JP2000501290A

JP2000501290A - ソマトスタチン及びインシュリン生成を刺激する化合物のスクリーニング・アッセイ

Info

Publication number: JP2000501290A
Application number: JP9520666A
Authority: JP
Inventors: アール．モントミニィ，マーク; ピールス，ベルナード
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1995-11-30
Filing date: 1996-11-27
Publication date: 2000-02-08
Also published as: CN1117876C; ZA9610080B; AU719614B2; US5849493A; EP0954598B1; CA2237717C; EP0954598A1; NZ324951A; KR100456183B1; CA2237717A1; DE69635998D1; IL124652A0; AU1274997A; EP0954598A4; RU2178714C2; IL124652A; CN1202936A; KR19990071797A; ATE321880T1; WO1997020075A1

Abstract

(57)【要約】本発明はＳＴＦ−１結合の安定化におけるＰbxの効果と同様の効果をもたらす化合物を設計する方法を提供する。公知のＤＮＡ結合アッセイを用いて、この技術領域で通常の技術を有する人であればＤＮＡに対するＳＴＦ−１結合を促進する上で有効な薬品を判定するための化合物を選別することができるであろう。こうして、ソマトスタチン及びインシュリン生成を促進する上で有益な新しい化合物を見出すことができるであろう。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ソマトスタチン及びインシュリン生成を刺激する化合物のスクリーニング・アッセイ発明の背景発明の分野本発明は一般的には生化学内分泌学、分子生物学、及び蛋白質化学に関するものである。より具体的には、本発明はソマトスタチン及びインシュリン生成を刺激する化合物のスクリーニング・アッセイに関するものである。関連説明の説明グルコース・ホメオスタシスは多数の神経内分泌システムの連携した活動を必要とする。しかしながら、哺乳動物においては、膵臓島細胞が主な『グルコース・センサー』であると考えられている。島細胞はプリマンシュリン、グルカゲン、ソマトスタチン、あるいは膵臓ポリペプチドと特徴付けられる４つの細胞群を含んでいる。これらのうち、インシュリン生成β−細胞が圧倒的優位を占めている。インシュリン分泌と生産は血清グルコースの増大によって刺激され、この現象の後には一部の組織でのグルコース摂取が必ず行われる。したがって、β−細胞の機能不全あるいは破壊は血清グルコース・レベルの上昇をもたらし、最終的には糖尿病を発生させる。遺伝子連鎖分析は遺伝性の要因が糖尿病状態の獲得しやすさに強く影響を及ぼすことを示唆している。例えば、少なくとも18の遺伝子座がインシュリン依存性糖尿病メリタス (mellitus) （ＮＩＤＤＭ）と一定の関連性を有している。ＮＩＤＤＭ２と称されるひとつの疾病感作性配座はヒト・インシュリン遺伝子をその範囲に含んでおり、インシュリン・プロモータ機能の変性転写性調節と関連している。したがって、インシュリン遺伝子表現を調節するプロセスの中断は部分的には糖尿病発生に関与している。こうした仮定と一貫しているが、損壊されたβ−細胞機能は糖尿病の非常に一般的な特徴である。インシュリン非依存糖尿病メリタス（ＮＩＤＤＭ）は外部的及び複合的遺伝的影響の両方の結果として起きると考えられている。興味深いのは、インシュリン配座の対立遺伝子変異体自体がその疾患に関係していることである。これらの変異体は通常のインシュリン遺伝子を含んでいるように見えるが、転写調節に関しては変わった性質を示す。推定データによれば、2,000万人ものアメリカ人がタイプII糖尿病を悩んでいる可能性があることを示している。この疾病の進行は環境的な要因と、一定の、しかしまだ大部分未確認で、タイプII糖尿病の周辺インシュリン抵抗に関与している可能性があり、その内部で組織がインシュリン信号に応じて適切にグルコースを活用できない糖尿病感作性遺伝子の両方を必要としているように思われる。また、これら個体におけるインシュリン生成膵臓β−細胞のグルコース感作性の減少の原因となっている可能性もある。両方の生理学的状態の両方の最終的な結果は糖尿病の基本的な特質である過血糖症である。インシュリン遺伝子の転写制御は細胞特有及びグルコース感作性信号発生分子と相互作用する側方ＤＮＡの短い領域を通じて行われる。この調節組織の正確な性質はまだ十分に理解されていないが、塩基性らせん−ループ−ラセン（bＨＬＨ）及びホメオドメイン含有ファクターがインシュリンのβ−細胞固有表現を支配する転写機構の重要な成分であることは一般的に認められている。島細胞固有塩基性らせん−ループ−らせん複合体は以前Ｎir，ＩＥＢ１あるいはＩＣＥと呼ばれていた基部Ｅ−ボックスと相互作用し、この要素はラット・インシュリンＩ遺伝子内に存在しているが、ラット・インシュリンII及びヒト・インシュリン遺伝子内に存在していたこともある。インシュリン生成細胞株における一過性アッセイはＥボックス結合ファクターが近くのＡＴを多量に含んだ、ホメオドメイン認識配列の特質を持ったＦＬＡＴと呼ばれる配列と結合するβ−細胞固有蛋白質と相乗作用を示すことを示唆している。ＦＬＡＴ結合ファクターはＩsl−１，lmx−１，cdx−３及びＳＴＦ−１を含んでいる。加えて、このうちの後者はＰ−エレメントと称される進化的に保存されているＡＴ−リッチ配列での主要結合活性に対応する。Ｉsl−１はＦＬＡＴエレメントと弱く結合し、インシュリン生成細胞からの抽出物によって検出されるＦＬＡＴ結合複合体には存在していないように思われる。これまでに得られている証拠は神経発達におけるＩsl−１のより重要な役割を裏づけている。ホメオドメイン・ファクターlmx−１及びcdx−３は種々の細胞のインシュリン・プロモータ機能に関して興味深い活性化機能を有しているが、その細胞分布及びβ−細胞内でのＦＬＡＴ結合能力はまだ不明である。さらに、β−細胞内でのこれらのファクターの機能に直接関係するデータはほとんどない。インシュリン・プロモータ結合活性を有するファクターのグループ内で、ＳＴＦ−１はおそらくインシュリン・プロモータ機能の正真正銘のレギュレータの有望な候補者である。マウスで、ＳＴＦ−１はすい臓の発生につながる最初の細胞の核において、この領域でのインシュリンの最も早い時期に検出される表現より少し前の萌芽8.5日目に最初に検出される。その後に起きる内分泌すい臓の発達の全過程を通じて、ＳＴＦ−１及びインシュリンはほぼ共表現される。さらに、インシュリン生成細胞株からの抽出物内で、ＳＴＦ−１はＦＬＡＴとインシュリン・プロモータ内のＰエレメントの両方での内発性ＤＮＡ結合活性の成分であるように思われる。ＳＴＦ−１はまたＦＬＡＴ結合ファクターから予想されるように、Ｅ−ボックス結合ファクターＰan−１と強い相乗作用を示す。しかしながら、ＤＮＡ結合アッセイは、β−細胞からの他の、まだ道のファクターも検出されたＦＬＡＴ−結合活性に大きく関与していることを示唆している。ＦＬＡＴ媒介インシュリン促進活性がこれら検出された種のすべてを必要とするのか、その一部だけを必要とするのかはまだ不明である。成人の膵臓は発達中の腺内の共通の前駆体細胞から発生すると考えられる内分泌性及び外分泌性両方の成分から構成されている。こうした前駆体細胞はＳＴＦ −１（14，20）（あるいはＩＰＦ−１（19），ＩＤＸ（17）又はＸ１Ｈbox８（2 2））と呼ばれるホメオドメイン蛋白質を表現し、その重要性はＳＴＦ−１遺伝子の標的を定めた破断が先天性の膵臓不在に導く『ノックアウト』研究で示されている（10）。ＳＴＦ−１は最初発達中の膵臓の内分泌腺及び外分泌腺細胞の両方で表現されるが、ＳＴＦ−１の生成は段階的にインシュリン及びソマトスタチン生成島細胞に制限される（７）。これらの細胞で、ＳＴＦ−１作用はソマトスタチン遺伝子とインシュリン遺伝子の両方の高レベルな表現を維持する上で重要であるように思われる（14，17，19，20，22）。ＳＴＦ−１はＦＬＡＴ及びＰと呼ばれるインシュリン・プロモータ上の２つのよく定義された島細胞固有エレメントを認識する。