JP2000501921A

JP2000501921A - 肝炎ウイルス感染を治療する方法

Info

Publication number: JP2000501921A
Application number: JP9513698A
Authority: JP
Inventors: タカハシ、ヒロシ
Original assignee: ザジェネラルホスピタルコーポレイション
Priority date: 1995-09-27
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2000-02-22
Also published as: WO1997011598A1; EP0866654B1; EP0866654A4; DE69637325D1; EP0866654A1; ATE377944T1; AU7377296A

Abstract

(57)【要約】本発明は、アシアロ・インターフェロンを投与することにより、Ｂ型肝炎感染を治療する方法であることを特徴とする。本発明はまた、肝炎の動物モデル、及び生物試料中のＢ型肝炎ウイルスを測定する方法であることも特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】肝炎ウイルス感染を治療する方法発明の背景Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は、世界な健康問題である。この感染は、不顕性の感染から致命的な肝細胞疾患にわたる、広範囲の病理を引き起こす（Tiol lais et al.，Nature 317: 489，1985）。ＨＢＶビリオンは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を運搬するエンベロープと、ヌクレオカプシドとからなる。ヌクレオカプシドには、ＲＮＡ中間体を経由して複製する、環状で部分的に二本鎖の３．２kbのＤＮＡが封入されている。ヌクレオカプシドは、Ｂ型肝炎コア抗原から形成されている。ビリオンが血中に存在すると、一般的に、カプシドに関連する別の可溶性抗原、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）が血清中に検出される。ＨＢＶが直接的に肝細胞を変性させるのではなく、感染肝細胞の表面に存在するウイルス抗原に対する宿主免疫応答が、病因において重要な役割を果たしているということが、いくつかの研究から示唆されている（Mondelli et al.，Immunol．12 9: 2773，1982; Mondelli et al.，Arch. Pathol. Lab. Mad. 112: 489，1988;C hisari et al.，Microb ．Pathog.6: 311，1989）。Ｂ型肝炎については適切な動物モデルが得られていないことから、肝細胞の死及びウイルス除去に関する分子機構の理解が妨げられている（Ochiya et al.，P roc ．Nat'l．Acad．Sci．USA 86: 1875，1989; Gripon et al.，J ．Virol.62:413 6，1988）。ＨＢＶ感染の病原を調査するため生殖系列トランスジェニックマウスモデルが作製されているが、これらの動物は、ＨＢＶ抗原に対して免疫学的に耐性があるため自発的には肝炎を発症しない（Moriyama et al.，Science 248:3 61，1990）。これらの動物には、例えば、同系の動物においてＨＢＶタンパク質でリンパ球を感作し、この感作された細胞をインビボ養子移入するということを含む、複雑で複数の工程からなる方法により、肝炎を誘導しなければならない（ Moriyama et al.,前出; Ando et al.,J ．Exp．Med.178: 1541，1993）。発明の概要本発明は、ＨＢＶ関連急性肝炎を患うヒトで見られるものと類似の一連の病理学的変化を示す、動物肝炎モデルであることを特徴とする。本発明は、複製性ヒト肝炎ウイルスＤＮＡでインビボ形質転換された肝細胞を有する非ヒト哺乳動物であることを特徴とする。該動物は、ヒト肝炎の一つ以上の症状を示す。好ましい実施形態において、哺乳動物はげっ歯動物である。より好ましくは、げっ歯動物はマウス又はラットである。好ましい実施形態において、肝炎ウイルスはＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、及びＧ型肝炎である。関連する態様において、本発明は、複製性ヒト肝炎ウイルスＤＮＡで形質転換された肝細胞を有する体細胞系トランスジェニックマウスを作製する方法であることを特徴とする。該方法は、肝細胞を、カチオン性脂質と複合体化されたヒト肝炎ウイルスＤＮＡを含むＤＮＡ分子と接触させることを含む。複合体化することにより、複合体が肝細胞に結合し、ＤＮＡが細胞に侵入する。他の態様において、本発明は、肝炎を治療する能力について候補薬物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。該方法は、ヒト肝炎の一つ以上の症状（例えば、ウイルス血症、ウイルスタンパク質発現、抗体産生、血清中のＧＤＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、γ−ＧＴＰなどの肝臓由来酵素の上昇、肝細胞のネクローシス又はアポプトシス及びリンパ球浸潤を含む組織学的変化、並びに肝臓におけるウイルスの複製）を哺乳動物が示す、複製性ヒト肝炎ウイルスＤＮＡでインビボ形質転換された肝細胞を有する非ヒト哺乳動物を得、候補薬物又はプラセボ（又は第二の候補薬物もしくは既知の有効薬物）を動物に投与し、その後、哺乳動物における肝炎の症状又は感染レベル（ビリオン又はウイルスタンパク質又はウイルス核酸の存在により示される）を測定し、該候補薬物により、プラセボ（又は第二の候補薬物もしくは既知の有効薬物）で処理された哺乳動物と比較して、肝炎の症状又は感染のレベルが消失するか否かを決定することを含む。