JP2000501293A - 抗菌剤をスクリーニングするための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 インビトロでの細菌性タンパク質−タンパク質結合を用いる、抗菌活性について化合物をスクリーニングするための方法が記述される。化合物の大ライブラリーをスクリーニングするため、この方法は固定化要素を用いて行うことが可能であり、この固定化は様々な固定化手段、例えば、カラム、ビーズ、吸着剤、ニトロセルロース紙等）を用いて行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】 抗菌剤をスクリーニングするための組成物及び方法 発明の分野 本発明は抗菌活性についての化合物のスクリーニングに関し、特には、細胞分 裂を妨害する化合物の検出に細菌性タンパク質をインビトロで用いることに関す る。 背景 抗菌剤は選択毒性の原理に基づいて開発される。すなわち、抗菌剤は、微生物 に対しては毒性であるにもかかわらず、患者に対して毒性であってはならない。 これらの薬剤の選択毒性は、通常、絶対的なものであるというよりも相対的なも のである。これは、単に、大部分の薬剤が、患者が寛容であるが微生物に対して は致死的または障害を与える濃度で患者に投与されることを意味する;より多く の用量は患者にとって毒性であり、回避される。 選択毒性は、しばしば、微生物上には存在するが宿主系には欠如している特定 の受容体の存在の反映である。選択毒性を達成する他の手段は、通常、微生物に とっては必須であるが宿主にとっては必須ではない生化学的事象の阻害に依存す る。感染性病原体及びそれらの宿主の生理、構造、及び生化学系が通常大きく異 なるため、抗菌剤の開発は通常これらの相違に依存する。 多くの抗菌剤の作用機構は十分には理解されていないが、作用の５つの主要範 疇には、細胞壁の合成の阻害、細胞膜の機能の阻害、タンパク質合成の阻害、核 酸合成の阻害、及び中間代謝の妨害が含まれる。（例えば、Ｗ.Ｋ.Joklikら，［ 編］,Zinsser Microbiology,18版,Appleton-Century-Crofts,Norwalk,CT，［198 4］,p.193を参照）。 例えば、全てのβ−ラクタム剤と同様に、ペニシリンは細菌細胞壁の合成を選択 的に阻害する化合物である。これらのβ−ラクタム剤の作用の機構における最初 の工程は、“ペニシリン結合タンパク質”（“PBP”）として知られる細胞受容 体への薬剤の結合に関与する。３−６種類のPBPが４−12×10⁵の範囲の分子量で 存在する；これらのPBPのうちの幾つかはぺプチド転移酵素である。（Jawetz,Me lnick ＆ Adelberg's MedicalMicrobiology,19版,Appleton ＆ Lange,Norwalk,C T［1991］,p.150）。PBPに 結合した後、この薬剤はペプチド転移反応を阻害し、その微生物の細胞壁材料に おけるペプチドグリカンの合成が遮断される。その結果、細胞の溶解につながる 自己融解カスケードの最終的な誘発が生じる。 ぺプチドグリカンの濃度が比較的高いため、グラム陽性菌はグラム陰性菌より もペニシリン及び他のβ−ラクタムの効果に感受性である傾向がある。重要な点 は、これらは細胞壁の合成に影響を及ぼすため、ペニシリン及び他のβ−ラクタ ムは、活発に成長しかつ分裂する培養物に対してのみ有効であることである。し かしながら、これらのβ−ラクタム剤の利点の１つは、動物の細胞がペプチドグ リカンを持たないことである：したがって、このような薬剤はヒト及び他の動物 に対して並外れて非毒性である。 微生物の中には、PBPの欠如、透過障壁の存在によるPBPへの接近不能、薬剤の 結合の後に活性化すべき自己融解カスケードの不全、又は細胞壁中のペプチドグ リカンの欠如（例えば、マイコプラズマ、Ｌ型、及び代謝的に不活性の細菌）に より、ペニシリン及び他のβ−ラクタムに対して生来耐性であるものがある。不 幸なことに、様々な感染及び疾患の治療への多年の使用の後、ペニシリン耐性が 、従来これらの薬剤の作用に対して感受性であった微生物集団内に徐々に広まっ ている。微生物の中には、抗菌剤それ自体を破壊する酵素であるβ−ラクタマー ゼを産生するものがあり、一方、PBPに対する変更を生じる遺伝的変化を薬剤が もはや効率的に受容体に結合しないように受けているものもある；さらに別の微 生物は、薬剤が結合した細胞の溶解を妨げるように被包されている。この後者の シナリオにおいては、薬剤はその細胞の成長を阻害してはいるが、細胞は殺され ない。ある環境においては、これは、治療の早すぎる中断に続く疾患の再発に寄 与するものと思われる。これは、細胞の幾つかが生存可能のままであり、ひとた び抗菌剤がそれらの環境から取り除かれれば成長し始めることが可能であるため である。 抗菌剤に対する寛容及び耐性の出現は、疾患の治療能力に対する重大な脅威を 意味する。この耐性株の観察の増加には多くの因子が寄与しており、これらには 抗菌剤の過剰使用及び／又は不適切な投与、耐性を付与する遺伝物質（すなわち 、Ｒプラスミド）を交換する多くの微生物の能力、及び多くの細菌に関して観察 される比較的速い変異速度が含まれ、これは耐性微生物の選別の余地を残す。 ペニシリン耐性の出現に関する問題を強調する十分に証拠立てられた例の１つ は、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、グラム陽性微生物に関わるもの である。初 めは、肺炎連鎖球菌の処置へのペニシリンの導入はこの微生物による死亡率の顕 著な低下を生じた。しかしながら、肺炎連鎖球菌は、それが最も頻繁に侵襲性感 染を伴う病原体の１つであるため、大きな関心を集めたままである；これは、細 菌性肺炎及び中耳炎の最も一般的な原因であり；細菌性髄膜炎の第２の最も一般 的な原因であり；かつ血液培養物からの第３の最も一般的な単離体である。（J. F.Sessegoloら，“1988年から１992年にブラジルにおいて単離された肺炎連鎖球 菌株の血清型及び抗菌剤耐性の分布(Distribution of Serotypes and Antimicro bial Resistance of Streptococcus pneumoniae Strains Isolated in Brazil F rom 1988 to 1992)”J.Clin.Microbiol.,32:906-911[1994]）。このように、こ の微生物における抗菌剤耐性の出現が関心を集める大きな原因である。 ペニシリンに対する感受性が低下した肺炎球菌の最初の報告は1967年であった 。この最初の報告がオーストラリアから出て以来、感受性が低下したさらなる株 が全世界で報告されている。加えて、ペニシリン代替物、例えば、クロラムフェ ニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、リファン ピン、及びスルファメトキサゾール−トリメトプリムに対する耐性が、しばしば ペニシリン耐性と共に、報告されている。肺炎球菌における多抗菌剤耐性は1977 年に最初に報告された。この最初の報告が南アフリカから出て以来、多剤耐性株 が、スペイン、イタリア、フランス、ベルギー、ハンガリー、パキスタン、チェ コスロバキア、カナダ、英国、及び米国を含む幾つかの国で報告されている。（ Sessegoloら、前出、906頁）。 ブラジルにおいて行われた、1988-1992年に単離された288の肺炎連鎖球菌株の うちの42の血清型の調査において、Sessegoloらは、ペニシリンに対する感受性 の低下がこれらの株の26.7％で検出されたことを報告した。加えて、これらの株 の35.9％はテトラサイクリンに対して耐性であり、29.2％はスルファメトキサゾ ール−トリメトプリムに対して耐性であり、1.5％はリファンピンに対して耐性 であり、0.80％はペニシリンに対して耐性であり、かつ0.50％はクロラムフェニ コールに対して耐性であった。ペニシリン耐性株はセファロスポリンに対しても 耐性であり、又は感受性が低下していることが見出された。また、これらの株の 耐性特性も半定量化され、中間耐性はペニシリンに対して17.9％、テトラサイク リンに対して8.7％、クロラムフェニコールに対して6.7％、エリスロマイシンに 対して6.1％、及びリファンピンに対して3.1％と報告されている。 1981年及び1982年にリオデジャネイロにおいて患者から得られた結果は、肺炎 球菌 単離体にペニシリン耐性が（相対的又は完全に）存在しないことを示した。しか しながら、1988年から1992年の期間で、同じ地理的集団からの株の19.4％はペニ シリンに対して比較的耐性であり、1.5％は完全に耐性であった。これらの結果 は、抗菌剤耐性の急速な蔓延を強調する。 ひとたび微生物が特定の薬剤に対する耐性を現すと、有効な代替薬剤を同定す ることが重要になる。その微生物がこの第２の薬剤に対する耐性を現す場合には 、別の代替物が必要になる。多剤耐性の歴史的な出現の一例は淋病である。1930 年代以前には、この疾患の治療には、通常、洗浄及び男性においては尿道消息子 （urethral sound）の使用のような機械的的手段が含まれていた。1930年代後期 にスルホンアミドが導入され、淋病の治療に有効であることが見出された。数年 後、淋菌（Ｎ.gonorrhoeae）のスルホンアミド耐性株が単離された。幸運なこと に、この時にはペニシリンが利用可能であり、有効であることが見出されていた 。しかしながら、1970年代には、淋菌の多くの単離体がぺニシリン耐性であるこ とが見出された。これには、スペクチノマイシンのような代替薬剤の使用を必要 とした。この傾向は、スルホンアミド、ペニシリン、スペクチノマイシン、及び 他の抗菌剤に対して耐性である株の出現を伴って、継続するものと予想すること ができる。 したがって、新規抗菌剤を開発する必要性が存続する。理想的には、その抗菌 剤は微生物の生理を標的とし、選択毒性を示すべきである。しかしながら、それ にも関わらず、この標的設定は広範な微生物スペクトル対する抗菌作用を考慮す るべきである。最も重要なことは、その抗菌剤が多剤耐性微生物に対する有効な 代替薬剤として働かなければならないことである。 発明の要約 本発明は抗菌活性についての化合物のスクリーニングに関し、特には、細胞分 裂を妨害する化合物の検出に細菌性タンパク質をインビトロで用いることに関す る。本発明では、潜在的な抗菌活性についての化合物のスクリーニングへのzipA 遺伝子及び遺伝子産生物の使用が意図される。現行のスクリーニングの取り組み 方とは異なり、本発明のスクリーニングの取り組み方は細菌細胞の使用を必要と しない。 本発明では、機能的であり、その上伝統的な生化学単離技術に典型的に関連す るタンパク質を含むことがない組換えZipAタンパク質の過剰発現が意図される。 本発明の組 換えZipAタンパク質の発現は、zipA遺伝子を含むべクター（例えば、プラスミド ）の構築及びタンパク質の発現に適する宿主に依存する。本発明が組み替えzipA の発現のために選択される発現系によって限定されることは意図されない。本発 明では、発現系（すなわち、発現ベクター／宿主細胞の組み合わせ）の全ての形 態及び源が意図される。 態様の１つにおいて、本発明では、a）i）試験化合物；ii）少なくともzipA遺伝 子の一部を含むオリゴヌクレオチドによってコードされる第１のタンパク質；ii i）該第１のタンパク質に結合することが可能な第２のタンパク質；及びiv）該 結合を検出するための手段を提供し；b）該第１及び第２のタンパク質を該試験 化合物の存在下において混合し；かつc）該結合検出手段を用いて結合を検出す ることを包含する化合物のスクリーニング方法が意図される。 