JP2000501618A

JP2000501618A - Ｎ―アセチル―（Ｌ）―４―シアノフェニルアラニンＡｃ―（Ｌ）―Ｐｈｅ（４―ＣＮ）―ＯＨおよびＮ―アセチル―（Ｌ）―ｐ―アミジノフェニルアラニン―シクロヘキシルグリシン―β―（３―Ｎ―メチルピリジニウム）―アラニンＡｃ―（Ｌ）―ｐＡｐｈ―Ｃｈｇ―ＰａｌＭｅ（３）―ＮＨ▲下２▼の新規な製法

Info

Publication number: JP2000501618A
Application number: JP9522336A
Authority: JP
Inventors: キング，チー―シン・アール
Original assignee: ヘキスト・マリオン・ルセル・インコーポレイテツド
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1996-11-25
Publication date: 2000-02-15
Anticipated expiration: 2016-11-25
Also published as: JP4044614B2; PL185541B1; PT868526E; SK85598A3; EP0868526A1; ZA9610600B; HK1017384A1; EP0868526B1; PL327314A1; KR100438879B1; SK281432B6; AR005119A1; DK0868526T3; EE03698B1; DE69623038T2; CA2241210A1; IL125003A; MX9804997A; DE69623038D1; EE9800188A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ラセミ化合物Ｎ−アセチル−(D,L)−４−シアノフェニルアラニンエチルエステルを分割してＮ−アセチル−(Ｌ)−４−シアノフェニルアラニンを製造する新規な方法及びその中間体Ｎ−アセチル−(Ｌ)−４−シアノフェニルアラニンを用いたAc-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂の立体異性体を製造する新規な方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】Ｎ−アセチル−(Ｌ)−4-シアノフェニルアラニン Ac-(L)- Phe(4-CN)-OHおよびＮ−アセチル−(Ｌ)−ｐ−アミジノフェニルアラニン−シクロヘキシルグリシン−β−（３−Ｎ −メチルピリジニウム）−アラニン Ac-(L)-pAph-Chg- PalMe(3)-NH₂の新規な製法発明の分野本発明は、ラセミ化合物Ｎ−アセチル−(D,L)−４−シアノフェニルアラニンエチルエステルを分割してＮ−アセチル−(Ｌ)−４−シアノフェニルアラニンを製造する新規な方法及びその中間体Ｎ−アセチル−(Ｌ)−４−シアノフェニルアラニンを用いたAc-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂の立体異性体を製造する新規な方法に関する。発明の背景ラセミ化合物Ｎ−アセチル−(D,L)−４−シアノフェニルアラニンおよびAc-(L )-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂は、1995年４月25日に出願された米国特許出願第08／4 28,404号(1994年４月26日に出願された米国特許出願第08／233,054号の部分継続出願)に開示され、記述されており、これらの開示は参照によって本明細書に加入する。最終生成物Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂はXa因子の阻害剤として有用である。立体異性体は、ラセミ体以上に、優れた効能、少ない副作用、毒性が低レベルであるかまたは無いなどの利点を有していることから、薬として開発するにはラセミ体よりむしろ立体異性体を得ることが望ましい。立体異性体のラセミ体を超えたこれらの利点は、時には薬物開発の後期まで、更には市販されているときでさえ知られていない。ラセミ体よりむしろ薬剤の立体異性体に関する調査書類を承認することは、市販薬を認可する多くの政府機関にとっても好ましい。従って、その化合物の立体異性体であるAc-(L) -pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂を製造する方法を得ることは望ましかった。この立体異性体を製造するための重要中間体は立体異性体Ｎ−アセチル−(Ｌ)−４−シアノフェニルアラニンである。ラセミ体を分割するためには、我々はこの目的に対して知られている種々の技術を選択しなければならない。例えば、ジアステレオマーの形成、続いて結晶化または特異な吸着（クロマトグラフィー）［Enantiomers，Racemates，and Reso lutions，J．Jacques，A．Collet，and S.H．Wilen，Wiley(1981)に記述されている］、キラル固定相上でのクロマトグラフィー分離、動的分割及び酵素による分割などがある。酵素による分割、特に加水分解酵素またはエステラーゼは、アミノ酸の分割に有効であることが示されている（Chemistry and Biochemistry o f the amino acids，Chapman and Hall，New York，1984，Chap．