及びこれらの 組合せから成る群から選択される、請求項２９記載の方法。 ３１．前記炎症性状態が結腸癌、直腸癌、結腸の腫瘍、直腸の腫瘍、結腸の発 癌、直腸の発癌、潰瘍性大腸炎、腺腫様ポリープ、家族性ポリポーシス及びこれ らの組合せから成る群から選択される、請求項２９記載の方法。 ３２．前記障害が肝臓の炎症性状態である、請求項２５記載の方法。 ３３．前記スルフェートが前記哺乳動物の大腸にＵＤＣＡを供給するために充 分な量で投与される、請求項２５記載の方法。 ３４．前記スルフェートがＣ−７炭素上にスルフェート部分を含み、前記スル フェートが、ＵＤＣＡによる又はＣ−７炭素上にスルフェート部分を有さないＵ ＤＣＡスルフェートによる大腸へのＵＤＣＡ投与に比べて、哺乳動物の大腸への ＵＤＣＡ投与を改良するために有効な量で投与される、請求項３３記載の方法。 ３５．前記方法がＵＤＣＡの腸吸収を阻害する、請求項２５記載の方法。 ３６．前記方法がＵＤＣＡとその代謝産物との腸転換を阻害する、請求項２５ 記載の方法。 ３７．前記方法が細菌分解による、ＵＤＣＡとその代謝産物との腸転換を阻害 する、請求項３６記載の方法。 ３８．前記方法が７α−デヒドロキシレーションによる、ＵＤＣＡとその代謝 産物との腸転換を阻害する、請求項３７記載の方法。 ３９．前記スルフェートがＣ−７炭素上にスルフェート部分を含み、前記スル フェートが結腸中のリトコール酸又はその塩、及びデオキシコール酸又はその塩 の量を減ずるために充分な量で投与される、請求項２５記載の方法。 ４０．前記スルフェートがＣ−７炭素上にスルフェート部分を含み、前記スル フェートが結腸におけるリトコール酸又はその塩の、デオキシコール酸又はその 塩に対する比率を実質的に高めることなく、結腸にＵＤＣＡを供給するために充 分な量で投与される、請求項２５記載の方法。 ４１．前記障害が肝臓の障害であり、前記スルフェートが肝疾患及び肝機能の 血清生化学を改良するために充分な量で投与される、請求項２５記載の方法。 ４２．前記血清生化学がアラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパルテート アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、γ−グルタミルトランス ペプチダーゼ及びこれらの組合せから成る群から選択される酵素の血清濃度を包 含する、請求項４１記載の方法。 ４３．前記スルフェートが胆汁流動を高めるために充分な量で投与される、請 求項２５記載の方法。 ４４．前記スルフェートが、リン脂質、コレステロール及びこれらの組合せか ら成る群から選択される脂質の胆汁分泌を減ずるために充分な量で投与される、 請求項２５記載の方法。 ４５．前記スルフェートが、経口投与、静脈内投与及びこれらの組合せから成 る群から選択される方法によって投与される、請求項２５記載の方法。 ４６．前記スルフェートが静脈内投与によって投与される、請求項３２記載の 方法。 ４７．単離された器官を維持する方法であって、前記単離された器官を３α， ７β−ジヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸（ＵＤＣＡ）のスルフェートによ って灌流する工程を含む方法。 ４８．前記単離された器官が肝臓、肺、腎臓及び腸から成る群から選択される 、請求項４７記載の方法。