JP2000501623A

JP2000501623A - アスパラギン酸プロテアーゼ

Info

Publication number: JP2000501623A
Application number: JP10513354A
Authority: JP
Inventors: ポウェル，デビッド; ケイ，ジョン; ヒル，ジェフリー
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd
Priority date: 1996-09-11
Filing date: 1997-09-09
Publication date: 2000-02-15
Also published as: EP0912747A1; GB9618966D0; WO1998011236A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびに該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に関する。さらに特定すると、本発明のポリペプチドは新規なアスパラギン酸プロテアーゼであると考えられる。本発明はまた、かかるポリペプチドの作用を阻害することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】アスパラギン酸プロテアーゼ本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびに該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に関する。さらに特定すると、本発明のポリペプチドは新規なアスパラギン酸プロテアーゼであると想定される。本発明はまた、該ポリペプチドの作用を阻害することに関する。現在、５種類のヒトアスパラギン酸プロテアーゼ、すなわち、ペプシン、ガストリシン、カテプシンＤ、カテプシンＥおよびレニンが知られており、これらは様々な機能を有する。ペプシンとガストリシンは胃の中の栄養プロセスに関与しており、カテプシンＤはほぼ全ての細胞型におけるタンパク質の代謝回転に係わりがあり、そしてレニンは前駆体アンギオテンシノーゲンからのアンギオテンシンの生成という高度に特異的な機能を有している。カテプシンＥの正確な役割は今のところ確認されていないが、それがいくつかの上皮細胞型に存在していることは抗原プロセシングにおける役割を示唆している。カテプシンＥはまた、ある種の炎症状態、例えば胃のヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)感染に関与している可能性がある。新規なアスパラギン酸プロテアーゼは細胞外機能をもっている可能性がある。アスパラギン酸プロテアーゼを必要とすると考えられるが、関与する正確な酵素がまだ同定されていないプロセスは目下数多く存在する。関係があるとされる重要な機能はエンドセリンおよびプロ-オピオメラノコルチン・プロホルモンのプロセシングである。アスパラギン酸プロテアーゼは血清アミロイドＡタンパク質のプロセシングにも関与していると考えられる。アスパラギン酸プロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解切断に必要とされるアスパラギン酸(Asp)残基対ゆえに、そのように呼ばれている。触媒Asp残基は通常-Hyd-Hyd-Asp-Thr-Gly-活性部位モチーフ配列（ここでHydは任意の疎水性アミノ酸である）内に位置している。真核生物のアスパラギン酸プロテアーゼは普通このような配列を２つ保有しており、これらの配列は酵素の活性部位に互いに隣接して存在していることが結晶学により明らかにされた。これら。酵素のもう一つの高度に保存された部分はβ-ヘアピンループ構造（「flap」とも言う）を含み、この構造は活性部位の上にあり、基質の結合を支援している可能性がある。 1996年10月22〜27日に開催された第VII回アスパラギン酸プロテアーゼ国際会議でのプレゼンテーションにおいて、Okalahoma Medical Research Foundation のTangらによって新規なアスパラギン酸プロテアーゼが発表された。本発明の一態様によると、配列番号１または配列番号１５に示したアミノ酸配列を含んでなる新規ポリペプチドまたはその断片、類似体もしくは誘導体が提供される。本発明のポリペプチドはヒト由来のものである。このポリペプチドはアスパラギン酸プロテアーゼであると考えられる。本発明のポリペプチドには、さらに、配列番号１または１５に含まれるアミノ酸配列をもつポリペプチド、および配列番号１または１５のアミノ酸配列のいずれかに対して、その全長にわたり、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは少なくとも97〜99％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。また、配列番号１または１５のアミノ酸配列のいずれかに対して、その全長にわたり、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは少なくとも 97〜99％の同一性を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドも含まれる。本発明のポリペプチドには、さらに、配列番号２または１６のヌクレオチド配列に対して、その全長にわたり、少なくとも80％の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる。これらのポリペプチドは「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加のアミノ酸配列を含めることが有利であり、このようなアミノ酸配列としては、分泌すなわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、または組換え体生産の際の安定性を確保する付加的配列などがある。また、ポリペプチドの断片も本発明に含まれる。こうした断片は全体的に前記ポリペプチドのアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このような断片は「フリースタンディング」(free-standing)であっても、より大きいポリペプチド内に含まれていてもよく、つまりその大きいポリペプチドの一部または一領域、最も好ましくは一つの連続領域、をその断片が構成していてもよい。本発明のポリペプチド断片の代表的な例として、およその見当でアミノ酸番号１−20、21−40、41−60、61−80、 81−100、および101から配列番号１または１５のポリペプチドの末端までの断片が挙げられる。ここで、「およそ」とは、上記の範囲の一端または両端で数個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸が増えたり減ったりした範囲を含むものである。好適な断片としては、例えば、アミノ末端を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連の残基の欠失、またはアミノ末端を含むものとカルボキシル末端を含むものとの二連の残基の欠失を除外すれば、配列番号１または１５のアミノ酸配列を有する末端切断型(truncation)ポリペプチドが含まれる。また、α ヘリックスとαヘリックス形成領域、βシートとβシート形成領域、ターンとターン形成領域、コイルとコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を含む断片のような、構造的または機能的特性により特徴づけられる断片も好適である。その他の好適な断片は生物学的に活性な断片である。生物学的に活性な断片は、同様の活性をもつ断片、その活性が増加した断片、または望ましくない活性が減少した断片を含めて、生物学的活性例えばアスパラギン酸プロテアーゼ活性を媒介するものである。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性がある断片も含まれる。これらのポリペプチド断片はどれも、抗原活性を含めた前駆体ポリペプチドの生物学的活性を保持することが好ましい。特定された配列および断片の変異型も本発明の一部を構成する。好適な変異型は同類アミノ酸置換により対象物と異なるもの、すなわち、ある残基が同様の性質をもつ他の残基で置換されているものである。典型的なこうした置換は、Ala，Val，LeuおよびIleの間；SerとThrの間；酸性残基AspとGluの間；AsnとGlnの間；塩基性残基LysとArgの間；または芳香族残基PheとTyrの間で起こる。特に、数個、５〜10個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失または付加されている変異型が好適である。本発明のポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。このようなポリペプチドには、単離された天然のポリペプチド、組換え的に生産されたポリペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の組合せにより製造されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチドの製造手段は当業界でよく理解されている。