JP2000502242A

JP2000502242A - 哺乳動物のプロホルモンコンバターゼ

Info

Publication number: JP2000502242A
Application number: JP9507056A
Authority: JP
Inventors: ジェ．セイダー，ナビル; デイ，ロベール; クレティアン，ミシェル
Original assignee: インスティテュトドゥルシェルシュクリニックドゥモントリオール
Priority date: 1995-08-02
Filing date: 1996-08-02
Publication date: 2000-02-29
Also published as: WO1997005256A3; WO1997005256A2; CA2227988A1; AU6608996A; EP0842280A2; US5840529A

Abstract

(57)【要約】本発明は rPC７と命名するラットから単離したスブチリシン−ケキシン科の新規であり、且つ７番目のメンバーに関連する。そのラット脾臓cDNAが全体的に配列決定された。より短い DNA配列がヒトに関して得られ、それはラットのプロホルモンコンバターゼに対応するヒトプロホルモンコンバターゼの触媒領域の一部に対応する。PC７はスブチリシン−ケキシン科のその他の哺乳動物メンバーから明確に区別できる。その組織分布は遍在的であるが、その存在はリンパ系組織において特に著しい。それは、 HIV gp160タンパク質を活性 gp120／gp41タンパク質へ切断でき、且つ今日まで知られるその他の有効なプロホルモンコンバターゼを欠くLoVo細胞の中に存在する。PC７は標的CD４⁺ 細胞中の HIV gp160タンパク質の変換を担う成熟酵素としての良好な候補である。従って、PC７の発現の休止化は gp160の活性化の阻害を供するであろう。完全な阻害はPC７、フリン、そしてPC５の発現の休止を包括するであろう。PC７はダウン症候群及びアルツハイマー病に苦しむ患者の脳で高いパーセンテージでも発現され、PC７に対する抗体の結合はプラク及びタングルにおいて復帰する。この発見はPC７がこれらの病気のマーカーとなるであろうことを示唆する。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳動物のプロホルモンコンバターゼ発明の分野本発明はプロテアーゼ、特に成熟酵素、より詳しくはスブチリシン−ケキシン科のそれに関する。発明の背景スブチリシン−ケキシン科の莫大な数の酵素が知られ、そしてそれらは全てタンパク質前駆体上の塩基性残基を認識且つ切断できる特徴を有する。これらは互いとは一及び二塩基性残基を含む特異的な配列を切断するその能力により相違する。これらはまた互いとはその組織及び細胞内分布により相違する。哺乳動物において、プロホルモンコンバターゼ１〜６が既に知られている。新規のホルモンコンバターゼの部分アミノ酸配列がヒト鱗状癌腫細胞系 BENから得られている。このアミノ酸配列はオーストラリア国のグループにより、その発明者の一人が開催した1995年３月２日〜８日にレークタホー（Lake Tahoe）CA州で開いたキーストーン（Keystone）会議で開示された。このグループはポスター（アブストラクト番号Ｂ７−102，J．Cellular Biochemistry,付録19B，1995，p243）を紹介し、それにおいて新規の成熟酵素が BEN細胞において甲状腺傍ホルモン放出タンパク質と一緒に同時発現されることを示した。ヌクレオチド配列は開示されていない。発明の記述本発明の目的はラット細胞から単離された新規の酵素であって前記ヒト酵素の部分アミノ酸配列とかなり高度な相同性を示し、且つ以降ラットプロホルモンコンバターゼ７（rPC７）と称するものを提供する。この酵素はスブチリシン−ケキシン科の新しいメンバーである。この酵素は遍在的な細胞分布を有するが、その存在は免疫系細胞において極めて著しいものである。ラットの脾臓から得られるcDNAが部分配列決定され、そして rPC７のアミノ酸配列がそれから推定できた。更に、ヒトPC７の部分アミノ酸配列をコードするcDNAも得られ、その配列は前記オーストラリア国のグループにより紹介されたものと同一のペプチド配列をコードする。ラット及びヒトPC７は種変異体であり、そして rPC７と同じ活性を有するタンパク質をコードするその他の変異体を誘導することは当業者の能力の範囲内に属するものであるため、PC７核酸変異体は総括的に本発明の範囲に属する。より詳しくは、機能的なアレル変異体及びPC７保存性置換に至る核酸置換が考慮される。本発明のその他の目的はヒト及びラットPC７に共通するペプチドの提供にある。これらのペプチドは様々な種のPC７遺伝子生成物に結合できる抗体の生産を誘引するために利用できうる。本発明の更なる目的はPC７に特異的な抗体の提供にある。