JP2000501603A

JP2000501603A - 尿生殖洞由来増殖因子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列

Info

Publication number: JP2000501603A
Application number: JP9521419A
Authority: JP
Inventors: ローリー，デービッド・アール
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1995-12-07
Filing date: 1996-12-06
Publication date: 2000-02-15
Also published as: US5958735A; US20030077745A1; EP0866859A4; AU1329397A; WO1997020930A1; CA2243508A1; EP0866859A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、尿生殖洞由来の成長阻害因子であるps20に関する。ps20のアミノ酸およびヌクレオチド配列を提供する。また、本発明においてはps20に結合する抗体も提供される。さらにps20は、ジスルフィドコアドメインファミリーのWAP-タイプのメンバーであり、そしてプロテアーゼ阻害機能を有することが示される。

Description

【発明の詳細な説明】尿生殖洞由来増殖因子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列予備出願への相互参照本出願は、1995年12月７日に出願された米国予備出願第60/008,348号の利益を享受する。政府の利益以下の発明はNIH認可第DK45909号およびCA58093号により一部援助された。米国政府は本発明において一定の権利を有する場合がある。発明の背景１．発明の分野本発明は、尿生殖洞由来増殖阻害因子、ps20に関する。より具体的には、本発明は、当該因子の使用並びに上記因子のアミノ酸およびヌクレオチド配列に関する。本発明はまた、上記因子に結合する抗体に関する。２．先行技術の説明上皮分化パターンは、肺、乳房、胃、皮膚、眼および前立腺を含む大部分の真核組織中の間質細胞によって誘導される。前立腺の発生においては、管形態形成および上皮の腺房の分化が、間質誘導から生じる。異型の組織−組織組換え体においては、胎児の尿生殖洞（前立腺の原基）からの間充織は、膀胱上皮細胞を誘導して、管形態形成を行わせ、前立腺特異的タンパク質を発現できる前立腺の上皮表現型へと分化させる。前立腺の管形態形成は間質誘導上皮細胞の増殖によって特徴付けられる。この後、（分泌表現型への）上皮の細胞分化は、間質の相互作用を同様に必要とする細胞休止と相関している。大部分の細胞では、分化した遺伝子発現は、細胞増殖の減少と関連している。細胞培養物では、（上皮細胞への）増殖刺激活性が、bF GFおよびNGF様因子を含めて、前立腺の間質細胞から馴化培地中で観察されている。間質由来因子の可能性の高い候補としてケラチノサイト増殖因子（KGF）を同定することが進められている。KGFの発現は間質に制限されており、前立腺ではアンドロゲンで調節されている。KGFは、精嚢の上皮分化の間質誘導を部分的に仲介する。TGF-β1およびTGF-β受容体は前立腺ではアンドロゲンによって負に調節される。TGF-βは発生中に発現するが、しかしながら、前立腺の発生におけるそれらの役割は明らかでない。前立腺間質培養物から分泌された増殖阻害活性が、本発明者の研究室および他者により報告されており、これらはTGF-β類を含む既知の阻害因子によるものではない。この増殖阻害活性は、尿生殖洞由来増殖阻害因子（UGIF）/ps20タンパク質によるものであり、これもまたタンパク質合成を誘導し、標的上皮細胞の表現型の形態を変化させる。他の全ての増殖調節タンパク質と同様に、ps20は前立腺に特異的ではなく、間充織および平滑筋細胞においても発現している。上皮分化を後に伴う前立腺の管形態形成の発生パターンには、種々の正および負の増殖調節因子の時期の定まった発現が関与しているらしい。ラットおよびヒトの前立腺平滑筋細胞株を用いた研究により、生理的濃度（５ -10mM）のアンドロゲンによりアンドロゲンで刺激された増殖が示される。これらの所見は共に、尿生殖洞間充織および成体平滑筋細胞が、前立腺において間質 −上皮相互作用に本質的な遺伝子を発現する可能性が高いことを示す。アンドロゲン応答性間質細胞株の単離と培養が技術的に困難であり、分泌タンパク質または細胞外マトリックスタンパク質の生化学的分析が困難であり、そして組織特異的間質細胞cDNAライブラリーの入手が比較的困難であるために、間質由来調節タンパク質とそれらの機構の同定の進歩は限定されている。良性前立腺過形成（BPH）および前立腺癌は、前立腺上皮の増殖と分化の異常である。BPH異常は間質−上皮相互作用とおそらく最も関係がある。BPHは局在化した間質細胞増殖から開始する。BPHの開始は、前立腺間質の誘導性潜在力の「再覚醒（reawakening）」と称され、胎児状態への間質の自発的な転換である。従って、尿道周囲領域における間質細胞の異常な増殖は、隣接する上皮細胞からの腺房の進界成長（ingrowth）と異常形成を誘導できる。前立腺の発癌の間、癌腫の進行パターンには間質−上皮相互作用が関与する。前立腺の癌腫は、アンドロゲン応答性状態から抗アンドロゲン治療にもはや応答しないアンドロゲン不感受性状態への進行に特徴がある。アンドロゲン不感受性への進行は、間質細胞での遺伝子発現の変化から生じることを示唆するいくつかの証拠が存在する。ダンニング（Dunning）ラット前立腺癌腫では、間質の型は隣接する上皮がFGF受容体（FGFRc2 IIIbから IIIc）のエキソンスイッチングを示すのを誘導し、これがこれらの上皮細胞にアンドロゲン不感受性増殖を付与する。