本発明の他の態様によると、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が提供される。本発明の好ましい態様では、配列番号１または配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。特に、本発明は、配列番号２または配列番号１６に示したＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、配列番号２または配列番号１６に示したＤＮＡ配列を含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドには、さらに、配列番号１または配列番号１５のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、その全長にわたり、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号２または配列番号１６のヌクレオチド配列に対して、その全長にわたり、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。さらに、少なくとも97％の同一性をもつものが一層好ましく、少なくとも98〜99％の同一性をもつものがより一層好ましく、少なくとも99％の同一性をもつものが最も好ましい。配列番号２および配列番号１６のｃＤＮＡに対して広範な同一性部分を示すｃＤＮＡ分子（ＥＳＴ）がさまざまな源から作製されたヒト由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて同定された。これらのＥＳＴは配列番号３〜１４に示される。配列番号：ライブラリー：配列番号３（EST 176432） Raji細胞、シクロヘキサミド処理した配列番号４（EST 424772）ヒトＢ細胞リンパ腫配列番号５（EST 443275）胸部リンパ節ｃＤＮＡライブラリー配列番号６（EST 567394） Raji細胞、シクロヘキサミド処理した配列番号７（EST 685578）ヒト活性化単球配列番号８（EST 928138）胎児肝臓、サブトラクションII 配列番号９（EST 947785）胸部リンパ節ｃＤＮＡライブラリー配列番号10（EST 1000163）脊髄配列番号11（EST 1218021）脾臓、慢性リンパ性白血病配列番号12（EST 1320439）ヒト扁桃腺、lib２配列番号13（EST 716478） cd34枯渇バッフィーコート臍帯血配列番号14（EST 857644）ヒト成人精巣、ラージインサートしたがって、更なる態様において、本発明は、配列番号３〜１４から選択される１以上の部分的ＤＮＡ配列により特徴づけられるアスパラギン酸プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。配列番号２および配列番号１６のポリヌクレオチドは構造的にアスパラギン酸プロテアーゼファミリーと関係がある。配列番号２および配列番号１６はそれぞれ1376個および1347個のヌクレオチドを有する。第１（すなわちＮ末端）の活性部位モチーフは-Ala-Phe-Asp-Thr-Gly-であると考えられ、少なくとも２つのＥＳＴ（配列番号１１および１２）により、それぞれの場合に同一のＤＮＡ配列(- GCC-TTT-GAC-ACT-GGC-)でコードされている。第２（すなわちＣ末端）の活性部位モチーフは-Ile-Leu-Asp-Thr-Gly-であると考えられ、少なくとも１つのＥＳＴ（配列番号１３）により（ＤＮＡ配列-ATC-CTG-GAT-ACA-GGC-で）コードされている。この酵素の保存されたflap領域は-Tyr-Gly-Thr-Gly-であると考えられ、すべての場合に同一のＤＮＡ配列（-TAT-GGA-ACT-GGG-）を有する少なくとも４つのＥＳＴ（配列番号９、１０、５および１２）によりコードされている。配列番号１および配列番号１５の配列は、新規なアスパラギン酸プロテアーゼの成熟型の全長を含み、さらにプロ部分（またはプロセグメント）を含有する約60アミノ酸を含むと想定される。配列番号１中に開始Met残基も同定され、ヌクレオチド26からＯＲＦが開始する。簡便なblast配列解析からは、配列番号１５のポリペプチドはニワトリ由来のプレプロカテプシンＤに対して最も高い相同性を示すことが示される。しかしながら、配列番号１および配列番号１５のポリペプチドは、機能的なレベルでは、Ｎ末端活性部位モチーフをコードする配列の直前にあるカテプシンＥ特異的グリコシル化部位(-Asn-Phe-Thr-)の存在ゆえにカテプシンＥに最も類似していると思われる。このポリペプチドと関連したＥＳＴが多くの細胞型に広く分布していることにより、コードされたポリペプチドは（カテプシンＥとカテプシンＤに類似した）非特異的加水分解機能をもつことが示唆される。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形であっても、ＤＮＡの形であってもよく、ＤＮＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡが含まれる。このＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖の場合はコード鎖であっても非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。本発明のポリペプチドをコードするコード配列は、配列番号２または配列番号１６に示されるコード配列と同一であっても、遺伝子コードの重複性または縮重のため、配列番号２または配列番号１６のＤＮＡと同じポリペプチドをコードする異なるコード配列であってもよい。本発明は、配列番号１または配列番号１５のアミノ酸配列をもつポリペプチドの断片、類似体および誘導体をコードする前記ポリヌクレオチドの変異体を包含する。ポリヌクレオチド変異体はポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体または天然に存在しない変異体であり得る。かくして、本発明は、配列番号１または配列番号１５に示したポリペプチドと同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに該ポリペプチドの断片、誘導体または類似体をコードする前記ポリヌクレオチドの変異体を包含する。このようなヌクレオチド変異体には欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体が含まれる。本発明のポリヌクレオチドは配列番号２または配列番号１６のコード配列の天然のアレル変異体であるコード配列をもっていてもよい。当技術分野で知られているように、アレル変異体はコードされるポリペプチドの機能を実質的に変えない１個以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有するポリヌクレオチド配列の別の形態である。配列番号１または配列番号１５のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、該ポリペプチドのコード配列のみ、該ポリペプチドのコード配列とリーダーもしくは分泌配列またはプロタンパク質配列のような付加的コード配列、および該ポリペプチドのコード配列（および場合により付加的コード配列）と成熟ポリペプチドのコード配列の５'および／または３'側の非コード配列やイントロンのような非コード配列を含むことができる。こうして、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、該ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドばかりでなく、付加的コード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドをも包含する。本発明は、したがって、該ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌に役立つポリヌクレオチド配列（例えば、宿主細胞からのポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列）に同じリーディングフレームで融合されたポリヌクレオチドを含む。リーダー配列をもつポリペプチドはプレタンパク質であり、このリーダー配列が宿主細胞によって切断されると成熟型のポリペプチドが生成する。こうしたポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質に５'アミノ酸残基が付加されているプロタンパク質をコードすることもできる。プロ配列をもつ成熟タンパク質はプロタンパク質であり、該タンパク質の不活性型である。このプロ配列が切断されると、活性な成熟タンパク質となる。かくして、例えば、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパク質、プロ配列をもつタンパク質、またはプロ配列とプレ配列（リーダー配列）の両方をもつタンパク質をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に同じリーディングフレームで融合されたコード配列を有していてもよい。