これらの抗体は、ラットとヒトのPC７部分タンパク質配列間に存在する配列の類似性を頼りとするなら、種間のタンパク質配列の保存性を前提に、様々な哺乳動物の種の細胞又は組織の中のPC７の存在又は量を検定するのに有用である。これらの抗体はPC７の存在及び／又は量を検出するための診断試薬として有用である。従って、細胞又は組織中のPC７の存在及び／又は量を検出するためのキット及び方法も本発明の観点である。キット及び方法はウェスタンブロット、免疫化学及び免疫学的アッセイの如き様々な目的のために考えつかれる。 PC７核酸、特に様々な哺乳動物種の細胞又は組織の中に存在するメッセンジャーRNA を検定するための核酸プローブ及びオリゴヌクレオチド並びに方法及びキットも本発明の目的である。方法及びキットは様々な方式、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の如きのための増幅方法、in situ ハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、並びに電気泳動により分離され、転写され、そしてラベル化プローブ及びオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせたDNA フラグメントの検出のための方式において開発される。診断試薬及びプローブはこの新規な酵素の検定において有用である。陰性又は陽性結果はその使用者に、細胞内に存在する注目のタンパク質のタンパク質前駆体が、その前駆体がPC７により認識可能な塩基性残基を担持するか否かで、切断されるか否かの情報を提供するであろう。かかる有用性はこの科のその他のメンバーに関して既に実証されている。例えば、副腎皮質細胞系、 AtT−20において、PC２の欠如はアルファーMSn 及びベーターEnd の生産性の欠如と相関し、一方この細胞のPC２コード配列により補完はこれら２種類のPOMC遺伝子生成物の生産を可能にする。別の例として、反応性低血糖症はPC１発現の欠失に相関する。タンパク質前駆体に対する各プロホルモンコンバターゼの切断の特異性に基づき、この新規の酵素は既に公知のコンバターゼにとっては劣る基質であることのわかっている前駆体の成熟化において有用でありうる。 PC７及びそのサブフラグメントをコードする核酸配列はセンス又はアンチセンス状態でプラスミドベクターにおいてクローニングできるインサートを構成する。これらのベクターは細菌性プラスミド、ファージ及び発現ベクターである。PC ７センスインサートを含んで成る組換ベクターはPC７遺伝子生成物を生産するのに有用である。PC７アンチセンスインサートを含んで成る組換発現ベクターはPC ７遺伝子の発現を休止させるのに有用である。 PC７に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドはPC７遺伝子発現を休止するのにも有用である。 PC７により切断可能な基質の一つはHIV エンベロープ糖タンパク質 gp160である。このタンパク質の切断は前駆 gp16Oの活性及び融合原性(fusiogenic)形態である gp120とgp41の生産を供す。PC科メンバーの全てがgp160 を gp120／gp41へとプロセシングすることができる。そのうち、PC４のみが試験されており、なぜならこの酵素は雄の生殖細胞の中に専ら局在しているからである。試験したPC科メンバーの全てがgp16O を切断できるが、HIV 感染のための主要標的において局在するもの、即ちフリン、PC７及びPC５のみが活性ウィルス糖タンパク質の形成を担う良好な候補である。フリン及びPC７はCD４⁺リンパ球細胞系の中で発現される酵素である。PC５は研究したCD４⁺細胞系の全てに局在する。従来の報告はフリンが gp160のタンパク質分解成熟にとって重要ではあるが必須ではないことを示した(Ohnishi，Y.ら(1994)J．virol．68 : 4075-4079 及びG u，M.ら(1995)FEBS Lett．365 : 95-97)。フリンは gp120をgp77及びgp53生成物へと更に切断でき、その切断特異性はフリンのみに認められる。従って、PC７は HIV標的細胞において gp160から gp120を形成できるその他のプロセシング酵素である。従って、本発明の目的は gp160の gp120／gp41生成物に至る変換を妨げる方法を提供し、この方法はg p160mRNAをフリンアンチセンス構築体及びPC７のアンチセンス構築体を含んで成る核酸と接触させて gp160の切断を担うプロセシング酵素の発現を休止させる工程を含んで成る。任意的に、mRNA又はPC５をコードする対応のcDNAに対するアンチセンスヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドが更に含まれる。 