これらのサイトに結合すると、ＳＴＦ−１はＦar及びＮirと呼ばれる２つのＥ−ボックス・エレメントを識別するらせん−ループ−らせん蛋白質、Ｅ47と共同してインシュリン転写を促進する。同様に、ＳＴＦ−１はＴＳＥＩ及びＴＳＥIIと呼ばれる２つの島細胞固有エレメントを介して島細胞内でのスマトスタチン表現を調節する（14，17）。ある種の遺伝子の転写刺激に加えて、ＳＴＦ−１などのホメオドメイン蛋白質が細胞あるいは部分的同一性を確立することで発達において大きな役割を果たすことが見いだされている。イン・ビボでのこれらの固有な、そして明確な効果とは対照的に、ほとんどのホメオドメイン蛋白質はイン・ビトロでは低い、そして重複したＤＮＡ結合特性しか示さない。しかしながら、最近の研究では、ある種の蛋白質共ファクターがイン・ビボでのホメオドメインＤＮＡ結合特性の決定因子である可能性を示唆している（８，13 ）。例えば、ショウショバエで、エクストラデンティクル（extradenticle：exd ）がその表現パターンを変えないでホメオドメイン蛋白質の活性を調節することが示されている（21，24）。むしろ、エクストラデンティクルは一定のホメオドメイン蛋白質のＤＮＡ結合特性を強化することで標的遺伝子選択を促進しているように思われる（２，25）。実際、エクストラデンティクルは脊椎動物では高度に保持されており、ヒトのプロト−オンコジンＰbx１と広範な配列類似性（71％）を有している（23）。先行技術はＳＴＦ−１などのホメオドメイン蛋白質の結合を強化する効果的な手段がない点で不十分である。本発明は先行技術でで長く待望されているニーズと願望に応えるこのである。発明の要約多数のホメオドメイン蛋白質が特定の標的遺伝子の転写を刺激することで細胞発達を調節することが示されている。イン・ビボでのこの明確な活性とは対照的に、ほとんどのホメオドメイン蛋白質はイン・ビトロではポテンシャル標的サイトと無差別に結合し、この現象は標的サイト選択を指定する共ファクターの関与を示唆している。エクストラデンティクル（exd）と呼ばれているそうした共ファクターのひとつはある種のホメオドメイン蛋白質と共同して標的調節エレメントに結合することでショウジョウバエ内の部分的形態発生に影響を及ぼすことが示されている。本発明は哺乳動物における膵臓発達のために必要なオーファン・ホメオドメイン蛋白質であるＳＴＦ−１は哺乳動物のエクストラデンティクル相同体であるＰbxと共にＤＮＡに共同的に結合することで膵臓島細胞ホルモン遺伝子ソマトスタチンの転写を刺激する。Ｐbxとの共同結合にはホメオドメイン蛋白質の大型のサブセット間によく保存されているぺンタペプチド・モチーフ（ＦＰＷＭＫ）を必要とする。このＦＰＭＷＫモチーフはＰbx−共同性を他のホメオドメイン蛋白質に伝えるには十分であるが、ＳＴＦ−１ホメオドメインのＮ末端アームも必要である。Ｐbxとの共同的結合はポテンシャルＳＴＦ−１標的サイト上だけで起きるので、本発明はＰbxがＳＴＦ−１とのヘテロディメリックな錯体を形成することで発達中の膵臓内で標的遺伝子選択を指定している可能性があることを示している。実際、本発明はソマトスタチン・プロモータのＴＳＥIIエレメントが膵臓島細胞内でのＳＴＦ−１とＰbxで構成されたへテロメリック複合体を識別することを示す。従って、膵臓におけるＳＴＦ−１作用の特性は部分的にポテンシャル標的プロモータ・サイトのＳＴＦ−１Ｐbxへテロメリック複合体を識別する能力によって指示されている可能性がある。従って、本発明のひとつの実施の形態においては、第１の容器内でＳＴＦ−１結合サイトを有する末端ラベルした二重鎖ＤＮＡをコントロールとしてのＳＴＦ −１とを組み合わせるステップと；第２の容器内で末端ラベルしたＳＴＦ−１結合サイトを有する二重鎖ＤＮＡをＳＴＦ−１及びサンプルとしてのテスト化合物と組み合わせるステップと；該第１及び第２の容器を培養するステップと；該コントロールと該サンプルを電気泳動ゲル上に負荷するステップと；該コントロール及び該サンプルが該ゲル内で融合するように該電気泳動ゲルに電流を流すステップと；該コントロール及び該サンプルを検出するステップと；該コントロールのミグレーションと該サンプルのミグレーションと比較するステップとで構成され、該サンプルが該コントロールよりミグレーションにおいて遅ければ、該テスト化合物が該ＳＴＦ−１結合サイトに対するＳＴＦ−１結合の促進において有効である、ＳＴＦ−１結合サイトに対するＳＴＦ−１結合を促進する上で有効な化合物を決定するＤＮＡ結合アッセイが提供される。本発明の別の実施の形態で、構成的にＳＴＦ−１を表現する第１の表現プラスミドとＳＴＦ−１結合サイトの制御下でレポータ遺伝子を表現する第２の表現プラスミドを適切な細胞株内にトランスフェクトさせるステップと；テスト化合物を表現する第３のプラスミドを該トランスフェクトされた適切な細胞株内にトランスフェクトさせるステップと；該レポータ遺伝子の転写の量を測定するステップとで構成され、該転写が起きた場合、該テスト化合物が該ＳＴＦ−１結合サイトへのＳＴＦ−１結合を促進する上で有効である、ＳＴＦ−１結合サイトへのＳＴＦ−１結合を促進する上で有効な化合物を判定するＤＮＡ結合アッセイが提供される。本発明の他の、さらなる側面、特徴、及び利点は開示のために行われる、本発明の現時点での好ましい実施の形態についての以下の説明から明らかになるであろう。図面の簡単な説明本発明の上に述べたような特徴、利点、及び目的がより詳細に理解されるように、上に簡単に述べた本発明のより具体的な説明を添付図面に示すようないくつかの実施の形態を参照して以下に行う。これらの図面は本明細書の一部を形成する。しかしながら、添付された図面は本発明の好ましい実施の形態を示すものであり、従って、その範囲の限定は意図していない。図１は膵臓のホメオボックス・ファクターＳＴＦ−１が遍在する核ファクターと共にソマトスタチン・プロモータ内の細胞固有調節エレメントと共同的に結合することを示している。図１Ａは、−303から−281までの範囲で広がる二重鎖ソマトスタチンＴＳＥIIオリゴヌクレオチドを用いた膵臓島細胞Ｔu−６細胞からの粗核抽出物のゲル移動性シフト・アッセイを示している。Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３、蛋白質ＤＮＡ複合体が示されている。クレッシェンド・バーは核抽出物の量の増大を示している。ＳＴＦは遺伝子組換えＳＴＦ−１蛋白質だけからの、そして、Ｔu−６及びＨe1a ＮＥはそれぞれTu−６とＨela細胞からの核抽出物である。ＰＩは免疫前抗血清を示す。ＳＴＦ−１ＡｂはＳＴＦ−１蛋白質のＣ−末端部分に対して発生されるＳＴＦ−１抗血清を示す。ＳＴＦ−１Ａb⁺オリゴはＳＴＦ− １抗血清＋ＳＶ40のＯct．１結合サイト（Ｓｐｈ１モチーフ）。Ｏct．ＡbはのヒトＯct．１蛋白質に対して発生されたモノクローナルＯct．１抗血清（W．Her rから提供）を示す。図１Ｂは以下に示すようにソマトスタチンＴＳＥIIプローブとTu６核抽出物（Ｃ１とＣ２の複合体だけを分析するためにラベルされないOc t１オリゴで予備培養したもの）で形成した複合体のオフ−レート分析を示す。複合体Ｃ１及びＣ２を示す。時間（分で表示）は各レーンに示す1000倍の非ラベルＴＳＥIIコンペティタＤＮＡを付加した後の時間を示す。ＰＩは免役前血清。ＳＴＦ−１Ａbはゲル・シフト・アッセイに加えられたＳＴＦ−１抗血清。図１ＣはソマトスタチンＴＳＥIIオリゴをプローブとして用いた遺伝子組換えＳＴＦ−１蛋白質のゲル移動性シフト分析を示す。ＳＴＦ−１結合活性はウェスターン・ブロット・アッセイで検出可能なレベルのＳＴＦ−１蛋白質を含んでいない Jurkat細胞からの非相同核抽出物の不存在（−）あるいは存在（＋）下でテストされた。クレッシェンド型のバーは遺伝子組換えＳＴＦ−１蛋白質の増大を示している。複合体Ｃ１とＣ２は図示の通り。図１Ｄは遺伝子組換えＳＴＦ−１＋Ju rk at核抽出物を含んだ再構成抽出物内での複合体Ｃ１とＣ２のオフ−レートを示している。時間（分）は各レーン上に示すように非ラベルＴＳＥIIコンペティタ（ 1000倍）を加えた後の時間を示す。図２は遍在するホメオボックス蛋白質ＰbxがソマトスタチンＴＳＥIIエレメント上でＳＴＦ−１とヘテロディメリック複合体を形成することを示している。図２ＡはＴＳＥIIオリゴヌクレオチドをプローブとして使ってのゲル移動性シフト・アッセイを示している。複合体Ｃ１，Ｃ２及びＣ３は図示の通り。ＰＢＸＡ bは反応に含まれたＰbx抗血清。ＰＩは免疫前血清。