このマーカー配列はｐＱＥ-9ベクターにより供給されるヘキサ-ヒスチジンタグであり得、細菌宿主の場合にはこのマーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を可能にし、また、例えば、哺乳動物宿主（例：ＣＯＳ-7細胞）を用いる場合のマーカー配列は赤血球凝集素（ＨＡ）タグであり得る。このＨＡタグはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から誘導されたエピトープに相当する (Wilson，I.ら，Cell，37:767(1984))。本発明はさらに、配列間に少なくとも50％、好ましくは70％の同一性が存在するとき上記配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いる「ストリンジェント条件」とは、配列間に少なくとも95％、好ましくは少なくとも97％の同一性が存在するときだけハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。好ましい態様において、上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号１５のポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチドをコードする。配列番号１または配列番号１５のポリペプチドを言及するときの「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、かかるポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチドを意味する。こうして、類似体には、プロタンパク質部分の開裂により活性化されて成熟型の活性ポリペプチドを生成するプロタンパク質が含まれる。本明細書中で用いる「同一性」という用語はヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最大級のマッチ（一致）が得られるように配列をアライメントする。「同一性」それ自体は当技術分野で認識された意味をもち、発表された技法を使って計算することができる。例えば、COMPUTATIONALM OLECULAR BIOLOGY，Lesk，A.M．編，Oxford University Press，New York，1988 ; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS，Smith，D.W．編，Academi c Press，New York，1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PARTI，Grif fin，A.M．and Griffin，H.G．編，Humana Press，New Jersey，1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von Heinje，G.，Academic Press，1987; およびSEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribskov，M．and Devereux，J.編，M Stockto n Press，New York，1991を参照のこと。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を決定する方法は多数存在していると同時に、「同一性」なる用語は当業者には公知である（Carillo，H．and Lipton，D.，SIAM J Appli ed Math（1988）48:1073）。２つの配列間の同一性または類似性を決定するために汎用される方法としては、Guide to Huge Computers，Martin J. Bishop編，Academic Press，San Diego，1994およびCarillo，H．and Lipton，D .，SIAM J Applied Math（1988）48:1073に記載される方法があるが、これらに限らない。同一性および類似性の決定方法はコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好適なコンピュータプログラム法としては、GCSプログラムパッケージ(Devereux，J.ら，Nuclei c Acids Research（1984）12(1):387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F. ら，J Molec Biol（1990）215:403)があるが、これらに限らない。一例として、配列番号２／１６の基準ヌクレオチド配列に対して、例えば、少なくとも95％の「同一性」を有するヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号２／１６の基準ヌクレオチド配列のそれぞれ100ヌクレオチドにつき最高で５つの点突然変異を含みうることを除けば、基準配列と同一であることを意図している。言い換えると、基準ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、基準配列中のヌクレオチドの５％までを欠失させるか、他のヌクレオチドで置換するか、または基準配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド数を基準配列に挿入すればよい。基準配列のこれらの突然変異は、基準ヌクレオチド配列の５'もしくは３'末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこで起こってもよく、基準配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして配置することができる。同様に、配列番号１／１５の基準アミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも 95％の「同一性」を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドとは、このポリペプチドのアミノ酸配列が基準アミノ酸配列のそれぞれ100アミノ酸につき最高で５アミノ酸の変更を含みうることを除けば、基準配列と同一であることを意図している。言い換えると、基準アミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、基準配列中の５％までのアミノ酸残基を欠失させるか、他のアミノ酸で置換するか、または基準配列中の全アミノ酸残基の５％までのアミノ酸数を基準配列に挿入すればよい。基準配列のこれらの変更は、基準アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこで起こってもよく、基準配列中のアミノ酸残基の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続したグループとして配置することができる。本発明のポリペプチドは組換え体ポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得るが、組換え体ポリペプチドであることが好ましい。配列番号１または配列番号１５のポリペプチドの断片、誘導体または類似体は、(i)１以上のアミノ酸残基が同類または非同類アミノ酸残基（好ましくは同類アミノ酸残基）で置換されているもの（置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードでコードされるものでも、コードされないものでもよい）、(ii)１以上のアミノ酸残基が置換基を含んでいるもの、(iii)成熟ポリペプチドが、該ポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えばポリエチレングリコール）のような他の化合物と融合されているもの、または(iv)成熟ポリペプチドに付加的アミノ酸（例えば、リーダーもしくは分泌配列、成熟ポリペプチドの精製に用いられる配列、またはプロタンパク質配列）が融合されているもの、であり得る。このような断片、誘導体および類似体は本明細書の教示内容から当業者の技量の範囲内であると考える。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離された形で取得することが好ましく、均一になるまで精製することが有利である。「単離された」という用語は、その物質がその元の環境（例えば、それが天然に存在するものであれば自然環境）から分離されていることを意味する。例えば、生存動物内に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系内の共存物質の一部または全部から分離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されたものである。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であっても、かつ／また、このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、こうしたベクターまたは組成物はその自然環境の一部ではないという点でやはり単離されたものである。