ダンニング（Dunning）腫瘍前立腺癌腫細胞の増殖は、正常精嚢または尿生殖洞間充織と再結合した場合に７倍阻害された。再結合した癌腫細胞は表現型の形態の変化を示した。正常間充織と再結合した場合、癌腫細胞は、野生型のダンニング（Dunning）腫瘍における典型的な鱗屑状／立方体様の未分化の表現型と比較した場合、分化した分泌上皮に典型的な背の高い円柱状の細胞形を示した。この点に関して、平滑筋がダンニング前立腺腫瘍に存在しないことは興味深い。さらに、癌腫形成のパターンは、関連した間質細胞の起源によって影響を受けることがある。膀胱転換細胞癌腫を正常尿生殖洞間充織と再結合すると前立腺に典型的な腺状腺癌の表現型の形成が生じた。マウスに前立腺腫瘍を生成するための組織−組織再結合試験には、ヒト表現型に典型的な前立腺腺癌を生成するために（mycおよびrasによる）間充織の形質転換が必要である。逆に言えば、繊維肉腫催腫瘍性間質細胞を非催腫瘍性正常上皮細胞と一緒にヌートマウスに接種すると、癌腫と繊維肉腫の混合が生じた。これらの研究は共に、前立腺癌腫上皮が間質環境に応答性であり、前立腺癌腫の進行および全体の表現型は間質の相互作用にある程度依存していることを示している。従って、間質−上皮相互作用の機構に関与する鍵となるタンパク質が前立腺の増殖疾患の研究にとって重要であると考えられる。プロテアーゼとプロテアーゼ阻害剤の作用のバランスが、組織、細胞外マトリックス（ECH）組成物、および増殖因子活性化過程のモデリングに関与している。プロテアーゼは、胚形成、細胞外マトリックスモデリング／再モデリングにおいて、並びに異常増殖、腫瘍浸潤の促進および転移の形成を含む腫瘍形成において重要な役割を担っている。メタロプロテナーゼ類が、乳癌、結腸癌、神経芽細胞腫および前立腺癌を含む大部分の新生物疾患において過剰発現していることは十分に証明されている。カテプシンＢおよびＤを含むシステインプロテアーゼ類は、前立腺癌を含む多くの癌転移で上昇している。プラスミノゲン活性化因子（PA）プロテアーゼは、作用の誘導されたカスケードのために、腫瘍の進行に重要である。プラスミノゲン活性化因子は、不活性なプラスミノゲンを活性型であるプラスミンに変換するセリンプロテアーゼ類である。プラスミンは次いで、糖タンパク質、プロテオグリカン（ヘパリンおよびヘパリン−硫酸塩を含む）、およびゼラチンを含むECM成分に対して幅広いタンパク質分解性のトリプシン様の作用を示す。プラスミンはまた、TGF-β類を含め、多様なECM結合増殖因子を潜在型から活性型へと活性化する。ウロキナーゼ型PAおよび組織型PAは最も広く調べられたPA類であった。ウロキナーゼPAは組織モデリング−再モデリング活性に主として関与する一方、組織PAは血餅溶解において最も活性である。プラスミノゲンは全部の組織および液体において存在するために、プラスミンの局所的効果はPAの局所的発現によって仲介される。ウロキナーゼPAは、膜に固定した特異的受容体と高い親和性で結合する不活性なプロ型として分泌され、そこでそれは切断されて活性型になり、数時間（細胞表面上に）そのままでいる。細胞表面上で、ウロキナーゼPAは限局性作用を有する結果、約40倍のプラスミン活性化の局所的増大が生じる。プラスミン活性は、活性ウロキナーゼを発現する細胞表面に対する限局性環境において増大している。限局性のプラスミンはECM の分解を行い、メタロプロテナーゼ類（プロコラゲナーゼ、プロストロメリシン、エラスターゼ）を活性化する。従って、少量のウロキナーゼPAの分泌は限局性のプラスミンカスケードを生じさせ、一定範囲の他の酵素および因子を生じさせる。ウロキナーゼPAは、セリンプロテアーゼ阻害剤であるPA阻害剤（PAI類）によって阻害される。PA類（および他のプロテアーゼ）の局所的作用が高度に調節された機構により発生過程の幅広い配列中で関与している。PA類、PAI類、およびプロテアーゼは各々ホルモンおよび増殖因子によって調節されている。発生における作用に加えて、ウロキナーゼPAは大部分の腫瘍転移において上昇している。上昇したウロキナーゼPAは、腫瘍浸潤の増大、腫瘍容積の増大、および細胞増殖速度の増大とともに、プロテアーゼおよび増殖因子の下流活性化をもたらす。前立腺では、プロテアーゼおよび阻害剤の研究は癌腫の進行に主として焦点を当ててきた。PA活性は正常組織よりも前立腺癌腫の方が高く、ウロキナーゼPA型が進行に主として関連している。ウロキナーゼPAは一次腫瘍部位と比較して前立腺骨転移で上昇している。ウロキナーゼPAはダンニング、ノベル（Nobel ）、ロブンド-ウイスター（Lobund-Wister）、およびフィッシャー（Fisher）-3 34前立腺腫瘍で過剰発現している。さらに、ウロキナーゼPAはPC-3およびDU-145 ヒト前立腺癌腫細胞株によって分泌される優勢なPAであり、これらの細胞株はウロキナーゼPA細胞表面受容体を示す。本発明者の研究では、PC-3細胞株を使用して胎児尿生殖洞間充織細胞から分泌されたps20を同定および精製した。ヌードマウスへのPC-3の転移は変異したウロキナーゼPAまたはウロキナーゼPA受容体阻害抗体によって阻害された。直接的な証拠により、ウロキナーゼPA阻害剤および他のプロテアーゼ阻害剤による癌細胞の増殖阻害が示されている。合成ウロキナーゼPA阻害剤（ｐ-アミノベンズアミジン）は、SCIDマウスにおけるDU-145ヒト前立腺癌腫の進行と培養物中の細胞増殖とを用量依存様式で阻害した（腫瘍容積の減少64％）。プロテアーゼ阻害剤アクチノニンは、コラーゲンゲル中で乳腫瘍進行（非転移型と転移型の両方）を阻害した。バチマスタット（Batimastat）、マトリックスメタロプロテナーゼ阻害剤は、２つのヒト結腸癌腫の肺での器官浸潤を阻害した（腫瘍容積の減少72％）。