ＳＴＦ−１ＡbはＳＴＦ− １抗血清。図２ＢはＳＴＦ−１結合活性に対するイン・ビトロで翻訳Ｐbx蛋白質（ＰＢＸ）の影響を示す。ＴＳＥIIオリゴヌクレオチド＋ＳＴＦ−１及び／又はＰbxを用いたゲル移動性シフト・アッセイは各レーンに示された通り。ＴＮＴは比較対象の細胞溶解物。図２ＣはＰＢＸがＴＳＥII複合体に対するＳＴＦ−１結合を安定化させることを示している。ソマトスタチンＴＳＥIIオリゴヌクレオチドをプローブとして用いたＳＴＦ−１及びＳＴＦ−１ Pbx複合体のオフ−レート分析。時間（分）は過剰の非ラベルＴＳＥIIオリゴを図のように付加した後の時間。それぞれＳＴＦ−１モノマーとＳＴＦ−１/ＰＢＸへテロダイマーに対応する複合体Ｃ１及びＣ２は図示の通り。図２Ｄはソマトスタチン及びインシュリン・プロモータ配列上でのＳＴＦ−１/Pbxヘテロダイマー形成の分析を示す。ＴＳＥ IIはワイルド−タイプＴＳＥIIオリゴヌグレオチド。Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３はその内部でＴＡＡＴモチーフが図３Ｄと３Ｅに示すように突然変異された突然変異体ＴＳＥIIオリゴヌクレオチドを示す。Ｐ及びＦＬＡＴは高い親和性でＳＴＦ−１を識別するインシュリンＩプロモータ。ＴＳＥＩはＳＴＦ−１と結合するソマトスタチン・プロモータ・エレメント。ＰＢＸは結合反応に加えられたイン・ビトロで翻訳されたＰＢＸ蛋白質。ＳＴＦは全長遺伝子組換えＳＦＴ−１蛋白質である。図２Ｅは図３Ｂのゲル・シフト・アッセイで用いられた野生タイプ及び突然変異体オリゴヌクレオチドの配列を示している。括弧は突然変異の標的とされたコンセンサスＴＡＡＴモチーフを示す。図２ＦはＳＴＦ−１とＰbxが共同してプロモータ・サイトのサブセットに作用することを示している。ＳＴＦ−１及びＥ２Ａ−Ｐbxエフェクタ・プラスミドを用いたＧＣ細胞の一過性トランスフェクション・アッセイは下の各バーで示す通り。バー・グラフは最小成長ホルモン（ＧＨ）プロモータ（Ｌuc）のみ、及びＧＨプロモータの上流のソマトスタチンＴＳＥ IIエレメント（ＴＳＥII−Ｌuc）の２つのコピーあるいはインシュリンＰエレメント（Ｐ−Ｌuc）の２つのコピーを含んでいるレポータ向性物から誘導されたルシフェラーゼ活性を示している。活性は共トランスフェクトされたＲＳＶ−ＣＡＴコントロール・プラスミドに対して標準化された。図３はＳＴＦ−１に保存されているぺンタペプチド・モチーフがＰbxとの共同的結合にとって重要であることを示している。図３Ａは野生タイプ及び途中で切断した遺伝子組換えＳＴＦ−１ポリペプチドに対するＳＴＦ −１モノマー（複合体Ｃ１）及びＳＴＦ−１/Pbxへテロダイマー（複合体Ｃ２）形成の分析を示している。突然変異体ＳＴＦ−１ポリペプチドにおける欠失末端を各レーン上に示す。例えば、Ｄ１−70は残基１−70を欠失したＳＴＦ−１ポリペプチドを示している。Ｈoxl40−215はＳＴＦ−１ホメオドメイン・ポリペプチド。図３Ｂは上のゲル・シフト・アッセイに用いられている構成物の図式的表示を示している。Ｈ．Ｄ．はＳＴＦ−１ホメオドメイン（アミノ酸残基140−215）を示す。全長ＳＴＦ−１蛋白質はアミノ酸残基１−284に延びている。図３Ｃは保存されているペンタペプチド・モチーフの突然変異が図に示すような数のアミノ酸を含む野生タイプ及び突然変異体ＳＴＦ−１蛋白質のＰbx配列との共同性を破壊することを示している。図３Ｄは野生タイプ（ＷＴ）及び突然変異体（ＭＵＴ）ＳＴＦ蛋白質のみの場合、及びイン・ビトロで翻訳されたＰＢＸあるいはＥ．Jurkat核抽出物と組み合わせた場合のゲル・シフト分析を示している。図４はソマトスタチンＴＳＥIIサイト上でのＰbxとのヘテロダイマー形成に必要なＳＴＦ−１内のペンタペプチドが多数のホメオボックス蛋白質内に保存されていることを示している。種々のホメオボックス蛋白質が種によって分類されており、名称が示されている。各蛋白質毎の、ＳＴＦ−１内のモチーフに関連した配列を示しＮ末端からホメオドメインまでの距離を右側に示す。図５は保存されたＰＢＸ相互作用モチーフ（Ｐim）が必要であるが、ＰＢＸとホメオボックス蛋白質との間の共同的結合を促進する上で十分ではないことを示している。図５Ａは下のゲル・シフト・アッセイで用いられる遺伝子組換えＧＳＴ融合蛋白質の構造を示している。Ｉsl１Ｈ．Ｄ．はリム・ドメイン・ファクターＩsl１のホメオドメインを示す。ＰＢＸ相互作用モチーフ−Ｉsl１Ｈ．Ｄ．はＩsl１ホメオドメインに融合したＳＴＦ−１ＰＢＸ相互作用モチーフ領域（アミノ酸残基110−138）を含むＳＴＦ−１−Ｉsl１融合蛋白質を示す．cdx３Ｈ．Ｄ．は膵臓ホメオボックス蛋白質cdx３（アミノ酸残基143−253）のホメオドメインを示す。ＰＢＸ相互作用モチーフ−cdx３はcdx３ホメオドメイン（アミノ酸残基176−253）に融合したＳＴＦ−１ＰＢＸ相互作用モチーフ領域（アミノ酸110−138）を示す。ＰＢＸ相互作用モチーフ−ＳＴＦ−１はＳＴＦ−１ホメオドメイン（アミノ酸残基140−215）に融合したＰＢＸ相互作用モチーフ領域 (110−138)を含むＳＴＦ−１ポリペプチドを示す。ＳＴＦ−１Ｈ．Ｄ．はＰＢＸ相互作用モチーフ領域を持たないＳＴＦ−１ホメオドメインのみを示す。図５Ｂは³²ＰでラベルしたプローブとしてソマトスタチンＴＳＥIIサイトを用いたゲル移動性シフト・アッセイを示す。−と＋はＰＢＸＲＮＡでプログラムされた赤血球溶解物の不存在と存在を示す。ホメオドメイン融合蛋白質でテストしたＰＢＸとの共同性を各レーン上に示す。モノマー及びへテロダイマー複合体をそれぞれラベルして示してある。図６はＰbxとの共同性のためにＳＴＦ−１ホメオドメインのＮ末端アームが必要であることを示している。ＳＴＦ−１ＰＢＸ相互作用モチーフ（アミノ酸残基110−138）＋cdx３ホメオドメインの代わりに置き換えられたＳＴＦ−１ホメオドメインの種々の領域を含んだＰＢＸ相互作用モチーフ−cdx３融合構成物のゲル・シフト分析。図６ＡはＳＴＦ−１/ cdx３融合構成物の構造と活性を示している。cdx３配列を網点部分で、ＳＴＦ− １配列を白い部分で示す。Ｎ−末端アーム（Ｎ）、及びらせん部分１，２，３（Ｈ１，Ｈ２，Ｈ３）の相対的な位置は図示の通り。ゲル・シフト分析でのＰbxとの共同結合（−，＋）を右側に示す。図６Ｂは下に示すＳＴＦ−１とcdx３のアミノ酸アラインメントを示し、Ｃ−末端残基のアミノ酸数を右側に示してある。破線はＳＴＦ−１とcdx３との間のアミノ酸の一致を示す。矢印は融合構成物のために用いられたアミノ酸末端（Ｉ，II，III）を示す。図６Ｃは遺伝子組換えＳＴＦ−１/cdx３融合蛋白質のゲル・シフト分析を示す。構成物数は図（一番上）に描かれた構成物を示す。結合反応におけるイン・ビトロで翻訳されたＰbx（ＰＢＸ）あるいは非プログラム赤血球溶解物（ＴＮＴ）の存在は図示の通り。Ｃ１，Ｃ２はそれぞれＳＴＦ−１モノマーとＰbx/ＳＴＦ−１ヘテロダイマーに対応する複合体。発明の詳細な説明ヒト・ゲノムは胚種形成中の軸方向パターン形成における重要な決定因子であるＨox遺伝子と呼ばれるホメオテイック・セレクタ遺伝子の４つの群を含んでいる（Krumlauf，1994Cell 78：191−201）。これら４つの群はそれぞれ最大13個の遺伝子を含んでおり、ひとつの群中の任意の遺伝子は通常他の３つの群のメンバーと特に高い相同性を有している。こうした相互に関連性を有する遺伝子はパラログと呼ばれ、従って、ＨoxＡ１，ＨoxＢ１，ＨoxＣ１及びＨoxＤ１はすべて相互に密接に関連したパラログであり、それぞれ異なったクロモソーム上の異なったＨox群内に存在している。ＨoxＢ複合体はクロモソーム17の長いアーム上にあり、例えば、ＨoxＢ１からＨoxＢ９までが確認されている。インシュリン遺伝子のグルコースに依存した制御はグルコースによって媒介されたインシュリン分泌の増大と並行して起こるように思われる。これは一部には細胞内カルシウムの増大とも関連している。加えて、グルコース応答性インシュリン・プロモータ機能は少なくとも一部にはＦＬＡＴ結合の活性を調節することで起きているのかもしれない。ＨoxＢ13はインシュリン・プロモータの機能的に重要なＦＬＡＴエレメントと高い親和性で結合する。さらに、ＨoxＢ13とインシュリンＩＣＥ/Ｎirエレメント−結合ファクターＰan−１を組み合わせて加えるとインシュリン・プロモータを強く活性化する。このことはＦＬＡＴ及びＮirエレメントがインシュリン生成細胞内で相乗効果的に機能するからである。