ポリペプチドは精製形態であることが好ましい。精製形態とは、他のタンパク質汚染物質に対して少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％、最も好ましくは99％純化されていることを意味する。本発明のＤＮＡはまた、この酵素を発現できないまたは発現する動物を相同的組換えまたは「ノックアウト」戦略(Kapecchi，Science，244:1288-1292(1989) ）により開発することを可能にする。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子工学的に作製された宿主細胞、および組換え法による本発明のポリペプチドの産生に関する。したがって、本発明のさらに他の態様によると、宿主において本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ、その発現産物を回収することを含んでなる、組換え法による本発明のポリペプチドの産生方法が提供される。あるいはまた、本発明のポリペプチドは慣用のペプチド合成機を使って合成により製造することもできる。宿主細胞は、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターを用いて遺伝子操作（形質導入、形質転換またはトランスフェクション）される。このベクターは例えばプラスミド、コスミド、ファージなどの形であってよい。遺伝子操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または遺伝子の増幅のために適宜改良された慣用の栄養培地で培養する。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞に関して以前に用いられた条件と同じであり、当業者には明らかだろう。適当な発現ベクターとして、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列（例：SV 40の誘導体）、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組合せから誘導されたベクター、ウイルスＤＮＡ（例：ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス）が挙げられる。しかし、宿主内で複製し生存できれば、他のベクターも使用可能である。適当なＤＮＡ配列をベクターに挿入するには、いろいろな方法を用いることができる。一般には、当技術分野で公知の方法によりＤＮＡ配列を適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。こうした方法および他の方法は当業者の技量の範囲内であると考える。発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの合成を指令する適当な発現制御配列（プロモーター）に機能的に連結される。このようなプロモーターの代表的な例として、次のものを挙げることができる。すなわち、LTRまたはSV40プロモーター、大腸菌のlacまたはtrp、ファージλＰ_Lプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそれらのウイルス中の遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターである。発現ベクターは翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターをも含み、発現増幅用の適当な配列を含んでいてもよい。さらに、発現ベクターは形質転換宿主細胞を選択するための表現型性質、例えば、真核細胞培養物ではジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、大腸菌ではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性、を付与する１以上の選択マーカー遺伝子を含むことが好ましい。遺伝子はプロモーターとリボソーム結合部位（細菌による発現の場合）と、場合によりオペレーター（これらをまとめて本明細書中では「制御」エレメントという）の制御下に配置され、その結果、この発現構築物を含むベクターで形質転換された宿主細胞では所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列がＲＮＡに転写される。コード配列はシグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいても、含んでいなくてもよい。本発明のタンパク質配列は、例えば大腸菌のtacプロモーターまたはプロテインＡ遺伝子(spa)プロモーターおよびシグナル配列を用いて発現させることができる。翻訳後プロセシングにおいて細菌宿主によりリーダー配列が除去される。プロモーター領域はCAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーをもつ他のベクターを用いて所望の遺伝子から選択できる。２つの適当なベクターはPKK232-8とPCM7である。特に細菌プロモーターの名を挙げると、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λＰ_R、Ｐ_Lおよびtrpがある。真核細胞プロモーターとしては、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTRおよびマウス・メタロチオネイン-Iがある。適当なベクターおよびプロモーターの選択は当業者の技量の範囲内である。制御配列のほかに、宿主細胞の増殖に対してタンパク質配列の発現を調節しうる調節配列を加えることが望ましいかもしれない。調節配列は当業者には公知であり、例えば、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現を誘導または中止するものが含まれる。他のタイプの調節エレメント、例えばエンハンサー配列がベクター中に存在してもよい。発現ベクターは、特定のコード配列を適当な調節配列をもつベクター中に位置づけるように構築され、制御配列に対するコード配列の位置づけおよび方向は、コード配列が制御配列の「制御」下で転写される（すなわち、制御配列の位置でＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコード配列を転写する）ようなものである。この目的を達成するためにはコード配列を修飾することが望ましいかもしれない。例えば、いくつかの場合には、コード配列が適切な方向で制御配列に結合され得るように、すなわちリーディングフレームを維持するように、コード配列を修飾することが必要である。制御配列と他の調節配列は、ベクター（例えば上記のクローニングベクター）への挿入に先立って、コード配列に連結させてもよい。あるいはまた、制御配列と適切な制限部位をすでに含む発現ベクターにコード配列を直接クローン化することもできる。また、発現を高めるために、所定の宿主細胞に適合するコドンの使用に変えるべくコード配列を修飾してもよい。一般的に、組換え発現ベクターは、複製起点と、宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー（例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびS．cerevis iaeのTRP1伝子）と、下流構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来のプロモーターを含むだろう。異種構造配列は翻訳開始および終止配列と、好ましくは細胞周辺腔または細胞外培地への翻訳タンパク質の分泌を指令できるリーダー配列とも、リーディングフレームを適切に合わせて組み立てられる。場合により、異種配列は所望の特性（例えば、組換え発現産物の安定化または簡便な精製）を付与するＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードしていてもよい。上記のような適当なＤＮＡ配列と適当なプロモーターまたは制御配列を含有するベクターを用いて適切な宿主を形質転換し、該宿主にタンパク質を発現させることができる。クローニング用の組換えＤＮＡベクターおよびそれらが形質転換しうる宿主細胞の例として、バクテリオファージλ（大腸菌）、pBR322（大腸菌）、pACYC177 （大腸菌）、pKT230（グラム陰性菌）、pGV1106（グラム陰性菌）、pLAFR1（グラム陰性菌）、pME290（非大腸菌グラム陰性菌）、pHV14（大腸菌と枯草菌）、p BD9（枯草菌）、pIJ61（ストレプトミセス）、pUC6（ストレプトミセス）、YIp5 （サッカロミセス）、バキュロウイルス昆虫細胞系、YCp19（サッカロミセス）などがある。総論としては、“DNA Cloning”：Vols.I & II，Gloverら編，IRL Press Oxford（1985）(1987)およびT．Maniatisら，“Molecular Cloning”Cold Spring Harbor Laboratory(1982)を参照のこと。ある場合には、宿主生物からのポリペプチドの分泌と、その後の分泌シグナルの開裂を引き起こす配列を加えることが望ましいかもしれない。酵母発現ベクターも当技術分野で知られている。