gp120形成は HIV感染能にとって必須であるため、本発明の更なる目的は HIV ウィルスによる感染に感受性である被検体のAIDSの発症を予防するための方法の提供にあり、その方法はフリン及びPC７の前記アンチセンス構築体を含んで成る組成物を投与する工程を含んで成る。このアンチセンス構築体はフリン及びPC７をコードするmRNA又は対応のcDNAに対する完全アンチセンス配列又は前記完全アンチセンス配列のオリゴヌクレオチドフラグメントを含んで成りうる。任意的に、PC５をコードするmRNA又は対応のcDNAに対するアンチセンスヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが更に含まれる。PC７を休止させる目的のために用いられるアンチセンス構築体を含んで成る組成物が本発明の目的である。より詳しくは、 gp16Oに至る成熟を担うプロテアーゼを休止させることのできるものが本発明の目的である。かかる組成物及び方法は処置被検体に対して著しく有害な作用を有し得るため、これらの組成物は HIV感受性器官又は細胞をターゲッティングできる製剤の中にこのようなアンチセンス構築体又はオリゴヌクレオチドが含まれた状態で含んで成るものであろうことが考えつく。かかる製剤は例えばwo96／10339 に記載の如きリポソーム、又は任意のその他のリポソーム、好ましくは HIV感受性器官又は細胞の中で優先的に蓄積し易いものを含みうる。その他のタイプの製剤にはナノエリトロソーム、例えばLejeune ら（1994）Anticancer Research 14 : 915-9 20に記載のものを含みうる。 HIV感染に対して感受性である器官又は細胞に対するターゲッティングの特異性を強めるため、このリポソームをかかる器官又は細胞の膜マーカーに特異的なリガンドにコンジェゲーションさせることが考えつく ° PC７に関する染色は高いパーセンテージでダウン症候群又はアルツハイマー病に苦しむ患者の脳並びに老人患者の脳において、特にプラク（plaq ue）及びタングル（tangle）において観察されるため、本発明の更なる目的はそれらに冒された患者のこれらの病気の一つを診断する方法を提供し、この方法は PC７に特異的なラベル化抗体又は抗体フラグメントを適量でこれらの患者に投与し、そしてこのような病気の存在の指標として脳のプラク及びタングルの中に蓄積したラベルを検出することを含んで成る。これらの病気を診断するための別の方法は脳脊髄液体の如き生物学的サンプル中の抗体又は抗体フラグメントに対するPC７結合を測定することであろう。 PC７の機能はこれらの病気に対して予防的であり得、そしてその遺伝子発現の活性化又は遺伝子導入を介するPC７の過剰発現はプラク及びタングルの発症を打破する新規なアプローチでありうる。発明の説明本発明は特定の実施例及び添付図面により以降詳細に説明し、その目的は本発明の限定ではなく、その例示にある。図面の簡単な説明図１はラット、マウス及びヒト細胞系における（上図）、並びにラット組織にわたる（下図）PC７のノーガンブロット分析である。PC７mRNAの推定のおよそのサイズは 4.0〜4.2kb である。示している22種の樹立細胞系は〔Ａ〕に種の構成的分泌細胞： HepG２（肝細胞癌腫、ヒト）、Cos-１（腎臓、アフリカングリーンモンキー）、BSC40（アフリカングリーンモンキーの腎上皮細胞）、BRL-3A（肝細胞、バッファロラット）、Ｙ１（副腎皮質、マウス）、LoVo（結腸アデノ癌腫、ヒト）、NIH／3T3（胚、マウス）、LtK^-（接続組織、マウス）、TM３（精巣Leydig細胞、マウス）、TM４（精巣Sertoli 細胞、マウス）、Caco−２（結腸アデノ癌腫、ヒト）及びLLC-PK₁(近位腎小管上皮細胞、ブタ)。〔Ｂ〕10 種の内性分泌顆粒含有調節細胞：Neuro ２Ａ（神経芽腫、マウス）、NG-108（神経芽腫グリオームハイブリド、ラット−マウス）、SK−Ｎ−MIXC （感覚上皮細胞、ヒト）、GH4C1（体乳腺発育細胞、ラット）、GH3（体乳腺発育細胞、ラット）、AtT-20（コルチコトロフ、ラット）、αＴ３−１（性腺剌激細胞、マウス）、Rin m5F（インスリノーマ、ラット）、PC12（褐色細胞腫、ラット）及びBTC-３（インスリノーマ、マウス）。図２はラットの（Ａ）胸腺、（Ｃ）脾臓及び（Ｅ）リンパ節におけるPC７のmR NA分布を実証するin situ ハイブリダイゼーション組織化学の結果を示す。ハイブリダイゼーションシグナルの特異性は、センス鎖RNA プローブとハイブリダイズさせたＢ，Ｄ及びＦに示す隣接コントロールと対比させたときに実証される。これらのデーターはPC７がCD４⁺及びCD８⁺細胞を含む様々なリンパ球サブ集団において発現されることを示す。CD４⁺細胞は HIVレトロウィルスによる感染の標的であり、従ってPC７の存在はウィルス感染に必要とされる表層糖タンパク質 g p160の活性化にとって重要でありうる。図３はラットPC７の部分cDNA及び推定アミノ酸配列を示す（この配列は活性酵素の全構造をカバーする）。