10pp.338-353; Applications of Biochemical Systems in Organic Chemistry，Part I，J．B ．Jones，C．J．Sih，and D．Perlman，Wiley，New York，1976，Chap 4．pp．1 07-401; およびChemistry of the Amino Acids，vol.1．Wiley，New York，1961 ，Chap 9．pp 728-750に記載されている）。ある方法を選択した後でさえ、当業者は、重要性のある化合物の容易な回収、高い収率、高い鏡像異性体過剰率、そしてあまり難しくない実験方法を与える、効果的で効率的なラセミ体の分割をするための適切な溶媒、補助溶媒(必要な場合)、温度、時間および他の条件を見つけるためにその後広範囲にわたって実験しなければならない。本発明は、Ｎ−アセチル−(D,L)−４−シアノフェニルアラニンと、そのＬ異性体であって、その後のAc-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂、すなわち化合物(II)の製造の中間体として使用されるものの分割についてのこれらの問題点を解決するものである。発明の要約本発明は、 a) 十分量の化合物(Ｉ)：十分量の水溶液、十分量のアセトニトリル、および化合物(Ｉ)の実質的な量と反応するのに十分量のズブチリシン（Subtilisin）を一緒にして、反応媒体を形成させ、そして b) その反応媒体を、ズブチリシンが添加される時に適切なpHに調節し、そして反応が起っている間、適切なpHに維持して、化合物(ＩＡ)を製造する、工程からなるＮ−アセチル−(Ｌ)−４−シアノフェニルアラニン、すなわち化合物(ＩＡ) の製造方法を提供するものである。本発明は、さらに a) 十分量の化合物(Ｉ)：十分量の水溶液、十分量のアセトニトリル、および化合物(Ｉ)の実質的な量と反応するのに十分量のズブチリシンを一緒にして、反応媒体を形成させ、そして b) その反応媒体を、ズブチリシンが添加される時に適切なpHに調節し、そして反応が起っている間、適切なpHに維持して、化合物(ＩＡ)：を製造し、 c) 化合物(ＩＡ)を化合物(３)：とカップリングさせて、化合物(４)：を生成させ、 d) 化合物(４)のシアノ基をアミジノ基に変換し、次いでピリジル基の窒素をメチル化して、化合物(II)を得る、工程からなる化合物Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2、すなわち、次の式の化合物 (II) またはその薬学的に許容される塩の製造方法を提供するものである。好ましい態様の詳細な説明次の用語は以下に記載される意味を有する。 (a) 用語「Ac」または「アセチル」は、式：の官能基を表わす。 (b) 用語「アミジノ」は、式：の官能基を表わす。 (c) 用語「ピリジル」は、式：の官能基を表わす。立体異性体は、空間における原子の配置に関してのみ異なる全ての異性体に対する一般的な用語である。これは、互いに鏡像でない一以上のキラル中心を持つ化合物の異性体（ジアステレオマーまたはジアステレオアイソマー）を包含する。用語「エナンチオマー」は、互いに重ね合わすことができない鏡像である二つの立体異性体を表わす。用語「キラル中心」は、四つの異なる基が付いている炭素原子を表わす。命名法Ｌ／ＤまたはＲ／Ｓは、生化学命名法に関するIUPAC−I UB合同委員会、Eur．J．Biochem．138：9-37(1984)に記載されているように用いられる。キラル物質は、等量のＲおよびＳ異性体（またはＬおよびＤ異性体）を含んでいるか（この場合、「ラセミの」または「ラセミ体」と呼ばれる）、あるいは等量のＲおよびＳ（またはＬおよびＤ異性体）を含まない（この場合、「光学活性な」または「非ラセミの」と呼ばれる）ことがある。用語「分割」は、ラセミ混合物を光学活性な成分に分離することを意味する。用語「鏡像異性体過剰率」または「ee」は、一つの鏡像体Ｅ１が、二つの鏡像体であるE2を加えたE1の混合物中、過剰である比率、すなわちを表わす。用語(＋)−は、(＋)−鏡像体を表わし、(−)−は、(−)−鏡像体を表わす。用語「薬学的に許容される塩」は、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸またはリン酸および酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、サリチル酸、２−アセチルオキシ安息香酸などの有機カルボン酸またはメタンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などの有機スルホン酸などの酸との反応により誘導されるこれらの酸付加塩を含む。もちろん医薬業界でよく知られた他の酸もまた利用することができる。ここで使用されている用語「アミノ酸」は、遺伝暗号から翻訳され、そして蛋白質の組立てブロックからなる、天然に存在しているアミノ酸を含むものと意味される。またこのアミノ酸の用語は、特に別な方法で記述されていない場合には、(Ｌ)−アミノ酸、(Ｄ)−アミノ酸、アミノ酸アナローグのような化学的に修飾されたアミノ酸、普通蛋白質に組み込まれていない天然に存在するアミノ酸をも含むものとする。