他の態様において、本発明は、天然に存在するインターフェロン又は哺乳動物細胞もしくは真核細胞において産生されたインターフェロンの改変型を用いて、アシアロ糖タンパク質受容体を保持する細胞の感染を治療する方法であることを特徴とする。該方法は、有効量のアシアロインターフェロンを投与することを含む。このアシアロインターフェロンは、真核細胞において産生されたインターフェロンを、ノイラミニダーゼ処理又は当業者に既知の他の方法により、アシアロ型へと変換することにより調製されている。したがって、該方法は、真核細胞において産生され、末端のシアル酸残基を除去することにより改変されたインターフェロンを用いた治療を含む。様々な好ましい実施形態において、インターフェロンがインターフェロンβであったり、インターフェロンがインターフェロンα であったり、アシアロインターフェロンを作製するためのインターフェロンがヒト繊維芽細胞であったり、及びアシアロインターフェロンを作製するためのインターフェロンが組み換え技術により作製されたものであったりする。他の態様において、本発明は、生物試料、例えば血清試料中のＨＢＶを定量する方法であることを特徴とする。該方法は、以下の工程、即ち（ａ）生物試料をＤＮａｓｅ及び／又はＲＮａｓｅで処理する工程と、（ｂ）ＨＢＶエンベロープに特異的な抗体、例えばモノクローナル抗体を用いて、ウイルス粒子及び他の不要な物質を免疫沈降させる工程と、（ｃ）ＰＣＲによりＨＢＶＤＮＡを定量する工程とを含む。図面の簡単な説明図１Ａは、形質転換ラットにおけるＨＢＶ遺伝子の発現のサザン解析の結果を示す写真である。ＲＮＡは示されている組織から単離され、６５９ｂｐのＨＢＶ特異的配列がＲＴ−ＰＣＲにより増幅され、サザン解析により検出された。ｐＨＢＶ−ＨＴＤ形質転換Ｈｕｈ−７肝癌細胞系から単離した全ＲＮＡを、ＨＢＶＲＮＡの陽性コントロールとして使用した。８３８ｂｐのβアクチン断片の増幅を、試料のローディングの確認のためのコントロールとして用いた。図１Ｂは、ラット血清中のＨＢＶビリオンを測定するために使用されたサザン解析の結果を示す写真である。血清は、ｐＨＢＶ−ＨＴＤ形質転換の１日後（レーン１〜３）、２日後（レーン４〜６）及び３日後（レーン７〜９）に３匹のラットから得られたものである。非形質転換正常ラット血清（レーン１０）及びｐＨＢＶ−ＨＴＤＤＮＡ（１００ng、レーン１２）を陰性コントロールとして使用し、ｐＨＢＶ−ＨＴＤ形質転換Ｈｕｈ−７肝癌細胞系の培養上清を陽性コントロールとして使用した。完全なウイルス粒子由来のＤＮＡが検出されたが（レーン１１）、ｐＨＢＶ−ＨＴＤプラスミドＤＮＡは同条件下で検出されなかった（レーン１２）ため、このＰＣＲアッセイはＨＢＶウイルス粒子に特異的であった。図１Ｃは、正常ラット（レーン１〜６）及び無胸腺ヌードラット（レーン７〜１３）の血清中のＨＢＶビリオンを測定するために使用されたＰＣＲサザン解析の結果を示す写真である。血清は、ｐＨＢＶ−ＨＴＤ形質転換の３日後（レーン１、４、及び１０）、７日後（レーン２、５、７、及び１１）、１４日後（レーン３、６、８、及び１２）及び２１日後（レーン９及び１３）にラットから得られたものである。ＨＢＶビリオンＤＮＡは、上記と同様に検出された。図２は、ラット肝臓におけるＨＢＶＤＮＡのサザンブロット解析の結果を示す写真である。ＤＮＡは、ＨＢＶ構築物のａｄｗＲ９頭部−尾部結合型へテロダイマーで肝臓を形質転換してから１日後（レーン１及び４）、２日後（レーン２及び５）、又は３日後（レーン３及び６）に肝臓から抽出されたものである。ＥｃｏＲＶで分解された肝臓ＤＮＡを含むサザンブロットに、まずＨＢＶ特異的プローブ（レーン１〜３）をハイブリダイズさせ、除去し、それからベクター特異的プローブ（レーン４〜６）を再ハイブリダイズさせた。図３は、ｐＨＢＶ−ＨＴＤ（丸）又はｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）（三角）で形質転換されたラットにおける、血清ＨＢｅＡｇレベル（白印）及び抗ＨＢｅ抗体力価（黒印）の解析の結果を示すグラフである。ＨＢｅＡｇ及び抗ＨＢｅの相対濃度は、それぞれ、本明細書に記載されているようなＡ₄₉₂及びパーセント阻害により表した。Ａ₄₉₂値が０．０６５（陰性コントロールの平均値と係数０．０６の和）というカットオフ値と等しいか又はそれよりも大きい標本を、ＨＢｅＡｇ陽性と見なし、パーセント阻害値が５０％と等しいか又はそれよりも大きい標本を、抗ＨＢｅ陽性と見なした。図４は、正常ＣＤラット（○）及びｐＨＢＶ−ＨＴＤで形質転換された無胸腺ヌードラット（●）における血清ＧＰＴレベルを示すグラフである。図５Ａは、ｐＨＢＶ−ＨＴＤでインビボ形質転換されたラット肝臓のパラフィン切片のヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す写真である（８０倍）。図５Ｂは、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）で形質転換されたラット肝臓のパラフィン切片のヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す写真である（８０倍）。