JP2000501183A

JP2000501183A - 診断装置中で血液を分離するための方法および装置

Info

Publication number: JP2000501183A
Application number: JP9520699A
Authority: JP
Inventors: ブラット，ジョエル・エム; マンガン，ウィルマ・エム; アレン，マイケル・ピー; パテル，ポール・ジェイ
Original assignee: メトリカ・インコーポレーテッド
Priority date: 1995-11-29
Filing date: 1996-11-27
Publication date: 2000-02-02
Anticipated expiration: 2016-11-27
Also published as: JP4216335B2; CA2238926A1; EP0891544A1; US5981294A; WO1997020207A1; AU1126197A

Abstract

(57)【要約】本発明は全血液から赤血球細胞を分離して血漿を得るためのフィルター（８０）を提供する。このフィルター（８０）は、固相支持体（８４）及び赤血球細胞のための凝集素（８６）を含んでいる。凝集素は全血サンプル中で不溶性でありそして該固相支持体に固定化されている。本発明はまた、全血サンプル中の複数分析成分の少なくとも一つの存在を測定するための装置（６０及び方法も包含する。

Description

【発明の詳細な説明】診断装置中で血液を分離するための方法および装置関連する出願本出願の内容は、1993年8月24日にMichael P．Allenにより出願された“新規ディスポーザブル電気的アッセイ装置（Novel Disposable Electronic Assay Device）”と題された米国特許出願第08/111347号、1995年5月31日にMichaelP． Allenにより出願された“新規ディスポーザブル電気的アッセイ装置（Novel Dis posable E1ectronic Assay Device）”と題された米国特許出願第08/455236号、および1995年8月9日にJoel M．BlattとMichael P．Allenにより出願された“乾燥試薬粒子アッセイおよび複数の試験ゾーンを有する装置とそのための方法（Dr y Reagent Particle Assay And Device Having Multiple Test Zones And Metho d Therefor）”と題された米国特許出願第08/512884号に開示されたようにすべての化学的試薬を含む、完全に独立したディスポーザブルの単回使用デジタル電気機器に関する。上記の出願は、本発明と譲受人が同一であり、その全体を参考文献として本明細書中に援用する。発明の属する技術分野本発明は、診断装置中で即時に使用するために十分な速度でそして効率よく血液から血漿または血清を分離するための方法および装置に関する。発明の背景多くの定性的および定量的診断自動試験が、試料として血液を使用する臨床分野で開発されてきた。これらの技術の中には全血に対して行うことができるものも存在するが、多くの診断的アッセイでは正確な分析結果を得るために血液試料から分離した血清または血漿を使用することを必要とする。そうしなければ、反射光または透過光のいずれかの測定技術に依存している診断試験のいずれかの測定に対して、血液試料中の赤血球または不純物が悪い影響を与える場合がある。全血から血漿または血清を分離するためのもっとも一般的な従来の技術は、遠心分離によるものである。しかしながら、この技術は、時間を消費しそして臨床実験室の外では一般的に使用することができない設備を必要とする。これらの理由のために、遠心分離は消費者によるあるいは専門家によるケアの現場の施設において診断自動試験を行うためには全く不適切である。これらの問題点を解消するために、多くの方法が考案されてきた。一般的には、血漿から赤血球を分離するために、フィルター装置が使用される。フィルターを形成するために、多くの材料が用いられた。紙、織物、グラスファイバー、合成ファイバーおよび適した孔径サイズを有するメンブレン材料が先行技術中に見られる。たとえば、Vogelに対する米国特許第4816224号は、全血から血漿または血清を分離し、そして特定の容積（dimension）および続いて行う反応のために全血から血漿を分離するための吸着性を有するグラスファイバー層を用いる血清の解析について開示する。グラスファイバーのみを使用することによる問題または他のファイバーと組み合わせて使用することによる問題の中には、全血の浸透速度の遅さと、容易に凝固しやすいために血漿の実質的な収量が通常25％未満であることがある。さらに、続いて行う定量的測定を妨害する可能性がある赤血球またはヘモグロビンの夾雑が全くない血漿または血清はほんの少量しかない。