本明細書の範囲に包含されるアミノ酸およびアミノ酸アナローグの略語は、表１に示される。スキーム１：化合物(Ｉ)の分割スキーム１：Ｎ−アセチル−(D,L)−４−シアノフェニルアラニンエチルエステルの分割そのエチルエステルのラセミ体（化合物(Ｉ)）は、その酸Ｎ−アセチル−４− シアノフェニルアラニン（化合物(ＩＡ)）のＬステレオアイソマーに分割されるが、一方そのエステルのＤステレオアイソマー（化合物Ｄ−(Ｉ)）は実質的にその酸に変換されない。このように、必要とされないエステルから所望される酸を分離することができる。以下により詳細に記載するように、本製造法により得られる酸は、その高いeeファクターによって示されるように、本来的にＬ異性体である。反応媒体を形成するために一緒にされる、十分量の化合物(Ｉ)とは、本発明の方法によるＬステレオアイソマーとして回収されるために要求される量の少なくとも２倍である。反応媒体は十分量のアセトニトリルと十分量の水溶液からなる。これらの十分量とは、本発明の方法により、その添加物を相互に作用させるために必要とされる。ここで用いられる「添加物」とは、反応媒体に加えられるあらゆる物を意味する。十分量のアセトニトリルとは、反応媒体中に化合物(Ｉ)の実質量を溶解する量でありうる。好ましくは、化合物(Ｉ)がアセトニトリル中に溶解され、水溶液がちょうど濁るようになる前まで、水溶液が徐々に加えられる。濁った溶液は化合物(Ｉ)アセトニトリルがその沈殿物を溶解するために必要とされることがある。例えば、十分量のアセトニトリルは、反応媒体の体積の約５〜９５％であり、より好ましくはその体積の約50〜60％である。好ましくは、化合物(Ｉ)が反応媒体１リットル当たり約20ｇ〜140ｇまでの濃度であり、より好ましくは１リットル当たり約35ｇ〜65ｇである。十分量の水溶液とは、反応媒体中に実質量の酵素ズブチリシンを溶解する量である。ここで用いられる限り、「水溶液」とは水からなる溶液であり、より好ましくは水と収率またはeeファクターを高めるのに役立つ他の添加物からなる溶液である。用語「溶液」とは、その水溶液に加えられる添加物が溶解していることを必ずしも意味しなく、また懸濁しているような、添加物が分散していることを意味してもよい。例えば、水溶液は更に添加物として十分量の、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウムなどの無機塩からなっていてもよい。好ましくは、無機塩は塩化カリウムである。無機塩の機能はズブチリシンを安定させることと信じられている。十分量の無機塩とは、ズブチリシンを安定させるのに十分な量である。これは水溶液１リットル当たり約0.02モル〜約0.20モルであり、より好ましくは１リットル当たり約0.05モル〜0.15モルである。例えば、塩化カリウム１Ｍの溶液は反応媒体の体積中約10〜約15パーセントの範囲内である。化合物(Ｉ)、アセトニトリルおよび水溶液と一緒にするのは、十分量のズブチリシンである。十分量のズブチリシンとは、化合物(Ｉ)の実質的な量（可能であるならば実際にはすべて）と反応することができる量である。これは化合物(Ｉ) の重量の約0.5〜約10ミリ当量である。反応媒体のpHは、その酵素が加えられたときに測定され、そして必要ならば適切なpHに調節される。適切なpHとは、酵素が反応することができるためのpHである。好ましくは適切なpHは約５〜約９であり、より好ましくは約6. 5〜約7.5である。化合物(Ｉ)とズブチリシンとの反応が起こっている間、適切な pHが維持される。これは約15分〜４時間であり、好ましくは攪拌しながら、または反応中促進するための他の適切な方法により行われる。適切なpHを維持するために、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどの十分量の塩基を加えることによる、好ましくは１Ｍ溶液中で、または例えば酢酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸水素ナトリウムなどの緩衝液もしくはりん酸水素アンモニウム、りん酸水素ナトリウムなどのりん酸バッファーを加えることによる、いかなる適切な手段も用いられてもよい。pHメーターが反応媒体のpHをモニターするために用いられてもよい。化合物(ＩＡ)は、例えば、その溶液が、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩の塩基性溶液の添加により希釈するなどのこの技術分野でよく知られた方法により集められうる。無機相は、例えばエーテル、塩化メチレン、クロロホルムなどの塩素化溶媒、トルエン、ヘプタンまたは酢酸エチルなどの有機溶媒により洗浄される。その水溶液は、例えば塩酸などの濃い酸を用いて、pHを約１〜３までに酸性化し、次いで有機溶媒で抽出すると化合物(ＩＡ)が得られる。表２および表３表２および表３は、水溶液とアセトニトリル(表２)、水溶液とアセトニトリルの代わりにジメチルスルホキシド(表３)で行なった反応の比較を示す。カラムＡは、分析で用いられた化合物(Ｉ)のグラム量を示す。カラムＢは、ジメチルスルホキシド（DMSO）またはアセトニトリル (CH₃CN)の、水の、および水溶液を調整するために用いられた塩化カリウム１Ｍの溶液のミリリットル（mL）量を示す。