ヒト前立腺では、酸システインプロテナーゼ阻害剤（ACPI）（カテプシン阻害剤）の発現の減少が正常組織と比較してBPH組織で見られた。ヒト前立腺の腺癌組織中ではACPIの発現は見られなかった。従って、プロテアーゼとプロテアーゼ阻害剤のバランスがヒトBPHおよび癌腫で増殖に影響しているようである。本明細書中に参照により取り込まれる米国特許第5,196,334号には、尿生殖洞由来増殖阻害因子、UGIF（ps20）の単離と部分的特徴付けが記載されている。しかしながら、ps20のアミノ酸およびヌクレオチド配列は以前には記載されていない。さらに、ps20に対する抗体も以前には記載されていない。発明の要旨本発明は、尿生殖洞由来増殖阻害因子のアミノ酸およびヌクレオチド配列に関する。従って、尿生殖洞由来増殖阻害因子、UGIF（ps20）をコードするアミノ酸配列が本明細書中に提供される。本発明のps20はプロテアーゼ阻害作用を有する。尿生殖洞由来増殖阻害因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列もまた本明細書中に提供される。尿生殖洞由来増殖阻害因子、ps20に結合する抗体もまた本明細書中に提供される。本発明のこれらおよび他の利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１：ラットps20のcDNAおよび推定アミノ酸配列。図２：ps20の４個のジスルフィドコアドメインと他のファミリー構成因子との整列。図３：ps20ペプチド抗体によるウエスタン分析。図４：免疫組織化学による局在化。図５：ヒト良性前立腺過形成におけるps20の免疫局在化。図６：ヒトの僅かに分化した癌腫におけるps20の免疫局在化。図７：配列番号１、ラットps20のcDNAヌクレオチド配列。図８：配列番号２、ラットps20のアミノ酸配列。図９：配列番号３、ヒトps20のcDNAヌクレオチド配列。図１０：配列番号４、ヒトps20のアミノ酸配列。発明の詳細な説明 ps20の単離および特徴付けは、米国特許第5,196,334号および米国特許出願番号第07/928,867（登録料支払い済）中に開示され、これらは本明細書中に参照により取り入れられる。本発明はps20のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。本明細書中で使用する場合、「ヌクレオチド配列」という用語には、ポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドが含まれ、天然由来の塩基と天然のホスホジエステル結合によって結合したシクロフラノシル基とから形成した複数の結合したヌクレオチド単位を意味する。この用語は、天然由来種または天然由来サブユニットから形成した合成種のことを事実上意味する。「ヌクレオチド配列」はまた、同様に機能するが非天然由来の部分を有する、プリンおよびピリミジン基および成分をも意味する。即ち、ヌクレオチド配列は変化した糖成分または糖内結合を有していてもよい。これらの例は、ホスホロチオエートおよび他の糖含有種である。それらはまた、生物学的活性が維持される限り、変化した塩基単位または他の修飾を含有していてもよい。ヌクレオチド配列はまた、少なくとも幾つかの修飾した塩基形態を含む種を含んでいてもよい。即ち、天然に通常見られるもの以外のプリンおよびピリミジンを使用してもよい。同様に、生物学的機能が修飾によって排除されない限り、ヌクレオチドサブユニットのシクロフラノース部分上に修飾が生じていてもよい。以下で明らかになる通り、ps20のクローニングおよび配列決定はこのタンパク質がプロテアーゼ阻害作用を有することを明らかにする。従って、ps20およびそのヌクレオチド配列は、プロテアーゼ阻害が望まれる多数の用途で使用することができる。これらには、細胞増殖の阻害または調節、癌細胞増殖の阻害または調節、癌転移の阻害または調節、プロテアーゼ作用によって活性化される他の増殖因子の生物学的活性の調節、細胞増殖および／または細胞分化（遺伝子発現の変化）および／または細胞形態または細胞外マトリックスによって調節される他の細胞機能の変化を生じさせる細胞外マトリックスタンパク質の調節、プロテアーセ作用に関連する増殖因子活性の活性化および不活性化が含まれるが、これらに限定されない。ps20に応答性の疾患または状態には、前立腺癌および転移、乳癌および転移、卵巣癌および転移、移行細胞癌腫および９転移、腎細胞癌腫および転移、気管支原生癌（肺癌）および転移、結腸直腸癌腫および転移、子宮内膜（子宮）癌腫および転移、悪性メラノーマおよび転移、肝細胞性癌腫（腎臓癌）および転移、膵臓癌および転移、睾丸の精上皮腫および非精上皮腫の生殖細胞腫瘍および転移、頸部癌および転移、食道偏平上皮細胞癌腫および転移、胃癌腫および転移、アテローム硬化症、血管形成後の再狭窄、血管壁損傷に伴う血管平滑筋増殖、良性前立腺癌腫、損傷治癒、および慢性炎症が含まれるが、これらに限定されない。当業者ならば、既知の薬物動態技術を使用して所望のプロテアーゼ阻害作用を達成するためにps20の好適な投与量を調べることができるであろう。さらに、ps20をコードするヌクレオチド配列は、前立腺癌および良性前立腺過形成などの（これらに限定されない）前立腺疾患を発達させる危険を評価するための診断道具として使用することができる。ps20をコードするDNA配列を単離して、正常および／または危険状態の個人に見られる配列と比較することができる。診断分析において、「危険状態」の個人とは前立腺疾患を有するか発達させているかもしれない人である。さらに、ps20およびそのヌクレオチド配列は、多数の疾患または異常を予防するために使用することができる。当業者ならば適当な予防投与量を決定できるであろう。また、ps20ヌクレオチド配列は、動脈硬化および再狭窄などの（これらに限定されない）心臓血管性疾患のスクリーニングのために使用することもできる。