これらのデータは全体として、カルシウムに依存した経路がＨoxＢ13の機能を調節している可能性を示唆している。本発明によれば、先行技術の範囲内で通常の分子生物学、微生物学、そして遺伝子組換えＤＮＡ技術を用いることができる。そうした技術は文献に十分に説明されている。例えばManiatis，Fritsch ＆ Sambrook,“Molecular Cloning：Ala boratory Manual（1982）”；“ＤＮＡ Cloning：A PracticalApproach”，Vol umes Ｉ及びII（D．N．Gloverら、1985）；“Oligonucleotide Synthesis”（M ．J．Gait編集、1984）；“Nucleic Acid Hybridization”［B．D．Hames & S． J．Higgins編集（1985）］；“Transcription and Translation”［B．D．Hames & S．J．Higgins編集（1984）］；“Anilna1 Cell Culture”［R．I．Freshney 編集（1986）］；“ImmobilizedCells And EnZymeS”［ＩＲＬ Press，（1986 ）］；B．Perba1，“A Practical Guide To Molecular Cloning”（1984）など参照。従って、以下の用語は、以下に定義されたような意味で解釈されねばならない。ここに述べられているアミノ酸は“Ｌ”アイソマー形態であることが好ましい。しかしながら、“Ｄ”アイソマー形態の残基は、免疫グロブリン−結合の望ましい機能的特性がそのポリペプチドで保持される限り、いずれのＬ−アミノ酸残基で置換してもよい。ＮＨ₂はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味している。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を意味している。標準的なポリペプチド命名法J Biol．Chem.，243：3552−59（1969）に従って、アミノ酸残基の略号は以下の対応表に示す通りである。対応表記号アミノ酸１文字３文字ＹＴｙｒチロシンＧＧｌｙグリシンＦＰｈｅフェニルアラニンＭＭｅｔメチオニンＡＡｌａアラニンＳＳｅｒセリンＩＩｌｅイソロイシンＬＬｅｕロイシンＴＴｈｒスレオニンＶＶａｌヴァリンＰＰｒｏプロリンＫＬｙｓリシンＨＨｉｓヒスチジンＱＧｌｎグルタミンＥＧｌｕグルタミン酸ＷＴｒｐトリプトファンＲＡｒｇアルギニンＤＡｓｐアスパルティック酸ＮＡｓｎアスパラギンＣＣｙｓシステインなお、すべてのアミノ酸残基配列は左から右への方向がアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向で示してある。さらに、アミノ酸残基配列の冒頭及び末尾のダッシュはひとつあるいは複数の別のアミノ酸残基へのペプチド結合を示す。上の表は１文字の略号と３文字の略号を対応して示し、これらの略号は以下の説明で交互に使われている。『レプリコン』はそれ自体の制御に基づいて複製を行うことができる、イン・ビボでのＤＮＡ複製の独立サブユニットとして機能するいずれかの遺伝子的エレメント（例えば、プラスミド、クロモソーム、ウィルス）である。『ベクター』はプラスミド、ファージ、あるいはコスミドなどのレプリコンであり、それに別のＤＮＡ部分を付着させて付着された部分の複製を起こさせることができる。『ＤＮＡ分子』とは、単鎖形態あるいは二重鎖らせん形態のポリマー形態のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、あるいはシトシン）を示す。この用語はこの分子の一次及び二次構造だけを示し、いずれの特定の三次形態も意味しない。従って、この用語は、特に、線形ＤＮＡ（例えば制限フラグメント）、ウィルス、プラスミド、及びクロモソームに見いだされる二重鎖ＤＮＡを含んでいる。以下の検討で、構造はＤＮＡの非転写鎖に沿った５′−３′方向の配列（つまり、mＲＮＡと相同の配列を有する鎖）だけを示すという通常の方法で示してある。『複製の発生源』とはＤＮＡ合成に関与するこれらＤＮＡ配列を示す。ＤＮＡ『コーディング配列』とは適切な調節配列の制御下に置かれた場合にイン・ビボでポリペプチドに転写、翻訳される二重鎖ＤＮＡ配列を示す。このコーディング配列の境界は５′（アミノ）末端の開始コドンと３ ′（カルボキシル）末端で翻訳停止コドンによって示される。コーディング配列は、原核性配列、真核性mＲＮＡからのcＤＮＡ、真核性（例えば哺乳動物の）ＤＮＡからのゲノム性ＤＮＡ配列、そして場合によっては合成ＤＮＡ配列なども含んでいる。ポリアデニル化信号及び転写終了配列は通常このコーディング配列の３′に配置される。転写及び翻訳制御配列はプロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化信号、ターミネータなど宿主細胞におけるコーディング配列の表現をもたらすＤＮＡ調節配列である。『プロモータ配列』は細胞内においてＲＮＡポリメラーゼを結合でき、下流（３′方向）コーディング配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモータはバックグラウンド上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低数の塩基あるいはエレメントの含むようにするために、転写開始サイトによって３′末端に拘束され、上流方向（５′方向）に延びたものとする。プロモータ配列内で転写開始サイト（ヌクレアーゼＳ１によるマッピングで好適に定義される）とＲＮＡポリメラーゼの結合に関与する蛋白質結合領域（コンセンサス配列）とが見出されるであろう。真核性プロモータは、常にではないが、“ＴＡＴＡ”ボックス及び“ＣＡＴ”ボックスを含んでいる場合が多い。原核性プロモータは−10及び−35コンセンサス配列に加えてシャイン−ダルガルノ配列を含んでいる。『表現制御配列』は別のＤＮＡ配列の転写及び翻訳を制御、調節するＤＮＡ配列である。コーディング配列はＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列を、その後で上記コーディング配列によってコード表現される蛋白質内に翻訳されるmＲＮＡ内に転写する場合に、細胞内の転写及び翻訳制御配列の『制御下』にある。『信号配列』はコーディング配列の前に含まれる場合がある。この配列はその宿主細胞にポリペプチドを細胞表面に向けさせたり、あるいはポリペプチドを培養液内に分泌させたりするように宿主細胞に伝える信号ペプチド、Ｎ末端−ポリペプチドをコード表現し、この信号ぺプチドはその蛋白質が細胞から出ていく前に宿主細胞によってクリップ・オフされる。信号配列は原核細胞や真核細胞に天然に存在している種々の蛋白質と結合して見出される場合もある。ここで本発明のプローブを指して用いられる『オリゴヌクレオチド』という用語は２つ以上、好ましくは３つのリボヌクレオチドで構成された分子を指している。その正確なサイズは多くのファクターに依存し、それらのファクターはオリゴヌクレオチドの最終的な機能と使い方に依存している。ここで用いられる『プライマー』という用語は、精製制限消化酵素などに天然に存在するか合成的につくられるかには関係なく、核酸鎖に対して相補的なプライマー延長精製物の合成が誘導される条件下に置かれた場合に、つまり、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在と適切な温度及びpH下に置かれた場合に合成の開始点として機能することができるオリゴヌグレオチドを指している。このプライマーは単鎖あるいは二重鎖のいずれであってもよく、誘導剤の存在下で望ましい延長生成物の合成を行わせるのに十分な長さを持っていなければならない。プライマーの正確な長さは温度、プライマーの供給源、及びその使用法など多くのファクターに依存している。例えば、診断的な使い方のためには、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチド・プライマーは通常15−20あるいはそれ以上のヌクレオチドを含んでいるが、もっと少ない場合もある。ここで言うプライマーは特定の標的ＤＮＡ配列の種々のストランドに対して『実質上』相補的となるように選択される。これは、プライマーがそれらの対応するストランドとハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味している。