肝細胞の損傷は観察されなかった。図５Ｃは、ｐＨＢＶ−ＨＴＤでインビボ形質転換されたヌードラットの肝臓のパラフィン切片のヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す写真である（８０倍）。図６は、天然ヒトＩＦＮ−βの構造の模式図である。天然ヒトＩＦＮ−βの典型的なバイアンテナリ一型複合型糖鎖のノイラミニダーゼによる切断部位も示されている。略語：Ｆｕｃはフコース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｍａｎはマンノース、Ｇａｌはガラクトース、ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を示す。図７は、ヒトＨＢＶのヌードマウスモデルにおけるアシアロＩＦＮ−βのインビボ効果を測定するために使用されたサザンブロット解析の結果を示す写真である。”前”は、インビボ形質転換の７日後、処理直前に、ＰＣＲサザン解析により検出された血清ＨＢＶを示す。アシアロＩＦＮ−βは実質的な抗ウイルス効果を示すことに注目のこと。“後”は、インビボ形質転換の１４日後、７日間の処理の最後に、ＰＣＲサザン解析により検出された血清ＨＢＶを示す。“ＰＢＳ” はリン酸緩衝生理食塩水が投与されたことを示す。“アシアロＩＦＮ−β”は天然のシアル化されたＩＦＮ−βが投与されたことを示す。発明の詳細な説明４組の実験を以下に説明する。第一の組の実験は、急性肝炎のラットモデルの作製に関する。第二の組の実験は、急性肝炎のマウスモデルに関する。第三の組の実験は、肝炎をアシアロインターフェロンβで治療する方法に関する。第四の組の実験は、アシアロインターフェロンβの、ＨＢＶ形質転換ヒト肝癌細胞に対する効果に関する。ラットモデルの調製クローン化ＨＢＶ（ｐＨＢＶ−ＨＴＤ）、ａｄｗサブタイプの頭部−尾部結合型ホモダイマーを構築し、Blum et al，J ．Virol．65: 1836，1991及びBlum et al.，Hepatology 14: 56，1991に記載の方法によりｐＧＥＭ−７２ｆ（＋）ベクター（Promega，Madison WI）のＥｃｏＲＩ部位へと挿入した。（ａｄｗサブタイプのクローン化については、Valenzuela et al.，The nucleotide sequence o fthe hepatitis B viral genome and the identification of the major viral genes ，in Animals Virus Genetics，Fields et al.，eds.，Academic Press，N ew York，1980，p.57に記載されている。）いくつかの例においては、ｐＨＢＶ −ＨＴＤに類似した複製可能ＨＢＶ構築物である、ＨＢＶ、ａｄｗＲ９の頭部− 尾部結合型ヘテロダイマーを、形質転換に用いた（Blum et al，j.Virol. 65: 1 836，1991及びBlum et al.，Hepatology 14: 56，1991）。肝切除によりＨＢＶトランスジーンの発現が増加するため、ヒギンス・アンダーソン（Higgins-Anderson）法（Higgins et al.，Arch ．Pathol.12: 186，193l ）に従い、インビボ形質転換の２４時間前に３分の２の肝切除を行った。クローン化ＨＢＶ構築物を、膜融合促進カチオン性脂質、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（Behr et al.,Proc．Nat'l ．Acad．Sci．USA 86: 6982，1989）を用いることによりインビボでラット肝臓へと直接的に輸送した。５０マイクログラムのｐＨＢＶ−ＨＴＤ又はｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）ベクターを、２５０μgのカチオン性脂質と５００μlの無菌生理食塩水（０．１５４ＭＮａＣｌ）中で混合し、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を形成させた。動物にエーテルで麻酔をかけ、門脈を止血鉗子で一時的に結紮しながら、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を肝臓の右中葉へ注射した。上記の方法に加えて、２０μGのｐＨＢＶ−ＨＴＤ（又は他の選択されたＤＮＡ分子）を、２５０μgのＨＢＳＳ中で、５０μgのアシアロフェチュイン−ポリ − Ｌ−リジン及び１００μgのカチオン性リポソームと複合体化し、上記と同様にして注射してもよい。ラット組織中のＨＢＶＲＮＡ形質転換ラットにおけるＨＢＶの発現を調査するため、ｐＨＢＶ−ＨＴＤでのインビボ形質転換の３日後に屠殺されたラットの選択された組織から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した（Chelly et al.，Nature 333: 859，1988 ）。図１Ａに示されているように、ＨＢＶ転写産物の６５９ｂｐのＰＣＲ断片が肝臓に検出されたが、他の組織では検出されなかった。この実験では、ｐＨＢＶ −ＨＴＤ形質転換Ｈｕｂ−７肝癌細胞系から単離した全ＲＮＡ（“ＨＢＶＲＮＡ”と標識されたレーン）を、陽性コントロールとして使用した。ＨＢＶ発現のレベルは、以下のようにして測定した。