本発明のヌクレオチド配列を使用して、ラットまたはヒトのps20のアミノ酸配列を有する組換えタンパク質を構築することができる。さらに、若干の修飾を有するタンパク質も、本発明のヌクレオチド配列を使用して構築することができる。本発明のヌクレオチド配列を含むベクターも提供される。 ps20に対する抗体も本明細書中に提供される。本抗体を使用してps20保有細胞を同定および計数することができ、または体液中のps20の量を単離または定量することができる。この目的のために、本抗体は当業者に既知の標準分析法で使用することができる。一般には、抗体を、抗体がps20と結合するのを可能にする条件下で試料と接触させる。定量は当業者に既知の慣用技術によって行われる。これらには、組織化学技術ENIT、ELISA、ラテックス凝集免疫分析、FPIAおよび他の免疫分析技術が含まれるが、これらに限定されない。ps20に対する有用な抗体にはポリクローナルまたはモノクローナル抗体が含まれる。以下の実施例は本発明の具体的実施態様を例示するためのものであり、本発明の範囲に対する限定とみなされるべきではない。実施例１．ｐｓ２０のクローニングと配列決定この実施例は、ラットps20のクローニングとヌクレオチド配列決定について記載する。ps20のcDNAをクローン化するために、cDNAライブラリーを、ウェスタン解析によりps20を高発現する細胞であることがわかったラット前立腺平滑筋PS-1 細胞株から調製した。PS-1細胞株は、米国特許出願第07/928867号に記載されている。cDNAライブラリーは、オリゴd(T)をプライマーとしたcDNAからラムダZAP 発現ベクター中に構築した。ZAP発現ベクターは、用途の広さ、切り出しの容易さ、そして再環状化を基準として選択され、pBK-CMVファージミドサブクローンを調製した。ライブラリーは試験スクリーニングにおいてB-アクチンcDNAの予想された表示（対照として）とIgGレクチン-結合タンパク質cDNAを示した。最初のアプローチとして、精製したps20タンパク質から決定したアミノ末端配列の５'末端に基づいて、縮重プライマーを調製した。PCRプローブの縮重性に基づき、5’ベクタープライマーからps20縮重プライマーまでを増幅するネステッドPCR（nested PCR）アプローチに続いてps20フォワード及びリバースの縮重プライマーを用いるネステッド増幅により、真正のps20配列（アミノ末端）の増幅が可能になった。最終PCR産物は予想される大きさが81bpで、TAクローニングによりpCRIIプラスミドに直接クローン化し、クローンを分離し、そしてクローン3 438pCRIIの配列決定をした。対応する配列は、推測されるアミノ酸配列と生成したps20から決定したアミノ末端配列とを直接競合することにより、ps20と確定した。非縮重フォワード及びリバースPCRプライマーを、クローン3438pCRII配列に基づいて作成し、そしてps20のcDNAの３'末端と５'末端を増幅しそしてクローン化するためにネステッドPCR反応に使用した。５'クローン(クローンＴ340pCRII) は184bpで、そしてクローン3438pCRII配列と重なり（50bp）があり、さらに加えて5’配列の120bpを有する。3’クローン（クローン42T7pCRII）は868bpの長さを有し、3’ポリAテールを含み、そしてクローン3438pCRII配列と重なり（54bp ）がある。 PS-1のcDNAライブラリーのスクリーニングは、PCRに基づいて陽性のプレートを得、続いてクローン42T7pCRII標識した挿入物（862bp）をプローブとして用いたプラークハイブリダイゼーションにより別個のコロニーを計測した。全数で12 0万のクローンを10-20000コロニーごとに検出される1つの陽性クローンについてスクリーニングした。クローン1025rps20pBK-CHV-IBを両方向から配列決定し（図１の配列）、さらに別のクローン1025rps20pBK-CMV-2Bから得られた配列と競合し、そして天然のps20と同一の予想されるアミノ酸配列によりps20として確認した。クローン1025rps20pBK-CNV-1Bは、U4F細胞及びラット背側外側の前立腺のノザン解析に従えば、長さが1029bpで、3’ポリ（A）テールを含み、そして図１中に示されるようにおよそ1.1kbの大きさの単一で同一の分子種であることを示した。配列解析により、ヌクレオチド52番（ATG）から始まりヌクレオチド688番（ UGAストップコドン）で終止する636ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有し、そして推定で212アミノ酸のタンパク質をコードすることが示された。疎水性のリーダー配列は、von Heijneの規則（Von Heijne，G．1984，How sig nal sequences maintain cleavage specificity．J．Mol．Biol．173: 243-251 ）に従うと、Gly（第26番）とThr（第27番）（それぞれが-1及び＋1）との間に完全なシグナルペプチダーゼ切断部位を有するアミノ酸1-26までと推測された。 Thr（第27番）（成熟分泌タンパク質の＋1番）からHis（第54番）は、精製した天然ps20のアミノ末端から決定したThr（第１番）からHis（第28番）までと完全に一致した。ハイドパシー（Hydopathy）解析（Tmpred）では、膜貫通領域はなく、分泌タンパク質であることが予想されると示唆された。潜在的な翻訳後修飾は、５つの潜在的カゼインキナーゼII部位以外には示されなかった。cDNAクローンから、20.7kDaの成熟分泌タンパク質（精製された天然の21kDaのps20と同一）であること、そしておよそ23.6kDaの細胞内分子量（疎水性シグナルペプチドを含む）であることが示され、これらの値はこれらの条件下で細胞内分子量が29kD aであることを示すウェスタン解析による検出と非常に一致する。