この方法は固定化された要素を用いて行うことができ、この固定化は様々な固 定化手段（例えば、カラム、ビーズ、吸着剤、ニトロセルロース紙等）を用いて 行うことができる。試験化合物（例えば、薬剤、新規抗菌剤等）の巨大なライブ ラリーをスクリーニングするため、本発明のスクリーニング検定は、好ましくは 、マイクロプレート形式で行われる。 本発明では様々な検定形式が意図される。態様の１つにおいては、（少なくと もzipＡ遺伝子の一部を含むオリゴヌクレオチドによってコードされる）前記第 １のタンパク質が固定化される。別の態様においては、（前記第１のタンパク質 に結合することが可能な）前記第２のタンパク質が固定化される。態様の１つに おいては、前記第２のタンパク質はFtsZである。態様に１つにおいては、前記第 ２のタンパク質が標識（例えば、放射標識）されている。 本発明が検出の手段又は方法によって限定されることは意図されない。例えば 、検出手段はプレートリーダー、シンチレーションカウンター、質量分析計又は 蛍光計であリ得る。 本発明が試験化合物の性質によって限定されることは意図されない。このよう な化合物は合成化合物であっても自然界から入手可能な化合物であってもよい。 本発明の方法は細菌に対して有効な抗菌剤の同定に特に有用である。しかしな がら、このような同定された薬剤は他の単細胞並びに、真菌、マイコプラズマ及 び原生動物を含むがこれらに限定されるものではない、多細胞生物に対する活性 を有することがある。 図面の説明 図１は、本発明において抗菌剤のスクリーニングに有用であることが予想され る、細菌細胞の分裂に関与するタンパク質を模式的に示す。 図２は、ニトロセルロース上に固定されたタンパク質を用いる結合検定のオー トラジオグラフである。 図３は、大腸菌染色体上のzipA遺伝子の位置、ZipAタンパク質を横断しての親 水性プロット、及び細胞内膜のZipAの模式図を模式的に示す。 図４は、大腸菌染色体のzipA遺伝子全体を含む部分のヌクレオチド配列を示す 。zipＡ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号１)に加えてZipAタンパク質のアミ ノ酸配列(配列番号２)も示される。 図５は、大腸菌におけるZipAタンパク質のアミノ酸配列(配列番号２)と整列化 された、Ｈ.インフルエンザにおけるZipAタンパク質相同体のアミノ酸配列(配列 番号３)を示す。 図６は、本発明において用いられる発現クローンングを模式的に示す。 図７は、zipA配列を含むプラスミド構築体の幾つかを模式的に示す。 定義 本発明の理解を容易にするため、幾つかの用語を以下に定義する。 ここで用いられる場合、“ベクター”という用語は、ＤＮＡセグメント（１つ もしくは複数）をある細胞から別の細胞に搬送する核酸分子に関して用いられる 。“ビヒクル”という用語が“ベクター”と交換可能に用いられることもある。 一般に用いられるベクターにはプラスミド及びバクテリオファージベクターが含 まれるが、これらに限定されるものではない。 ここで用いられる“発現ベクター”という用語は、所望のコーディング配列及 び特定の宿主微生物におけるその作動可能に連結したコーディング配列の発現に 必要である適切な核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。原核生物における発 現に必要な核酸配列は、通常、しばしば他の配列と共に、プロモーター、オペレ ーター（任意）、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、 エンハンサー、並びに終止及びポリアデニル化シグナルを用いることが知られて いる。 ここで用いられる場合、“相補的”又は“相補性”という用語は塩基対形成則 で関連 付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）に関して用いら れる。 例えば、配列“Ａ-Ｇ-Ｔ”は配列“Ｔ-Ｃ-Ａ”に対して相補的である。相補性は 、その核酸の塩基の幾つかのみが塩基対形成則に従って組み合わされる“部分的 ”なものであってもよい。さもなければ、核酸の間の“完全な”もしくは“総体 的な”相補性であり得る。核酸鎖の間の相補性の程度は核酸鎖の間のハイブリダ イゼーションの効率及び強度に対する大きな効果を有する。これは、増幅反応の 他に核酸間の結合に依存する検出方法においても特に重要なものである。 ここで用いられる場合、“ハイブリダイゼーション”という用語は相補的核酸 の対形成に関して用いられる。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーシ ョンの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与 する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴ_m、及びそれらの 核酸内のＧ：Ｃ比のような因子ｏに影響を受ける。 ここで用いられる場合、“Ｔ_m”という用語は“融解温度”に関して用いられ る。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が一本鎖に半解離するようになる温度で ある。核酸のＴ_mを算出するための等式は当該技術分野において周知である。標 準的な参考文献によって示されるように、Ｔ_m値の簡単な見積もりは、核酸が1M NaClの水溶液中に存在する場合、等式：Ｔ_m=81.5＋0.41（％G＋C）で算出するこ とができる。（例えば、Anderson及びYoung,定量的フィルターハイブリダイゼー ション（Quantitative Filter Hybridization）、Nucleic Acid Hybridization （1985）を参照のこと。他の参考文献には、Ｔ_mの算出に際して構造的な特徴の 他に配列の特徴を考慮する、より洗練された計算が含まれる。 ここで用いられる場合、“ストリンジェンシー”という用語は、核酸のハイブ リダイゼーションが行われる、温度、イオン強度、及び有機溶媒のような他の化 合物の存在の条件に関して用いられる。“高ストリンジェンシー”条件では、核 酸の塩基対形成は、高頻度の相補的塩基配列を有する核酸断片間でのみ生じる。 したがって、遺伝的に多様である生物に由来する核酸に関しては、相補的配列の 頻度が通常より低いため、ストリンジェンシーが“弱い”、すなわち“低い”条 件がしばしば必要とされる。 ここで用いられる場合、“増幅可能な核酸”という用語はどのようなものであ っても増幅方法で増幅することが可能である核酸に関して用いられ、この増幅反 応にはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が含まれるがこれに限定されるものではな い。“増幅可能な核 酸”には、通常、 “サンプルテンプレード”が含まれることが意図される。 ここで用いられる場合、“サンプルテンプレード”という用語はサンプルに由 来する核酸を指す。対照的に“バックグランドテンプレード”は、サンプル中に 存在していてもしていなくてもよいサンプルテンプレート以外の核酸に関して用 いられる。バックグランドテンプレートは不注意によるものであることが最も多 い。これはキャリーオーバーの結果であることがあり、又はサンプルから探して 除去すべき核酸汚染物質の存在によるものであることがある。例えば、検出しよ うとするもの以外の微生物に由来する核酸が試験サンプル中にバックグランドと して存在することがある。 ここで用いられる場合、“プライマー”という用語は、精製された制限消化物 におけるもののような天然に生じるものであろうと合成により生成されたもので あろうと、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産生物の合成が誘導される条件 下（すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼのような誘発作用因子の存 在下、並びに適切な温度及びpH）におかれた場合に合成の開始点として作用し得 るオリゴヌクレオチドを指す。 プライマーは、好ましくは、増幅の最大効率のために一本鎖であるが、その代わ りに二本鎖であってもよい。二本鎖である場合、伸長産生物の調製に用いる前に 、まずそのプライマーを処理してその鎖を分離する。好ましくは、プライマーは オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘発作用因子の存在下 において伸長産生物の合成を初回刺激するのに十分な長さでなければならない。 プライマーの正確な長さは多くの因子に依存し、これには温度、プライマーの源 及びその方法の使用が含まれる。 ここで用いられる場合、“プローブ”という用語は、精製された制限消化物に おけるもののような天然に生じるものであろうと合成により生成されたものであ ろうと、関心のある別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能で あるオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは 特定の遺伝子配列の検出、同定及び単離において有用である。 本発明において用いられるタンパク質（もしくはプローブ）は“レポーター分 子”で標識され、そのためいずれかの検出系において検出可能であることが意図 されており、この検出系には酵素（例えば、酵素ベースの組織化学的検定に加え てELISA）、蛍光、放射能、及び発光が含まれるがこれらに限定されるものでは ない。放射性同位体、酵素及び蛍光生成物質（flurogenic substance）であろう と他の型の分子（例えば、ビオチン等）であろうと、本発明が特定の検出系又は 標識に限定されることは意図されない。 特定の標識スキームを利用するための幾つかの市販のキットが存在する（そのよ うなキットの１つがアマシャム（Amersham）から入手可能であって米国特許4,56 8,649号に記述されており、これは参照することでここに組み込まれる）。 ここで用いられる場合、“標的”という用語は、検出及び／又は (例えば、ポ リメラーゼ連鎖反応による)増幅のために用いられるプライマーが結合する核酸 の領域を指す。 したがって、“標的”は他の核酸配列から区別されるように探す。“セグメント ”はこの標的配列内の核酸の領域と定義される。 ここで用いられる場合、“ポリメラーゼ連鎖反応”（“PCR”）という用語は Ｋ.Ｂ.Mullis 米国特許4,683,195号及び4,683,202号(これらは参照することで ここに組み込まれる)の方法を指し、これらの特許にはクローンング又は精製を 行うことなくゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加させ るための方法が記述されている。 ここで用いられる場合、“PCR産生物”及び“増幅産生物”という用語は、変 性、アニール及び伸長のPCR工程の２回以上のサイクルが完了した後に生じる化 合物の混合物を指す。これらの用語は、１つ以上の標的配列の１つ以上のセグメ ントが増幅されている場合を包含する。 ここで用いられる場合、“増幅試薬”という用語は、プライマー、核酸テンプ レート及び増幅酵素以外の増幅に必要とされる試薬（デオキシリボヌクレオシド 三リン酸、バッファー等）を指す。典型的には、増幅試薬は、他の反応成分と共 に反応容器（試験管、マイクロウェル等）内に収容される。 