ｐＨＢＶ−ＨＴＤで形質転換されたラットの肝臓、心臓、肺、腎臓、腸、及び脾臓から、全ＲＮＡを抽出し、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅＩ（ユニット／１μgのＲＮＡ）（Promega ）で３７℃で３０分間消化した。２μgの全ＲＮＡを含む混合液中で、アンチセンスプライマーを逆転写酵素（ＢＲＬ）を用いて伸長させることによりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡのＰＣＲを、２．５mM ＭｇＣl₂及び１００pmo1の各プライマーを含む１００μlの最終容量で行った。増幅サイクルは、９５℃３０秒、５０℃１分、７２℃１分であった。３５サイクルの後、ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレン（ Amersham）へと転写した。サザンブロットに、³²Ｐで標識したＨＢＶ特異的制限断片（ｐＨＢＶ−ＨＴＤのＡａｔＩＩ断片；３２２１bp）をハイブリダイズさせた。増幅に用いたプライマーは、ＨＢＶのＳ読み取り枠内に位置するものであった（センスプライマー、５’−ＴＧＣＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＡＡＣＡＡＧＡ−３’（配列番号１）；アンチセンスプライマー、５’−ＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＡＴＴＧＴＧＡＧＧＡＴＴＣＴＴＧ−３’（配列番号２））。これらは、６５９bpの断片を与えた。８３８bp断片を増幅するβ アクチンプライマーを、コントロールとして使用した（センスプライマー、５’ −ＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧ−３’（配列番号３）：アンチセンスプライマー、５’−ＣＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣ−ＣＡＣＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号４）。ｐＨＢＶ−ＨＴＤでインビトロ形質転換されたヒト肝細胞癌腫細胞系（Ｈｕｈ−７）（Blum eta l.，Hepatology 14: 56，1991）から得られた全ＲＮＡを、ＨＢＶＲＮＡの検出のための陽性コントロールとして使用した。ラット血清中のＨＢＶビリオンラット血清をＤＮａｓｅＩ処理し、抗ＨＢｓＡｇ結合ビーズでＨＢＶビリオンを免疫沈降させた後、ＰＣＲを行うことにより、ＨＢＶＤＮＡを検出することにより、血清中のＨＢＶビリオンの存在を検討した。血清は、１８から２１匹のラットでビリオン陽性であった。血清中に検出されたＨＢＶの量は、サザン解析により検出されたＰＣＲ増幅可能物質の増加によりアッセイしたところ、形質転換後最初の３日間は増加し（図１Ｂ、レーン１〜９）、その後急速に減少し、形質転換の１４日後には検出されなくなった（図１Ｃ、レーン１〜６）。ＨＢＶビリオン血清は、以下のようにして測定した。まず、血清を1ml当たり２０ユニットのＤＮａｓｅＩ（Boehringer Mannheim）で３７℃で３０分処理し、ｐＨＢＶ−ＨＴＤプラスミドのような裸ＤＮＡを消化した。次に、アズラクトン−アクリルアミド・コポリマー・ビーズ（Pierce）に結合したマウス抗ＨＢｓＡｇ抗体（５Ｄ３モノクローナル抗体）（Takahashi et al.,J ．Immunol．Metho ds 112:91，1988）を用いることにより、血清からＨＢＶ粒子を免疫沈降させた。完全なＨＢＶビリオンには、二本鎖で３．２kbのＨＢＶＤＮＡが含まれており、そのエンベロープにはＨＢｓＡｇが存在するため、ＨＢＶは、これらの抗体結合ビーズにより免疫沈降する。十分に洗浄した後、９５℃で５分加熱することによりビーズからＨＢＶＤＮＡを放出させ、上記と同一のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、サザン解析においてＨＢＶプローブへとハイブリダイズさせ、ＰＣＲ産物の特異性を確認した（Liang et al.，J ．Clin．Invest．84: 1367，198 9）。別法として、ＰＣＲ解析は以下のようにして行ってもよい。ＨＢＶのＰＣＲ解析を２．５mMＭｇＣｌ₂及び１μMの各プライマーを含む５０μlの最終容量で行う。増幅サイクルは、９５℃３０秒、５０℃１分、７２℃１分である。３０サイクルの後、ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ⁺ナイロンメンブレン（Amersham）へと転写する。ブロットに、サザン解析用の³²Ｐで標識したＨＢＶ特異的制限断片（ｐＨＢＶ−ＨＴＤのＡａｔ I I断片；３２２１bp）をハイブリダイズさせる。ＨＢＶのコア読み取り枠内に位置する以下のプライマーをＨＢＶ検出に用いる。センスプライマー、ＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧ（配列番号５）；アンチセンスプライマー、ＧＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＡＴＴＧＡＧＡ（配列番号６）。これらのプライマーは、５７８bpの断片を与える。以下のベータアクチンプライマーを、コントロールとして使用した。センスプライマー、ＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧ（配列番号７）；アンチセンスプライマー、ＣＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣ（配列番号８）。