例えば、米国特許第4,446,23 5号、第4,443,539号、第4,430,428号を参照のこと。また、ヨーロッパ特許出願第103,409号、第100,561号、第96,491号も参照のこと。pSV2_neo(J.Mol．Appl．G enet．1:327-341に記載)は哺乳動物細胞において発現を指令するためにSV40後期プロモーターを使用しており、pCDNA1から誘導されたベクターpCDNA1_neo（Mol． Cell Biol．7:4125-29）は発現を指令するためにCMVプロモーターを使用している。これら２種類のベクターはいずれも、哺乳動物細胞における一過性の発現または安定な（G418耐性を使用）発現のために使用される。昆虫細胞発現系（例えばショウジョウバエ）も有用であり、例えば、PCT出願WO 90/06358およびWO 92/ 06212ならびにEP290,261-B1を参照のこと。ポリペプチドは適当なプロモーターの制御下で宿主細胞において発現させることができる。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いて前記タンパク質を産生させるために無細胞翻訳系も使用し得る。原核および真核細胞宿主と共に使用するのに適したクローニングおよび発現ベクターは、Sambrookら，Molecu lar Cloning: A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor，N.Y.（1989 ）に記載されており、その開示内容を参考としてここに組み入れる。高等真核細胞による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することで増大できる。エンハンサーはＤＮＡのシス作用エレメントで、通常は約10〜300 bpであり、プロモーターに作用してその転写を増大させる。例を挙げると、bp 100から270までの複製起点の後期側のS V40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーなどがある。更なる態様において、本発明は上記のベクターを含む宿主細胞に関する。この宿主細胞は哺乳動物細胞のような高等真核細胞、または酵母細胞のような下等真核細胞であり得、また、宿主細胞は細菌細胞のような原核細胞であってもよい。適当な宿主の代表例として、次のものを挙げることができる。原核細胞としては、例えば大腸菌、ストレプトミセス、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonell atyphimurium)などの細菌細胞、真核細胞としては、例えば酵母のような真菌細胞、ショウジョウバエ(Drosophila)やスポドプテラ・フルギペルダ(Spodopteraf rugiperda）のような昆虫細胞、CHO、COSまたはBowesメラノーマのような哺乳動物細胞、植物細胞などである。適当な宿主の選択は本明細書の教示内容から当業者の技量の範囲内であると考える。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE -デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションなどにより行うことができる(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Mol ecular Biology(1986))。適当な宿主株の形質転換および適当な細胞密度への宿主株の増殖後、所定のプロモーターを適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）で誘導し、細胞を更なる時間培養する。細胞を典型的には遠心分離により回収し、物理的または化学的手段で破壊し、得られる粗製抽出物をその後の精製のために取っておく。タンパク質の発現に使用した微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含めて、どのような方法でも破壊することができ、かかる方法は当業者に公知である。組換えタンパク質を発現させるために種々の哺乳動物細胞培養系も使用できる。哺乳動物発現系の例として、Gluzman，Cell，23:175(1981)に記載されるサル腎繊維芽細胞のCOS-7系、および適合性のベクターを発現することができる他の細胞系、例えば、C127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞系がある。哺乳動物の発現ベクターは複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサーを含み、さらに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終止配列、および５'フランキング非翻訳配列も含むだろう。必要とされる非転写遺伝子エレメントを得るためにSV40スプライスおよびポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を用いてもよい。選択した発現系および宿主に応じて、上記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を目的のポリペプチドが発現される条件下で増殖させることで、本発明のポリペプチドを産生させる。その後該ポリペプチドを宿主細胞から単離して精製する。発現系が該ポリペプチドを増殖培地に分泌する場合は、その培地から該ポリペプチドを直接精製することができる。ポリペプチドが分泌されない場合は、それを細胞溶解物から単離するか、または細胞膜画分から回収する。ポリペプチドが細胞表面に局在する場合は、全細胞または分離した膜を所望遺伝子産物のアッセイ可能な源として使用できる。大腸菌のような細菌宿主により発現されたポリペプチドは封入体からの分離および再生・復元を必要とするかもしれない。適切な増殖条件および回収方法の選択は当業者の技量の範囲内である。ポリペプチドを組換え細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む種々の方法を用いることができる。成熟タンパク質の立体配置を完成させるために、必要に応じて、タンパク質再生ステップを採用してもよい。最後に、最終精製ステップとして高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いることができる。組換え体の産生方法で用いた宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化体であったり、非グリコシル化体であったりする。また、本発明のポリペプチドは最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよい。本発明のポリペプチドは同様の生物学的活性をもつ他の分子を同定する際にも有用である。そのようなスクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するためにまたはプローブそれ自体として既知のＤＮＡ配列を用いることにより、アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子のコード領域を単離することである。本発明の遺伝子配列に相補的な配列をもつ標識オリゴヌクレオチドを用いて、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして、該プローブがライブラリーのどのメンバーとハイブリダイズするかを調べる。本発明のポリペプチドは、しばしば「遺伝子治療」と称するポリペプチドのin vivo発現により本発明に従って使用することもできる。こうして、例えば、患者由来の細胞を、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いてex vivoで遺伝子工学的に操作し、その後操作した細胞を該ポリペプチドで治療すべき患者に導入する。こうした方法は当技術分野で公知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用することにより公知の方法で細胞を遺伝子工学的に操作することができる。同様に、ポリペプチドのin vivo発現のために、例えば当技術分野で公知の方法により、細胞をin vivoで遺伝子工学的に操作することもできる。当技術分野で知られているように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞を、細胞のin vivo遺伝子工学的操作およびポリペプチドのin vivo発現のために患者に投与しうる。かかる方法により本発明のポリペプチドを投与する方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかだろう。例えば、細胞を遺伝子工学的に操作するための発現ベヒクルはレトロウイルス以外のもの、例えばアデノウイルスであってもよく、アデノウイルスを適当な送達ベヒクルと組み合わせた後にin vivoで細胞を遺伝子操作するために使用することができる。「組換え」ポリペプチドとは、組換えＤＮＡ法により産生されたポリペプチド、すなわち、目的のポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生されたポリペプチドのことである。