従って、プライマー配列はテンプレートの正確な配列を反映している必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド・フラグメントをそのプライマーの５′末端に取り付けて、そのプライマーの残りの部分をそのストランドと相補的にするようにしてもいい。また、非相補的な塩基あるいはより長い配列をプライマー内に点在させてもよいが、その場合はそのプライマー配列はその配列と十分な相補性を有しているか、それとハイブリダイズして、それによって延長生成物合成のためのテンプレートを形成しなければならない。ここで用いられている『制限エンドヌクレアーゼ』及び『制限酵素』という用語はバクテリア性酵素を意味し、それぞれ特定のヌグレオチド配列、あるいはその近くで二重鎖ＤＮＡを切断する。細胞は、そうしたＤＮＡがその細胞内部に導入されると、外因性あるいは非相同性ＤＮＡによって『形質変換』される。形質変換ＤＮＡはその細胞のゲノム内に統合（共有結合で結合）される。原核細胞、イースト菌、及び哺乳動物の細胞などにおいては、形質変換ＤＮＡはプラスミドなどのエピゾーム性エレメント上で保持される場合と保持されない場合とがある。真核細胞に関しては、安定的に形質変換される細胞は形質変換するＤＮＡがクロモソームに統合されて、クロモソーム複製を通じて娘細胞によって遺伝されるようなものである。この安定性は真核細胞のその形質変換ＤＮＡを含む一群の娘細胞によって構成される細胞株あるいはクローンを確立できる能力によって示される、『クローン』とは単一の細胞、あるいはミトシスによって共通な祖先から誘導された一群の細胞を意味している。『細胞株』とは何世代にわたりイン・ビトロで安定した成長ができる一次細胞のクローンを意味する。２つのＤＮＡ配列は、少なくとも75％程度（好ましくは少なくとも80％程度、そして最も好ましくは90または95％程度）のヌクレオチドが決められた長さのＤＮＡ配列と対応する場合に『ほぼ相同』である。ほぼ相同の配列は配列データ・バンクで入手できる標準的なソフトウエアを用いて配列を比較するか、あるいは、例えば特定の系に対して決められるような厳しい条件下でのサザーン・ハイブリダイゼーション実験で決められる。適切なハイブリダイゼーション条件を決めるのは当業者に公知の範囲内である。例えば、Maniatisら、；ＤＮＡ Cloning，Vo1．Ｉ＆II・など； Nucleic Acidhybridizationなど参照。ＤＮＡ構成物の『異種の』領域は自然の大型の分子との関連では見いだされない大型ＤＮＡ分子内のＤＮＡの確認可能なセグメントである。従って、異種の領域が哺乳動物遺伝子をコード表現する場合、遺伝子は通常、供給源器官のゲノムの哺乳動物ゲノム性ＤＮＡには隣接しないＤＮＡによって隣接される。別の例で、コーディング配列はそのコーディング配列が自然には見いだされない構成物（例えば、ゲノム性コーディング配列がイントロンを含むcＤＮＡ、あるいは天然の遺伝子とは異なったコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子の変異あるいは自然発生的突然変異的イベントはここで定義されていないようなＤＮＡの異種の領域を発生させない。これらの調査のために最も一般的に用いられたラベルは放射性エレメント、酵素、紫外線に露出された場合蛍光を発生する化学物質などである。多数の蛍光物質が知られており、ラベルとして用いることができる。これらには、例えば、フルオレスセイン、ローダミン、アウラミン、テクサス・レッド、ＡＭＣＳブルー及びルシフェール・イエロウである。特定の検出物質はヤギの体内でつくられ、イソチオシアネートを通じてフルオレスセインと接合された抗ウサギ抗体である。蛋白質は放射性エレメントあるいは酵素でラベルすることができる。こうした放射性ラベルは現在入手できるいずれのカウンティング手順によっても検出できる。好ましいアイソトープは³Ｈ，¹⁴Ｃ，³²Ｐ，³⁵Ｓ，³⁶Ｃl，⁵¹Ｃr，⁵⁷Ｃo，⁵⁸ Ｃo，⁵³Ｆe，³⁰Ｙ，¹²⁵Ｉ，¹³¹Ｉ及び¹⁸⁶Ｒeから選択される。酵素ラベルも同様に有用で、現在用いられている色測定、分光測定、蛍光分光測定、電流測定、あるいはガス測定技術のいずれによっても検出することができる。酵素はカルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子との反応によって選定された粒子に接合される。これらの手順で用いることができる多くの酵素が知られており、利用することができる。好ましいものはぺロキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコース・オキシダーゼ＋ペロキシダーゼ、及びアルカリ性ホスファターゼである。別のラベル用物質及び方法については、例えば、米国特許No.3,654,090 、 3,850,752及び4,016,043を参照。この技術分野で開発、利用されているひとつの具体的なアッセイはレセプタ・アッセイである。レセプタ・アッセイにおいては、アッセイされる物質が適切にラベルされて、その後、一定の細胞テスト・コロニーに一定量のラベルが接種され、その後、ラベルされた物質がその細胞レセプタに結合した程度を判定するために結合調査が行われる。こうして、それらの物質の間の親和性の違いを確認することができる。先行技術において有用なひとつのアッセイは“cis/trans”アッセイである。要約して述べると、このアッセイは２つの遺伝子構成物を用い、そのひとつは適切な細胞株にトランスフェクトされると特定のレセプタを継続的に表現するプラスミドであり、２番目のものはレセプタ／リガンド複合体の制御下でルシフェラーゼなどのレポータを表現するプラスミドである。従って、例えば、特定のレセプタに対するリガンドとしての化合物を評価することが望ましい場合、それらのプラスミドのひとつは選ばれた細胞株内でのその」レセプタの表現をもたらす構成物であり、２番目のプラスミドはその内部にその特定のレセプタに対する応答エレメントが挿入されるルシフェラーゼ遺伝子に結合されたプロモータを有していることになるであろう。テストされる化合物がそのレセプタのアゴニストである場合、リガンドはリセプタと複合化し、その結果できる複合体はその応答エレメントに結合し、ルシフェラーゼ遺伝予の転写を開始する。その結果もたらされる化学蛍光物質を光学的に測定され、容量応答曲線が得られ、公知のリガンドのそれと比較される。上に述べた手順は米国特許No.4,981,784とＰＣＴ国際公報No .88/03168に詳細に述べられている。本発明はＳＴＦ−１がＰbxと結合して、この結合がソマトスタチンと最も高い可能性としてはインシュリンの強化された転写をもたらす。ＳＴＦ−１のＰbxに対する結合はぺンタぺプチド（ＥＰＷＭＫ）を必要とする。ＳＴＦ−１とＰbxはＳＴＦ−１−Ｐbxへテロダイマーを認識するサイトのサブセット上でのみ相乗効果的に機能する。以下に示すように、ＳＴＦ−１のアミノ酸残基115−123はＰbx との共同性のために必要とされる。つまり、突然変異体ＳＴＦ−１ cＤＮＡはＰ bxと共同できないので、Ｐimが必要とされる。さらに、ＳＴＦ−１ホメオドメインのアミノ酸残基145−153を含むフレキシブルなＮ−末端アームはＰbxとの共同性に不可欠である。以下の実施例は本発明の種々の実施の形態を示すために提供されるものであり、いかなる意味でも本発明の範囲の限定は意図していない。実施例１プラスミドの構成及び蛋白質の表現図３Ｂで示されているＳＴＦ−１欠失構成物については上に述べた（20）。ＳＴＦ−１欠失プラスミドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅方法を用いて作成した。テンプレートとしてＳＴＦ−１ cＤＮＡ用いて、欠失部分にまたがるひとつのセンス・オリゴヌクレオチドをＳＴＦ−１ cＤＮＡの３′末端に対応した抗センス・オリゴヌクレオチドを用いて培養した。コード表現領域内に適当な欠失部分を含むＳＴＦ −１ｃＤＮＡフラグメントを、Ｔaqポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅により得た。Ｐbx１ｃＤＮＡ（C．Murreからの入手）（18）及びＳＴＦ−１欠失突然変異体Ｄ１−70，Ｄ１−115,Ｄ１−139及びＤ216−284をメーカーの定めた生成手順に従って、転写／翻訳系に結合したPromega ＴＮＴウサギ赤血球溶解物を用いて生成した。