これらのプライマーは、１０４５bpの断片を与える。ＨＢＶ肝臓ＤＮＡａｄｗＲ９で形質転換されたラットから単離した肝臓ＤＮＡのゲノムサザン解析を行うことにより、ＨＢＶＤＮＡを検出した。ＨＢＶ特異的プローブでのハイブリダイゼーションにより、７．２kb及び３．２kbのＤＮＡバンドが、ＥｃｏＲＶ消化したゲノムＤＮＡ中に検出された（ｐＨＢＶ−ＨＴＤのＡａｔ II断片）（図２、レーン１〜３）。ベクター特異的プローブ［ＢａｍＨＩで消化したｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）ＤＮＡ］を再ハイブリダイズさせた同一の肝臓ＤＮＡブロットにも、７．２kbバンドは観察されたが、３．２kbのバンドは検出されなかった（レーン４、５、及び６）。ＨＢＶゲノム（ａｄｗサブタイプ；３．２kb）及びａｄｗＲ９ＨＢＶ構築物（７．２kb）両方に、単一のＥｃｏＲＶ部位が含まれているため（Blum et al.，Hepatology 14: 56，1991）、観察された３．２kbのバンドは、消化されたａｄｗＲ９に由来するものではなかった。これらのデータにより、ＨＢＶＤＮＡが肝臓において取り込まれていない形態で産生され、存在していたことが確認できる。さらに、ＨＢＶＤＮＡは、１日目、２日目、及び３日目に同程度の強度で検出されたが（それぞれレーン１〜３）、肝臓内のａｄｗＲ９プラスミドＤＮＡは、１日目と３日目の間に急速に減少した。このように、ａｄｗＲ９構築物が除去された後にも３．２kbのＨＢＶＤＮＡが存在していたということは、ＨＢＶ産生がそれ自体の複製により行われているということを示唆している。ゲノムサザン解析は以下のようにして行った。ＨＢＶ、ａｄｗＲ９の頭部−尾部結合型ヘテロダイマーで形質転換されたラット肝臓を解析に用いた。肝臓からＤＮＡを抽出し、単一の部位でＨＢＶゲノム及びａｄｗＲ９を切断するＥｃｏＲＶで消化し、１％アガロースゲル電気泳動により分離した。ＤＮＡ断片をサザンハイブリダイゼーションフィルターに転写し、ＨＢＶ特異的制限断片（ｐＨＢＶ −ＨＴＤのＡａｔ II断片）をまずハイブリダイズさせ、除去し、それからサザン解析用のベクター特異的制限断片［ＢａｍＨＩで消化したｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）ＤＮＡ］を再ハイブリダイズさせた。形質転換ラットにおける血清ＨＢｅＡｇ及び抗ＨＢｅ抗体反応ｐＨＢＶ−ＨＴＤ形質転換ラットにおける、血清ＨＢｅＡｇレベル及び抗ＨＢｅ抗体反応の代表的な時間経緯を図３に示す。ｐＨＢＶ−ＨＴＤでの肝臓形質転換の３〜７日後にラット血清中にＨＢｅＡｇが観察され、その後２１日目まで抗ＨＢｅ抗体力価が増加した。ＨＢｅＡｇも抗ＨＢｅも、ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）で形質転換されたモック形質転換ラットの血清中には観察されなかった（図３）。ＨＢｅＡｇ及び抗ＨＢｅ抗体は、以下のようにして測定した。血清をラットの尾静脈から採取した。ＨＢｅＡｇ及び抗ＨＢｅ抗体の存在は、それぞれ、“サンドイッチ法”及び“競合結合法”により、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Abbott）を用いて、決定した。ＨＢｅＡｇの相対濃度は、標本の４９２nmにおける吸光度（Ａ₄₉₂）により示した。抗ＨＢｅのレベルは、以下の式を用いて計算されたパーセント阻害として表した。パーセント阻害＝［（陰性コントロールの平均Ａ₄₉₂−試料のＡ₄₉₂）／（陰性コントロールの平均Ａ₄₉₂−陽性コントロールのＡ₄₉₂）］×１００。血清中のグルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）レベルＧＰＴは主に肝臓に見られ、損傷を受けた肝細胞から放出されるため、血清中のＧＰＴ活性を肝疾患の指標として測定した。ＨＢＶ形質転換の２〜３週間後、大部分のラットで血清ＧＰＴ値が上昇していた［０日目には６０国際ユニット（ IU）／１±５IU/l、２１日目には２１０IU/l±４９IU/l、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝１５］（図４）。モック形質転換ラットでは、血清ＧＰＴの上昇は観察されなかった（０日目には３７IU/l±１８IU/l、２１日目には３０IU/l±１２U/l、ｎ＝３）。肝臓の組織構造ｐＨＢＶ−ＨＴＤ、ａｄｗＲ９、又はｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）構築物でインビボ形質転換してから３〜２１日後に屠殺された、無作為に選択されたラットから、肝臓組織を得た。図５Ａは、血清ＧＰＴレベルが４８３IU/lの（図４参照）、ｐＨＢＶ−ＨＴＤ構築物でインビボ形質転換してから２１日後のラットの肝臓組織の組織構造を示す。門脈周辺の実質細胞は消失し、代わりにリンパ球が浸潤していた。ｐＨＢＶ−ＨＴＤ又はａｄｗＲ９で形質転換された他の動物も同様の組織学的変化を示した。モック形質転換ラットの肝臓では、肝細胞の死、又はリンパ球の浸潤は観察されなかった（図５Ｂ）。無胸腺ヌードラトのｐＨＢＶ−ＨＴＤでのインビボ形質転換本明細書に記載の実験動物モデルにおいて、Ｔリンパ球が肝細胞の損傷の誘導に重要であるか否かを調べるため、Ｔリンパ球欠損無胸腺ヌードラットに上記のようにしてｐＨＢＶ−ＨＴＤを形質転換した。