カラムＣは、用いられるズブチリシンのミリグラム（mg）量および化合物(Ｉ) の重量に対応するミリ当量（meq）を示す。カラムＤは、実験を行なうための時間を示す。カラムＥは、得られる化合物(ＩＡ)の鏡像異性体過剰率を示す。カラムＦは、得られる化合物(ＩＡ)の収率を示す。１．DMSOは化合物(ＩＡ)に存在し、除去するのは大変難しい。２．90℃／８torrで蒸発、酢酸エチル中に溶解、水（３×）で洗浄することによるDMSOの除去。３．化合物(ＩＡ)は固体として容易に単離される。これらの試験は、アセトニトリルが使用されたときに、化合物(ＩＡ)の容易な回収、高収率で、そして高い鏡像異性体過剰率で、効果的かつ効率的な分割が行われたことを示す。スキーム２スキーム２は、スキーム１の続きであり、化合物Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-N H2、化合物(II)の製造方法を示すものである。スキーム２の工程Ａにおいて、化合物(３)を化合物(ＩＡ)とカップリングすると化合物(４)が得られる。化合物(３)は、例えば、化合物(ＩＡ)を窒素などの不活性雰囲気下に、無水ジメチルホルムアミドまたは無水塩化メチレンなどの適切な無水有機溶媒に溶解するなどのアジド方法を用いてカップリングすることができる。この溶液に、ジフェニルホスホリルアジド、１〜４当量のジイソプロピルエーテルなどの適切な塩基および無水ジメチルホルムアミドまたは無水塩化メチレンなどの適切な無水有機溶媒に溶解された、少なくとも１当量の保護されたアミノ酸、化合物(３)を加える。次いで、反応混合物を約１〜15時間攪拌する。その後、カップリングされた化合物(４)が単離され、抽出技術、沈殿化、結晶化およびフラッシュクロマトグラフィーなどのこの技術分野でよく知られた技術により精製される。例えば、溶媒を蒸発し、カップリングされた化合物 (４)をエチルエーテルにより沈殿し、洗浄し、濾過により集める。スキーム２の工程ＢおよびＣにおいて、化合物(４)のシアノ基を化合物(II)のアミジノ基に変換する。この変換は、化合物(５)（化合物(４)のシアノ基の硫化水素との反応により形成される）の対応するメチルチオイミダートのアミノリシスにより、次いで1982年21日に発行され、1988年11月９日に再審査された、Wagn er et al.，DDR特許番号155,954(参照によって本明細書に加入する)に記載された方法により行われる。例えば、スキーム２の工程Ｂにおいて、化合物(４)をジメチルスルホキシドのような有機溶媒に溶解する。ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、2,6−ルチジン、コリジンなどの有機塩基を加える。化合物(４)がなくなるまで、硫化水素流を室温でその溶液に通じる。反応はさらに１〜18時間室温に保っていてもよい。化合物(５)を、沈殿および濾過などのよく知られた方法により集める。その後、その沈殿物をジエチルエーテルなどの有機溶媒で洗浄し、真空で乾燥した。スキーム２： Ac−(Ｌ)−pAph−Chg−Pal−Me(3)−NH₂の合成スキーム２の工程Ｃにおいて、化合物(５)のピリジル基をメチル化して、化合物(６)を得た。メチル化に対して、より一般的には、よう化メチル、臭化メチルまたは塩化メチルなどのハロゲン化メチルを用いてもよい。フルオロスルホン酸メチル、硫酸ジメチル、トルエン−ｐ−スルホン酸メチルおよびZoltewicz and Deady，Adv．Heterocycl．Chem．22，71-121(1978)、およびDu ffin，Adv．Heterocycl．Chem．3，1-56(1964)（これらは参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されている他のメチル化剤もまた用いてもよい。好ましくは過剰のハロゲン化メチル、さらに好ましくは過剰のよう化メチルが用いられる。反応は、メタノールおよびエタノールのようなアルコール、アセトン、クロロホルム、アセトニトリル、ニトロベンゼンおよびジメチルホルムアミドなどの溶媒中で行われる。さらに好ましくは、反応はアセトンとジメチルスルホキシドの混合溶媒中で行なわれ、室温で１〜24時間攪拌される。化合物(６)は、例えば過剰のよう化メチルを蒸発し、化合物(６)をエチルエーテルにより沈殿し、デカンテーションにより集め、洗浄し、乾燥するなどのよく知られた方法により単離される。スキーム２の工程Ｄにおいて、化合物(６)のメチルチオイミデートを対応する化合物(II)のアミジノ基にさらに変換する。好ましくは化合物(６)をメタノールなどの有機溶媒に、更に好ましくは酢酸の存在下に溶解する。酢酸アンモニウムをその溶液に加える。反応を好ましくは40℃〜65℃の温度範囲で、さらに好ましくは50℃〜60℃の範囲で加熱し、この温度で２〜３時間維持する。化合物(II)をこの技術分野でよく知られた方法により単離し、そして薬学的に許容される塩として単離してもよい。例えば、溶媒を蒸発し、残留物をアセトニトリルに溶解し、トリフルオロ酢酸を加えて沈殿し、濾過し、真空下で乾燥された。次の実施例は、スキーム１およびスキーム２に記載された典型的な合成を表わす。