ここで用いられる場合、“制限エンドヌクレアーゼ”及び“制限酵素”という 用語は、その各々が特定のヌクレオチド配列で、又はその近辺で、二本鎖ＤＮＡ を切断する細菌性酵素を指す。 ここで用いられる場合、“組換えＤＮＡ分子”という用語は、分子生物学的技 術により共に結合されているＤＮＡのセグメントを含んでなるＤＮＡ分子を指す 。 ＤＮＡ分子は“5’末端”及び“3’末端”を有すると言われる。これは、モノ ヌクレオチドが、あるモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がホスホジエ ステル結合によりそれに隣接するものの３’酸素に一方向に結合するような様式 で反応してオリゴヌクレオチドを形成するためである。したがって、オリゴヌク レオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオシドペントース環の３’酸素 に連結していない場合に“５’末端” と呼ばれ、その３’酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸と結 合していない場合に“３’末端”と呼ばれる。ここで用いられる場合、核酸配列 は、例えより大きなオリゴヌクレオチドの内部であっても、５’及び３’末端を 有すると言うこともできる。直鎖又は環状ＤＮＡ分子のいずれにおいても、不連 続のエレメントは“下流”すなわち３’エレメントの“上流”すなわち５’であ ると呼ばれる。この用語法は、転写がＤＮＡ鎖に沿って５’から３’へという様 式で進行するという事実を反映する。連結した遺伝子の転写を指向するプロモー ター及びエンハンサーエレメントは、一般には、コーディング領域の５’、すな わち上流に位置する。しかしながら、エンハンサーエレメントは、プロモーター エレメント及びコーディング領域の３’に位置する場合でもそれらの効果を発揮 し得る。転写終止及びポリアデニル化シグナルはコーディング領域の３’、すな わち下流に位置する。 ここで用いられる場合、“遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリ ゴヌクレオチド”という用語は、遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ配列、 すなわち、還元すると、遺伝子産生物をコードするＤＮＡ配列を意味する。コー ディング領域はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのいずれの形態で存在していてもよい 。必要であれば、プロモーター及び／又はエンハンサー、スプライス接合、ポリ アデニル化シグナルのような適切な調節エレメントを遺伝子のコーディング配列 の極めて近くに配置し、真核宿主細胞における転写の適切な開始及び／又は一次 ＲＮＡ転写の処理の修正を可能にすることができる。原核生物が宿主細胞として 用いられる場合、適切な調節エレメントにはプロモーター、オペレーター、リボ ソーム結合部位、及び転写終止エレメントが含まれるがこれらに限定されるもの ではない。真核細胞宿主における発現が望まれる場合には、用いられるコーディ ング領域は、典型的には、イントロンを欠いている。その代わりに、本発明の発 現ベクターにおいて用いられるコーディング領域は、内在性エンハンサー／プロ モーター、スプライス接合、介在配列、ポリアデニル化シグナル等、又は内在性 及び外来性両者の調節エレメントの組み合わせを含んでいてもよい。 ここで用いられる場合、“をコードする核酸分子”、“をコードするＤＮＡ配 列”、及び“をコードするＤＮＡ”という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿う デオキシリボヌクレオチドの順序又は配列を指す。これらのデオキシリボヌクレ オチドの順序はそのポリペプチド（タンパク質）鎖に沿うアミノ酸の順序を決定 する。したがって、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。 ここで用いられる“薬剤”という用語は、ヒト又は他の動物において用いられ るあらゆる医学的物質を指す。類似、天然、及び合成化合物並びに組換え医薬品 、ホルモン、抗菌剤、抗生物質等がこの定義に包含される。 発明の説明 本発明は抗菌活性についての化合物のスクリーニングに関し、特には、細胞分 裂を妨害する化合物の検出に細菌性タンパク質をインビトロで用いることに関す る。本開示ではZipAタンパク質をコードする遺伝子の単離が説明される。細菌細 胞においてタンパク質が機能的に過剰発現することを考慮してプラスミドを含む 発現ベクターが構築されている。しかしながら、このプラスミドはまた、他の宿 主においても機能的に発現するように構築される。実際、本発明が発現系によっ て限定されることは意図されていない：本発明では発現系の全ての形態及び源が 考慮される。 態様の１つにおいて、本発明では、化合物をそれらの抗菌活性についてスクリ -ニングするために細胞を含まない検定においてZipAタンパク質を用いることが 考慮される。 細胞を含まない検定は、伝統的な微生物スクリーニング検定を越える固有の利点 を有する。 別の態様において、本発明では、細胞性検定においてZipAタンパク質を用いる ことが考慮される。考慮される細胞性検定の１つは酵素ツーハイブリッド系（ye ast two-hybrid system）である。 Ｉ.伝統的な抗菌剤スクリーニング 細胞ベースのスクリーニング検定の限界（及び本発明の細胞を含まないスクリ ーニング検定の利点）を理解するには、細胞の成長の検出に固有の原理を考慮す ることが有用である。例えば、培養物の一定分量を新鮮な培養培地（例えば、固 体又は液体培養培地）に移して微生物の成長が生じ得るような適切な条件下にお いたときに成長しない場合、細菌培養物は“滅菌されている”と考えることがで きる。この期間及び成長条件（例えば、温度）を“増幅因子”と呼ぶことができ る。この増幅因子は、検出方法（細菌コロニーの出現についての培養プレートの 目視検査）の限界と共に、不活性化方法の感度を決定する。検出しようとする信 号に対して最小限の数の生存可能な細菌がプレートに塗布されなければならない 。最適な検出方法で、この最少数は１細菌細胞である。準最適 検出方法では、信号が観察されるように適用される細菌細胞の最少数は１より大 きなものであり得る。この検出方法は、それより下でその方法が完全に有効であ る（及び、それより上では、その方法は現実には部分的にのみ有効である）と思 われる“閾値”を決定する。 この検定の増幅因子とその検出方法が決定する閾値との関係を示すことができ る。例えば、細菌細胞を培養培地のプレートに塗布することができる；検出方法 を随意に選択して目視検査する。成長条件及び期間を、生じている全体的な増幅 が10⁴であるものと仮定する。検出可能な信号は増幅後に実際に存在する細菌細 胞の数に比例する。計算のため、検出閾値を10⁶細胞とする；増幅後に存在する ものが10⁶細胞を下回る場合、細胞コロニーを目視で検出することはできず、そ の不活性化方法は有効であるものと思われる。増幅因子が10⁴であり、かつ検出 閾値が10⁶である場合、その感度限界は100細菌細胞である；滅菌法を行った後に 細菌培養物の元の一定分量中に存在する生存可能な細菌細胞が100を下回る場合 、その培養物は滅菌されているものと考えられる。 このような状況は細菌成長検定にとって一般的なものである。この検定の感度 は、生存可能な細菌細胞は存在するもののその検定がそれらを検出することがで きないというものである。 細胞成長検定を用いる抗菌剤感受性試験は微生物に対する抗菌剤の有効性を決 定する方法の１つである。溶液中の抗菌剤の毒性（すなわち、効力）を決定する ため抗菌剤感受性をインビトロで測定し、体組織又は体液中のその濃度を見積も り、かつ既知濃度の抗菌剤に対する所定の微生物の感受性を決定する。インビト ロで抗菌剤の活性に重大な影響を及ぼし得る様々な因子が存在する。試験環境の pH、微生物が成長する培地、抗菌剤の安定性、接種サイズ、抗菌剤への曝露期間 の長さ、及び微生物の代謝活性のような因子を抗菌剤感受性のインビトロ試験の 間考慮しなければならない。（例えば、G.F.Brooksら,Jawetz,Melnick & Adelbe rg's Medical Microbiology,19版,Appleton & Lange,Norwalk,CT[1991],155頁 を参照）。 多くの場合において、患者に害を及ぼすことなく、微生物を殺し、又は阻害す るのに必要とされる抗菌剤の量又は濃度を定量化することが可能である。ある状 況においては、以前は低濃度の抗菌剤に感受性であった微生物がその抗菌剤に対 する耐性を現す状況によって示されるように、定量化が重要になる。加えて、特 定の微生物の感受性を予測し、又は特定の抗菌剤を単離することはしばしば可能 ではない。（P.R.Murrayら［編］， 臨床微生物学マニュアル(Manual of Chnical Microbiology),６版,ASM Press,Wa shington,Ｄ.Ｃ.,[1995],1277頁のJ.J.Jorgensen及びＤ.Ｆ.Sahm,“抗菌剤感受 性試験:一般的な考察(Antimicrobial Susceptibility Testing: General Consid erations)”を参照）。これらの理由の全てにより、本発明は細胞ベースのスク リーニング法に限定されない。むしろ、本発明では、生きている細胞のパラメー タの測定に関連する欠点がない、細胞を含まない検出系が考慮される。 II．本発明において有用なタンパク質 態様の１つにおいて、本発明では、細胞分裂を妨害する化合物の検出に細菌性 タンパク質をインビトロで用いることを包含する、抗菌活性について化合物をス クリーニングするための細胞を含まない方法が考慮される。このため、本発明で は、細胞分裂に関与する細菌性タンパク質（図１を参照）が化合物のスクリーニ ングにおいて有用なタンパク質として考慮される。このようなタンパク質の１つ が必須分裂タンパク質FtsZであり、これは異なる種間で非常によく保存される。 細胞分裂の直前、内膜にFtsZが集まり予想される分裂部位で環状構造を形成す る。 （図１を参照）。中隔形成の間、FtsZ環の直径は、それが陥入する細胞壁の先端 に留まるため小さくなる。FtsZ環は細胞壁の陥入にとって重要であると考えられ るが、その正確な役割は不明である。魅力的な仮説の１つでは、この環は細胞膜 を内部に移動させる収縮性要素である。これは、次に、中隔特異的ムレイン合成 酵素PBP3（Ftsl）を誘発して堅いムレイン層で内部に移動する膜を支援する。 精製FtsZを用いてインビトロで行われた実験は、このタンパク質が巨大ポリマ ーをヌクレオチド依存性の様式で形成することが可能なGTP加水分解酵素である ことを示している。これは、FtsZ環が、１つの巨大な、又は複数のより小さな、 GTP/GDP結合FtsZサブユニットからなるポリマー（１つもしくは複数）を含むと いう着想と一致する。３種類の細菌種に由来する既知配列のFtsZペプチドは、完 全に保存され、かつ真核細胞のα−、β−及びγ−チューブリンの間で高度に保 存される配列にほぼ等しい７アミノ酸の伸長を含む13アミノ酸セグメントを共有 する。FtsZのチューブリンシグネチャー配列(tubulin signature sequence)内で の一アミノ酸置換は、高温での細胞成長での中隔形成の失敗につながる。 