これらの形質転換動物のいずれにおいても血清ＧＰＴ上昇は見られず（図４）、肝臓は組織学的に正常であった（図５Ｃ）。興味深いことに、これらのヌードラットでは７日目と２１日目の間にＨＢＶビリオンの血清レベルが増加した（図１Ｃ、レーン７〜１３）。この発見は、形質転換から７〜１４日後に急速に減少した、正常ラットの血清ＨＢＶビリオンレベルと対称的である（図１Ｃ、レーン１〜６）。モデルの特徴解析上記の方法によりクローンＨＢＶＤＮＡをインビボ形質転換した後、肝臓には３．２kbのＨＢＶＤＮＡだけでなくＨＢＶＲＮＡも存在し、ＨＢＶビリオンが血中に検出された。最も重要なこととして、活発なウイルス複製の血清マーカーであるＨＢｅＡｇ（Brechot et al.，Lancet，ii: 765，1981; Hadziyannis e tal.,Hepatology 3: 656，1993）がラットの血清中に観察され、その出現に続いて抗ＨＢｅ抗体反応が観察された。これらのデータより、ＨＢＶ構築物で形質転換されたラットで、ＨＢＶビリオンが活発に産生され、ＨＢＶ遺伝子産物に対する免疫応答が生じたことが明らかとなった。さらに、これらの動物における肝臓の組織構造では、血清ＧＰＴ値が上昇している時、肝細胞の死及びリンパ球の浸潤により特徴付けられる重篤な肝細胞の損傷が示された。このように、これらの形質転換ラットにおいてＨＢＶにより誘導される病原は、ＨＢＶ遺伝子の発現、ＨＢＶビリオンの産生、血清トランスアミナーゼの増加、及び特徴的な組織学的発見と特徴としていた。ＨＢＶＤＮＡで形質転換されたラットにおけるこれらの病理学的変化は、ヒトでＨＢＶにより誘導される急性ウイルス肝炎で見られるものと類似している。これらの試験では、ＨＢＶ（ｐＨＢＶ−ＨＴＤ）及びａｄｗＲ９の頭部−尾部結合型ダイマー構築物を使用した。これら及び他の頭部−尾部結合型ダイマー構築物には、ヒト肝癌細胞系において完全なビリオンを産生することができる、ＨＢＶゲノム及び内在性ウイルスエンハンサー／プロモータ一因子が含まれる（Bl umet al.，J ．Virol．65: 1836，1991; Blum et al.,Proc Nat'l Acad ．Sci.USA 84:1005,1987; Sureau et al.,Cell 47:37,1986; Yaginuma et al.,Proc ．Natl Acad．Sci．USA 84: 2678，1987; Yasinuma et al.,Proc.Nat'l Acad．Sci．U SA 84: 2678，1989）。そして、ＨＢＶのインビトロ複製は、ラット肝臓由来細胞において既に示されている（Shih et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci.USA 86.63 23，1989,Diot et al.，J ．Med．Virol.36: 93，1992）。しかしながら、これらの複製可能構築物を直接的に形質転換した後、ラット肝臓でインビボでＨＢＶ遺伝子が発現するか否かを決定した研究はこれまでに存在しなかった。本データは、単一の遺伝子をインビボ導入することにより、ラットにおいて、ＨＢＶ遺伝子が発現し、ＨＢＶ粒子が産生され、自発的肝炎が発症されることを示すものである。ＨＢＶの無胸腺ヌードマウスモデルにおけるアシアロＩＦＮ−βのインビボ効果ｐＨＢＶ−ＨＴＤをアシアロフェチュイン−ポリ−Ｌ−リジン結合体及びカチオン性リポソームと複合体化し、肝特異的形質転換のためのウイルス様粒子（感染性リポソーム）を作製した。感染性リポソーム複合体を、脾臓を介してヌードマウスの門脈に注入した。インビボ形質転換の７日後、マウスを無作為に選択し、生理食塩水溶液（ＰＳＳ）、ＩＦＮ−β（１０，０００IU/日）又はアシアロＩＦＮ−β（１０，０００IU/日）を腹腔内注射して７日間処置を行った。アシアロフェチュイン−ポリ−Ｌ−リジン結合体及びカチオン性リポソームは、トルベッケイ（Trubetskay）ら（Bioconjugate Chem ．3:323，1992）及びカール（Karl）ら（Am ．J．Med．Sci．307: 138，1994）に記載の方法により調製した。アシアロフェチュインは肝細胞のＡＧＰＲに結合し、カチオン性リポソームは細胞膜の融合及び肝細胞へのＤＮＡの送達を容易にするため、肝特異的な形質転換を達成するために、ｐＨＢＶ−ＨＴＤをアシアロフェチュイン−ポリ−Ｌ− リジン結合体及びカチオン性リポソームと複合体化した。簡単に述べると、５Ｏ μｌのｐＨＢＶ−ＨＴＤ（４００μg/mlのＤＭＥＭ）、１００μlのアシアロフェチュイン−ポリ−Ｌ−リジン結合体（５００μg/mlのＨＢＳＳ、pH７．４）及び１００μｌのカチオン性リポソーム（１，０００μg/mlのＨＢＳＳ、pH７．７）を、微量遠心チューブ内で混合した。混合しながら室温で１５分インキュベーションを行った後、［アシアロフェチュイン−ポリ−Ｌ−リジン］−ＤＮＡ−［カチオン性脂質］複合体を、０．２μmポリカルボン酸メンブレンフィルター（P oreticｓ Corporation，CA）で濾過した後、形質転換を行った。アシアロＩＦＮ−βの調製約１mgのヒトＩＦＮ−β（ヒト繊維芽細胞により産生されたもの）を１ユニットのアーソバクター・ウレアファシエンス（Arthobacter ureafaciens）由来のノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）で、１mlの５mMギ酸（ｐＨ３．５）中で３７ ℃で３時間消化した（図６）。