クローン1025rps20pBK-CHV-2Bを標識プローブとして使用して、正常ヒト前立腺（ヒト前立腺５'-ストレッチcDNA、クロンテック）から調製されたラムダgtl1 ライブラリーを、標準のプラークハイブリダイゼーション技術を用いてスクリーニングした（120万クローン）。５'末端及び３'末端のPCRスクリーニングに基づいて、８個のクローンを完全長である可能性があるものとして単離した。ラット ps20のcDNAとラットps20と同一の分子量を示す以前に決定されたヒトps20タンパク質との比較に基づくと、これらのうちの５つが完全長（1-1.2kb）であるらしかった。ラットps20のヌクレオチド配列を図１に示す。さらに図７は、ラットps20のヌクレオチド配列を示し、そしてその配列は本明細書中で配列番号１として引用されている。図７の配列は、図１に示された配列中には示されていない３'非コード領域中の余分のヌクレオチドを含む。同様に、ラットps20の推定されるアミノ酸配列も図１に示す。ラットps20のアミノ酸配列は図８にも示し、そしてその配列は本明細書中で配列番号２として引用されている。下線部分はシグナルペプチドを示す（アミノ酸１-26）。ps20タンパク質は、U4F間葉系細胞培養及び成熟ラット前立腺組織において発現される単一の1.1kb転写物によりコードされる。転写物は分泌された精製タンパク質の最初のアミノ酸の前にある原型のシグナルペプチド切断部位を伴う予想されるシグナルペプチドリーダー配列（アミノ酸１-2 6）を有する、23.6kDaのタンパク質をコードする。推測されるアミノ酸配列の解析により示されたことは、ps20がWAP型の４つのジスルフィドコア領域を有し、ps20がWAP型の４つのジスルフィドコア領域タンパク質ファミリーの新規のメンバーとして分類されるということである。WAP型の４つのジスルフィドコア領域に関与するシステイン58−96も図１で下線を施した。WAP型の４つのジスルフィドコア領域タンパク質ファミリーのメンバーは、ジスルフィド結合に関与するタンパク質コア中に保存的な８システインモチーフを含む比較的小さなタンパク質である。既知の生物学的活性を有するファミリーのメンバーの大部分は、プロテアーゼ阻害剤として機能する。ps20にもっとも近接に関連するコア領域を有するファミリーのメンバーには、以下のものが含まれる。すなわち、ps20と39.4％同一性であるセロニアニン（Chelonianin）（赤ウミガメ卵白身から単離されたズブチリシン（subtilisin）プロテアーゼ阻害剤）；ps20と35.4％同一性である抗リューコプロテナーゼＩ（HUSI-1、分泌型セリンプロテアーゼ阻害剤）；ps20と35.3％同一性であるWAP（乳清酸性タンパク質、乳中にみられる擬似プロテアーゼ阻害剤）；ps20と33.3％同一性であるWDNMIタンパク質（プロテアーゼ阻害作用を持つことが予想される乳腺転移抑制遺伝子）；ps20と33.3％同一性であるHE4（精巣上体中で分泌されるプロテアーゼ阻害剤と予想される）；ps20と31,2％同一性であるカルマン（Kallman）症候群タンパク質（細胞外マトリックスに局在するプロテアーゼ阻害剤と予想され、そして適切な嗅覚神経及びGnRH合成神経の発達に必要とされる。）；ps20と29.2％同一性であるエラフィン（Elafin）（分泌型エラスターゼ特異的セリンプロテアーゼ阻害剤）；そしてps20と27.1％同一性であるカルトリン（Caltrin）様タンパク質I I（精子中へのカルシウム輸送を阻害する精嚢由来の分泌タンパク質）が含まれる。図２は、ps20の４つのジスルフィドコア領域の配列を、その他のファミリーのメンバーとともに示す。配列スコアは、ファスタスコアリング法（fasta scor ing method）（EERIE）によりコンピュータで計算した。このタンパク質ファミリーの機能的な重要性は、組織モデリング、細胞分化及びガン転移制御における投割について指摘する。WAPは、乳腺の腺房上皮細胞の最終分化及び発生に投割を果たしうる。MHTVによるWAPトランス遺伝子の指向性発現は、結果として欠陥のある乳腺発生及び男性生殖器系中の凝固腺（前立腺前部）の新生組織形成／形成異常を引き起こす。正常ヒト前立腺組織と比較してヒトBPH中のps20の染色強度が高いことが観察されているため、この観察は重要である。カルマン症候群は、"嗅覚-性器形成異常"と呼ばれる嗅球の非形成、そして低ゴナドトロピン性性腺機能低下症（hypogonadotropic hypogonadism）を引き起こす。カルマン症候群における防御的遺伝子はADMLXと呼ばれ、そしてWAP型の４つのジスルフィドコア領域とIII型フィブロネクチン繰り返し配列を含む分泌タンパク質をコードする。このタンパク質は細胞接着において、そしてプロテアーゼ阻害剤として機能しうるものである。ADMLXはGnRHニューロンの移動及び軸索性の嗅覚神経伸長に関与し、それにより分化パターンが引き起こされる。 WDNMI遺伝子は転移抑制機能を持つと考えられている４つのジスルフィドコアタンパク質ファミリーの新規メンバーである。WDNMIは、非転移乳腺癌腫と比較してラットの転移乳腺アデノカルシノーマにおいては20分の１に抑制制御された。WDNMIはプロテアーゼ阻害剤として機能していることが示唆され、そしてそれ故にWDNMIタンパク質の変化が結果として非調節のプロテアーゼ活性を引き起こし、一般的には癌腫の転移拡大に関与する。実施例２．ｐｓ２０に対する抗体の調製この実施例はps20に対して特異的な抗体の調製とその特徴について記載する。ラット及びヒト組織におけるps20は、免疫組織化学によれば局在化されている。 ps20のペプチド配列の第1-14番の位置に基づいて合成ペプチドを作成し、Vituki arusの方法の変法（Vitukiarus，J.，J.B．