本発明が正確な機構によって限定されることは意図されていないが、FtsZは細 胞分裂 プロセスの１以上において特定の役割を果たす幾つかの異なる分子と相互作用す ることが必要であるものと信じられる。遺伝学的な研究により、FtsZと幾つかの 他のタンパク質との間で考えられる相互作用が示唆されている。さらに、FtsZと FtsAとの相互作用の確実な物理的証拠が存在する。実際、FtsAはFtsZと共に精製 することが可能であり、その逆も同じである。 他のタンパク質がFtsZと相互作用する可能性に取り組むため、本発明者らはFt sZに対する親和性を有するタンパク質を探索した。取り組みの１つにおいて、Ｎ 末端にヒスチジンタグ（このヒスチジンタグは米国特許5,310,663号に記述され るもののような金属キレートアフィニティクロマトグラフィーによる精製に有用 であり、この特許は参照することでここに組み込まれる）を坦持し、加えて心筋 キナーゼの基質部位を坦持するFtsZ誘導体(HFKT-FtsZ)を作製した。精製したこ のタンパク質をキナーゼ及び［γ³²Ｐ］ATPと共にインキュベートすることによ りインビトロで放射標識し、ウェスタンブロットでプローブとして用いた。この 検定において、HKFT-FtsZは、大腸菌タンパク質の中に存在する、不溶性（P200 ）画分中に見出される、50Kdの見かけのMWを有する種に相当する１つの微量タン パク質バンドに特異的に結合し（及び可溶性（S200）画分中のいかなるバンドに も結合せず）（図２の中央のパネルを参照）、本発明者らはこれを“ZipA”と命 名している。このタンパク質の結合は、幾つかの他のタンパク質のHKFT−タグ付 け誘導体がこの50Kdバンドに結合することができず（図２の左側のパネルは、放 射標識HKFT-MinEがOmpには結合するがZipAには結合せず、そのため陰性対照とし て役立つことを示す）、かつ未変性のFtsZが結合に競合する［図２の右側のパネ ルは、（“＋FtsZ”として示される）未変性の非標識FstZが検定に含まれる場合 に信号が減少することを示す］ため、HKFT−FtsZプローブのFtsZ部分に特異的で あった。 ZipAは破壊された細胞の不溶性画分に排他的に存在する。この画分を尿素で処 理してもZipAは放出されなかったのに対して、サルコシル又はトリトンＸ-100の いずれかで処理するとこのタンパク質が効率的に可溶化された。これは、ZipAが 内膜を構成するタンパク質であることを示唆する。細胞分裂におけるZipAの正確 な役割を理解することは本発明の実施に必要なものではないが、図１には、他の 既知の細胞分裂タンパク質との関連でZipAの考えられる配置が模式的に説明され ている。 ZipAの遺伝子(zipA)が発現クローンングによりλgt11ライブラリーから単離さ れ、 大腸菌染色体上の52分の位置の従来同定されていない遺伝子であることが示され た。 （図３を参照）。T7 ＲＮＡポリメラーゼベースの系におけるzipAオープンリー ディングフレーム（ORF）の過剰発現は、50Kd種として移動し、かつ上述の検定 においてFtsZと容易に結合する単一のタンパク質の過剰産生をもたらした。ZipA の推定一次構造はaa疎水性Ｎ末端及び多量のプロリン残基(12.5％)を示す。算出 されたMWは50Kdではなく36.4Kdであり、これはこのタンパク質がSDS-PAGEゲルに おいて異常に移動することを示す。データベースの検索ではZipAと有意に類似す る既知タンパク質はいかなるものも明らかにならなかった。完全なzipA遺伝子を 坦持するＤＮＡ断片は高コピー数ベクターではクローンングすることができなか ったが、ファージＭ13、すなわち低コピー数プラスミドに坦持された場合には維 持することが可能であった。zipA遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）を図 ４に示す。 ZipAタンパク質は抗菌性化合物のスクリーニングの魅力的な基礎を形成するは ずである。これは、１）ZipAは必須であり、十分なZipA活性を欠く細胞は死ぬ; ２）ZipAはFtsZに、これらの２種類のタンパク質が（部分的に）変性している場 合でさえ、結合する（実際、ZipAは、界面活性剤中で煮沸することにより処理さ れた全細胞抽出物のウェスタンブロットの探索に放射標識FtsZを用いたアフィニ ティブロッティング技術により発見された）；３）ZipAの可溶性断片及び誘導体 はFtsZを結合する能力を保持する［すなわち、ZipAタンパク質の一部又は断片は （コーディング領域内の第２PvuI部位での消化により生じるzipA遺伝子の配列を 用いて）可溶性タンパク質として発現することが可能であり（39-328ぺプチドと して定義される、図４を参照）、この部分はFtsZに結合する］；４）HFTK-ZipA は自然のFtsZの他に固定化されたFtsZに結合する；及び５)ZipAの標識誘導体（ すなわち、このタンパク質の一部が緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescent Pro tein)に融合している）はFtsZを結合する能力を保持する、というものを含む幾 つかの理由のためであるが、これらに限定されるものではない。 上述の特徴は、FtsZとZipAとの相互作用する能力を妨害するか又はZipAそれ自 体に結合する化合物についての大規模スクリーニングの設計における高い柔軟性 を明確にするはずである。 抗体 本発明では、これらのスクリーニング検定における抗体の使用が、抗体の使用 を含めて、考慮される、このような抗体は、陽性対照として（すなわち、ZipAと 別のタンパク質の相互作用を妨害する抗体として）、又は他のタンパク質の結合 パートナーとして用いることができる。 ZipA及びFtsZ又はZipA：FtsZ結合複合体（“一次抗体”）のようなタンパク質 に対するこれらの抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよ い。上述の一次抗体に対するあらゆる二次抗体（モノクローナル又はポリクロー ナル）を含めることは本発明の範囲内にある。これらの一次及び二次抗体の両者 を検出検定において用いることが可能であり、あるいは一次抗体を市販の抗−免 疫グロブリン抗体と共に用いることができる。ここで考慮される抗体には、いか なる領域であっても細胞分裂タンパク質に特異的なあらゆる抗体が含まれる。 ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両者はそのタンパク質で免疫するこ とにより入手可能であり、いずれの型も免疫検定に利用可能である。両方の型の 抗体を得る方法は当該技術分野において公知である。ポリクローナル抗体は好ま しさの点では劣るが、適切な実験動物に有効量の精製タンパク質又はそれらの抗 原性部分を注射し、その動物から血清を集め、かつ既知の免疫吸着剤技術のいず れかにより特異的抗体を単離することにより比較的容易に調製することができる 。この方法によって製造された抗体は事実上いかなる型の免疫検定においても用 いることができるが、その産生物の潜在的な異質性のため、一般に好ましさの点 で劣る。 免疫検定におけるモノクローナル抗体の使用は、それらを大量に製造する能力 及びその産生物の同質性のため、特に好ましい。不死細胞系と免疫源の調製に対 して感受性が高められたリンパ球との融合により誘導される、モノクローナル抗 体産生のためのハイブリドーマ細胞系の調製は、当業者に公知の技術によって行 うことができる。（例えば、免疫概諭(Compendium of Immunology),第II巻,Schw artz編，1981のDouillard及びHoffman,ハイブリドーマに関する基本的事実（Bas ic Facts about Hybridomas）；Kohler及びMilstein,Nature 256：495-499,1975 ；European Journal of Immunology ６：511-519,1976を参照）。 ポリクローナル抗体の調製とは異なり、感受性が高められたリンパ球を単離す るための動物の選択はリンパ球と融合することが可能な適切な不死系の利用可能 性に依存する。 マウス及びラットがハイブリドーマ技術において選択される動物であり、これら が好ま しく用いられる。適切な不死化ヒト（もしくは非ヒト）細胞系が利用可能である 場合には、ヒトを感受性が高められたリンパ球の源として利用することもできる 。本発明の目的のため、選択した動物に抗原性量、例えば、約0.1mgないし約20m gのタンパク質又はそれらの抗原性部分を注射することができる。通常、注射す る物質はフロイント完全アジュバント中で乳化する。追加免疫注射が必要となる こともある。抗体産生の検出は、その抗体を適切に標識した抗原で試験すること により行うことができる。リンパ球は、感受性を高めた動物のリンパ節の脾臓を 無菌的に取り出すことにより得ることが可能であり、その後、不死細胞系との融 合の実施に用いられる。あるいは、例えばReading,Journal of Immunological M ethods 53：261-291,1982に記述されるように、リンパ球をインビトロで刺激も しくは免疫することができる。 融合に適する多くの細胞系が開発されており、ハイブリダイゼーションプロト コルのための特定の系の選択は速度、成長の特徴の均一性、成長培地の成分の代 謝の欠損、及び良好な融合頻度の可能性のような多くの基準のうちのいずれか１ つによって導かれる。 種内ハイブリドーマ、特に同様の株の間のハイブリドーマは、種間融合よりも 良好に働く。幾つかの細胞系が利用可能であり、これにはミエローマ免疫グロブ リンを分泌する能力の喪失について選択された突然変異体が含まれる。 細胞融合は、エプスタイン・バーもしくはセンダイウイルスのようなウイルス 、又はポリエチレングリコールのいずれかによって誘発することができる。ポリ エチレングリコール（PEG）は哺乳動物の体細胞の融合に最も有効な作用薬剤で ある。PEG自体は細胞にとって毒性である可能性があり、融合を試みる前に生存 度に対する効果について様々な濃度を試験するべきである。PEGの分子量範囲は1 000ないし6000で変化し得る。PEGを生理食塩水又は血清非含有培地中で約20％な いし約70％（ｗ／ｗ）に希釈した場合に最良の結果が得られる。本発明の場合、 ネズミの細胞を用いて、37℃で約３０秒間PEGに露出することが好ましい。極端 な温度（すなわち、約45℃）は避け、その融合系の各々の成分を融合に先立って 約37℃で予備インキュベートすることが有用であり得る。リンパ球と悪性細胞と の比は脾臓細胞の間での細胞融合を回避するように最適化され、通常、約１：１ ないし約１:10の範囲が用いられる。 うまく融合した細胞は、当該技術分野において公知のいかなる技術によっても ミエローマ系から分離することができる。最も一般的で好ましい方法は、ヒポキ サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）を欠失する悪性 系を選択すること であり、これは、ハイブリドーマの成長のみを可能にし、かつ一般にヒポキサン チン１×10^-4Ｍ、アミノプテリン１×10^-5Ｍ、及びチミジン３×10^-5Ｍを含んで なる、通常HAT培地として知られるアミノプテリン含有培地中で成長しない。融 合混合物はHAT含有培養培地において融合24時間後の直後に成長可能である。培 養スケジュールには、通常、HAT培地における２週間の維持と、その後の通常の 成長培地もしくはヒポキサンチン、チミジン含有培地のいずれかの供給が伴う。 続いて、成長するコロニーを、抗原性の調製品を認識する抗体の存在について 試験する。