加水分解後、シアル酸が除去されたＩＦＮ−βを、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル直線勾配で、Ｃ１８逆相カラム（Zorbax PR-10,4.6×300mm; Dupont）を用いて単離した。ＨＢＶの無胸腺ヌードマウスモデルにおけるアシアロＩＦＮ−Ｂのインビボ効果感染性リポソームを用いたインビボ形質転換により、すべてのヌードマウスにＨＢＶ粒子を産生させた。ＰＢＳで処理をしたヌードマウスでは、ＨＢＶウイルス血症が処理の最後（形質転換の１４日後）まで持続した（図７）。シアル化された天然のＩＦＮ−β（１０，０００IU/マウス／日、７日間）は、有意な抗ウイルス効果を示さなかった。対称的に、アシアロＩＦＮ−β（１０，０００IU/ マウス／日、７日間）は、図７に示されるように、実質的な抗ウイルス効果を示した。ヒトアシアロＩＦＮ−βのＨＢＶ形質転換ヒト肝癌細胞に対する効果アシアロ糖タンパク質受容体を有する肝癌細胞系が、［¹²¹Ｉ］標識されたアシアロ・オロソムコイドを用いて同定されている（Schwartz et al.，J ．Biol． Chem． 256:8878，1981）。一つのアシアロ糖タンパク質受容体発現細胞系ＨｅｐＧ２（アメリカンタイプカルチャーコレクション；Bethesda，MD: ATCC HB8065 ）をＨＢＶ形質転換のために選択した。ＨｅｐＧ２細胞に、以下のようにしてｐＨＢＶ−ＨＴＤを形質転換した。アシアロＩＦＮ−β及び天然ＩＦＮ−βのＨＢＶ形質転換ＨｅｐＧ２細胞に対する効果を調べるため、２×１０⁵個の形質転換細胞を、ヒト天然ＩＦＮ−β（１，０００IU/ml）又はアシアロＩＦＮ−β（１，０００IU/ml）又は食塩水のいずれかで４８時間処理した。細胞毒性を、モスマン(Mosmann)により記載された方法（J ．Immunol．Meth．65．55，1983）により、比色ＭＴＴ細胞増殖アッセイを用いてモニターした。アシアロＩＦＮ−８は天然ＩＦＮ−βよりも効果が高いアシアロＩＦＮ−β及び天然ＩＦＮ−βはいずれも、ＨＢＶ形質転換ＨｅｐＧ２細胞によるＨＢＶ産生を減少させることが見出された。しかしながら、アシアロＩＦＮ−βは、天然ＩＦＮ−βよりも効果が高いことが見出された。アシアロＩＦＮ−βにより、ＨＢＶ産生はコントロール細胞と比較して５倍超減少したが、天然ＩＦＮ−βでは１．５から２倍しかＨＢＶ産生が減少しなかった。さらに、アシアロＩＦＮ−βでは、ＨＢＶ形質転換ＨｅｐＧ２細胞によるＨＢｓＡｇ産生が２６〜３８％に減少したが、天然ＩＦＮ−βでは３３〜４０％であった。アシアロＩＦＮ−β及び天然ＩＦＮ−βのｐＨＢＶ−ＨＴＤ形質転換ＳＫ−ＨＥＰ細胞に対する効果を調べた。これらの細胞には、アシアロ糖タンパク質受容体が存在しない。これらの細胞では、アシアロＩＦＮ−βは天然ＩＦＮ−βと同程度に効果がなかった。表１ HBeAg(ng/ml) 0時間 48時間 72時間食塩水 0.018±0.006 6.934±0.175 14.530±0.280 IFN-β(1,000IU/ml) 0.029±0.003 2.747±0.090* 3.830±0.266**アシアロ IFN-β(1,000IU/ml) 0.042±0.008 2.618±0.093* 3.830±0.266** 注：形質転換の６時間後、食塩水、ＩＦＮ−β、又はアシアロＩＦＮ−βを培養液に添加した（０時間）。形質転換ＨｅｐＧ２細胞からのＨＢｓＡｇ産生は、ＩＦＮ−β及びアシアロＩＦＮ−βで４８時間処理することにより有意に阻害された（スチューデントｔ検定により、＊は食塩水に対してＰ＝０．００００４、＊＊は食塩水に対してＰ＝０．００００４かつＩＦＮ−βに対してＰ＝０．０１５であることを示す）。本節に記載された実験では、以下の方法を用いた。これらの実験のため、上記の方法により、ヒトアシアロＩＦＮ−βを天然グリコシル化ＩＦＮ−βから調製した。ＨＢＶ形質転換ＨｅｐＧ２細胞によるＨＢＶビリオン産生は、上記のようにして測定した。ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（AUSZYME，Abbot Laboratories）を用いて調べた。すべての細胞系は、５６℃で３０分不活化した１０％胎児ウシ血清、１０μＭ非必須アミノ酸、１００U/mlペニシリン、及び１００μg/mlストレプトマイシンを添加したイーグルＭＥＭ（M．A．Bioproducts; Walkersville，MD）中で維持した。インビトロ試験に用いた細胞は、トリプシンの非存在下、０．０４％エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）／バーシン（versine）緩衝液で、３７℃ で５分処理することにより、単層培養から採取した。３００mmのプレート１枚当たり、２×１０⁵個の細胞及び３μgのｐＨＢＶ−ＨＴＤを用いて、リン酸カルシウム法（Mol ．Biol．Cell．7:2745，1987）により、細胞を（上記の）ｐＨＢＶ−ＨＴＤで形質転換した。形質転換後、３０μlのＩＦＮ−β（１００IU/μl）又はアシアロＩＦＮ−β（１００IU/μl）を６時間ごとに４８時間培養液に添加し、最終濃度１，０００IU/mlとした。コントロール培養液には、同じ総容量の生理食塩水を添加した。アシアロ・インターフェロンＢ型肝炎ウイルス及び他の症状を治療するために用いられるアシアロ・インターフェロンは、通常、末端にシアル酸残基を有している真核細胞において産生されたグリコシル化インターフェロンから該残基を除去することにより作製される。