別の例としては、血液をファイバーを介して反応領域に押し上げるための毛細管力を使用して、血液から血漿を分離する方法を開示する、Hillmanらに対する米国特許第4753776号がある。いったん反応領域が飽和すると、毛細管力が止まり、そしてファイバーを介した反応領域への血液の輸送が停止する。２つの特定のフィルター媒質が開示されている：すなわち、グラスファイバーのみと、濾過媒体に対して遊離型の状態で添加する可溶性赤血球凝集素を用いるその他のセルロース性材料のファイバーである。しかしながら、遊離型凝集素はファイバーから移動して、凝集素と結合した赤血球が血漿に夾雑する。同様に、ファイバー床中に作られた無効容量を満たすためにフィルター内に血漿の一部が残存するため、血漿の一部は使用することができない。別の問題として、凝集素の濃縮が起こりうる。最小容量の凝集素は、凝集を行うためには必要である。過剰量の凝集素により血漿の移動が遅くなる。これらの先行技術の方法は、スペースや容量に制約を受ける診断装置を含んだ応用に対しては不適切であることが証明された。診断装置は、微量な血液試料から、しばしばたった一滴から、装置のアッセイ部分に輸送されるべき十分な量の血漿を作成するために、血漿を分離する効率的な方法をも必要とする。血液試料の分離を完了するまでにかかる時間も重要であり、それにより化学反応を確実に完了することができ、そして反応物を使用者の便宜のために適時的な様式で提供する。このようにして、血液分離フィルター、および家庭、緊急医療現場などの場所または臨床以外の場所で、訓練されていない人がケアの現場で使用することができる診断装置中で使用するために十分に適時的で、効率がよく、そして信頼性の高い方法の必要性が、診断領域では存在する。発明の概要本発明は、全血試料から赤血球を分離して血漿を形成するためのフィルターを提供する。フィルターには、固相支持体および赤血球凝集素が含まれる。凝集素は、全血試料中で不溶性でありそして固相支持体上に固定化されている。好ましくは、本発明の一態様は、全血試料から赤血球を分離して血漿を形成するためのフィルターを提供し、そのフィルターには、非孔性の粒子からなる固相支持体が含まれる。フィルターは、赤血球凝集素も含む。凝集素は全血試料中では不溶性であり、そして固相支持体に直接化学的に結合することにより固相支持体上に固定化されている。固相支持体上に固定化されている凝集素の量は、全血試料中の赤血球数とほぼ同数の結合部位数を提供し、そして少なくとも全血試料の容量の40％が血漿を形成する。孔性の材料からなる第二の固相は、第二の固相中に固定化されていて、それにより固相支持体上に固定化された不溶性凝集素も第二の固相中に固定化されている。本発明はまた、全血試料から赤血球を分離し血漿を形成するフィルターも提供し、そのフィルターは内部空間を限定するハウジング（housing）を含む。ハウジングは、ハウジングの内部空間と外部との間の液体交流を提供するための入口と出口を有する。固相支持体は、内部空間中に固定化されている。フィルターは全血試料の流路中に固相支持体を物理的に保持するための手段を含む。全血試料中で不溶性の赤血球凝集素は、さらに固相支持体上に固定化される。本発明はまた、全血試料中の複数の分析対象（analyte）のうちの１つが存在することを測定するための装置も含む。装置には、外部表面、および分析対象の存在を測定するために選択されたその分析対象を含む全血試料を受け入れるための試料受容手段とを有するハウジングを含む。試料受容手段はハウジングの外部表面に位置している。フィルターは全血試料を試料受容手段から受け入れる。フィルターは、固相支持体および赤血球凝集素を有する。凝集素は全血試料中では不溶性であり、そして固相支持体中に固定化されていて、それにより選択された分析対象を含む血漿試料が形成される。試料処理手段は、血漿試料を試薬と反応させて、血漿試料中の選択された分析対象の量と相関する、物理的に検出可能な変化を得る。試料処理手段は、ハウジング中に存在し、そして試料受容手段と連絡がある液体中に存在する。全血試料中の１またはそれ以上の選択された分析対象の存在を測定する方法を本発明により提供する。この方法は、全血試料を容器の外側表面に導入しそして全血試料を固相支持体と赤血球凝集素で濾過する工程を含む。凝集素は全血試料中では不溶性であり、そしてさらに固相支持体に固定化されていて、それにより選択された分析対象を含む血漿試料を形成する。試料はハウジング中の反応ゾーンに輸送され、化学的に少なくとも１つの試薬と反応させて、血漿試料中の選択された分析対象に対応する量と相関する物理的に検出可能な変化を得る。本発明の目的は、このようにして、微量の全血試料から赤血球を効率よく分離し、診断装置に輸送しその中で化学試薬と反応するために十分な血漿を得る、血液分離フィルターを提供することである。本発明のさらなる目的は、診断装置内で使用するために十分な小容量を占有する血液分離フィルターを提供することである。