Robbins，E．Nieschlag，and G.T．R oss，1971，A method for producing specific antisera with small does of i mmunogen．J．Clin．Endocr.，33: 988-991）に従い、メスのニュジーランド種ウサギに免疫源として使用した。精製したps20のアミノ末端に対応している独特の14アミノ酸合成ペプチドは、アプライドバイオシステムズ430Aペプチド合成機で合成した：N-Thr-Trp-Glu-Al a-Het-Leu-Pro-Val-Arg-Leu-Ala-Glu-Lys-Ser-C。初回の免疫化のために、ps20 ペプチドを滅菌の組織培養品質のH₂Oに可溶化し（400μg/ml）、フロイントの完全アジュバントと混合し（１：１比率）、そして500ml（100μg）を等分して、３羽のメスのニュジーランド種ウサギの頸部（皮下）と背部の肩甲下筋（筋肉内）の複数の部位（４ないし５箇所）注射した。初回免疫化後３週間の時点で、血清試料を調製し、固相酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）により解析した。それぞれの抗体に陽性のウサギには、背部と頸部の複数部位に皮下に注射されるフロイントの不完全アジュバント500μl中の100μgのペプチドを、そしてさらに肩甲下領域の筋肉内100μgを追加免役した。血清試料は２週間ごとにps20 特異的抗体について試験し、そして免疫グロブリンサブタイプをELISA解析により決定した。血清は初回免疫から３週間の時点でps20抗体について試験し、抗体陽性ウサギは同一の手順に従って２回目の追加免疫を受けた。高力価の抗血清を産生するウサギから血清をプールし（1：106希釈で活性）、IgGを硫酸アンモニウム（50％飽和）で沈殿し、PBS中で再可溶化し、そしてPBSで一晩4℃で透析した。抗体の特異性は、濃縮し部分的に精製したU4F細胞（ps20をこの細胞から精製した）からの調整培地からの調製物中の20kDaタンパク質との免疫反応性により確認した。免疫反応性IgGをペプチドカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製したps20の最初の14アミノ酸に対応するペプチド（10mg）を、上述したように生成し、そしてMethods in Molecular Biology，Vol．34（"Immunocytochemical Met hods and Protocols"（免疫細胞化学の方法とプロトコール）、Lorette C．Javo is（ed.），19-23章、155-193ページ、Humana Press，Totowa，N.J．1994）に記載の標準の手順に従って1gのCNBr-活性化セファロース4Bに結合し、そして２ml のポリプレップカラム（バイオラッド）に注いだ。IgG調製物はPBSバッファー（ 200mMホウ酸ナトリウム、160mM塩化ナトリウム、pH8）で希釈し、そして２回連続的にカラムを介したクロマトグラフィーをした。カラムはPBS（カラムの10-15 倍量）で完全に洗い、そして結合した抗体をグリシン-Clバッファー（0.05Mグリシン、0.15M NaCl、pH2.28）で溶出した。画分（2ml）を溶出し、そして0.5mlの中性化バッファー（0.5Mリン酸、pH7.7）を含むチューブに直接回収した。画分をタンパク質含量についてアッセイし（280nmでの吸光度）、そしてピークの画分を貯蔵しそして固相酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）により免疫反応性をアッセイした。抗体産生はELISAで計測した。高力価の抗血清が３羽のウサギで検出された。 ps20抗血清のIgG画分についてウェスタン解析により特異性を解析し、そして親和性精製抗体をセファロース4Bに共有結合させたペプチド1-14を用いたゲルクロマトグラフィーにより調製した。ウェスタン解析により、調整培地中の分泌型の（シグナルペプチドを含まない）ps20（20-21kDa）に対する単一特異的反応性が示された（Rowley，D.R.，T.D．Dang，N．Larsen，J.J．Gerdes，L．McBride ，and B．Lu，1995，Purification of a novel protein（ps20）from urogenita lsinus mesenchymal cells with growth inhibitory properties in vitro.，J ．Biol．Chem.，270: 22058-22065を参照）。U4F細胞抽出物からのウェスタン解析から、29kDaタンパク質に対する単一特異的反応性が示され（図３）、それはS DS-PAGE及びウェスタン解析における見かけの骨格（24.6kDa）の大きさを増加するように示された非切断細胞型（26アミノ酸疎水性リーダー領域を含む）を表している。（A）U4F胎児ラット尿生殖洞間葉系細胞。レーン１：クマシー染色；2 ：ps20抗血清IgG画分；3：免疫前血清；4：親和性精製ps20抗体；5：一次抗体なし。ps20抗血清IgG画分（レーン2）は、これらの条件下において見かけ29kDaの大きさの単一種を特異的に認識した。親和性精製抗体（レーン4）は、29kDaのバンドのみを認識した。免疫前血清（レーン3）は、すべての非特異的に交差反応するバンドを認識した。二次抗体のみでは、何らバンドのパターンが見られなかった（レーン5）。成熟ラット前立腺平滑筋及びヒト前立腺平滑筋抽出物のウェスタン解析により、ラット及びヒトの細胞株両方に由来する29kDaバンドに対して同一の免疫反応性が示された。これらの研究から、ラット及びヒトのps20型は、ほとんど同一のアミノ酸配列により示されるように、大きさ及び免疫反応性において同一であることが示された。