「合成」ポリペプチドは化学合成により製造されたものである。「レプリコン」は、in vivoで自律ＤＮＡ複製単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製する能力がある遺伝的エレメント（例：プラスミド、染色体、ウイルス）である。「ベクター」は、他のＤＮＡセグメントと結合することができ、結合したセグメントの複製を生じさせるような、プラスミド、ファージ、コスミドなどのレプリコンである。「二本鎖ＤＮＡ分子」とは、二本鎖ヘリックス（弛緩およびスーパーコイルの両方）の形をしたデオキシリボヌクレオチド（塩基アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマー形態のことである。この用語はこの分子の一次および二次構造を指すにとどまり、それを特定の三次形態に限定することを意味しない。したがって、この用語は、中でも、線状ＤＮＡ分子（例：制限フラグメント）、ウイルス、プラスミドおよび染色体中に存在する二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を記述するとき、本明細書では、ＤＮＡのセンス鎖に沿って５'から３'の方向で示す慣例に従って配列を記載する。特定のタンパク質のＤＮＡ「コード配列」または特定のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」は、適当な調節配列の制御下に配置したとき、ポリペプチドに転写および翻訳されるＤＮＡ配列のことである。「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合して下流（３' 方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。転写開始部位（ヌクレアーゼS1を用いるマッピングにより簡便に規定される）およびＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）はプロモーター配列内に見いだせるだろう。真核細胞プロモーターはしばしば（いつもとは限らないが）「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含むだろう。ＤＮＡ「制御配列」とは、宿主細胞におけるコード配列の発現（すなわち、転写および翻訳）をもたらすプロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流の調節ドメイン、エンハンサーなどをひとまとめにして指す用語である。制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列と結合してコード配列をｍＲＮＡに転写し、その後ｍＲＮＡが該コード配列によりコードされるポリペプチドに翻訳されるとき、細胞内でコード配列の「発現を指令する」。「宿主細胞」は、外来ＤＮＡ配列により形質転換もしくはトランスフェクションされた細胞、または外来ＤＮＡ配列による形質転換またはトランスフェクションが可能な細胞である。外来ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されているとき、細胞は外来ＤＮＡにより「形質転換」されている。外来ＤＮＡは細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれていても（共有結合で連結されていても）いなくてもよい。例えば、原核細胞や酵母では、外来ＤＮＡがプラスミドのようなエピソームエレメント上に保持されていてもよい。真核細胞に関して、安定に形質転換またはトランスフェクションされた細胞とは、染色体の複製を通して娘細胞によって受け継がれるように外来ＤＮＡが染色体に組み込まれている細胞のことである。この安定性は、外来ＤＮＡを含有する娘細胞の集団からなる細胞系またはクローンを樹立する真核細胞の能力により実証される。「クローン」は有糸分裂により１個の細胞または共通の先祖から誘導された細胞の集団である。「細胞系」は多くの世代にわたりin vitroで安定して増殖することができる初代細胞のクローンである。２つのＤＮＡまたはポリペプチド配列は、そのヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約85％（好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約 95％）が該分子の一定の長さにわたり一致するとき、「実質的に相同」または「実質的に同一」であり、これにはアレル変異体が含まれる。本明細書中で用いる「実質的に相同」とは、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して同一性を示す配列をも指す。実質的に相同なＤＮＡ配列は、特定の系のために規定された（例えばストリンジェントな）条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験により同定できる。適当なハイブリダイゼーション条件を規定することは当業者の技量の範囲内である。例えば、“Current Protocols in Mol．Biol.”Vol.I & I I，Wiley Interscience，Ausbelら編（1992）を参照のこと。実質的に同一であるタンパク質配列は、タンパク質加水分解消化、ゲル電気泳動およびミクロシークエンシングにより同定できる。「機能的に等しい」という用語は、対象タンパク質のアミノ酸配列がアスパラギン酸プロテアーゼと同じ種類の酵素活性を示すものであることを意味する。ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然ではもう一方の分子と結合状態で存在しない別のＤＮＡ分子内のまたは該別のＤＮＡ分子に結合された同定可能なＤＮＡセグメントである。本発明のポリペプチドは治療に使用することができる。したがって、更なる態様において、本発明は、治療に用いるための配列番号１または配列番号１５に示したアミノ酸配列を有するポリペプチド、およびその断片、類似体または誘導体を提供する。適切には、かかるポリペプチドは高血圧、炎症、喘息および心肺疾患を含むがこれらに限らない機能障害または疾患を防止し、改善し、治療する上である役割を果たし得るものである。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは適当な製剤学上の担体と共に用いられる。このような組成物は治療に有効な量の活性薬剤および製剤学上許容される担体または賦形剤を含有する。こうした担体として、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限らない。製剤は投与様式に合わせるべきである。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。こうした容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた形式の通知書（通知書はヒトに投与するための製造、使用または販売の政府機関による承認を示す）を添付することができる。さらに、本発明のポリペプチドは他の治療化合物と共に使用してもよい。医薬組成物は簡便な方法で、例えば、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路で投与することができる。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは特定の徴候を治療および／または予防するのに有効な量で投与される。被験者に投与される活性薬剤の量および投薬レジメは、投与様式、治療すべき症状の性質、医師の判断などの多くの要因に左右されるだろう。本発明の配列は染色体の同定にも有用である。かかる配列は個々のヒト染色体上の特定位置に特異的にターゲッティングし、該位置とハイブリダイズすることができる。さらに、染色体上の特定部位を同定する必要性が目下存在している。現在、実際の配列データ（反復多型）に基づく染色体マーキング試薬が染色体位置を示すために利用可能である。本発明による染色体へのＤＮＡのマッピングは、こうした配列を疾病関連遺伝子と相関させるうえで重要な第一段階である。簡単に説明すると、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ましくは15〜25 bp）を作製することにより染色体に該配列をマップすることができる。ｃＤＮＡのコンピュータ解析を用いて、ゲノムＤＮＡ中の２以上のエキソンにかからないプライマーを迅速に選択する。その後、これらのプライマーを、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅断片をもたらすだろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは特定のＤＮＡを特定の染色体に割り当てるための迅速な方法である。同一のオリゴヌクレオチドプライマーと共に本発明を使用して、同様の方法で特定の染色体由来の断片のパネルまたは大きなゲノムクローンのプールを用いてサブ局在化が達成され得る。染色体にマップするために同様に使用できる他のマッピング戦略としては、in situハイブリダイゼーション、標識フロー選別染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択が含まれる。