本発明の別の目的は、全血から赤血球を分離するためのフィルターおよび方法であり、それにより診断装置の化学反応を確実に完了することができ、そして結果物を使用者の便宜のために適時的な様式で提供する。その他の別の有利な効果、態様、改変などは、付属する図面および請求の範囲を含んだ本明細書から当業者にとって明らかであろう。図面の簡単な説明この開示の一部をなす図面中：図１は、本発明にしたがって全血試料から分離された血漿の定量的アッセイおよび定性的アッセイをするために使用することができる、診断試験装置の上部表面の外観であり、図２は、本発明にしたがって全血試料から分離された血漿の定量的アッセイおよび定性的アッセイを同時に複数行うために使用することができる、診断試験装置の上部表面の外観であり、図３は、全血試料から分離された血漿に対して同時に複数のアッセイを行うための診断装置を提供する、本発明の一態様の上部表面の外観であり、図４は、全血試料から分離された血漿に対してアッセイを行うための診断装置を提供する、本発明の別の態様の上部表面の外観であり、図５は、診断アッセイ装置中で全血試料から血漿を分離するために積層の配列（a stacked configuration）に配置されたサンプルパッドとアッセイストリップの横断面側面図であり、図６は、本発明にしたがった血液分離フィルターを収納した容器の横断面図であり、そして図７は、図６中の血液分離フィルターの別の態様の横断面図である。好ましい態様の説明本発明は、引用により前に編入された上記特許出願において詳細に記載された使い捨ての一回使用のデジタル式の電子器具およびアッセイ装置において利用してよい。本発明は、これらの装置または試料の正確な分析のために全血からの赤血球細胞の除去に依存する他のあらゆる装置への直接の全血の適用を可能にする。一般に、本発明は、全血試料が流れる流路中のゾーンを提供する固相支持体上に拡散しないように凝集素を固定する。凝集素は、全血内では不溶性であり赤血球細胞に結合する。結果として、赤血球細胞は間接に固相支持体上に固定されて全血試料から除去されることにより、血漿または血清試料を生じる。従来技術に比して、全血試料からの赤血球細胞の分離がより効果的であり、時間どおりに完了するので、広範囲の診断装置における使用に適している。固相支持体は、凝集素が固定されうるあらゆる固体材料であることができ、限定されないが、ビーズ、磁気粒子、常磁性粒子、ミクロ粒子またはマクロ粒子、試験管、織物またはキャストの布またはメッシュ、およびミクロタイタープレートを含む。そのような固相支持体は、合成材料、天然材料、または合成により修飾された天然材料から製造することができ、そして限定されないが、セルロース材料、例えば紙、セルロースおよびセルロース誘導体、例えば酢酸セルロースおよびニトロセルロース；ファイバーガラス；天然生地、例えば綿；合成生地、例えばナイロン；孔性ゲル、例えばシリカ、アガロースデキストラン、およびゼラチン；孔性繊維マトリックス；デンプンに基づく材料、例えば架橋デキストラン鎖；セラミック材料；オレフィンまたはポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、酢酸ビニルと塩化ビニルのコポリマー類、ポリ塩化ビニル−シリカの混合物を含む熱可塑性材料：および類似物を含む。本明細書における用語凝集素は、赤血球細胞の凝集を起こすことができるあらゆる化学または生化学薬剤を含む。凝集素は全血試料中において不溶性であって、固相支持体上に固定化され続けなければならない。凝集は、細胞表面上の抗原と、抗原を架橋するブリッジを形成する抗体との相互作用による、赤血球細胞の塊（ｃｌｕｍｐｓ）または綿状物（ｆｌｏｃｓ）の形成である。凝集素は、限定されないが、赤血球細胞の抗体およびレクチンを含む。固定化は、固相支持体への凝集素の化学的な結合、吸着、吸収、架橋または共有結合により実施することができる。本発明は、多くの形状を有するアッセイ装置中において使用することができ、そのうちの幾つかは本明細書において特に例示される。しばしば、これらのアッセイ装置は、孔性材料の吸上部材または輸送マトリックスを用いる。「孔性」の意味するところは、材料が、試験試料が容易に通過することができて吸水性および非吸水性の固相材料を含む材料であることである。本発明において、孔性部材は、ファイバーガラス、セルロース、またはナイロンのパッドであって、注入材料並びに複数のアッセイ試薬のための複数の層を有するフロースルーアッセイ装置において使用されるもの；吸上用または薄層クロマトグラフィーの毛管作用（例えば、ニトロセルロース）の技術のための試験ストリップ；または当業者にはよく知られた他の孔性または開孔材料（例えば、ポリエチレンシート材料）を含みうる。アッセイ装置は、分析物の存在を測定するために選択された多数の分析物の少なくとも一つを含む全血試料を受容する試料受容手段を含む。