実施例３．免疫組織化学局在この実施例は、前立腺検体中のps20の免疫組織化学局在を示す。図４ＥおよびＦ、５および６は、ヒト前立腺検体中のps20の局在を示す。図４は、親和精製抗体を用いたラット前立腺中のps20の免疫組織化学局在を示す。免疫組織化学局在の確認は、Methods in Molecular Biology，Vol 34，”Immunocy tochemical Nethods and Protocols”，Lorette C．Javois（ed.）、第19-23章，155-193ページ、Humana Press，Totowa，N．J．1994に記載された方法により実施した。基本的には、２月齢および６月齢のオスのスプラグダウレイ（Spragu e Dawley）ラットを犠牲にして、ホルマリンO．N．Fixedの組織中に固定された全組織をパラフィン中にうめて、５μmの厚さの切片に切り、ポリリジンでコートしたスライドにのせて染色前に37℃において焼いた。ホルマリン固定してパラフィンにうめた31人の患者のヒト前立腺切片は、メソディスト病院、ヒューストン（18）およびテキサス小児病院、ヒューストン（13 ）から得た。５μmの厚さの切片を、パラフィンにうめたブロックから切り出して、ポリリジンコートしたスライドにのせた。概して：カルシノーマ（９）、BP H（３）、重病BPH（２）、間質（３）、および正常（６）と特徴付けされる、53 歳から72歳の24人の成人患者からのスライドをps20に関して染色した。１歳未満の４人の患者および10−14歳の４人の患者からのスライドを染色した。組織切片は、Hemo Dに１×10分間および１×５分間浸して脱パラフィンし；10 0％、95％および70％エタノールを用いた５分間の勾配洗浄により水和し；１×p BS/0.1％ Triton-X-100中へ５分間浸すことにより浸透させ；そして３％パーオキシド（H₂O₂）（30％シグマから希釈）で５分間処理することにより、内在パーオキシダーゼ活性を最小にした。一次抗体のインキュベーションは、親和精製したps20抗体を組織切片O．N．と37℃にてインキュベートした点を除き、免疫組織化学に関して記載された濃度および条件で実施した。免疫反応性は、ビオチン化ヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス二次抗体（シグマ）の何れかと45分間インキュベートして、１：15に希釈し；続いてエキソアビジン結合ペロジダーゼ（シグマ）と共に30分間インキュベートし、１：15に希釈し、最終的にジアミノベンジジン（DAB）と共に７分間インキュベートしてゲルマウントでマウントすることにより、可視化した。ヘモトキサリンとエオシン（H ＆ E）による染色は、Method s in Molecular Biology，Vol 134，”Immunocytochemical Methods and Protoc ols”，Lorette C．Javois（ed.）、第19-23章、155-193ページ、Humana Press ，Totowa，N．J．1994に記載されたとおりに実施した。スライドは光学顕微鏡（ Labophot-2，ニコン）およびエクタクローム400スライドまたはローヤルゴールド25プリントフィルム（イーストマンコダック）を用いて分析した。図４中、パネル（A）は親和精製したps20の抗体を、パネル（B）は陰性対照を、パネル（C）は平滑筋α-アクチン（ＳＭαアクチンを、そしてパネル（D）はヘモトキサリンとエオシンの染色パターンを描写する。ps20抗血清（A）およびp s20のIgG画分は、ラット前立腺の小房周囲の平滑筋中に同様の特異的局在を示した。一次抗体不含（B）、予め免疫した血清、およびps20ペプチドを予め吸着させた抗体を含む陰性対照は、特異的染色の同様の欠如を示した。ps20はＳＭαアクチン陽性細胞のサブセットに免疫位置確認された。免疫位置確認は平滑筋に特異的であるが、前立腺には特異的でない。強い染色は、精管および精嚢を含む、他のオスの生殖管（reproductive tract）組織において観察された。中程度の染色は、動脈の中膜および結腸および小腸の平滑筋中に観察された。脳、肺、膀胱および精巣中には、明確な染色が観察されなかった。ヒト前立腺中のps20の免疫位置確認のパネル（E）は、パネル（F）に示すとおりのＳＭαアクチン陽性細胞のサブセットに対応する局在を示した。独占的な局在は、上皮腺房に隣接した小房周辺の平滑筋細胞中に観察された。顕著な活性はあらゆる他の細胞種において観察されなかった。精嚢、精管、胃、腸、肺、唾液腺、心臓、脳および精巣を含む他の組織の調査は、ps20の発現が平滑筋に独占的であることを示した。最も高い活性はオスの生殖管組織（精管、前立腺、精嚢）中に著しく、消化管および動脈の中膜の平滑筋において中程度の染色であった。精巣、肺または脳においては反応性は目立たなかった。興味深いことに、ps20の反応性が前立腺中の動脈の中膜に観察された。局在は平滑筋細胞（αアクチン陽性間質細胞）に特異的であった。ヒトはラットと異なり、上皮腺房の回りに平滑筋細胞のはっきりとした小房周辺のリングをもたない。むしろ、ヒト前立腺間質は、平滑筋と繊維芽細胞の混合物である。ps20陽性細胞はαアクチン陽性細胞のすべてのセクションと連関した。興味深いのは、前立腺疾患に観察された染色パターンであった。図５および６は、BPHおよび前立腺カルシノーマにおける、正常に比して一貫して高いps20の局在を示す。図５中、パネル（A）はps20の抗血清IgG画分を、パネル（B）は予め免疫した血清を、パネル（C）はＳＭαアクチンを、そしてパネル（D）はヘモトキサリンとエオシンの染色を描写する。BPHの領域におけるps20 の免疫局在は、成人ヒト前立腺の正常領域における局在と同様であるか、または正常に比してわずかに上昇した。