ＳＴＦ−１全長蛋白質及びＳＴＦ−１欠失突然変異体hox14O−215 ，１−140及び110−215（図３Ａを参照）がバクテリア性表現ベクターpＧＥＸ３Ｘを用いて大腸菌内で表現された。遺伝子組換え蛋白質は上に述ベたように精製した。ＳＴＦ−１ポリペプチドは最初にそれらのＮ−末端でグルタチオン−Ｓ− トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む融合蛋白質として表現された。ＧＳＴ−ＳＴＦ−１ポリペフチドはグルタチオン・セファローズ樹脂上でのアフィニイテイーグロマトグラフィでバクテリア性溶解物から精製した。精製蛋白質は、グルタチオン（10mM）を用いてその樹脂から溶離させたり、あるいはＧＳＴとＳＴＦ− １の配列間に挿入されるファクターＸ開裂サイトのために蛋白質分解的に切断することができる。遺伝子組換え蛋白質は４μｇのＸa因子で室温で16時間消化作用させることでグルタチオン−セファローズ・ビーズから溶離された。図５に示されているＧＳＴ融合蛋白質は、pＧＥＸ３Ｘベクターを用いて大腸菌内でも表現された。ラットＩsl１ホメオドメイン（12）（アミノ酸残基176−2 48）、ハムスターcdx３ホメオドメイン（６）（アミノ酸残基143−253）及びＳＴＦ−１ホメオドメイン（アミノ酸残基140−215）をコード表現する配列をポリメラーゼ連鎖反応で増幅して、pＧＥＸ３Ｘプラスミドのフレームで融合させた。ＰＢＸ相互作用モチーフ−ホメオドメイン融合蛋白質のＰＢＸに関しては、ＦＰＷＭＫモチーフを含む110−138の残基からなるＳＴＦ−１をコード表現する配列を、Ｉsl１ホメオドメイン（12）（アミノ酸残基176−248）、cdx３のホメオドメイン（６）（アミノ酸残基176−253）及びＳＴＦ−１ホメオドメイン（アミノ酸残基140−215）をコード表現する配列より上流のフレームで結合し、pＧＥＸ３Ｘベクターに挿入した。ＧＳＴ溶融蛋白質が上（14）に述べたように表現、精製され、５mMの還元グルタチオンを用いてビーズから溶離された。実施例２ゲル移動性シフト・アッセイその配列を図２Ｃに示すO.1ngの末端ラベル二重鎖オリゴヌグレオチドを用いて、以前（20）に述べたのとまったく同じようにゲル移動性シフト・アッセイを行なった。オフ−レイト分析を行うために、ＴＳＥIIプローブを先ずその蛋白質で室温で30分間培養し、その後、1000倍量に過剰の非ラベルＴＳＥIIオリゴヌクレオチドを加えて、アリコットを種々の時点でで操作ゲル上に負荷した。スーパシフト・アッセイで、ＴＵ６核細胞抽出物を、ＴＳＥIIプローブを加える前に、室温で15分間、１μlのＰbx（11）あるいはＳＴＦ−抗血清（20）で予備培養した。Ｐbx抗血清は多数のＰbxファミリーのメンバー（Ｐbx１，２，３）間の違いを識別しない。実施例３特定の蛋白質ＤＮＡ複合体Ｃ１，Ｃ２及びＣ３膵臓の腫瘍細胞株においては、膵臓島ホルモン遺伝子であるソマトスタチン及びインシュリンの表現はホメオボックス・ファクターＳＴＦ−１に依存している。ＳＴＦ−１は、ＴＳＥＩ及びＴＳＥII（14）と呼ばれる２つの組織特異的調節エレメントに結合することにより、Ｔu−６細胞内のソマトスタチン表現を調節する。粗Ｔu−６核抽出物のゲル移動性シフト・アッセイにおける³²ＰでラベルしたＴＳＥIIサイト・オリゴヌクレオチド・プローブを用いて、３つの特定の蛋白質ＤＮＡ複合体が検出され、ここでは複合体Ｃ１、複合体Ｃ２及び複合体Ｃ３（図１Ａ）として示されている。複合体Ｃ１及びＣ２は、膵臓島細胞抽出物だけで観察されるが、複合体Ｃ３はHelaなどの非島細胞株で比較できる程度のレベルで検出された。複合体Ｃ３はＯct−１抗血清を用いた『スーパシフト・アッセイ』によって示されるように、遍在するＯct−１蛋白質を含むように見える。これとは対照的に、複合体Ｃ１及びＣ２は、ＳＴＦ−１抗血清の添加に対する感作性を判定されるように、複合体Ｃ１及びＣ２はＳＴＦ−１蛋白質を含んでいた。ゲル移動性シフト・アッセイで、複合体Ｃ２は抽出濃度の関数として指数関数的に増大するが、複合体Ｃ１は直線的に増大する。遺伝子組換え全長ＳＴＦ−１蛋白質は複合体Ｃ１と同じ位置（図１Ａ、レーン６）に移入する１つの複合体を生成したが、このことは複合体Ｃ１がＳＴＦ−１だけを含んでおり、一方、複合体Ｃ２が高親和性異量体ＳＴＦ−１複合体を示すことを示唆している。この点に関して、オフ−レート調査は、複合体Ｃ１の半減期が１分以下で、異量体ＳＴＦ−１複合体Ｃ２の半減期は15分程度である（図１Ｂ）。Ｃ２複合体がＳＴＦ−１のホモ２量体に対応しないことを確認するため、遺伝子組換えＳＴＦ−１蛋白質濃度の増大をＴＳＥIIプローブを用いたゲル移動性シフトアッセイで調べた（図１Ｃ）。多量のＰＹＦ−１蛋白質を用いた場合、移行がより遅い複合体は観察されなかったが、これは複合体Ｃ２がＳＴＦ−１のＤＮＡへの結合を非常に安定化している別の蛋白質成分を含んでいなければならないことを示している。この成分がどこにでも表現されていることを実証するために、粗Jurkat（あるいはHela）核抽出物を遺伝子組換えＳＴＦ−１蛋白質を含む反応物に加えた。これらの条件下で、複合体Ｃ２の生成が容易に観察され、遺伝子組換えＳＴＦ−１の添加に依存していた（図１Ｃ）。再構成された抽出物内でのＣ２複合体のオフ −レートはＴu−６抽出物内におけるそれと同じ程度（約15分間）で、遍在するファクターがＳＴＦ−１のＴＳＥIIサイトへの結合を安定化していることを示している（図１Ｄ）。エクストラデンティクル（extradenticle）と呼ばれるショウジョウバエのホメオボックス蛋白質は標的プロモータ・サイトに他のホメオドメイン蛋白質と共同的にで結合する（２，25）。次に、Ｐ bx（23）と呼ばれるエクストラデンティクルの哺乳動物相同物が複合体Ｃ２に含まれるかどうかを調べた。粗Ｔu−６核抽出物に加えると、Ｐbx血清は複合体Ｃ２の形成を特異的に停止させたが、この抗血清はＳＴＦ−１だけを含んでいるＣ１の形成に対しては影響を及ぼさない（図２Ａ、レーン２）。さらに、Ｐbxと遺伝子組換えＳＴＦ−１蛋白質を共に培養すると、ゲルシフト・アッセイで異量体Ｃ２複合体をもたらした（図２Ｂ）。オフ−レイト分析で評価されたこのＰbx− ＳＴＦ−１複合体の安定性は、Ｔu−６核抽出物のＣ２複合体の安定性とほぼ同様である（図２Ｃ）。ＰbxとＳＴＦ−１がＴＳＥII以外の別のＳＴＦ−１標的サイトと共同的に結合できるかどうか判定するために、ＳＴＦ−１と結合し、そして膵臓細胞内でラット・ソマトスタチン及びインシュリンＩ遺伝子の島細胞制限表現にそれぞれ必要なサイトである、ソマトスタチンＴＳＥＩあるいはインシュリンＰ及びＦＬＡＴエレメント上で、遺伝子組換えＳＴＦ−１及びＰbx蛋白質を用いてゲル・シフト・アッセイを行った（図２Ｄ及び図２Ｅ）。ＴＳＥIIエレメントとは対照的に（図２Ｄ）レーン１−４）、ＴＳＥＩ，ＰあるいはＦＬＡＴエレメント上で異量体ＳＴＦ−１−Ｐbx複合体は観察されなかった。実際、異量体ＳＴＦ−１複合体は、粗粗膵臓細胞抽出物のゲル・シフト・アッセイでＴＳＥＩ，ＰあるいはＦＬＡＴエレメントが用いられた場合も検出されない（データ示さず）（20）。ＳＴＦ−１及びＰbxが共同的な方法で転写を刺激できるかどうか判定するために、最小成長ホルモン・プロモータの上流のソマトスタチンＴＳＥIIサイトの２つの複製を含むレポータ・ベクターを用いて、一過性トランスフェクション・アッセイを行なった（図２Ｆ）。トランスフェクトされたＰbx表現プラスミドが関与する調節を最適化するために、Ｐbxに融合されたＥ２Ａの活性領域を表現するＥ２Ａ−Ｐbxベクターが用いられた（15）。ＧＣ細胞に別々にトランスフェクトされた場合、ＳＴＦ−１とＥ２ａ−Ｐbx表現ベクターは、ＴＳＥIIルシフィラーゼ・レポータ遺伝子活性にはほとんど影響を及ぼさなかった。しかしながらＳＴＦ−１及びＥ２ａ−Ｐbxエフェクタ・プラスミドを共トランスフェクトとすると、ＴＳＥII活性が劇的に増大したが、この現象はＳＴＦ−１がＴＳＥIIサイト上のＰbxと実際に共同できることを示唆している。反対に、インシュリンＰエレメント（Ｐ−Ｌuc）を含むレポータ・プラスミドを用いても、ＳＴＦ−１とＥ２Ａ −Ｐbx間のこうした共同性は観察されなかった。ＤＮＡ結合アッセイではインシュリンＰエレメントがＳＴＦ−１−Ｐbxヘテロダイマーを形成することができなかったので、こうした結果はＳＴＦ−１とＰbxが、ＳＴＦ−１−Ｐbxへテロダイマーを認識できるサブセット上だけで相乗的に作用できることを実証している。