試料受容手段は装置のハウジングの外部表面上に配置されて、全血試料が試料パッド、吸上材料、輸送マトリックスまたは類似物に適用されるのを可能にする。次に、赤血球細胞が全血から除去されることにより血漿試料が形成される。血漿試料は、分析物に対応する少なくとも一つの化学試薬を血漿試料に化学反応させるための試料処理手段と液体連絡している。各々の試薬は、輸送マトリックス上に位置する対応の反応ゾーン中の血漿試料と化学反応して、各々の試薬に対応する反応産物混合物を生成する。試料処理手段も、各反応産物混合物の少なくとも一部を、輸送マトリックス上に位置する対応の検出ゾーンに輸送する。試料処理手段は、ハウジング内に位置して試料受容手段と液体連絡する。本発明は、試料中の分析物のレベルに対する各反応ゾーン中の検出可能な応答またはシグナルに関する粒子の検出を用いるのが好ましい。反応ゾーン中において検出可能な応答を提供するための他の手段は、本発明の使用に適している。例えば、限定ではないが、分析物は、電気伝導性、または特徴的な光の波長の反射率または吸収を測定するための指示薬で標識されてよい。本明細書にて用いられる「指示薬」は、分析物またはその配合体を標識することができて且つ試料中の分析物のレベルを示す検出可能な応答またはシグナルを生じることができるすべての化合物を含むことを意味する。本発明の化学および構成は完全なアッセイ装置中において使用してよいが、本発明はあらゆる他の器具の反射率または透過率メーター中において、置換可能な試薬として用いることができる。即ち、本発明は、完全なアッセイ器具および本発明のアッセイ装置を含む分析用アッセイ器具も包含する。以下に記載される多くの実験調査において利用される単一チャンネル試験装置１０を、図１に示す。装置１０は、吸上材料１４と液体連絡している試料パッド１２を含む。吸上材料１４はその長さの分、試料を輸送する。同様に、末端パッド１６は、試料パッド１２の反対の終端において吸上材料１４を終わらせる。全血を含む試料は試料パッド１２に適用されて、血漿試料中に分離されるが、一方赤血球細胞は試料パッド１２上に残る。血漿試料は吸上材料１４を通過して末端パッド１６に到達する。図２を参照すると、以下に記載される調査において利用される２チャンネル試験装置２０が示される。装置２０は、分配パッド２６と接続したブリッジ２４と液体連絡している試料パッド２２を含む。２つの別々の吸上材料２８と３０は、一方の末端において分離パッド２６と、そして他方の末端において２つの反応パッド３２と３６と各々液体連絡している。全血を含む試料は試料パッド２２に適用されて血漿試料中に分離され、一方赤血球細胞は試料パッド２２に残る。血漿試料はブリッジ２４により輸送されて、分配パッド２６を飽和する。次に、血漿試料は同時に吸上材料２８と３０に沿って進行する。反応パッド３２と３４は、その上に付着した化学試薬と反応するために血漿試料を受容して、２つの診断アッセイを同時に実行する。本発明の好ましい態様の一つは、複数のアッセイを同時に実行するための図３に示された診断装置４０である。装置４０は、全血試料を受容するための試料パッド４２を含む。試料パッド４２は、固相支持体上に固定された凝集素に赤血球細胞を結合させることにより赤血球細胞を除去するための固相支持体を含む。吸上ストリップ４４と４６は、試料パッド４２と液体連絡しており、診断アッセイを実施するために必要な化学試薬を含む各反応パッド４８と５０に血漿試料を輸送する。図４を参照すると、本発明の他の好ましい態様が、アッセイを実施するための診断装置５２として示される。装置５２は、一方の末端に試料パッド５４を、そして他方の末端に反応パッド５５を含む吸上ストリップ５３を含む。全血を含む試料が試料パッド５４に適用された後、試料は、その上に凝集素を固定して有する多数のミクロ粒子５７を含むゾーン５６を通過する。ミクロ粒子５７は、凝集素に結合する固相支持体を提供する。さらに、ミクロ粒子自身はゾーン５６内に固定化される。ゾーン５６は、その中に物理的にミクロ粒子を保持する固相支持体を提供する。第２の固相は、試料パッド５４または吸上ストリップ５３を含む材料と同じかまたは異なる材料でありうる。別法として、凝集素は、ミクロ粒子５７上よりむしろゾーン５６を含む材料上に直接固定されうる。この態様において、ゾーン５６を含む材料が固相支持体を提供する。第２の固相は使用されない。図５は、全血を含む試料６１を受容する診断装置６０に関する、積み重ねの構成を示す。装置６０は、固相支持体上に固定された凝集素に赤血球細胞を結合させることにより赤血球細胞を除去するための固相支持体を含む試料パッド６２を含む。その結果得られる血漿は、診断アッセイを実行して物理的に検出可能な変化を生じるのに必要な化学試薬を含む反応パッド６４に流れる。この構成において、検出機６６は反応パッド６４のエリア内の物理的な検出可能な変化を観察するように配置される。