１段階で正確な染色体位置を得るために、中期染色体領域へのｃＤＮＡクローンの蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を用いることができる。この技術は500または600塩基ほどの短いｃＤＮＡの場合にも使用可能である。しかし、 2,000 bpより大きいクローンは、簡便な検出にとって十分なシグナル強度で、唯一の染色体位置に結合する可能性がより高い。FISHはクローン（該クローンからＥＳＴが誘導された）の使用を必要とし、長ければ長いほど良い。例えば、2,00 0 bpが良好で、4,000がより良好である。良好な結果（合理的な時間のパーセンテージ）を得るためには、おそらく4,000より多くは必要でない。この技術に関しては、Vermaら，Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques，Pergam on Press，New York(1988)を参照のこと。正確な染色体位置に配列がマップされたら、この染色体上の該配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることができる。この種のデータは例えばV.McKu sick，Mendelian Inheritance in Man（Johns Hopkins University Welch Medic al Libraryからオンラインで入手可能）中に見いだせる。その後、同一の染色体領域にマップされた疾病と遺伝子との関係を連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝）により確認する。次に、罹患個体と非罹患個体の間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異を調べる必要がある。突然変異が罹患個体の一部または全部に観察されるが、どの正常個体にも観察されない場合は、その突然変異が疾病の原因である可能性がある。物理的マッピングおよび遺伝的マッピングの技術の現在の分解能によると、疾病と関連した染色体領域に正確に位置づけられたｃＤＮＡは、50〜500の可能な原因遺伝子のうちの一つだろう（これを１メガベース(megabase)マッピング分解能および１遺伝子／20kbと仮定する）。罹患個体と非罹患個体の比較は、一般的には、最初に染色体の広がりから可視的な、またはｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲにより検出可能な、欠失または転座といった染色体の構造的変化を探し出すことを含む。最終的には、突然変異の存在を確認し、突然変異と多型とを区別するために、いくつかの個体から得られた遺伝子の完全な配列決定を必要とする。本発明のポリペプチドまたはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させるための免疫原として使用することができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体でありうる。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体、およびFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を含む。このような抗体およびフラグメントの作製には当技術分野で知られた様々な方法を用いることができる。本発明のポリペプチドに対する抗体は、動物に該ポリペプチドを直接注入することにより、または動物（好ましくはヒト以外）に該ポリペプチドを投与することにより得ることができる。このようにして得られた抗体は該ポリペプチドそれ自体と結合するだろう。この方法では、該ポリペプチドの断片をコードする配列を用いたときでも、完全な天然ポリペプチドと結合する抗体を生成することができる。その後、かかる抗体を用いて、該ポリペプチドを発現している組織から該ポリペプチドを単離することが可能である。モノクローナル抗体を作製するには、連続細胞系の培養物から産生される抗体を提供するどのような技術も使用できる。例を挙げると、ハイブリドーマ法(Koh ler and Milstein，1975，Nature，256:495-497)、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozborら，1983，Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBV-ハイブリドーマ法(Coleら，1985，in Mo noclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc.，pp.77-96)がある。単鎖抗体の作製に関して記載された技術（米国特許第4,946,778号）は、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体の作製にも応用できる。本発明はさらに、該ポリペプチドを阻害する化合物を同定するための化合物スクリーニング法を提供し、この方法は、単離したポリペプチドを試験化合物と接触させ、試験化合物の不在下での代謝回転速度と比べた、酵素基質の代謝回転速度を測定することを含んでなる。本発明はこれにより同定された化合物にも関係する。本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。さらに、突然変異およびＳＡＲ（構造／活性関係）評価のためのモデルとして、または薬物スクリーニングにおいて、前記のトランスジェニック動物を使用するための方法も提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドの阻害剤分子、および該ポリペプチドの機能を低減もしくは消失させる際のそれらの使用に関する。阻害剤の例は抗体であり、いくつかの場合には、該ポリペプチドに結合するオリゴヌクレオチドである。阻害剤の例はアンチセンス技術を用いて作製したアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を用いると、三重らせんの形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ（これらの方法は両方ともＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づいている）により遺伝子の発現をコントロールすることができる。例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５'コード部分は、長さが約10〜40塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは転写に関与する遺伝子の領域に相補的となるように設計され（三重らせん − Leeら，Nucl．Acids Res. ，6:3073(1979); Cooneyら，Science，241:456(1988);およびDervanら，Science ，251:1360(1991)を参照のこと）、その結果転写とポリペプチドの産生が妨げられる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはin vivoでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする(Okano ，J．Neurochem.，56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibi tors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。上記のオリゴヌクレオチドを細胞に送達してin vivoでアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを発現させ、それによりポリペプチドの産生を抑制することもできる。阻害剤のもう一つの例は、ポリペプチドの触媒部位に結合して該部位を占有する小分子であり、この小分子が触媒部位を基質に接近できないようにする結果、正常な生物学的活性が妨害される。小分子の例として、小型のペプチドまたはペプチド様分子が含まれるが、これらに限らない。治療に用いるとき、本発明の阻害剤は標準的な製剤上の慣用手段に従って製剤化される。経口投与したときに活性である阻害剤は液剤、例えば、シロップ剤、懸濁剤または乳濁剤、錠剤、カプセル剤およびロゼンジ剤として製剤化することができる。液体製剤は一般に、懸濁化剤、防腐剤、風味剤または着色剤を含むエタノール、グリセリン、非水性溶媒（例えば、ポリエチレングリコール）、油、水などの適当な液状担体中に懸濁または溶解した化合物またはその薬学的に許容される塩の懸濁液または溶液からなる。錠剤の形の組成物は、固体製剤を製造するのに通常用いられる適当な製剤学上の担体を使って調製することができる。このような担体の例として、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、ラクトース、スクロースおよびセルロースが挙げられる。カプセル剤の形をした組成物は通常のカプセル化法を用いて調製することができる。