強から上昇した染色は腺性BPHおよび間質性BPH の両者を有する患者において観察された。ここに示された染色データは評価されたサンプルの代表である（腺性BPHと診断された５患者および間質性と診断された３患者）。対照的に、ps20の染色強度は極めて不均一であり、概してカルシノーマサンプルにおけるよりも低かった。図６中、パネル（A）はps20の抗血清IgG 画分を、パネル（B）は予め免疫した血清を、パネル（C）はＳＭαアクチンを、そしてパネル（D）はヘモトキサリンとエオシンの染色を描写する。カルシノーマの領域中のps20の免疫局在は、評価された９のカルシノーマ患者において正常に比して不均一な染色パターンを示した。ps20の染色は幾つかのほとんど分化していない小節を囲む間質中で低下しており、パターン（B）に示すとおりである。特に、ps20の染色強度は、図６に示す上皮被膜下の領域中に位置するほとんど分化していない小節に隣接した、幾つかの（あるいは全てでない）間質領域において、低いかまたは全く存在しなかった。実施例４．ヒトｐｓ２０配列この実施例は、ヒトps20のヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列を記載する。市販の（クロンテック、Palo Alto，CA.）cDNAライブラリーを用いた。該ライブラリーは正常ヒト前立腺から調製した。スクリーニングは、Current Protocol s in Molecular Biology，Vol．1，Ausubel，F．M；Brent，R．；Kingston，R． E．；Moore，D．D．；Seidman，J．G．;Struhl，K．；and Smith，J．A．（ed. ），John Wiley & Sons，NY，NY，1995に記載された標準プラークハイブリダイゼーション法を用いて実施した。プローブは、³²Ｐで標識されたラットのps20の cDNAであった。DNAのコロニーはフィルターで取り出してラットps20のcDNAクローンにハイブリダイズさせた。陽性コロニーを選択して、第２および第３ラウンドのスクリーニングにより精製した。陽性コロニーを配列決定してラット配列と比較した。陽性クローンＨ₁Ｔ₂100 およびＨ₆Ｂ₂-３について、ジデオキシ配列決定法（Current Protocols in Mole cular Biology Vol 1，上記に記載されたとおり）およびIBIモデル377自動配列決定機を用いた自動配列の両方で配列決定した。クローンＨ₁Ｔ₂100は1124bpの大きさであり、完全コーディング領域（成熟ps20タンパク質をコードする配列）を含むヌクレオチド１-1124を含んだ。クローンＨ₆Ｂ₂-３は約1000bpの大きさであり、完全な３'非翻訳領域（ポリAテールを含む）およびコーディング配列（クローンＨ₁Ｔ₂100と重複）に最初の幾つかのアミノ酸を欠いた。ヒトヌクレオチド配列およびそれに由来するアミノ酸配列（ヒトcDNA配列は220のアミノ酸タンパク質をコードした）を、MacVector 4.1配列分析プログラムを用いて、ラットのps20配列と比較した。これらの分析に基づくと、ヒトとラットのアミノ酸（ラットの１-212位）は配列で82.1％の完全適合を伴ってよく保存されており、保存的アミノ酸置換を考慮すると90.6％の全体同一性で保存されていた。ヒトps20タンパク質はアミノ末端リーダーペプチド配列において余分の７アミノ酸を含み、 52 番の位置にアミノ酸が付加される。ヒトps20のヌクレオチド配列を図９の配列番号３に示す。それに由来するヒト ps20のアミノ酸配列番号を図１０の配列番号４に示す。本発明の概念から逸脱することなく、当業界の経験のある者により、多くの他の変更および修飾が本明細書に記載された方法になされてよい。したがって、前に記載された方法は例示にすぎず、本発明の範囲を限定することを意図しないことは、明確に理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．尿生殖洞由来の成長阻害因子をコードするcDNA配列。２．cDNAがラットのcDNAである、請求項１記載のcDNA配列。３．配列番号１の配列番号を有する、請求項１記載のcDNA配列。４．cDNAがヒトのcDNAである、請求項１記載のcDNA配列。５．配列番号３の配列番号を有する、請求項１記載のcDNA配列。６．尿生殖洞由来の成長阻害因子のポリペプチド断片またはポリペプチド類似体をコードする精製して単離されたDNA分子。７．DNAがラットのDNAである、請求項６記載の精製して単離されたDNA分子。８．DNAがヒトのDNAである、請求項４記載の精製して単離されたDNA分子。９．配列番号１のヌクレオチド配列を有する、ps20をコードするDNA。 10．配列番号２のヌクレオチド配列を有する、ps20をコードするDNA。 11．配列番号３のアミノ酸配列を有するps20をコードする、DNA。 12．配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質および生物学上活性なその変更物。 13．ps20をコードする、精製して単離されたDNA分子。 14．ヒトps20の一次構造のコンフォメーションの一部または全部並びに生物活性を有するポリペプチド産物の原核または真核宿主発現をコードする、精製して単離されたDNA分子。 15．配列番号１の配列を有するDNA分子を含む生物学上機能的なベクター。 16．配列番号３の配列を有するDNA分子を含む生物学上機能的なベクター。 17．ps20に結合する抗体。 18．配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体。 19．プロテアーゼにps20を接触させることからなる、プロテアーゼ活性の阻害方法。 20．プロテアーゼに配列番号４の配列を有するポリペプチドを接触させることからなる、プロテアーゼ活性の阻害方法。