本発明は、全血試料から赤血球細胞を分離して血漿を形成するためのフィルター８０も提供し、図６に示されるとおりである。フィルター８０は、全血試料の流路の範囲でゾーン中に固相支持体を保持するコンテナー８２を含む。固相支持体上に固定化されたのは、全血試料中の赤血球細胞に結合させるのに適した凝集素８６である。固相支持体８４および固定化された凝集素は、全血または血漿試料を完全に透過する膜８８により、コンテナー８２中に保持される。膜８８は、コンテナー８２中で物理的に固相支持体８４をトラップする。全血は、入口９０を通してコンテナーに入り、血漿は出口９２を通って保持される。図６中の血液分離フィルターの別の態様を図７に示す。コンテナー８２は、固相支持体８４を保持するための第２の膜９４を含み、コンテナーを通る流れを逆流させるべきである。コンテナーを通る流れの逆流は、例えば、結合した赤血球細胞を除去することにより、凝集素の結合能力を再生させるのに望まれるはずである。凝集素と赤血球細胞の間の結合を分断するためのあらゆる慣用法が、本発明を伴う使用に適している。例えば、凝集素の赤血球細胞結合機能は、高イオン強度、低ｐＨ値を有する溶液または変性剤で固相支持体８４を処理することにより、再生できる。界面活性剤による赤血球細胞の溶解は、他の適切な再生処理である。図６および７の態様は、自動化された試験装置または高体積の適用に特に有用である。何れかの態様を用いた本発明の再生は、低コストおよび利便性を有する広範囲の応用を提供する。実施例１様々な材料の全血を吸い上げる能力に関する効果を評価するために、図１の装置１０のための試料パッド１２を、１／４インチの直径の円盤に切られたＧＦ／Ｄフィルターペーパーから作成した。様々な材料を、吸上材料１４として使用するために３ｃｍ×０．２ｃｍのサイズに切り出した。末端パッド１６は１／４インチの円盤に切られたニトロセルロースから作成した。ニトロセルロース材料は平均孔サイズ８ミクロンを有するＳ＆Ｓのカタログ番号ＡＥ９９から得た。試験は、全血２０μｌを加えることによって行われた。次の試験それぞれにおいて、特に断らない限り、用いられた全血は、ベクトン・ディキンソン（Becton Dickinson）からヘパリンナトリウムを含有するバクテイナー（Vacutainer）カタログ367673ロット43852として入手された。これら試験の結果は、少なくとも二つの材料が、ニトロセルロースエンドパッド１６を３分以内に含浸させうることを示した。一つは、テトコ・インコーポレーテッド（Tetko,Inc.）によってカタログ番号7-2F777 D として製造されたポリ４．０１ｏｚ／ｙｄの重さおよび７０ｃｆｍ／平方ｆｔの通気度を有した。もう一つ適当な材料は、ポリエチレン材料であるポレクス（Porex）カタログ番号458 8であった。実施例２エンドパッド１６に対して血漿を輸送する種々の材料の有効性を評価するために、図１の装置１０を再度用いた。特に断らない限り、実施例１の場合と同様の手順を用いた。材料の長さに沿って試験中に得られた透明な血漿の長さを観察した。上記のニトロセルロース材料では、全血１０μＬを用いて３ｍｍの分離が見られた。試験された材料の一つは、ワットマン・スペシャルティー・プロダクツ・インコーポレーテッド（Whatman Specialty Products,Inc.）によって製造された結合剤不含のガラス微小繊維組成物であるワットマンＧＦＡであった。ワットマンＧＦＡ材料では、全血３０μＬを用いて約８ｍｍの分離が見られた。ＧＦＡ材料は、２６０μｍの厚みで５３ｇ／ｍの重さおよび１．９μｍの平均細孔度を有する。マウント・ホリー・スプリングス，ＰＡのアールストローム（Ahlstrom）によっ０μｌを用いて試験して、カタログ番号1660、1661および1662それぞれについ材料は、次の厚み、1660:０．３３ｍ、1661：０．１８ｍｍおよび1662:０．６４ｍｍで、ガラス繊維と混合された合成繊維材料の組成物を有し、本明細書中にそのまま援用される米国特許第5,186,843号で開示されている。試験されたもう一つの材料は、リッチモンド，ＶＡのアメリカ・フィルトロナ（America Filtrona）によって製造された１．１ｍｍの厚みを有するポリエステル組成物であった。全血５０μＬを用いて、観察された分離は３ｍｍであった。ポート・ワシントン，ＮＹのポール（Pall）によってヘマディン（Hemadyne）全血２０μＬを用いて、観察された分離は５ｍｍであった。実施例３二つ以上の検定を同時に行う装置で分離を生じた材料の有効性を評価するために、図２で図示された装置２０を用いた。試料パッド（ＳＰ）２２は、サイトセッディスクに切断された。吸上ストリップ（ＷＳ）２８および３０は、１５ｍｍｘ（ＲＰ）３２および３４は、ニトロセルロースS&S AE99から１／８インチ直径ディスクに切断された。全血２０μＬを用いて、反応パッド３２および３４は３分以内に完全に含浸した。