Ｐbx−ＳＴＦ−１共同性にとって重要なソマトスタチンＴＳＥIIエレメントの配列を同定するために、いくつかの突然変異体ＴＳＥIIオリゴヌクレオチドを構成した（図２Ｄ及び図２Ｅ）。ＴＳＥIIサイトはホメオドメイン蛋白質の主要認識モチーフである３ＴＡＴＡモチーフを含んでいる。ＴＡＡＴモチーフ１または３の突然変異体（Ｍ１及びＭ３、プラス鎖）は、ＳＴＦ−１及びＰbx間の共同的結合に対しては最小限の効果しか及ぼさないが、ＴＡＡＴモチーフ２（マイナス鎖）の突然変異体はＰbx−ＳＴＦ−１の共同性を完全に破棄し、このことはＰbx −ＳＴＦ−１複合体形成のためにその特別のＴＡＴＡモチーフが重要であることを示している。第３のモチーフ（Ｍ３）の突然変異体もＳＴＦ−１の単量体Ｃ１複合体の形成に影響を与えた。Ｐbxと共同的な結合を促進するＳＴＦ−１の残基を同定するために、一端を切断した一連のポリペプチドをＴＳＥIIプローブを用いてゲルシフト・アッセイでテストした（図３Ａ及び図３Ｂ）。ホメオボックス・ドメインヘ残基Ｃ−末端の欠失はＰbxとの共同的結合に影響を及ぼさない（Ｄ216−284突然変異体）。そして、ＳＴＦ−１トランス活性領域（アミノ酸１−115）を欠失しているＮ−末端に切断されたＳＴＦ−１ポリペプチドもＴＳＥIIサイトに共同的に結合する能力を保有していた。しかし、アミノ酸115から123までの残基をさらに欠失させるとＰbxとの共同性がまったく失われてしまい、このことはＳＴＦ−１ホメオドメインの外側の領域がへテロダイマー形成には重要な役割を果していることを示唆している（図３Ａ及び図３Ｂ）。実際、ＳＴＦ−１（Ｈoxl40−215）のホメオボックス領域は、ＴＳＥ II上で単量体複合体を形成したが、Ｐbxと共同的に結合しなかった。ＳＴＦ−１ホメオドメイン（アミノ酸110−215）に加えてＮ−末端配列を含むＳＴＦ−１ポリペプチドはＰbxとの共同性を示したが、このことはＳＴＦ−１ホメオボックスに隣接しているＮ−末端残基がＴＳＥIIサイトに結合してＰbxと蛋白質−蛋白質接触を形成する可能性を示唆している。エクストラデンティクルとＤＮＡに共同して結合する別のショウジョウバエのホメオドメイン蛋白質とＳＴＦ−１内の残基を比較するプロセスにおいて、このＳＴＦ−１のＮ−末端領域内に位置し（アミノ酸115−123）、種々の種類の後生動物から多数の類似蛋白質内に保持されているショウジョウバエのＰbx相同体であるぺンタペブチド・モチーフＦＰＷＭＫが確認された（５）。Ｐbxとの共同性に対するこのぺプチド・モチーフの重要性を示すために、モチーフ（ＦＰＷＭＫからＡＡＧＧＱまで）内の各残基でアミノ酸置換を含んだ突然変異体ＳＴＦ−１ cＤＮＡが構成された（図３Ｃ）。野性型ＳＴＦ−１蛋白質をゲル移動性シフト・アッセイで比較した場合、突然変異されたＳＴＦ−１蛋白質は遺伝子組換えＰ bxかJurkat抽出物からの内発性Ｐbxのいずれかと共同する能力が不十分であった（図３Ｄ及び図３Ｅ）。対照的に、突然変異体ＳＴＦ−１蛋白質は、へテロダイマー性複合体を形成しないインシュリンＰ及びＦlatエレメント上で野性タイプ結合活性を示した。これらの結果はＰbxモチーフ領域またはpimと呼ばれるＳＴＦ−１のＰbx相互作用モチーフは、実際にＰbxとの共同性に必要であることを示している。Ｐbx相互作用モチーフ領域がＰbxとの共同性のために十分であるかどうか判定するために、非相同ホメオボックス蛋白質に融合された場合にＰbxの共同性を付与するこのモチーフの能力を調べた（図５Ｂ）。ゲル移動性シフト・アッセイにおいて、limホメオドメイン蛋白質Ｉsl１は高い親和性でソマトスタチンＴＳＥI Iを認識したが、Ｐbxとヘテロダイマー化することはできなかった。顕著な点として、Ｉsl１ホメオボックスの上流のＰbx相互作用モチーフ領域の融合はＰbxとの共同性を促進しなかった。尾状様ファクターcdx３は、そのホメオドメインの上流のモチーフＣＥＷＭＲに関連したＰＢＸ相互作用モチーフを含んでいる。しかし、Ｉsl１の場合と同様、cdx３はＰbxと異へテロダイマー化せず、ＰＢＸ相互作用モチーフ領域をcdx３ホメオドメインに付加してもＰbxの共同性を促進しなかった。特徴的な点として、ＰＢＸ相互作用モチーフ領域とホメオボックス間の間隔は、ＳＴＦ−１に及びＰＢＸ相互作用モチーフ−Ｉsl１とＰＢＸ相互作用モチーフ−cdx３融合蛋白質の両方との間の間隔とほぼ同様であり、ホメオドメインからの距離がＰbxと共同能力のないことの理由にはならないことを示唆している。さらに、キメラ性蛋白質（ＰＢＸ相互作用モチーフ−Ｉsl１）ＰＢＸ相互作用モチーフ−cdx３）は、野性型親和性を有するＤＮＡと結合すると思われ、このことは共同の欠失が正しくないヒダ形成（folding）を反映したものではないことを示唆している。これらを共に考え合わせると、これらの結果は、ＰＢＸ相互作用モチーフ領域がＰbxと異量性複合体の形成に必要とされるが、さらにＳＴＦ−１ホメオドメインの中にある残基がソマトスタチンＴＳＥIIサイトに共同して結合するために必要とされることを示唆している。ＰＢＸモチーフ領域に加えて、Ｐbxと共同して結合するために機能的に重要であるＳＴＦ−１のホメオドメイン内の残基を特徴づけを行うために、cdx３ホメオドメイン内の断片をＳＴＦ−１の対応する断片と置き換えた（図６Ｃ）。そうした実験のための融合テンプレートとしてＰＢＸ相互作用モチーフ−cdx３を用いると、ＳＴＦ−１のＮ−末端アームがＰbxとの共同性を回復したが、ＳＴＦ− １ホメオドメインの他の領域（らせん１，２または３）はそうした活性を示さないことが判定された。これらの結果は、ＰＢＸ相互作用モチーフとＳＴＦ−１のＮ−末端アームの両方がＰbxと複合体を形成するには必要であることを証明している。ショウジョウバエのＰbx相同体であるエクストラデンティクルは、発達中にウイングレス（wingless）、テイシャツ（teashirt）及びデカペンタプレジック（ decapentaplegic）など標的遺伝子のサブセットの活性化を適切にするために重要であると見られる（24）。エクストラデンティクルは異なった異形化蛋白質と共に共同的にＤＮＡに結合することにより、これらの標的遺伝子を誘導ように思われる。本発明は、ヒト相同性エクストラデンティクルであるＰbxがソマトスタチンＴＳＥIIエレメント上でＳＴＦ−１でへテロダイマー性複合体を形成することを実証している。ＳＴＦ−１だけの場合と比較すると、ＳＴＦ−１−Ｐbx複合体は、ゲル移動性シフトアッセイでのこの複合体の減少したオフ−レイトで測定して、高度に安定性がある。しかしながら、これらの結果がＨＯＸ蛋白質と共同的に結合する能力を有するＰbxファミリーの種々メンバー間の違いを示さないことは重要である。ソマトスタチンＴＳＥIIサイト上でのＳＴＦ−１−Ｐbxヘテロダイマー形成するは、脊椎動物だけでなくショウジョウバエとＣエレガント（C ．elegans）でも、多数の相同蛋白質内に保持されているぺンタペプチド・モチーフ（ＦＰＭＷＫ）を必要とする。従って、このモチーフを含むＣ．エレガント相同蛋白質mab５あるいはlin−39はＰbxと相同であるように思われる蛋白質ceh−20と共同性を示す可能性ある。Ｐbx：hoxのへテロダイマー形成を誘発するための人工的な標的配列を用いて、ChangらはＤＮＡへのＰbxとの共同的結合にとっての、この保存保守モチーフの重要性を指摘した。これらの結果は、Ｐbxの効果がhox複合体の蛋白質内に制約されず、ＳＴＦ−１などの孤立ホメオボックス蛋白質を含むことを示唆している。 Changらは保持されたＹＰＭＷＫモチーフのＨox Ａ10への融合がＰbxとの共同性を促進するには十分であることを見出したが（３）、このモチーフがＩsl−１及びcdx−３など島細胞ホメオドメイン蛋白質に移入された場合に共同性の誘発が見られなかった。これらの結果は、ホメオドメイン自体の中の付加的な残基がＳＴＦ−１/Ｐbx複合体を形成するために必要であるかもしれないことを示唆した。これに関して、ＳＴＦ−１−ホメオドメインのフレキシブルナＮ−末端（アミノ酸145−153）がＰbxとの共同性には非常に重要であることが見出された。Ｎ−末端アームは機能的特性をアテナピデア（Antennapedia）などホメオドメイン蛋白質に付与することが示されているが、その基礎となるメカニズムはまだ解明されていない（４，26）。構造的な研究では、Ｎ−末端アームがＤＮＡ結合あるいは蛋白質同士の相互作用における微妙な違いを与えているＤＮＡの小さな溝の中に配置されていることを明らかにした。