これらの実施例は説明するものと理解され、決して本発明の範囲を限定するものではない。当業者に認識されているように、各スキームにおいて、各工程が行われる順序は任意である。出発物質は市販され入手可能なものであるか、またはよく知られた方法により容易に製造されるものである。本明細書中で用いられている次の用語はその指示された意味を持つ。「ｇ」はグラムを表わし、「mol」はモルを表わし、「mmol」はミリモルを表わし、「Ｌ」はリットルを表わし、「mL」はミリリットルを表わし、「μL」はマイクロリットルを表わし、「mp」は融点を表わし、「℃」は摂氏温度を表わし、「TLC」は薄層クロマトグラフィーを表わし、「Ｍ」はモル濃度を表わし、そして「R_f」は保持ファクターを表わす。実施例１ (D,L)−Ｎ−アセチル−４−シアノフェニルアラニン Ac-(D,L)-Phe(4-CN)-OH 工程Ａ：ジエチル４−シアノベンジルアセタミドマロネートジオキサン（400mL）中にジエチルアセタミドマロネート（44ｇ、0.203mol）、アルファーブロモ−ｐ−トルオニトリル(40ｇ、0.204mol)、よう化カリウム(1 0ｇ)を懸濁し、ナトリウムエトキサイド(200mLの乾燥エーテルに4.6ｇのナトリウム)の溶液を加えた。その混合物を３〜４時間、還流下加熱し、一晩放置した。氷（２Ｌ）上にその混合物を注ぎ、沈殿物を濾過し、水で洗浄し、凍結乾燥機で乾燥した。メタノールから再結晶して、ジエチル４−シアノベンジルアセタミドマロネートを白色結晶として得た（61ｇ、91％）。工程Ｂ：Ｎ−(D,L)−アセチル−４−シアノフェニルアラニンエチルエステル Ac-(D,L)Phe(4-CN)-OEt エタノール（0.6Ｌ）中に４−シアノベンジルジエチルアセタミドマロネート( 41.97ｇ、0.126mol)を懸濁した。次の間隔：０分で10mL(60mmol)、30分後に10mL （60mmol）、３時間後に５mL（30mmol）で、水酸化ナトリウム（６Ｍ）を加えた。出発物質が消失するまで（TLC、酢酸エチル、Rf＝0.63）、水酸化ナトリウム（ＧＭ）を添加して反応液を攪拌した。水(100 mL)で溶液を希釈し、濃塩酸を添加してpHを３に調整した。エタノールを蒸発させ、半固形上の生成物を一晩凍結乾燥して、Ｎ−アセチル−４−シアノベンジルモノエチルアセタミドマロネートを得た。乾燥したジオキサン(0.5Ｌ)中に、このようにして得られたＮ−アセチル−４ −シアノベンジルモノエチルアセタミドマロネートを懸濁し、還流下2.5〜３時間加熱した。ジオキサンを蒸発させて、酢酸エチル（250mL）中に固体を懸濁し、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液（３×）、水、塩酸(0.5Ｍ)そしてブラインで抽出した。酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、次いで蒸発させた。酢酸エチル／ヘキサンからその生成物を再結晶して、28.95ｇ（88％）のＮ−（D,L）−アセチル−４−シアノフェニルアラニンエチルエステルを得た。実施例２ Ac-(D,L)Phe(4-CN)-OEt（６：４；Ｄ：Ｌ）の酵素による分割および（Ｌ）−Ｎ −アセチル−４−シアノフェニルアラニン Ac-(L)Phe(4-CN)-OHの製造 Ac-(D,L)Phe(4-CN)-OEt(６：４；Ｄ：Ｌ、67ｇ)のアセトニトリル（１Ｌ）溶液に塩化カリウム溶液（１Ｍ、241mL）と水（600mL）を加えた。その溶液のpHを 7.3〜6.9に調整し、ズブチリシンカールズバーグ(50mg)の塩化カリウム水溶液（８mL、0.1Ｍ）を加えた。水酸化ナトリウム(１Ｍ)で滴定することにより、溶液のpHを維持した。一時間後、ズブチリシン(50mg)の塩化カリウム水溶液（８mL 、0.1Ｍ）を加え、次いで水酸化ナトリウム（１Ｍ）で滴定することにより、溶液のpHを維持した。2.5時間後、炭酸水素ナトリウム溶液（800mL）を加え、酢酸エチル（４×800mL）で抽出した。酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、その混合物を濾過した。濾液を濃縮して、Ac-(D)Phe(4-CN)-OEtを固体として得た（38ｇ、95％、90％ee）。水層を濃塩酸（56mL）でpH１まで酸性にした。水層を酢酸エチル（４×800mL）で抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、その混合物を濾過した。濾液を濃縮して、Ac-(L)Phe(4-CN)-OHを固体として得た（21ｇ、88％）。 mp 124〜126℃、99.4％ee 実施例３Ｎ−アセチル−(Ｌ)−ｐ−アミジノフェニルアラニン Ac-(L)-pAph-(L)-Chg-(L)-PalMe(3)-NH₂ 工程Ａ：Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−(Ｌ)−β−（３−ピリジル） −アラニンアミド Boc-(L)-Pal-NH₂ 塩化メチレン（50mL）にBoc-(L)-Pal-OH（1.34ｇ、5mmol）を懸濁し、−15℃ まで冷却した。ジイソプロピルエチルアミン(963μL、5.5mmol)とイソブチルクロロホルメート(715μL、5.5mmol)を加えた。