したがって、インターフェロンは、それを天然に産生するヒト繊維芽細胞、又はクローン化インターフェロン遺伝子を発現するよう操作された真核細胞から単離することができる。動物モデル上記の方法は、他の型の肝炎のげっ歯動物モデルを調製するために用いることが可能である。したがって、他の変種又は変異型Ｂ型肝炎ウイルスを、上記の実験で使用されているａｄｗ２変種の代わりに使用することができる。したがって、ａｄｗ、ａｄｒ（１）、ａｙｒ（２）、ａｙｒ、ａｙｗ（１）、ａｙｗ（２）又は他の変種を使用することができる。さらに、上記の方法は、Ｃ型肝炎及びＧ型肝炎のモデルを調製するためにも、当業者により使用されうる。アシアロ・インターフェロンによる治療上記の方法及び当業者に既知の他の方法を、グリコシル化インターフェロンのアシアロ型を調製するために使用することができる。したがって、インターフェロンα₂又は他のグリコシル化ヒトインターフェロンのアシアロ型を調製することが可能である。グリコシル化インターフェロンは、広範囲の肝疾患、又はアシアロ糖タンパク質受容体を有する細胞へインターフェロンを投与することが必要とされる他の疾患、例えばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、腎細胞癌腫、及びＧ型肝炎を治療するために使用されうる。末端のシアル酸残基の除去は、真核細胞において産生される広範囲の他のタンパク質（天然又は組み換え遺伝子の発現による）を修飾するための有用な方法となりうる。この修飾により、アシアロ糖タンパク質受容体を有する細胞により取り込まれやすく、したがってより効果の高いアシアロタンパク質が産生される。使用本発明の動物肝炎モデルは、肝細胞の死の研究など、肝炎の病理過程の免疫学的研究及び分子学的研究に使用されうる。重要なこととして、本モデルは治療薬となりうる化合物をスクリーニングするために使用することが可能である。ＨＢＶゲノムの突然変異による変化又は欠失が同定されており、それが重篤な肝炎の進行と関連していると考えられている。しかし、適当なモデル系が存在しないために、この仮説はインビボでは試験されていなかった。様々なＨＢＶトランスアクチベータータンパク質の細胞における機能、及びこれらのタンパク質が癌過程に関与している可能性も、正常な成体肝細胞では検討されていなかった。変種又は変異体又は他のウイルスを保持する動物を調製することにより、本明細書に記載の動物肝炎モデルを用いて、この仮説を実験で評価することが可能となった。さらに、インビボ療法の抗ウイルス効果を試験するため、そしてＣ型肝炎ウイルスなどの他の肝臓親和性ウイルスの病原を調査するための、実験モデルを開発することも可能となった。アシアロ・インターフェロンβは、天然型のヒトインターフエロンについて当業者が使用している量と同程度又はそれ以下の量で、Ｂ型肝炎（又はＣ型肝炎もしくはＣ型肝炎）を治療するために使用することができる。特異性が高められているために、より高い有効量が、低毒性で可能となるであろう。当業者であれば、動物モデル及び用量上昇臨床試験を用いて、適切な用量を決定することができよう。もちろん、有効量は、末端のシアル酸を除去する処理を受けていない天然のインターフェロンよりも、一般的に低下するであろう。他の型のインターフェロンも、同様にして処理することが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/50 ＴＣ１２Ｑ 1/68 ＰＧ０１Ｎ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/66 ＧＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト肝炎ウイルスＤＮＡで形質転換された肝細胞を保持する、肝炎の症状を示す非ヒト哺乳動物。２．げっ歯動物である、請求項１記載の非ヒト哺乳動物。３．げっ歯動物がマウスである、請求項２記載の非ヒト哺乳動物。４．げっ歯動物がラットである、請求項２記載の非ヒト哺乳動物。５．ヒト肝炎ウイルスＤＮＡがＢ型肝炎をコードするものである、請求項１記載の非ヒト哺乳動物。６．ヒト肝炎ウイルスＤＮＡがＣ型肝炎をコードするものである、請求項１記載の非ヒト哺乳動物。７．ヒト肝炎ウイルスＤＮＡがＧ型肝炎をコードするものである、請求項１記載の非ヒト哺乳動物。８．ａ）非ヒト哺乳動物に由来する肝細胞の試料を、リポポリアミンと複合体化されたヒト肝炎ウイルスＤＮＡと接触させ、複合体を肝細胞に結合させＤＮＡを細胞に侵入させることにより、形質転換肝細胞を調製し、そしてｂ）該形質転換肝細胞の試料を、該非ヒト哺乳動物と同種の、部分的に肝切除された非ヒト哺乳動物へと投与することを含む、請求項１記載の非ヒト哺乳動物を調製するための方法。９．真核細胞により産生されたインターフェロンからアミノ末端のシアル酸を除去することにより作製されたアシアロインターフェロンを、患者に投与することを含む、肝炎ウイルスに感染した患者を治療する方法。１０．真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項９記載の方法。１１．インターフェロンがインターフェロンβである、請求項９記載の方法。１２．（ａ）生物試料をヌクレアーゼで処理し、（ｂ）該試料をＢ型肝炎エンベロープタンパク質に特異的な抗体と接触させ、該試料の画分を免疫沈降させ、そして（ｃ）ポリメラーゼチェーン反応を用いて、該画分中のＢ型肝炎核酸を増幅させ、増幅されたＢ型肝炎核酸のレベルを該試料中のＢ型肝炎ウイルスのレベルの指標とすることを含む、生物試料中のＢ型肝炎ウイルスを測定する方法。