ハイブリドーマ抗体の検出は、抗原が固体支持体に結合され、かつ推 定上の抗体を含むハイブリドーマ上清と反応することが可能となっている検定を 用いて行うことができる。抗体の存在は、様々な指示薬を用いる“サンドイッチ ”技術によって検出することができる。通常の方法の大部分は、ハイブリッドの 成長の間に分泌される抗体の濃度範囲において用いるのに十分な感度である。 ハイブリッドのクローンングは、細胞が21-23日成長した後に選択培地（例え ば、HAT）中で行うことができる。クローンングは、液相中での細胞の限界希釈 により、又は半固体アガロースにおいて成長する単一の細胞を直接選択すること により行うことができる。限界希釈については、細胞懸濁液を連続的に希釈して 細胞をウェル当たり１個だけにする統計的確率を得る。アガロース技術について は、支持細胞(feeder cell)を含む下層の上の半固体上層にハイブリッドを播種 する。上層のコロニーを取り出し、最終的にウェルに移せばよい。 抗体分泌ハイブリッドは様々な組織培養フラスコにおいて成長させることが可 能であり、それにより様々な濃度の抗体を含む上清が得られる。より高い濃度を 得るため、ハイブリッドを動物に移して炎症性の腹水を得てもよい。抗体含有腹 水は腹腔内注射の８−12日後に回収することができる。この腹水はより高濃度の 抗体を含むが、モノクローナル抗体及びその炎症性の腹水に由来する免疫グロブ リンの両者を含む。その後、例えばアフィニティクロマトグラフィーにより、抗 体の精製を行うことができる。 ここで考慮される細胞分裂タンパク質への結合は、例えばウェスタンブロット 法により細菌のコロニーを試験する半固体成長培地プレートを用いるもののよう な多くの方法で行うことができる。あるいは、そのタンパク質を含むサンプルが 固定化されている他の半固体支持体を用いることもできる。別の方法においては 、タンパク質を含むサンプルを、既に特異的抗体を有する固体支持体に接触させ る。いずれにせよ、検定の背後に ある原理は同じである。米国特許4,016,043号、4,424,279号及び4,018,653号に 見ることができるように広い範囲の免疫検定技術が利用可能であり、これらの特 許は参照することでここに組み込まれる。もちろんこれには、伝統的な競合結合 検定の他に、非競合型の一部位及び二部位,すなわち“サンドイッチ”、検定の 両者が含まれる。 最も有用で一般的に用いられる検定の中にはサンドイッチ検定があり、これは 本発明における使用に好ましい。サンドイッチ検定技術には幾つかの変法が存在 し、それらの全てが本発明によって包含されることが意図される。簡単に述べる と、典型的な先の検定においては、非標識抗体を固体基材に固定化し、試験しよ うとするサンプルをその結合した分子と接触させる。抗体−抗原二次複合体を形 成させるのに十分な期間の適切なインキュベーション期間の後、検出可能な信号 を生成することが可能なレポーター分子で標識した、抗原に特異的な二次抗体を 添加し、抗体−抗原−標識抗体の三元複合体を形成するのに十分な期間インキュ ベートする。あらゆる未反応物質を洗い流し、レポーター分子によって生成され る信号を観察することにより抗原の存在を決定する。これらの結果は、視認可能 な信号の単純な観察による定性的なものであっても、既知量のハプテンを含む対 照サンプルとの比較によって定量化されたものでもよい。先の検定の変法には、 サンプル及び標識抗体の両者を結合した抗体に同時に添加する同時検定が含まれ る。これらの技術は、容易に明らかなマイナーな変法を含めて、当業者に公知で ある。 典型的な先のサンドイッチ検定においては、本発明において考慮される、酵素 もしくはタンパク質又はそれらの抗原性部分に対する特異性を有する第１抗体を 固体表面に共有結合により、又は受動的に結合させる。この固体表面は典型的に はガラス又はポリマーであり、最も一般的に用いられるポリマーはセルロース、 ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニル塩化物又はポリプロ ピレンである。固体支持体は管、ビーズ、マイクロプレートのディスクの形態で あっても、免疫検定を行うのに適する他のいかなる表面であってもよい。結合方 法は当該技術分野において周知であり、一般には、架橋共有結合的に結合させる か、又は物理的に吸着させることからなり、そのポリマー−抗体複合体を試験サ ンプル用の調製品中で洗浄する。その後、試験しようとするサンプルの一定分量 をこの固相複合体に添加し、25℃で抗体中に存在するあらゆるサブユニットの結 合を可能にする期間インキュベートする。このインキュベーション期間は変動す るが、一般には約２-40分の範囲である。このインキュベーション期間の後、抗 体サブユニット固相を洗浄して乾燥させ、ハプテンの一部に特異的な二次抗体と 共にイ ンキュベートする。この二次抗体は、ハプテンへの二次抗体の結合を指示するの に用いられるレポーター分子に結合する。 本明細書において用いられる場合、“レポーター分子”は、その化学的性質か ら、抗原結合抗体の検出を可能にする分析上同定可能な信号をもたらす分子を意 味する。検出は定性的なものであっても、定量的なものであってもよい。この型 の検定において最も一般的に用いられるレポーター分子は、酵素、蛍光体、発光 分子又は放射性核種含有分子（すなわち、放射性同位体）のいずれかである。 酵素免疫検定の場合、一般にはグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸塩により、 酵素を二次抗体に結合させる。しかしながら、容易に認識されるように様々な異 なる結合技術が存在し、それらは熟練者が容易に利用可能である。一般的に用い られる酵素には、とりわけ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキ シダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼが含まれる。特定 の酵素と共に用いられる基質は、一般に、対応する酵素による加水分解の際の検 出可能な色の変化の生成について選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルリン 酸塩はアルカリホスファターゼ結合体との使用に適する；ペルオキシダーゼ結合 体については、１，２−フェニレンジアミン、５−アミノサリチル酸、又はトル イジンが通常用いられる。蛍光生成性基質を用いることも可能であり、これは上 述の色素生成性基質とは異なって蛍光性産生物を生じる。全ての場合において、 酵素標識抗体を第１抗体ハプテン複合体に添加し、結合させた後、過剰の試薬を 洗い流す。次に、この抗体−抗原−抗体の三元複合体に適切な基質を含む溶液を 添加する。この基質は第２抗体に結合する酵素と反応して定量的な可視信号を生 じ、これは、通常は分光光学的に、さらに定量化してサンプル中に存在するハプ テンの量の指標を得ることができる。“レポーター分子”は、細胞凝集の使用又 はラテックスビーズ上の赤血球のような凝集の阻害にまで拡張することもできる 。 あるいは、フルオレセイン及びローダミンのような蛍光性化合物を、抗体の結 合能を変化させることなく抗体に化学的に結合させることができる。特定波長の 光で照射することにより活性化すると、蛍光色素標識抗体はその光エネルギーを 吸収し、それによリその分子において励起状態が誘発され、続いて光学顕微鏡を 用いて目視で検出可能な特徴的な色で光が放射される。EIAと同様に、蛍光標識 抗体は第１抗体−ハプテン複合体に結合させる。未結合試薬を洗い落とした後、 残留する三元複合体を適切な波長の光に晒し、観察される蛍光が関心のあるハプ テンの存在を示す。免疫蛍光及びEIA技術は両 者とも当該技術分野において十分確立されており、本発明に特に好ましい。しか しながら、放射性同位体、化学発光もしくは生物発光分子のような他のレポータ ー分子も用いることができる。必要とされる目的に適応させるためにその手順を どのように変化させるのかは熟練技術者には容易に明らかであろう。 類似体及び相同体 本発明では、類似体、特にはZipA及びFtsZタンパク質類似体の使用が考慮され る。このような類似体は、構造的に修飾されてはいるものの、［例えば、親（非 誘導体化）分子とは異なる親和性でではあるものの、ここに記述される（例えば 、放射標識を用いて毎分のカウントを測定する）検定条件下において、検出可能 な結合、すなわち、陰性対照のバックグランド結合を約２倍(より好ましくは約 ５倍)上回る結合を示し続ける］類似する様式で作用するように観察される誘導 体として定義される。類似する様式で作用しないタンパク質は“非ZipA”及び／ 又は“非FtsZ”タンパク質である。タンパク質類似体は、zipA及び／又はftsZ遺 伝子をコードするヌクレオチド配列を（例えば、置換、欠失等により）修飾する ことにより作製することができる。あるいは、本発明では、化学的手段（又はｍ ＲＮＡのインビトロ翻訳）によるもののようなインビトロでのポリペプチドの合 成によって生じた類似体の使用が考慮される。 また、本発明では相同体の使用も考慮され、これは、グラム陽性種及びグラム 陰性種を含む他の種におけるZipA及びFtsZに相当するタンパク質として定義され る。態様の１つにおいて、本発明ではインフルエンザ菌(Haemophilus influenza e)Rdに由来する相同タンパク質の使用が考慮され、この菌はその唯一の天然宿主 がヒトである小さな非運動性グラム陰性菌である。６種類のＨ．インフルエンザ 血清型株（aないしf）が免疫学的に異なる莢膜多糖抗原に基づいて同定されてい る。型を決定することができない株も存在し、これらは検出可能な多糖を欠くこ とで区別される。これらは子供及び成人の上部呼吸器粘膜の共生常在菌であり、 主として子供において中耳炎及び気道感染を引き起こす。より重い侵襲性感染が ほぼ排他的にｂ型株によって引き起こされ、冒された子供の50％までに神経学的 後遺症を生じる髄膜炎が伴う。 インフルエンザRdのゲノムサイズは細菌の中で典型的なものである。より具体 的には、Ｈ．インフルエンザRdのゲノムは1,830,137bpの環状染色体である。総 Ｇ＋Ｃヌクレオチド含有率は約38％(Ａ、31％；Ｃ、19％；Ｇ、19％；Ｔ、31％) である。Ｇ＋ Ｃに富む領域は６つのｒＲＮＡオペロン及び潜在的なmu様プロファージに相当す る。バクテリオファージmuによってコードされるタンパク質に類似する幾つかの タンパク質の遺伝子が、この遺伝子の約1.56ないし1.59Mbpの位置に存在する。 このゲノムの領域は、Ｈ．インフルエンザの平均よりもＧ＋Ｃ含有率が著しく高 い（ゲノム全体の〜38％と比較して〜50％のＧ＋Ｃパーセント）。 大腸菌における最小複製基点(oriC)は、一端（ＤＮＡ巻き戻しの開始部位）で は13bpの反復の３つのコピーで、かつ他端では9bpの反復の４つのコピーで決定 される245bpの領域である。この３つの13bpの反復及び４つの9bpの反復に類似す る構造を有する約280bpの配列がＨ．インフルエンザRdにおける推定複製基点を 決定する。この領域は、リボソームオペロンrrnF、rrnE、rrnDとrrnA、rrnB、rr nCとの組の間に横たわる。この２つのリボソームオペロンの群は反対の方向に転 写され、起点の配置はそれらの転写の極性と一致する。 大腸菌の複製の終止は中間点のいずれかの側の〜100kbに位置する２つの23bp の終止配列によって印付けられ、そこでその２つの複製分岐が出会う。この大腸 菌終止配列と10bpのコア配列を共有する２つの潜在的な終止配列がＨ．