その混合物を、−15 ℃で15分間攪拌した。その溶液に無水アンモニア（固体水酸化ナトリウムを用いて）の激しい気流を約３分間通じた。その混合物を−15℃で10分間、次いで室温で20分間攪拌した。塩化メチレンを蒸発させ、酢酸エチル（70mL）を加え、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させた。酢酸エチル／ヘキサンから結晶化して、Boc-(L)-Pal-NH₂を得た（0.98ｇ、7 5％）。工程Ｂ：(Ｌ)−β−（３−ピリジル）−アラニンアミド塩酸塩 H-(L)-Pal-NH₂・2HCl 軽く加熱しながら、塩化メチレン（15mL）中にBoc-(L)-Pal-NH₂（0.98ｇ）を懸濁し、塩酸のジオキサン溶液（４Ｍ、10mL）を加えた。30分後、塩化メチレンとジオキサンを蒸発させた。固体をメタノールに溶解し、エーテルを加えて沈殿し、次いで濾過して、H-(L)-Pal-NH₂・2HClを得た(0.86ｇ、98％)。工程Ｃ：Ｎ−t-ブチルオキシカルボニル−(Ｌ)−シクロヘキシルグリシン −(Ｌ)−β−（３−ピリジル）−アラニンアミド Boc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂ H-(L)-Pal-NH₂・2HCl（432mg、1.82mmol）、Boc-(L)-Chg-OH(609mg、2.37mmol 、1.3当量)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(494mg、2.4mmol)、ヒドロキシベンゾトリアゾール（324mg、2.4mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（４mm ol）をジメチルホルムアミド（15mL）中で一晩攪拌した。ジメチルホルムアミドを蒸発させ、酢酸エチルを加え、次いでその混合物を室温で１時間おいた。形成されたジイソプロピルカルボジイミドシクロヘキシル尿素を濾去し、その水溶液を炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（３×）により抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで蒸発させた。ヘキサンを添加し結晶化して、Boc-(L)-Chg-(L)-Pal- NH₂を得た（598mg、81％）。工程Ｄ：(Ｌ)−シクロヘキシルグリシン−（Ｌ）−β−（３−ピリジル）− アラニンアミド塩酸塩 H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂・2HCl 塩化エチレン(50mL)中にBoc-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂(1.27ｇ、3.12mmol)を懸濁し、塩酸（10mL、４Ｍジオキサン）を加えた。30分間後、ジオキサンと塩化メチレンを蒸発し、その固体をメタノールに溶解し、エーテル(200mL)を加えて生成物を沈殿し、次いで濾過して、H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂・2HClを得た（1.12ｇ、9 5％）。工程Ｅ：Ｎ−アセチル−ｐ−シアノフェニルアラニン−(Ｌ)−シクロヘキシルグリシン−(Ｌ)−β−（３−ピリジル）−アラニンアミド Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂ ジメチルホルムアミド(30mL)中で、H-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂・2HCl(1.13ｇ、３ mmol)、Ac-(L)Phe(4-CN)-OH(0.84ｇ、3.6mmol)、ジイソプロピルエチルアミン(1 0mmol)およびジフェニルホスホリルアジド(803μl、3.6mmol)を一晩攪拌した。ジメチルホルムアミドを蒸発し、エーテルで沈殿し、濾過し、エーテルで洗浄して、Ac-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂を得た（1.282ｇ、82％）。工程Ｆ：Ｎ−アセチル−(Ｌ)−ｐ−チオアミドフェニルアラニン−(Ｌ)− シクロヘキシルグリシン−(Ｌ)−β−（３−ピリジル）−アラニンアミド Ac-(L)-Phe(４−チオアミド)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂ ジメチルスルホキシド（20〜40mL）にAc-(L)-Phe(4-CN)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂ （1.18ｇ、2.28mmol）を溶解し、ピリジン(40mL)とトリエチルアミン（14mL）を加えた。その溶液に室温で30分間硫化水素を通じた。その溶液を室温で一晩放置し、小容量になるまで蒸発し、ジエチルエーテルにより生成物を沈殿した。数時間冷蔵庫に放置し、濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥して、Ac-(L)-Phe(４−チオアミド)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂を黄色固体として得た（1.26ｇ）。