これらの結果はこれらのモデル間の違いを示すものではないが、ＳＴＦ−１/Ｐbx複合体の形成が小さな特異的溝接触を形成するためにＮ−末端アームの能力の役割に部分的に依存しているかもしれないという想定には魅力がある。ＳＴＦ−１−Ｐbxヘテロダイマーの形成は可能性のあるＳＴＦ−１の標的サブセットでのみ行われる。これらの結果はこうした優先性が島細胞発展における標的サイト選択の基礎を形成していることを示唆している。例えば、膵臓島細胞の細胞ライプに違いがあっても（それぞれβ及びｄ）、ＳＴＦ −１がインシュリンとソマトスタチンの表現の両方を誘発することについては上にも述べた。β細胞で、ＳＴＦ−１はらせん−ループ−らせん蛋白質Ｅ47ど共同的に作用することにより、インシュリンの表現を誘発するように見える。対照的に、ＳＴＦ−１は、ＴＳＥIIサイトにＰbxと共同的に結合することで、ｄ細胞におけるソマトスタチンの表現を促進するように見える。これらの観察はインシュリンまたはソマトスタチンのいずれかを表現するための島細胞系列内の細胞の関与は、Ｅボッグス結合とＰbx型蛋白質の表現の割合に依存している可能性を示唆している。膵臓の発達に関してここで述べられているのと同様の発達調節の組み合わせ的メカニズムがイースト菌についても述べられている。これに関して、ホメオドメイン蛋白質Mata２は、二倍体ａ/ａ内の金属と共同して、hsgオペレータと結合し、一倍体（haploid）固有遺伝子を抑制する。しかし一倍体ａまたはａ細胞において、Mata２は違った活性物ＭＣＭ１と共同して、それによって違った遺伝プログラムを活性化するように思われる（９）。Ｐbxとある種のホメオボックス蛋白質の間の相互作用を可能にする保存されたモチーフの存在は発達におけるこの調節因子の全体的な影響をある程度説明しているかもしれない。ソマトスタチン遺伝子は、脳、胃及び延髄甲状腺などをを含む膵臓以外の多数の組織内で表現される。これらの組織内での直接的なソマトスタチン表現は確認されていないが、これらの結果はＰbxとへテロダイマー複合体を形成することによりＴＳＥIIエレメント上でのソマトスタチンの表現を刺激できることを予想させる。ここに引用された文献は以下の通りである。 1. Burglin T．R．ら、Nature Genet．１：319−320，1992。 2. Chan Ｓ．ら、Ce11 78：603−615，1994。 3. Chang C．ら、Genes & Dev．９：663−674、1995。 4. Furukubo-Tokunaga K．ら、Proc．Nat1． Aca. Sci．90：6360−6364,199 3。 5. Gehring W．J．ら、Annu．Rev．Biochem．63：437−526，1994。 6. German M．S．ら、Genes & Dev．６：2165−2176，1992。 7. Guz Y．ら、Developlnent 121：11−18，1995。 8. Hayashi S．ら、Ce11 63：883−894，1990。 9. Johnson A.，Acombinatorial regulatory circuit in budding yeast.，I n S．McKnight（ed．）,transcriptional regulation，Cold Spring Harbor Lab．Press，NＹ，ｐ．975−1006，1992。 10. Jonsson J．ら、Nature 371：606−609，1994。 11. Kamps M．P．ら、Genes & Dev．５：358−368，1991。 12. Karlsson O．ら、Nature 344：879−882，1990。 13. Krumlauf R.，Cell 78：191−201，1994。 14. Leonard J．ら、Mol．Endocrinol．７：1275−1283，1993。 15. Lu Q．ら、Mol．Cell．Biol．14：3938−3948，1994。 16. McGinnis W．ら、Cell 68：283−302，1992。 17. Miller C．P．ら、EMBO J．13：1145−1156，1994。 18. Monica K．ら、Mol．Cell．Biol．11：6149−6157，1991。 19. Ohlsson H．ら、EMBO J．12：4251−4259，1993。 20. Peers B．ら、Mol．Endocrinol．８：1798−1806，1994。 21. Peifer M．ら、Genes & Dev．４：1209−1223，199O。 22. Peshavaria M．ら、Mo1．Endocrino1．８：806−816，1994。 23. Pausko1b C．ら、Ce11 74：1101−1112，1993。 24. Rauskolb C．ら、EMBO J．13：3561−3569，1994。 25. van Dijk M．ら、Cel1 78：616−624，1994。 26. Zeng W．ら、Development 118：339−352，1993。本明細書に述べられたいずれの特許あるいは刊行物も、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルのものである。これらの特許及び刊行物は、それぞれ個々の刊行物が引例として組み込まれるのと程度に、本明細書に組み込まれる。当業者なら、ここに述べられている、およびそれらと本質的に付随した目的を及実行し課題と利点を達成するためによく適していることは容易に理解できるであろう。これらの実施例は、ここに述べられている方法、手順、対処、分予及び特定の化合物と共に本例は、好ましい実施の形態として現段階で示しており、本発明の範囲を限定することを意図していない。本発明の精神と、請求項の範囲内での変更や他の使用法は当業者には容易に想到されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１. ＳＴＦ−１結合サイトへのＳＴＦ−１結合を促進するのに有効な化合物を判定するＤＮＡ結合アッセイにおいて、第１の容器で、ＳＴＦ−１結合サイトを有する末端ラベル化二重鎖ＤＮＡを比較対象としてのＳＴＦ−１と結合するステップと、第２の容器で、ＳＴＦ−１結合サイトを有する末端ラベル化二重鎖ＤＮＡをＳＴＦ−１及びサンプルとしてのテスト化合物と組み合わせるステップと、該第１及び第２の容器を培養するステップと、該比較対象と該サンプルを電気泳動ゲル上に負荷するステップと、該比較対象及び該サンプルを該ゲル内で移行させるために該電気泳動ゲルに電流を加えるステップと、該比較対象及び該サンプルを検出するステップと、該比較対象の移行を該サンプルの移行と比較するステップで構成され、該サンプルの移行が該比較対象より遅い場合に、該テスト化合物が該ＳＴＦ−１結合サイトへのＳＴＦ−１結合の促進において有効とされるアッセイ。２. 第２のサンプルがＳＴＦ−１結合サイトを有する末端ラベル化二重鎖ＤＮＡ、ＳＴＦ−１、テスト化合物及び該末端ラベル化二重鎖ＤＮＡと同じ配列を有する過剰の、ラベルされていない二重鎖ＤＮＡを含んで調製され、該第２のサンプルの検出がラベルされたＤＮＡ／ＳＴＦ−１／テスト化合物複合体の減少を示した場合、該ＳＴＦ−１／テスト化合物複合体の結合がＳＴＦ−１結合サイトを有する該二重鎖ＤＮＡに対して固有であるとされる請求項１のアッセイ。３. 該末端ラベル化二重鎖ＤＮＡがＳＥＱＩＤ No.１の配列を有するひとつの鎖とＳＥＱＩＤ No.２を有する他の鎖を有している請求項１のアッセイ。４. ＳＴＦ−１結合サイトに対するＳＴＦ−１結合を促進するのに有効な化合物を判定するＤＮＡ結合アッセイにおいて、ＳＴＦ−１を構成的に表現する第１の表現プラスミドと、レポータ遺伝子を表現する第２の表現プラスミドをＳＴＦ−１結合サイトの制御下で適切な細胞株内のトランスフェクトするステップと、該トランスフェクトされた適切な細胞株内に第３のプラスミドをトランスフェクトして、該第３の表現プラスミドがテスト化合物を表現するステップと、そして該レポータ遺伝子の転写の量を測定するステップとで構成され、該転写が起きていれば、該テスト化合物が該ＳＴＦ−１結合サイトに対するＳＴＦ−１結合を促進するのに有効であるとされるＤＮＡ結合アッセイ。５. 該第２の表現プラスミドが該ＳＴＦ−１結合サイトとしてソマトスタチンＴＳＥIIサイトのコピーを含んでいる請求項４のアッセイ。６. 該適切な細胞株がＧＣ細胞である請求項４のアッセイ。