インフル エンザにおいて同定されている。これらの２つの領域は、提案されるＨ．インフ ルエンザ複製起点の約180゜反対の点から約100kbずれている。 Ｈ．インフルエンザにおいてZipAをコードする相同遺伝子は（大腸菌と同様に ）ＤＮＡリガーゼ遺伝子に隣接して位置する。図５には、大腸菌に由来するZipA タンパク質のアミノ酸配列（一番上の配列）がＨ．インフルエンザに由来する相 同体（一番下の配列）（配列番号３）と整列されて示されている。図５に示され る整列は、ベストフィット(Bestfit)プログラム（BLASTネットワーク・サービー (Network Servie)、国立生物工学情報センター(National Center for Biotechno logy Information)）を用いて作成した。これらの２つの配列の最大整列を得る ために間隙を導入した（鎖内の点が間隙を示す）。これらの２つの配列の間の垂 直線は同一領域を示す。二重の点は保存的置換を示し、これに対して鎖間の単一 の点は保存性に劣る置換を示す。 著しい相同性を有する幾つかの領域が存在し、これらにはILIIVG（配列番号４ ）；DLX（Ｒ又はＮ）Ｘ（Ｌ又はＴ）ILIIVG（配列番号５）；ILIIVGX（Ａ又はＩ ）Ｘ（Ｉ又はＶ)AX（Ｉ又はＬ）Ｘ（Ｉ又はＶ）AL（配列番号６）；ILIIVGX（Ａ 又はＩ）Ｘ（Ｉ又はＶ）AX（Ｉ又はＬ）Ｘ（Ｉ又はＶ）ALX（Ｉ又はＬ）VHG（配 列番号７）；ALX（Ｉ又はＬ） VHG（配列番号８）；ＡＬＸ（Ｉ又はＬ）VHGX（Ｆ又はＬ）Ｗ（配列番号９）；Y HRHL（配列番号１０）；PX（Ａ又はＶ）LFSX（Ｌ又はＶ）AN（配列番号11)；PGT F（配列番号12）；Ｘ（Ｉ又はＬ）FMQ（配列番号１３）；Ｘ（Ｉ又はＬ）FMQX（ Ｖ又はＬ）PS（配列番号１４）が含まれるがこれらに限定されるものではない。 本発明では、これらの相同領域の１以上を有するZipAタンパク質相同体が考慮さ れる。 発明の詳細な説明 発明の詳細な説明は５つの主要な項：I)遺伝子の単離及びプラスミドの構築;I I)タンパク質の発現及び精製；III)タンパク質の標識；IV)他のタンパク質への 結合；及びＶ)抗菌剤のスクリーニングに分けられる。 Ｉ．遺伝子の単離及びプラスミドの構築 大腸菌zipA遺伝子の単離及びこのzipA遺伝子を含むプラスミドの構築を、Samb rookら,分子クローニング、実験マニュアル(Molecular Cloning,A Laboratory M anual),第２版，(Cold Spring Harbor Press,NY 1989)に一般的に記述される通 りに行った。zipA遺伝子を発現クローンングにより単離した［図６に模式的に示 される；図６は、標識FtsZ融合タンパク質を発現ライブラリーの探索に用いてFt sZに結合するタンパク質を発現する組換えクローンを同定することができる（“ 発現ライブラリー”)他に、ウェスタンブロットの探索に用いてFtsZに結合する 、電気泳動によって分離されるタンパク質種を同定することができる（“ファー ウェスタン（Far Western）”)ことを示す］。簡単に述べると、λgt11ライブラ リーを大腸菌PB103株の染色体ＤＮＡから作製した。プラークをニトロセルロー スフィルターにのせ、³²Ｐ標識HKFT-FtsZで探索してZipAを発現することが可能 なクローンを同定した(HKFT-FtsZの発現、精製及び標識は以下に説明する）。合 計７つの組換えファージが同定され、その全てが完全なzipA遺伝子を含む７−10 kbの大腸菌ＤＮＡを含んでいた。zipA遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１に 記載されており、ZipAタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に記載されている 。 図７には、これらの組換えファージクローン上に存在するzipA遺伝子を含む大 腸菌ゲノムの一部が示されている。図７の最上部に示されるように、zipA遺伝子 はcysZ遺伝子とlig遺伝子との間に位置し、後者はＤＮＡリガーゼをコードする 。図７において は、以下の略語が用いられる：Ｂ（BamHI）、Pv（PvuI）、Ag（AgeI）、Ｐ（Pst I）、Af（AflII）、Ｈ（HindIII）。矢印の下の大きなＰはcysZ、zipA又はlig遺 伝子のいずれかの発現を駆動するプロモーターの位置を示し；矢印の頭の方向は 転写の方向を示す。完全なzipA遺伝子の他にcysZ及びlig遺伝子の一部を含む、 図７の最上部に示されるBamHI及びHindIII部位の間に見出されるＤＮＡ配列が配 列番号１に記載され、かつ図１に示される。zipA配列を含む幾つかのプラスミド 構築体が図７に模式的に示される（zipA配列を含む配列のみが図示される；すな わち、プラスミド主鎖は図示されない）。pDB315は、zipA遺伝子全体及びcysZ及 びlig遺伝子の一部を含む1727bpのBamHI−HindIII断片を含む；このBamHI-HindI II断片は７つのλgt11クローンのうちの１つから単離されたものである。pDB315 の生成及び残りのプラスミドは以下で論じられる。 細菌細胞におけるZipAタンパク質の過剰発現を可能にするため、T7プロモータ ーの制御の下でZipAの発現を可能にするpET21bベクターに完全なzipA ORFを挿入 した；得られたプラスミドをpDB319と命名した。pDB319の構築及びZipAタンパク 質の断片をコードする幾つかのプラスミドは以下に記載される。加えて、本発明 のスクリーニング方法において用いられる融合タンパク質をコードするベクター の構築も記述される。 a）ZipAタンパク質及びそれらの断片をコードするベクターの構築 プラスミドpDB319及びpDB322は、それぞれT7又はlacプロモーターの転写制御 の下で完全なzipA遺伝子を発現する。pDB319及びpDB322を構築するため、zipAを 、zipAの翻訳開始コドン（下線）にNdel部位を導入するように設計されたプライ マー５’−ACAGAGATCCATATGATGCAGGATTTGCGTCTG−３’（配列番号１５）及び5’ −TTAACCAAGCTTAAGTGTATCAGGCGTTGG−３’（配列番号１６）を用いてPCRにより 増幅した。大腸菌PB103株から単離した染色体ＤＮＡをテンプレートとして用い た。1018bpのPCR産生物をHindIII及びNdeIで処理し、生じた986bpの断片をHindI II及びNdeIで消化したpET21a（ノバジェン（Novagen））にライゲートして、PDB 317を得た。 次に、pDB317の676bpのAgeI-HindIII断片をpDB315の1015bpのAgeI-HindIII断 片（以下で記述）で置換し、pDB318を得た。pDB319を得るため、pDB318を AflII及びHindIII、クレノウ酵素に加えてデオキシヌクレオチド、及びリガーゼ で連続的に処理し、それにより全てのlig配列を除去してHindIII部位を保持した 。プラスミドpDB319はT7プロモーターの制御の下で完全なZipAタンパク質をコー ドする。zipAの発現をlacプロモーターの制御の下に置くため、pDB319の1089Bgl II-HindIII断片をBamHI-HindIII消化pMLB1113にライゲートし、pDB322を得た［ このpMLBプラスミドはpBR322から誘導され、一方の側でlacl遺伝子、lacプロモ ーター及びオペレーター、並びにlacZリボソーム結合部位及び翻訳開始コドンが 隣接し、かつ他方の側で残りのlacZ遺伝子及びlacYの一部が隣接するポリリンカ ー領域を坦持する；また、このプラスミドはアンピシリン耐性のためのβ−ラク タマーゼ遺伝子も含む］。 ZipAの断片をコードするプラスミドを以下の通りに構築した。pDB315及びpDB3 1６については、まずλgt11誘導λCH1−1A（zipAf）（すなわち、元のλgt11ク ローンの１つ）に由来する1727bpのBamHI-HindIII断片をM13mp19（ファルマシア （Pharmacia））に挿入し、M13mp19H-B1.7を得た。M13mp19H-B1.7ＤＮＡをPstI で消化することによりzipA内に338bpの欠失を作製し、この大断片を再環化してM 13mp19H-B1.7ΔPstIを得た。次に、２つのファージに由来する1727bp及び1389bp のBamHI-HindIII断片をpMAK700［このベクターは、染色体内のzipA遺伝子をノッ クアウトすることができるように選択した；pMAK700はpSC101誘導体であるが、 このプラスミドを複製について温度感受性にするrepAts対立遺伝子をクロラムフ ェニコール耐性マーカーの他に含む］にクローンングし、それぞれ、［完全なzi pA遺伝子を含む］pDB315（zipA⁺）及び［同じではあるがzipA内部の330bpのPstI 断片が欠失している（このため、zipA−）断片を含む］pDB316（zipA^-）を得た 。 b）ZipA／GFP融合タンパク質をコードするプラスミドの構築 本発明では、スクリーニング方法において有用なタンパク質の“融合標識”が 考慮される。態様の１つにおいて、本発明では、ZipA（又はそれらの一部）及び クラゲ、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victoria）に由来する緑色蛍光タ ンパク質(GFP)を含む融合タンパク質が考慮される。GFPは緑色光（約510nm）を 放射する。他の生物発光レポーターとは異なり、GFPは他のタンパク質、基質、 又は補因子のいかなるものも存在しない状態で蛍光を発する。 精製GFPは238アミノ酸からなる27kDaの単量体である。蛍光には完全なGFPが 必要であるが、活性発色団は環化Ser−デヒドロTyr−Gly三量体を含むヘキサペ プチドである。発色団の形成は酸素依存性であり、翻訳後に徐々に生じる。 GFP含有ベクターはクローンテック・ラボラトリーズ社（Clontech Laboratori es,Inc.）（パロアルト、CA）（以下“クローンテック”）から商業的に入手可 能である。pGFP（クローンテック）がGFP ｃＤＮＡの源として第１に意図され、 これは、gftコーディング配列に隣接する２つの多クローンング配列(MCS)内の制 限酵素部位を用いて容易に切り取ることができる。あるいは、GFPコーディング 配列は、GFP遺伝子を含むあらゆるプラスミドからPCRにより単純に増幅すること ができる。pGFP−１（クローンテック）は、プロモーターのないGFP遺伝子の上 流のMCSにクローンングされたプロモーターの活性を観察するための可変性転写 レポーターベクターである。GFP開始コドン周辺の配列は、真核細胞における翻 訳効率を高めるため、コザック(Kozak)コンセンサス翻訳開始部位に変換されて いる。また、このベクターは、形質転換細菌及び真核細胞を選別するためのネオ マイシン／カナマイシン耐性カセットも含む。pGFP−N1は、GFPのＮ−末端への 異種タンパク質の融合に有用である３種類のベクターのうちの１つである。pGFP −N1 pGFP−N2、及びpGFP−N3では同じMCSが異なるリーディングフレーム内に存 在する。これらの構築体は、17の制限部位のうちのいずれか１つを、関心のある 遺伝子内の通常の制限部位へのインフレーム融合体の創出に用いることを可能に する。同様に、pGFP−C1 pGFP-C2、及びpGFP-C3（クローンテック）を、GFPのＣ −末端へのインフレーム融合体の創出に用いることができる。