工程Ｇ：Ｎ−アセチル−ｐ−メチルチオアミデートフェニルアラニン−シクロヘキシルグリシン−(Ｌ)−β−（３−メチルピリジニウム） −アラニンよう化水素酸塩 Ac-(L)-Phe(４−メチルチオアミデート)-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)- NH₂・2HI ジメチルスルホキシド(10〜20mL)とアセトン(80mL)中にAc-(L)-Phe(４−チオアミド)-(L)-Chg-(L)-Pal-NH₂（1.2ｇ）を懸濁した。よう化メチル（14mL、50当量）を加えた。反応混合物を室温で一晩維持し、アセトンと過剰のよう化メチルを蒸発した。ジエチルエーテル（0.5〜1.1）により沈殿した。数時間後、４℃でデカントしまたはジエチルエーテルを濾過し、次いで壁に付いている半固体をジエチルエーテルおよび酢酸エチルで洗浄した。生成物を真空で乾燥して、Ac-(L) -Phe(４−メチルチオアミデート)-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)-NH₂・2HIを得た（1.31 ｇ）。工程Ｈ：Ｎ−アセチル−(Ｌ)−ｐ−アセタミドフェニルアラニン−シクロヘキシルグリシン−(Ｌ)−β−（３−Ｎ−メチルピリジニウム） −アラニンアミドトリフルオロ酢酸塩 Ac-(L)-pAphe-(L)-Chg-(L)-PalMe-NH₂・TFA メタノール(50mL)と酢酸（0.5mL）中にAc-(L)-Phe(４−メチルチオアミデート )-(L)-Chg-(L)-Pal(Me)-NH₂・2HI（1.31ｇ）を溶解した。酢酸アンモニウム(0.8 ｇ)を加えた。その混合物を３時間、55℃まで加熱し、蒸発し、アセトニトリル／水（0.1％トリフルオロ酢酸）(１：１)に溶解し、濾過し、凍結乾燥して、Ac- (L)-pAphe-(L)-Chg-(L)-PalMe-NH₂・TFAを得た（1.22ｇ）。本発明は、Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂、すなわち化合物(II)の製造に有効な、中間体Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、化合物(ＩＡ)の製造に関する。この最終化合物は、血液凝固蛋白質の阻害、特に血液凝固酵素「Xa」因子の阻害に有用であり、より詳細には1995年４月25日に出願された米国出願08／428,40 4に記載されており、この開示は参照によって本明細書に加入する。ここで用いられる限り、用語「Xa因子活性」とは、プロトロンビンのトロンビンへの変換を触媒するために、単独でまたはプロトロンビナーゼ複合体として知られているサブユニットの集合でのXa因子の働きを表わす。Xa因子活性について用いられる場合、用語「阻害」とは、Xa因子活性の直接的なおよび間接的な阻害の両方とも含まれる。Xa因子活性の直接的な阻害は、例えば、プロトロンビナーゼ複合体活性部位に対するプロトロンビンの結合を妨げるように、Xa因子にまたはプロトロンビナーゼにペプチドを結合することにより行われる。ここで用いられる限り、Xa因子活性の阻害について用いられる場合の用語「特異的な」とは、化合物が他の特定のプロテアーゼの活性を実質的に阻害することなくXa因子活性を阻害すること（同濃度の阻害剤を用いて）を意味するものである。このような他の特定のプロテアーゼは、例えば、トロンビン、プラスミン、トリプシンおよびエラスターゼなどの凝固カスケードに必要とされる、これらのプロテアーゼを包含する。ある疾患状態で、循環系統内での血液凝固の形成がそれ自身病的状態の原因ではあるが、凝固系を完全に阻害することは命にかかわる出血を引きおこす恐れがあるため望ましくない。血液凝固の過程は、次第に拡大された一連の酵素活性反応（その反応では、血漿酵素原が限定された蛋白質分解により引続き活性化される）を伴う複雑な過程である。機構的には、血液凝固カスケードは、「内因的」または「外因的」な二つの経路に分けられる。これらの経路は、単一の「共通経路」を通して進行するトロンビンのその後の発生過程からＸ因子の活性化に収束する。内因性の経路からはフィブリン形成の維持および増加に重要な役割をし、一方外因性の経路は血液凝固の開始段階に重大であることが今までの証拠より示唆されている。組織因子／VIIａ因子複合体の形成時に、血液凝固が物理的に開始されることが現在一般的に受け入れられている。一度形成されると、この複合体が IXおよびＸ因子を活性化することにより、凝固を迅速に開始する。その後、新たに生成されたXaは、因子VIａとリン脂質１対１の複合体を形成する。プロトロンビナーゼと呼ばれるこの複合体が原因で可溶なフィブリノーゲンが不溶なフィブリンへ変換する。時間経過とともに、 VIIａ因子／組織因子複合体の活性（外因性の経路）は、Xa因子に複合される時、VIIａ因子／組織因子の蛋白質分解活性を直接阻害することができる、クーニツ型(Kunitz-type)プロテアーゼ阻害蛋白質、TFPIにより抑制される。阻害された外因性系の存在時に凝固過程を維持するために、さらにXa因子が内因性経路のトロンビン−媒介された活性を経て生産される。