例えば、活性成分を含有するペレットを標準的な担体を用いて調製し、その後硬質ゼラチンカプセルに該ペレットを充填するか、あるいはまた、分散体または懸濁体を適当な製剤学上の担体（例えば、水性ガム、セルロース、シリケート、油）を用いて調製し、その後分散体または懸濁体を軟質ゼラチンカプセルに充填する。典型的な非経口組成物は、無菌の水性担体または非経口的に許容される油（例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、落花生油、ゴマ油）中に溶解または懸濁した化合物もしくはその薬学的に許容される塩からなる。あるいはまた、この溶液を凍結乾燥して、投与直前に適当な溶剤で再調製することもできる。典型的な座剤は、この方法で投与したとき活性な式(I)の化合物またはその薬学的に許容される塩を、結合剤および／または滑剤（例えば、重合グリコール、ゼラチン、カカオ脂）、または他の低融点の植物もしくは合成ワックスまたは脂肪と共に含有する。組成物は錠剤やカプセル剤のような単位投薬形態であることが好ましい。経口投与用の各投薬単位は、好ましくは１〜250 mg（非経口投与の場合は、好ましくは0.1〜25 mg）の本発明の阻害剤を含有する。成人患者の１日の投薬レジメは、例えば、経口用量が１〜500 mg、好ましくは１〜250 mg、静脈内、皮下または筋肉内用量が0.1〜100 mg、好ましくは0.1〜25 mgの式(I)の化合物またはその薬学的に許容される塩（遊離塩基として計算）であり得、該化合物は１日に１〜４回投与される。適当には、該化合物は連続治療期間にわたって投与されるだろう。本発明について以下の実施例を参考にしてさらに説明することにする。しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことを理解すべきである。すべての部または量は、他に特定されない限り、重量基準である。以下の実施例を理解しやすくするために、いくつかの繁用される方法および／または用語を説明する。「プラスミド」は、先行する小文字および／またはその後の大文字および／または数字で表される。本明細書中の出発プラスミドは市販されているか、制限なしに利用可能であるか、または公表された方法に従って入手可能なプラスミドから構築することができる。さらに、記載したものと同等のプラスミドは当技術分野で知られており、当業者には明らかだろう。「オリゴヌクレオチド」とは、化学的に合成できる一本鎖のポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のことである。このような合成オリゴヌクレオチドは５'リン酸をもたず、かくして、キナーゼの存在下でＡＴＰを用いてリン酸基を付加することなしには他のオリゴヌクレオチドに連結されない。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていない断片には連結されるだろう。「連結」とは、２つの二本鎖核酸断片の間にホスホジエステル結合を形成する方法を指す(Maniatis，T.ら，Id.，p.146)。他に提示しない限り、連結反応は連結すべきほぼ等モル量のＤＮＡ断片0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（リガーゼ）を用いて公知の緩衝液と条件下に行われる。配列データ配列番号１配列番号２ c/a = この位置はCまたはAのいずれかで、現在は不明開始ATGに下線が引いてあり、停止コドンは不明配列番号３(EST 176432) 配列番号４(EST 424772) 配列番号５(EST 443275) 配列番号６(EST 567394) 配列番号７(EST 685578) 配列番号８(EST 928138) 配列番号９(EST 947785) 配列番号10(EST 1000163) 配列番号11(EST 1218021) 配列番号12(EST 1320439) 配列番号13(EST 716478) 配列番号14(EST 857644) 配列番号15 446アミノ酸(+ 3個の追加の停止コドン）配列番号１６

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 35/76 38/46 39/395 Ｄ 39/395 Ｎ 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/40 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ａ６１Ｋ 37/54 (72)発明者ポウェル，デビッドアメリカ合衆国 19426―0989 ペンシルバニア州，カレッジビル，ピー．オー．ボックス 5089，サウスカレッジビルロード 1250，スミスクラインビーチャムファーマシューティカルズ (72)発明者ケイ，ジョンイギリス国シーエフ１３ティーイーカーディフ，ユニバーシティーオブウェールズ (72)発明者ヒル，ジェフリーイギリス国シーエフ１３ティーイーカーディフ，ユニバーシティーオブウェールズ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号１または配列番号１５のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドの断片、類似体もしくは誘導体をコードするヌクレオチド配列に対して、その全長にわたり、少なくとも80％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。２．前記のヌクレオチド配列が配列番号２または配列番号１６に含まれるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．配列番号２または配列番号１６のヌクレオチド配列に対して、その全長にわたり、少なくとも80％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。４．配列番号１のポリヌクレオチドである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。５．前記のポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。６．前記のポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。７．前記のポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである、請求項５に記載のポリヌクレオチド。８．請求項２、４、５、６または７のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有するベクター。９．請求項８に記載のベクターで遺伝子工学的に操作された宿主細胞。 10．請求項９に記載の宿主細胞から前記ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現させることを含んでなる、ポリペプチドの産生方法。 11．請求項８に記載のベクターで細胞を遺伝子工学的に操作することを含んでなる、ポリペプチドを発現できる細胞の作製方法。 12．請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能であり、配列番号１または配列番号１５のポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 13．配列番号１または配列番号１５のアミノ酸配列に対して、その全長にわたり、少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド、またはその断片、類似体もしくは誘導体。 14．配列番号１または配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその断片、類似体もしくは誘導体。 15．前記のポリペプチドが配列番号１または配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項14に記載のポリペプチド。 16．単離された形である、請求項13、14または15に記載のポリペプチド。 17．治療に用いるための請求項13〜16のいずれか１項に記載のポリペプチド。 18．請求項13、14または15に記載のポリペプチドを阻害する化合物を同定するための化合物のスクリーニング法であって、単離されたポリペプチドを試験化合物と接触させ、酵素基質の代謝回転速度を測定して、試験化合物の不在下での該代謝回転速度と比較することを含んでなる方法。 19．請求項18に記載の方法により同定された化合物。 20．請求項13、14または15に記載のポリペプチドの阻害剤。 21．請求項13、14または15に記載のポリペプチドに対する抗体である、請求項20 に記載の阻害剤。 22．請求項１または12に記載のポリヌクレオチド、請求項13または14に記載のポリペプチド、請求項19に記載の化合物、または請求項20に記載の阻害剤および製剤学上許容される担体を含有する医薬組成物。 23．請求項13、14または15に記載のポリペプチドを阻害する必要がある患者の治療方法であって、該患者に、治療に有効な量の請求項19に記載の化合物または請求項20に記載の阻害剤を投与することを含んでなる方法。 24．治療に用いる医薬を製造するための請求項19に記載の化合物または請求項20 に記載の阻害剤の使用。