６種類のGFPタン パク質融合ベクターの全ては、コザックコンセンサス配列、哺乳動物細胞におい て融合体を発現させるためのサイトメガロウイルス(CMV)の即時型プロモーター 、及びネオマイシン／カナマイシン耐性カセットを含む。 （図７に模式的に示される）プラスミドpDB341及びpCH50はZipA／GFP融合タン パク質をコードする。pDB341及びpCH50については、用いられる下流プライマー が５’−AAGTCTCGAGGGCGTTGGC GTCTTTGAC−３’（配列番号１７）を用いたこと を除いて上記と同様のPCRによりzipAを増幅した。このプライマーは翻訳停止コ ドンをXhoI部位（下線）で置換するように設計された。そのPCR産生物をNdeI及 びXhoIで処理し、その984bpの断片をNdeI及びXhoIで消化したpET21bにライゲート してpCH38を得た。プラスミドpGFPS65Tは、65位のセリンをトレオニンで置換す ることによりpGFPから誘導された突然変異体である；このプラスミドはベクター pRS ET B（ウィスコンシン州マディスンのインビトロジェン（インビトロgen）から 商業的に入手可能）中の729bpのBamHI断片上にgfpS65Tを含む。この断片をBamHI 消化pET16bにライゲートし、gfpコーディング配列のすぐ上流にXhoI部位を有す るプラスミドpDB338を得た。次に、pDB338の小ApaI-XhoI断片をpCH38のもので置 換し、pDB341［PT7：：ZipA-GfpS65T］を得た。このプラスミドは64.2kdのZipA −GfpS65T融合タンパク質をコードし、これは小リンカーペプチド(LEDPPAEF)（ 配列番号18）によって融合する完全なZipA及びGfpタンパク質を含む。この融合 体の発現をlacプロモーターの制御の下に置くため、次に、pDB341の〜2180bpのB gIII−HindIII断片をpMLB1113のBamHI及びHindIII部位に挿入し、pCH50［Ｐ_lac ：：ZipA−GfpS65T］を得た。 c）MinE及びFtsZ融合タンパク質をコードするプラスミドの構築 MinE及びFtsZタンパク質を含む融合タンパク質をコードするプラスミドを構築 し、本発明の方法においてそれぞれ陰性及び陽性対照を提供するのに用いられる これらのタンパク質の過剰発現を可能にした。MinEタンパク質はZipAタンパク質 とは相互作用しないため、陰性対照として有用である。対照的に、FtsZタンパク 質はZipAタンパク質と相互作用し、陽性対照として有用である。 i）MinE融合タンパク質をコードするプラスミド pDB311は、T7プロモーターの制御の下で、MinEのＮ−末端の４つのアミノ酸が HFKTのペプチドMGHHHHHHHHHHSSGHIEGRHMDYKDDDDKARRASVEFHMASMTGGQQMGRGS（配 列番号１９）で置換されている15.9kDのHFKT-MinE融合タンパク質をコードする 。プラスミドpDB311を構築するため、pDB151をTaqI、クレノウ酵素に加えてデオ キシヌクレオチド、及びEcoRIで連続的に処理した。MinEの最初の４つのアミノ 酸を除く全てをコードする307bpの断片を、BamHI、クレノウ酵素に加えてデオキ シヌクレオチド、及びEcoRIで連続的に処理されているpET21a（ノバジェン）に ライゲートした。これにより、BamHI部位は期待通りに回復したがEcoRI部位が予 想外に破壊されたpDB302が生じた。プラスミドpDB302は、このベクターのT7プロ モーターの制御の下で、MinEのＮ−末端の４つのアミノ酸がT7タグペプチドMASM TGGQQMG RGS（配列番号20）で置換されたT7タグ−MinE（T-Min E）融合タンパク質をコードする。 pDB302の1037bpのApaI-NdeI断片をpET16b（ノバジェン）の1099bpのApaI−Nde I断片で置換した。得られたプラスミドpDR1は、His−タグペプチドMGHHHHHHHHHH SSGHIE GRH（配列番号21）がT-MinEタンパク質のＮ−末端に融合した融合タンパ ク質HT-MinEをコードする。プラスミドpAR(ΔRI)59／60［一般には、M.A.Blanar 及びW.J.Rutter，“相互作用クローンング：cFosと相互作用するヘリックス−ル ープ−へリックスジッパータンパク質の同定（Interaction Cloning:Identifica tion of a hehx-loop-helix Zipper Protein that Interacts with cFos”,Scie nce 256:1014(1992)を参照］は、ペプチドMDYKDDDD KARRASVEF（配列番号22）を コードする54bpのNdeI断片を含む。FKと表示されるこのペプチドは心筋キナーゼ 基質ぺプチド（下線）を含むフラグ(Flag)ペプチド(IBI)の融合体である。NdeI カセットの操作を容易にするため、pUC4-KIXX（ファルマシア）から単離され、 かつTn5 aph(neo)遺伝子を坦持する〜1800bpのEcoRI断片を、Ndel部位が隣接す るpAR(ΔRI)59／60のEcoRI部位に挿入した。次に、生じたプラスミドpTD1の〜18 50bpのNdeI断片をpDR1のNdeI部位に挿入してpDB309を得た。最後に、EcoRIで処 理して再ライゲートすることによる〜1800bpのTn5スタファー断片（stuffer-fra gment）の欠失によりpDB311を得た。 ii）FtsZ融合タンパク質をコードするプラスミド プラスミドpDR10は、ぺプチドMGHHHHHHHHHHSSGHIEGRHMDYKDDDDKARRASVEFHMASM TGG QQMGRGSH（配列番号２３）が完全なFtsZタンパク質に融合する46.6kDのHFKT -FtsZ融合タンパク質をコードする。 プラスミドpDR10を構築するため、大腸菌PB103株に由来する染色体DＮＡ［一 般には、P.A.J.de Boerら，“大腸菌における分裂部位の正しい配置に関与する 複合遺伝子座minBの単離及び特性（Isolation and Properties of minB,a Compl ex GeneticLocus Involved in Correct Placement of the Division Site in Es cherichia coli）”J.Bacteriol.170：2106(1988)を参照］をfTtsZを増幅するPC Rにおけるテンプレートとして用いた。ftsZの翻訳開始コドン（下線）の近傍にB amHI部位を導入するため、プライマー［５’−GGAGGATCCCATATGTTTGAACCAATGGAA C−３’（配列番号24）及び５’−TTCGGTCGACTCTTAATCAGCTTGCTTACG−３’（配 列番 号25）］を設計した。生じた1176bpのPCR産生物をBamHI及びSalIで処理して1163 bpの断片を得、これを、pDB311に由来する、全てのminE配列を含む320bpのBamHI -SaII断片の置換に用いた。生じたプラスミドをpDR10と命名した。 II．タンパク質の発現及び精製 MinE及びFtsZ融合タンパク質（いずれもHFKTペプチドを含む）を以下のように 大腸菌において発現させて精製した。HMS174(DE3)／pLysS株（ノバジェン）をpD R10又はpDB311のいずれかで形質転換した。pDR10［PT7：：hfkt-ftsZ］又はpDB3 11［PT7：：hfkt-minE］のいずれかを含むHMS174(DE3)／pLysSを、アンピシリン (100μg/ml)、クロラムフェニコール(25μg/ml)及びグルコース(0.2％)を含むLB 培地中37℃で一晩振盪して増殖させた。培養物を50μg/mlアンピシリン及び0.04 ％グルコースを含む500mlのLBで200×に希釈した。約0.5のOD₆₀₀で、IPTG（イソ プロピル−β−チオガラクトシド）を0.84mMまで添加し、増殖を90分間継続させ た。遠心(5000×g)によって細胞を集め、20mlの冷生理食塩水0.9％NaClで１回洗 浄した。ペレットをドライアイス／アセトン浴において急速に凍結させ、−85℃ で保存した。細胞を37℃で急速に解凍し、5.0mlの冷バッファーＡ(20mMトリスCl 70mM NaCl、 50mMイミダゾール、pH7.9）に再懸濁させた。さらに３回の急速凍結 （ドライアイス／アセトン浴）及び解凍（37℃水浴）のサイクルにより、細胞の 溶解を誘発した。 この溶解物を簡単に超音波処理して粘性を低下させ、200,000×gで３時間、８ ℃で遠心することにより不溶性物質を除去した。上清の一部（50mg総タンパク質 ）を、それ以前にNiSO₄が充填され、かつバッファーＡで平衡化されている0.5ml のファースト・フロー・キレーティング・セファロース（Fast Flow Chelating Sepharose）（ファルマシア）カラムに３回通過させた。このカラムを、1.5mlの バッファーＢ（20mMトリス−Cl，500mM NaCl、 50mMイミダゾール、pH7.9）で３ 回、1.0mlのバッファーＣ（20mMトリス-Cl、 500mM NaCl、 200mMイミダゾール、p H7.9）で３回洗浄した。 次に、HFKT−タグ付けタンパク質を３×1.0mlのバッファーＤ（20mMトリス−Cl、 ５00mM NaCl、 500mMイミダゾール、pH7.9）で溶出した。（SDS PAGEによって決 定される）適切な画分をプールしてバッファーＥ（20mMトリス-Cl，25mM NaCl、2 mM EDTA、pH8.0）に対して広範に透析し、セントリコン(Centricon)10装置（ア ミコン（Amicon））で濃縮して−85℃で保存した。このHFTK−タグ付けタンパク 質は、SDS-PAGE及びクーマシーブリリアントブルー染色（約２５マイクログラム のタンパク質を12％アクリルアミドゲルにかけた）による判定で95％を上回る純 度であるものと見積もられた。 III．タンパク質の標識 精製したHFKT−タグ付けタンパク質を［γ³²Ｐ］ATP及びウシ心筋キナーゼの 触媒性サブユニット（シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）、セントルイ ス、Mo）と共にインキュベートすることによりインビトロでリン酸化した。反応 (30μl)は氷上で45分間行い、これはHMKバッファー（20mMトリス−Cl．100mM Na Cl、12mM MgCl₂、1mM DTT、pH7.5）、300-600ピコモル(９-15μg)の精製HFKT−タ グ付けタンパク質、60μCi［γ-³²P］ATP（6000Ci／ミリモル）、及び1μlのキ ナーゼ（40mM DTT中10U/μl）を含んでいた。タンパク質を他の反応成分から分 離するため、20μlのバッファーＺ（25mM HEPES-KOH、100mM KCL、 12mM MgCl₂、 1mM DTT、10％グリセロール、pH7.7）を添加し、この混合物を、それ以前に1mg/m l BSA（ウシ血清アルブミン）を含むバッファーＺ 5.0ml及びBSAを含まないバッ ファーＺ5.0mlでそれぞれ洗浄した2.0mlクウィクセプ・エクスセルロース（Kwik sep Excellulose）脱塩カラム（ピアス（Pierce））にかけた。50μlの画分ずつ 分取し、一定分量をシンチレーションカウント法による放射能の決定に用いた。 所望の放射標識種の存在及び完全性を可視化するため、一定分量をSDS-PAGEゲル で電気泳動した後、乾燥したゲルのオートラジオグラフ処理を行った。