実施例４試験は、実施例３で記載の装置２０を用いて、試料パッドを含み且つ固相支持体として働く材料上に直接的に受動吸着した種々の凝集素を用いて行われた。凝集素は、その凝集素を含有する溶液中に材料を浸漬した後、オーブン中で乾燥させることによって吸着した。比較のために、同様の種類の凝集素を、固相支持体として働くラテックス微粒子上に更に固定した。ラテックス微粒子自体は、試料パッド材料内に物理的に保持された。特異的凝集素は、ヒト赤血球に対するウサギ抗体（ａ−ｈＲＢＣ）、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）またはこれら凝集素の混合物であった。ＲＢＣは、ロックランド・インコーポレーテッド（Rockrand Inc.）カタログ番号209-4139，ロット701から入手された。ＳＢＡおよびＷＧＡは、シグマ（Sigma）から、それぞれカタログ番号Ｌ9640およびＬ1395、およびロット番号96H4012および63H4005として入手された。微粒子は、マグスフェア・カンパニー（Magsphere Co.）から入手された。１ｍｇ／ｍＬの濃度を用いて固相支持体を処理した。凝集素を、その固相支持体上に直接的に付着させた。或いは、凝集素を最初に、０．４０３μｍの直径を有する微粒子（Ｍ）ラテックスビーズ上に付着させた。それぞれの凝集素と微粒子との間で形成された結合体は、０．１２５％（ｗ／ｖ）の濃度を有した。凝集素は、グラバレク（Grabarek），Ｚ．およびゲルゲリ（Gergely)，Ｊ．によってAnal.Biochem ,185,131(1990)で記載されたようなカルボジイミドカップリング化学によって微粒子に対して結合した。離の結果は、それぞれ表１および２で見出される。未処置固相支持体を対照として用いる。個々の微粒子：凝集素結合体をＭ：Ｘとして挙げる。装置２０の個々の部分は、支持体という見出しの下に略記されている。そこで示された性能情報の略語一覧は次の通りである。＋＋＋＝大量の赤血球（ＲＢＣ）混入（暗赤色）＋＋＝中程度のＲＢＣ混入（淡〜中くらいいの赤色）＋＝微量のＲＢＣ混入 − ＝透明な血漿（赤い着色が見られない）それぞれのＲＰは別々に、すなわち、ＲＰ／ＲＰで報告される。表１および表２は、ＳＢＡおよびＷＧＡの混合物を用いることによって、更には、単独でかまたは組合わせでのａ−ｈＲＢＣを用いて、血液から血漿を分離する場合の有意の改良を示している。分配パッドも装置２０のブリッジ部分も、３種類の条件全部で充分に無着色であった。先行技術とは驚くほど対照的に、抗体を微粒子上に固定することは、血液分離効率を増加させただけでなく、血漿試料が反応に到達する時間も減少させた。装置２０の濾過容量は、固相支持体の間の細孔または空間の目詰まりによって減少することはなかった。この効果は、ワッて得られたものと比較して速い血液分離時間をも示した。血漿約１０μＬは約２０μＬの全血の出発試料を用いて生成されたことが観察された。その出発試料の大きさを用いると、少なくとも８μＬの血漿が、固定された凝集素とは無関係に生じた。本発明は、全血試料から約４０％〜約５０％血漿を生じる。血漿のほとんど全部が試料パッド（ＳＰ）から除去されたことも観察された。対照的に、先行技術は、材料層中の空隙率を満たすために、かなりの部分の血漿が血液分離フィルター材料中に保持されていることを必要とする。本発明は、ほとんど全部の血漿を固相支持体から引き出させる。これは、等しい出発容量の全血試料について先行技術材料と比較して有意に多量の血漿が本発明によって生じることをもたらす。実施例５ワットマンＧＦＡ材料を装置２０の固相支持体として用い、ヒト赤血球に対するウサギ免疫グロブリンＧ（ＲＩｇＧ）標品を用いて更に別の試験を行った。ＲＩｇＧを固相支持体上に直接的に吸着させるか、または０．４０３μｍ直径ラテックス微粒子（Ｍ）上に固定した後にそれらを固相支持体上に固定した。表３は、ＲＩｇＧを用いた結果を与え、そして表４は、凝集素としてＳＢＡを用いている。性能の略語一覧には次が含まれる。＃＝反応パッドの不完全な含浸−試料は使用中の試料パッド上で玉状になり且つ徐々にパッドに浸透する。実施例６体としての材料に対して直接的に吸着した凝集素を用いることは、固相支持体としてのラテックス微粒子（Ｍ）上に凝集素を固定することに匹敵した。次に、凝集素：微粒子結合体を第二の固相としての材料に固定する。用いられた凝集素は、ヒト赤血球に対するウサギ免疫グロブリンＧ（ＲＩｇＧ）およびダイズ凝集素（ＳＢＡ）であった。ＲＩｇＧを、０．４０３μｍ直径ラテックス微粒子上に固定した後、それらをその材料に固定した。表５は、ＲＩｇＧを用いた結果を与え、そして表６は、凝集素としてＳＢＡを用いている。性能の略語一覧には次が含まれる。 _*＝反応パッドの不完全な含浸−試料は使用中の試料パッド上で玉状になり且つ徐々にパッドに浸透する。実施例７実施例３および４で記載された手順を用いて、固相支持体上に直接的に固定された凝集素ＳＢＡおよびａ−ｈＲＢＣの濃度水準を漸進的に増加させた。