このように、トロンビンはそれ自身の生産およびフィブリノーゲンのフィブリンへの変換を媒介する「自動触媒的な」二重の役割をする。トロンビン生産の自動触媒的な性質は制御されない出血に対する重要な保護である。一度得られた閾値レベルのプロトロンビナーゼが存在すると、血液凝固は完了するまで進み、例えば、出血の終結が達成されるだろう。このように直接にトロンビンを阻害することなく凝固を阻害する薬剤を開発することが非常に望まれている。本発明の方法を経て合成され、ペプチドアナローグである化合物、Ac-pAph-Ch g-PalMe(3)-NH₂は、Xa因子活性の有効な阻害剤を供給し、血液凝固に必要とされる他のプロテアーゼの活性を実質的に阻害しない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (54)【発明の名称】Ｎ―アセチル―（Ｌ）―４―シアノフェニルアラニンＡｃ―（Ｌ）―Ｐｈｅ（４―ＣＮ）―ＯＨおよびＮ―アセチル―（Ｌ）―ｐ―アミジノフェニルアラニン―シクロヘキシルグリシン―β― （３―Ｎ―メチルピリジニウム）―アラニンＡｃ―（Ｌ）―ｐＡｐｈ―Ｃｈｇ―ＰａｌＭｅ（３）―ＮＨ▲下２▼の新規な製法

Claims

【特許請求の範囲】１．a) 十分量の化合物(Ｉ)：十分量の水溶液、十分量のアセトニトリル、および化合物(Ｉ)の実質的な量と反応するのに十分量のに十分量のズブチリシンを一緒にして、反応媒体を形成させ、そして b) その反応媒体を、ズブチリシンが添加される時に適切なpHに調節し、そして反応が起っている間、適切なpHに維持して、化合物(ＩＡ)を製造する、工程からなるＮ−アセチル−(Ｌ)−４−シアノフェニルアラニン、すなわち化合物(ＩＡ) の製造方法。２．十分量のアセトニトリルが反応媒体の体積の約５〜95％である請求項１記載の方法。３．十分量のアセトニトリルが水溶液の体積の約50〜約60％である請求項１記載の方法。４．水溶液が十分量の無機塩からなる請求項１記載の方法。５．十分量の無機塩が無機塩の１モル溶液の水溶液の体積の約10〜約15％である請求項４記載の方法。６．無機塩が塩化カリウムである請求項５記載の方法。７．十分量の塩基を添加することにより反応媒体の適切なpHを調節し、そして維持する請求項１記載の方法。８．塩基が水酸化ナトリウムである請求項７記載の方法。９．十分量のバファーを添加することにより反応媒体の適切なpHを調節し、そして維持する請求項１記載の方法。 10．バファーがりん酸塩溶液である請求項９記載の方法。 11．反応媒体の適切なpHをpH約５〜約９で調節し、そして維持する請求項１記載の方法。 12．反応媒体の適切なpHをpH約6.5〜約7.5で調節し、そして維持する請求項１記載の方法。 13．十分量のズブチリシンと実質量の化合物(Ｉ)間で、約15分〜約４時間、反応が起こっている間、さらに反応媒体を攪拌することからなる請求項１記載の方法。 14．十分量のズブチリシンが化合物(Ｉ)の重量の約0.5〜約10ミリ当量である請求項１記載の方法。 15．反応媒体から化合物(ＩＡ)を集めるさらなる工程からなる請求項１記載の方法。 16．a) 十分量の化合物(Ｉ)：十分量の水溶液、十分量のアセトニトリル、および化合物(Ｉ)の実質的な量と反応するのに十分量のズブチリシンを一緒にして、反応媒体を形成し、そして b) その反応媒体を、ズブチリシンが添加される時に適切なpHに調節し、そして反応が起っている間、適切なpHに維持して、化合物(ＩＡ)：を製造し、 c) 化合物(ＩＡ)を化合物(３)：とカップリングさせて、化合物(４)：を生成させ、 d) 化合物(４)のシアノ基をアミジノ基に変換し、次いでピリジル基の窒素をメチル化して、化合物(II)を得る、工程からなる化合物Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH₂、すなわち化合物 (II) またはその薬学的に許容される塩の製造方法。 17．十分量のアセトニトリルが水溶液の体積の約５〜95％である請求項16記載の方法。 18．十分量のアセトニトリルが水溶液の体積の約50〜約60％である請求項16記載の方法。 19．水溶液が十分量の無機塩からなる請求項16の方法。 20．十分量の無機塩が無機塩の１モル溶液の水溶液の体積の約10〜約15％である請求項19記載の方法。 21．無機塩が塩化カリウムである請求項20記載の方法。 22．十分量の塩基を添加することにより反応媒体の適切なpHを調節し、そして維持する請求項16記載の方法。 23．塩基が水酸化ナトリウムである請求項22記載の方法。 24．十分量のバファーを添加することにより反応媒体の適切なpHを調節し、そして維持する請求項16記載の方法。 25．バファーがりん酸塩溶液である請求項24記載の方法。 26．反応媒体の適切なpHをpH約５〜約９で調節し、そして維持する請求項16記載の方法。 27．反応媒体の適切なpHをpH約6.5〜約7.5で調節し、そして維持する請求項16記載の方法。 28．十分量のズブチリシンと実質量の化合物(Ｉ)間で、約15分〜約４時間、反応が起こっている間、さらに反応媒体を攪拌することからなる請求項16記載の方法。 29．十分量のズブチリシンが化合物(Ｉ)の重量の約0.5〜約10ミリ当量である請求項16記載の方法。 30．反応媒体から化合物(ＩＡ)を集めるさらなる工程からなる請求項16記載の方法。