ピーク画 分をプールし、さらに使用するまで氷上に保持した。得られた典型的な比活性は 1.5ないし4.0×10⁶cpm／μg HFKT−MinE及び5.0ないし8.0×10⁶cpm／μg HFKT-F tsZであった。 IV．結合検定における固定化融合タンパク質の使用 アフィニティブロッティング １容積の電気泳動サンプルバッファーリスCL 4％SDS、20％グリセロール、1.4 Mβ−メルカプトエタノール、pH=6.6）を添加した後、サンプル（例えば、サン プルバッファー中で煮沸した全細胞、又は分画した細胞）を沸騰水浴に５分間保 持し、0.75mm厚の10％T/2.7％Cゲルでの通常のSDS-PAGEに供した。ニトロセルロ ー スフィルター(0.2μ)への電気泳動的転写を、ゲニー・ブロッター(Genie blotte r)（アイディア・サイエンティフィック社（Idea Scientific Co.））において 、通常のタウビン（Towbin）バッファー（25mMトリスCl、 192mMグリシン、20％ メタノール、pH8.3）を用いて12Ｖで30分間行った。転写を監視し、分子量標準 を可視化するため、フィルターを可逆的染料ポンソーＳ（5％酢酸中0.1％）で１ 分間処理した。次に、フィルターを10mMトリス−Cl中で脱染し、水ですすいで、 空気中で15分間乾燥させた。 フィルターをHBBバッファー（25mM HEPES-KOH、25mM NaCl、 5mM MgCl₂、1mM DTT、 pH7.7）で湿らせ、５％脱脂粉乳及び0.05％NP-40を含むHBBにおいて60分間、並 びに１％脱脂粉乳及び0.02％NP-40を含むHBBにおいて30分間ブロックした。次に 、これらを、275,000cpm／mlで標識したタンパク質と共に、Hybバッファー（20m M HEPES-KOH、50mM KCL、 0.1mM EDTA、2.5mM MgCl₂、0.1mM ATP、1％脱脂粉乳、 0.02％NP-40、1mM DTT、pH7.7）中で一晩インキュベートし、標識タンパク質を含 まないHybバッファーにおいてそれぞれ７、５、及び２分間の３回洗浄した。全 てのブロッキング、インキュベーション、及び洗浄工程は４℃で行った。フィル ターを風乾し、Ｘ−線フィルムを露光することにより、又はアンビス・ホスファ ーイメージャー（Ambis phosphorimager）で放射能を定量的に画像処理すること により分析した。 ZipAの膜局在化 膜タンパク質の界面活性剤可溶化については、PB103株の一晩培養物を１リッ トルのLB培地で200×に希釈し、OD₆₀₀が1.0に到達するまでインキュベートした 。細胞を遠心により集め、冷生理食塩水で１回洗浄し、9.0mlの冷細胞破壊バッ ファー（CBBは20mMトリス-Cl、 25mM NaCl，5mM EDTA、3.6mMβ−メルカプトエタ ノール、pH8.0）に再懸濁させ、フレンチ圧力セルを３回通過させた後粘性を低 下させるために非常に簡単に超音波処理して破壊した。この加圧体（pressate） を200,000×gで３時間、8℃での遠心に処し、上清（S200）を除去してぺレット 画分（P200）を2.0mlのCBBに再懸濁した。その一定分量（0.1ml、タンパク質5.4 mg）をCBB単独、又は6M尿素、0.5％トリトン−Ｘ100、又は0.2％サルコシル（最 終濃度）を含むCBBのいずれか0.5mlにとり、その混合物を室温でヘッド・オーバ ー・ヘッド・ミキサー（head over head mixer）において１時間インキュベート した。遠心(200,000×g、１時間、４℃)に より可溶性物質を不溶性物質から分離し、後者を超音波処理（設定２、約20秒、 氷上）により0.5mlのCBB中にホモジナイズして各々の等しいサンプルをSDS-PAGE 及びアフィニティブロッティングに用いた。 粗製膜調製品を異なる膜成分にするのを容易にするため、Ishidateらの手順を 以下のように改変した。簡単に述べると、PB103株の対数増殖培養物(500mlLB)か らの細胞を1.0の0D₆₀₀で遠心により回収し、冷生理食塩水で洗浄して10mlの20％ ショ糖（全てのショ糖溶液はｗ／ｗで10mM Hepes-KOH、pH7.4中に調製した）並 びに各々10μg／mlのＤＮＡ分解酵素及びＲＮＡ分解酵素に再懸濁した。細胞を 、フレンチ圧力セル(10,000psi)に３回通過させた後EDTAを5mMまで添加すること により破壊した。粗製膜調製品を得るため、1.7mlの加圧体を、0.8mlの60％ショ 糖クッションの最上部に2.5mlの25％ショ糖を積層することにより調製した２つ の勾配（SG0）の各々にのせた。これらの勾配を、SW50.1ローターにおいて、37, 000×gで４時間、４℃で回転させた。粗製膜をシリンジの助けを借りてクッショ ンから回収し、10mM HEPES-KOH（pH7.4）で1.3650の屈折率及び1.7mlの体積まで 希釈し、60％(0.5ml)、55％（1.0ml）、50％(2.1ml)、45％(2.1ml)、40％(2.1ml )、35％(1.5ml)、及び30％(1.0ml)ショ糖溶液を積層することにより調製した沈 降ショ糖勾配（SG1）の頂部にのせた。SW41ローターにおいて39,000×gで20時間 、４℃で遠心した後、管の底部から画分（0.33ml）を集めた。各々の画分につい てタンパク質濃度及び屈折率を決定し、ISCO表（第９版）を用いて後者を対応す る比重値に変換した。適切な画分をプールし、各々のプールを10mM HEPES-KOH(p H7.4)及び粉末化ショ糖を添加することにより2.0mlの体積及び1.4285の屈折率に 調整した。各々のプールから0.2mlを保存し、残りを、底部から頂部に向けて67 ％(0.5ml)、プールしたサンプル、50％(1.8ml)、45％(3.0ml)、40％(2.0ml)、35 ％(1.0ml)、及び30％ショ糖からなる浮上分離ショ糖勾配(SG2)に組み込んだ。SW 41ローターにおいて36,000×gで72時間、４℃で遠心した後、画分（0.30ml）を 集めて上述の通りに分析し、次いで適切な画分をプールした。これらのプールし た画分に加えてSG1からのプールした画分の残りを、CBBを10mlの体積にまで添加 することにより10％未満のショ糖濃度に調整した。SW50.1ローターにおいて38,0 00×gで２時間、４℃で遠心することにより膜を集め、0.1mlのCBＢに再懸濁した 。続いて、一定分量を、上述の通りにSDS-PAGE及びアフィニティブロッティング に処した。 これらの結果（示さず）は以下のように要約することができる。第１に、ZipA は、ショ糖勾配中での沈降及び浮上分離の両者の間に細胞の内膜画分と共に同時 分画される。これは、ZipAが内膜と実際に会合することを示す。第２に、ZipAは 界面活性剤で可溶化することは可能であるが、尿素では可溶化することができな い。これは、ZipAが必須膜タンパク質である（すなわち、膜を横断する）ことを 示す。 酵母ツーハイブリッド系 本発明では細胞を含まないスクリーニング検定が考慮されるが、細胞性スクリ ーニング検定もまた考慮される。酵母ツーハイブリッド系（クローンテックから 商業的に入手可能）では酵母におけるタンパク質−タンパク質相互作用の検出が 考慮される。一般には、Ausubelら,分子生物学における現在のプロトコル（Curr ent Protocols in Molecular Biology）（John Wileyt ＆ Sons）（13.14.1−13 .14.14頁）を参照。この系は、標的タンパク質（例えZipAもしくはFtsZタンパク 質又はそれらの断片）と相互作用するタンパク質について特別に構築されたｃＤ ＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。本発明では、 ZipAタンパク質又はFtsZタンパク質のいずれかに結合する化合物についてのスク リーニングへのこのツーハイブリッド系の使用が考慮される。FtsZタンパク質に 結合し、かつZipAタンパク質ではない、ツーハイブリッドスクリーニングにおい て同定される化合物（例えば、タンパク質）は、ZipAタンパク質とFtsZタンパク 質との相互作用を遮断することが可能な化合物を表し得る。同様に、ZipAタンパ ク質に結合し、FtsZタンパク質ではない化合物は、ZipAとFtsZとの相互作用を遮 断することが可能な化合物を表し得る。 上記から、本発明が抗菌活性について多数の試験化合物をスクリーニングする ための化合物及び方法を提供することが明らかであるはずである。細菌性タンパ ク質をインビトロで化合物の検出に用いることにより、細胞を含まないスクリー ニング系が本発明で考慮される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/245 Ｃ０７Ｋ 14/245 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/25 Ｃ１２Ｑ 1/25 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｑ 1/25 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 化合物をスクリーニングするための方法であって、 a）i）試験化合物、ii）少なくともzipA遺伝子の一部を含むオリゴヌクレオチ ドによってコードされる第１タンパク質、iii）該第１タンパク質に結合するこ とが可能な第２タンパク質、及びiv）該結合を検出するための手段を提供し； b）該第１及び第２タンパク質を該試験化合物の存在下において混合し；かつ c）該結合を検出するための手段を用いて結合を検出する、 ことを包含する方法。 ２. 記第１タンパク質が固定されている、請求項１記載の方法。 ３． 前記第２タンパク質が固定されている、請求項１記載の方法。 ４． 前記第１タンパク質がニトロセルロース上に固定されている、請求の範囲 第２項の方法。 ５． 前記第１タンパク質が標識を含む、請求項１記載の方法。 ６． 前記標識が蛍光生成性基質である、請求項５記載の方法。 ７． 前記蛍光生成性基質がエクオレア・ビクトリアに由来する緑色蛍光タンパ ク質を含む、請求項６記載の方法。 ８． 前記第２タンパク質が標識を有する、請求項１記載の方法。 ９． 前記標識が放射性基質である、請求項８記載の方法。 10. 前記第２タンパク質がFtsZである、請求項１記載の方法。 11． 少なくともzipA遺伝子の一部を含む精製オリゴヌクレオチド。 12． 請求項11記載の精製オリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチ ドが配列番号１に示される配列を有する精製オリゴヌクレオチド。 13． 発現ベクター中の、請求項12記載の精製オリゴヌクレオチド。 14. 少なくともZipAタンパク質の一部を含む精製タンパク質。 15． 前記一部が配列番号２を含む、請求項14記載のタンパク質。 16. 前記一部が配列番号４-14からなる群より選択される、請求項14記載のタ ンパク質。 17． 標識をさらに含む、請求項14記載のタンパク質。 18． 前記標識が放射標識である、請求項17記載のタンパク質。 19. 前記タンパク質が、少なくともZipAタンパク質の一部及び非ZipAタンパ ク質 を含む融合タンパク質である、請求項14記載のタンパク質。 20． 前記非ZipAタンパク質がエクオレア・ビクトリアに由来する緑色蛍光タン パク質を含む、請求項19記載の融合タンパク質。