材料とびａ−ｈＲＢＣについて与える。材料としてのワットマンＧＦＡの結果を、表９および１０においてそれぞれＳＢＡおよびａ−ｈＲＢＣについて与える。性能の略語一覧には次が含まれる。 _***＝反応パッドの不完全な含浸。実施例８実施例３および４に記載の方法を用いて、ラテックス微粒子に直接固定し、次いで固相支持体に間接的に固定したアグルチニンａ−ｈＲＢＣおよびＳＢＡの濃度を徐々に増加した。固相支持体としてＣｙｔｏＳｅｐ１６６０を用いたときの結果を、ａ−ｈＲＢＣおよびＳＢＡのそれぞれについて表１１および１２に示す。固相支持体としてワットマンＧＦＡを用いたときの結果を、ａ−ｈＲＢＣおよびＳＢＡのそれぞれについて表１３および１４に示す。表中の記号には以下のものを含む：実施例７と８の結果を比較することによってわかるように、固相支持体に凝集素を固定する結果として少なくとも約５倍効率が増加する。凝集素濃度をさらに増加すると効率が減少することなく改良された。このことは従来技術に記載されていることと逆であり驚くべき結果である。さらに顕著な違いは、本発明では、少ない凝集素で効率がよいことである。従来技術では少なくとも最小量の凝集素が凝集に必要である。本発明では、予期されるサンプルの大きさにとって充分な結合部位をフィルター中につくるような凝集素量のみが必要である。上記の教示に基づき本発明の種々の修飾、変更が可能である。従って、付属の請求の範囲内において、本発明はここに特定して記載する以外の態様で実施することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アレン，マイケル・ピーアメリカ合衆国カリフォルニア州94024, ロス・アルトス，シエラ・ヴェンチャー・ドライブ 2213 (72)発明者パテル，ポール・ジェイアメリカ合衆国カリフォルニア州94086, サニーヴェール，アスター・アベニュー 1035，ナンバー 2180

Claims

【特許請求の範囲】１．血漿を形成するために全血試料から赤血球を分離するためのフィルターであって、固相支持体；および赤血球のための凝集素であって、全血試料中では不溶であり、固相支持体上にさらに固定化されている凝集素；を含むフィルター。２．フィルターが第２の固相をさらに含み、固相支持体が第２の固相の中に固定化されていて、それによって固相支持体上に固定化されている不溶性凝集素が第２の固相の中にも固定化されている、請求の範囲第１項記載のフィルター。３．固相支持体が非多孔性粒子であり、第２の固相が多孔性物質である、請求の範囲第２項記載のフィルター。４．非多孔性粒子が約０．４μｍの直径を有する、請求の範囲第３項記載のフィルター。５．固相支持体および固定化された凝集素が、約０．１重量％から約０．２５重量％／容量の濃度で第２の固相に適用される、請求の範囲第２項記載のフィルター。６．固定化された固相支持体が第２の固相の中に物理的に封入されている、請求の範囲第２項記載のフィルター。７．凝集素が固相支持体上に約１０：１の質量比を使用して固定化されている、請求の範囲第１項記載のフィルター。８．フィルターが、全血試料の流動路の中に固相支持体を物理的に保持するための手段をさらに含む、請求の範囲第１項記載のフィルター。１０．不溶性凝集素が、固相支持体に直接的に化学的に結合している、請求の範囲第１項記載のフィルター。１１．固相支持体が、セルロース、ガラス繊維、ガラス繊維と混合した合成物質を有する複合材料、ニトロセルロース、ポリエチレン、ナイロン、およびポリエステルから成る群から選択される織物またはキャスト材料である、請求の範囲第１項記載のフィルター。１２．凝集素が、ヒト赤血球に対するウサギＩｇＧ抗体、大豆凝集素、小麦胚芽凝集素、およびレクチンから成る群から選択される、請求の範囲第１項記載のフィルター。１３．フィルターが約２０μＬの全血から約１０μＬの血漿を形成する、請求の範囲第１項記載のフィルター。１４．血漿が３分以内に形成される、請求の範囲第１３項記載のフィルター。１５．フィルターが全血の試料から約４０容量％から約５０容量％の血漿を形成する、請求の範囲第１項記載のフィルター。１６．固相支持体上に固定化された凝集素の量が、全血の試料中の赤血球の数とほぼ同一数の結合部位を提供する、請求の範囲第１項記載のフィルター。１７．血漿を形成するために全血試料から赤血球を分離するためのフィルターであって、非多孔性粒子から作られた固相支持体；赤血球のための凝集素であって、全血試料中では不溶であり、固相支持体に直接的に化学的に結合することによって固相支持体上にさらに固定化されていて、固相支持体上に固定化された凝集素の量が全血の試料中の赤血球の数とほぼ同一数の結合部位を提供し、そして全血試料の容量の少なくとも４０％が血漿を形成する、凝集素；および多孔性物質から作られた第２の固相であって、固相支持体が第２の固相の中に固定化されていて、それによって固相支持体の上に固定化された不溶性凝集素が第２の固相の中にも固定化されている、第２の固相；を含むフィルター。１８．血漿を形成するために全血試料から赤血球を分離するためのフィルターであって、内部空間を画定するハウジングであって、内部空間とハウジングの外部との間に流体伝達を提供するための入口と出口とを有するハウジング；内部空間の中に固定化された固相支持体；全血試料の流動路の中に固相支持体を物理的に保持するための手段；および赤血球のための凝集素であって、全血試料中では不溶であり、固相支持体上にさらに固定化されている凝集素；を含むフィルター。１９．保持手段が、固相支持体に不透過性で血漿に透過性であり、出口を覆う膜を含む、請求の範囲第１８項記載のフィルター。２０．保持手段が、固相支持体に不透過性であり、入口を覆う膜をさらに含む、請求の範囲第１９項記載のフィルター。２１．固相支持体が非多孔性粒子である、請求の範囲第１８項記載のフィルター。２２．凝集素が固相支持体上に約１０：１の質量比を使用して固定化されている、請求の範囲第１８項記載のフィルター。２３．不溶性凝集素が、固相支持体に直接的に化学的に結合している、請求の範囲第１８項記載のフィルター。２４．フィルターが約２０μＬの全血から約１０μＬの血漿を形成する、請求の範囲第１８項記載のフィルター。２５．血漿が３分以内に形成される、請求の範囲第１８項記載のフィルター。２６．フィルターが全血の試料から約４０容量％から約５０容量％の血漿を形成する、請求の範囲第１８項記載のフィルター。２７．固相支持体上に固定化された凝集素の量が、全血の試料中の赤血球の数とほぼ同一数の結合部位を提供する、請求の範囲第１８項記載のフィルター。２８．全血の試料中の複数の分析物の少なくとも１つの存在を測定するための装置であって、外部表面を有するハウジング；その存在を測定するために選択された分析物を含む全血の試料を受容するための試料受容手段であって、ハウジングの外部表面上に位置している試料受容手段；試料受容手段からの全血の試料を受容するためのフィルターであって、固相支持体、赤血球のための凝集素であって全血試料中では不溶であり、固相支持体上にさらに固定化されていて、それによって選択された分析物を含む血漿の試料が形成される凝集素を有するフィルター；および血漿の試料中の選択された分析物の量と相関する物理的に検出可能な変化を産生させるための少なくとも１つの試薬と血漿の試料とを反応させるための試料処理手段であって、ハウジングの中にあり、試料受容手段と流体伝達している試料処理手段；を含む装置。２９．フィルターが第２の固相をさらに含み、固相支持体が第２の固相の中に固定化されていて、それによって固相支持体上に固定化されている不溶性凝集素が第２の固相の中にも固定化されている、請求の範囲第２８項記載の装置。３０．固相支持体が非多孔性粒子であり、第２の固相が多孔性物質である、請求の範囲第２９項記載の装置。３２．固相支持体および固定化された凝集素が、約０．１から約０．２５重量％／容量の濃度で第２の固相に適用される、請求の範囲第２９項記載の装置。３３．凝集素が固相支持体上に約１０：１の質量比を使用して固定化されている、請求の範囲第２８項記載の装置。３４．フィルターが約２０μＬの全血から約１０μＬの血漿を形成する、請求の範囲第２８項記載の装置。３５．血漿が３分以内に形成される、請求の範囲第３４項記載の装置。３６．フィルターが全血の試料から約４０容量％から約５０容量％の血漿を形成する、請求の範囲第２８項記載の装置。３７．固相支持体上に固定化された凝集素の量が、全血の試料中の赤血球の数とほぼ同一数の結合部位を提供する、請求の範囲第２８項記載の装置。３８．全血の試料中における１以上の選択された分析物の存在を測定するための方法であって、容器の外部表面上に全血の試料を導入する工程；固相支持体、並びに赤血球のための凝集素であって全血試料中に不溶であり、固相支持体上にさらに固定化されている凝集素で全血の試料を濾過し、それによって選択された分析物を含む血漿の試料が形成される工程；試料をハウジング内の反応領域に移す工程；そして血漿試料中の対応する選択された分析物の量と相関する物理的に検出可能な変化を産生させるための少なくとも１つの試薬と試料とを化学的に反応させる工程：を含む方法。３９. 濾過工程が、凝集素を非多孔性粒子に化学的に結合させて結合体を形成することを含む、請求の範囲第３８項記載の方法４０. 固相支持体を全血試験の流動路の中に物理的に保持することをさらに含む、請求の範囲第３８項記載の方法。４１．濾過工程が、約２０μＬの全血から約１０μＬの血漿を形成する、請求の範囲第３８項記載の方法。４２．凝集素：赤血球の結合を切断してフィルターから赤血球を除去することによって、赤血球に結合する凝集素の能力を再生する工程をさらに含む、請求の範囲第３８項記載の方法。４３．濾過工程が、全血の試料から約４０容量％から約５０容量％の血漿を形成する、請求の範囲第３８項記載の方法。