図４はラット（上図）及びヒト（下図）PC７の部分ヌクレオチド配列の整合を示し、ここで同一配列は垂直線分により接続した。図５はヒト（上図）及びラット（下図）活性PC７の部分アミノ酸配列の整合を示し、ここでPC７特異的エピトープに感受性な配列に下線を付した。PC ７の発現の歴史 1995年３月２〜８日にレークタホーCA州で開かれた本発明の一人が開催した最近のキーストーン会議の際、オーストラリア国のグループは、ヒト鱗状癌腫細胞系 BENから単離したPCR フラグメントを基礎とする新規のスブチリシン−ケキシン様コンバターゼの推定部分アミノ酸配列を示すポスター（アブストラクト番号Ｂ７−102，J．Cellular Biochemistry，付録19Ｂ，1995，p243）を紹介した °オーストラリア国のグループにより紹介されたアミノ酸データー下線を付したアミノ酸は共通縮重センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの開発を可能にする配列を示す。PC ７のヒトタンパク質配列を基礎とする縮重オリゴヌクレオチドの開発の選り抜きの戦略このアミノ酸配列を基礎に縮重オリゴヌクレオチドを開発し、これは発明者が BEN細胞の全 RNA及びラット下垂体mRNA由来の同等のmRNA由来の同一のアミノ酸配列をコードするcDNAを単離することを可能にした。 hPC ７に対するセンスオリゴヌクレオチド hPC ７に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド PCR クローン由来のラット及びヒトのPC７の推定ヌクレオチド及びアミノ酸配列ラット下垂体全 RNA及びオリゴ−dTに対して逆転写酵素 PCRを利用し、本発明者は第一鎖cDNAを増幅した。次いでこれらを94℃で20sec、52℃で1min 及び72℃ で２min の典型的な PCR反応で30サイクルにおいてセンス及びアンチセンス共通オリゴヌクレオチドによりプライミングした。285nt の増幅cDNAをベクター PCR IIの中にサブクローニングし、そしていくつかの陽性クローンを自動 ALFシーケンサーにより配列決定した。Ｒ14と称する一のクローンはラットPC７配列を供し、それをノーザンブロット分析、in situ ハイブリダイゼーション、及びラットの脾臓からラムダgtll cDNA ライブラリーをスクリーニングするために用いた。２種類のその他のクローンを単離し、それらは完全タンパク質をコードする長いラットcDNA列の同定を可能にした。活性酵素はSEQ ID NO:５のアミノ酸残基12 6〜783 によりコードされる。BEN細胞から得られる RNAから出発して、同じ戦略を利用してヒトPC７のcDNA配列を単離した。285bｐのフラグメントが得られ、そして配列決定した。ヒトPC７の部分cDNA配列はSEQ ID NO:４に規定してある。SE Q ID NO:４から推定したアミノ酸配列は全体的にオーストラリア国のグループにより開示された配列内に含まれる。次にラットの285bp プローブ(PCRフラグメント)を利用して細胞系の多重度のノーザンブロット並びにラットの組織及び細胞におけるin situ ハイブリダイゼーション研究を実施した。ノーザンブロット上の結果は図１に示し、in situ ハイブリダイゼーションから得られるものは図２に示す。このデーターはPC７と称するこの新規のmRNAの下記の特性を明示する。１）ノーザンブロット分析から、PC７転写体は調べた全ての組織及び細胞において遍在的に発現されることが認められ、フリンに類似の広範な分布が示唆され、なぜならそれは構成的及び調節分泌経路により細胞において発現されるからである。２）in situ 及びノーザンのデーターの総合はPC７が結腸、脾臓、胸腺及びリンパ節において最も豊富に発現されることを示唆した。これらは全てリンパ系組織である。３）樹立細胞系内のPC７の細胞発現の分析は全ての細胞におけるPC７の遍在発現を確証せしめたが、更にはマウス、ラット、ヒト及びブタの如き様々な種におけるその配列保存性も示した。PC７の最も豊富な起源は性腺剌激細胞に由来するマウスの下垂体アルファーＴ３−１細胞系及びマウスインスリノーマ由来のベーターTC３細胞系、マウスの線維芽細胞系LtK ^-1及びラットの褐色細胞腫PC12であった。４）更に、ヒト結腸癌腫LoVo細胞系におけるPC７の発現が有意であり、なぜならこの細胞系はフリン活性を欠くからである。この細胞系はPACE４及びフリンを発現することで事実上知られる〔Seildah 09〕。しかしながら、LoVoフリンは点突然変異を有し、それはこの細胞系においてそれを不活性な酵素に効率的にしてしまう〔Takaha shi，S.，Kasai，K.，Hatsuzawa，K.，Kitamura，N.，Misumi，Y., Ikehara，Y. ，Murakami，K．and Nakayama，K．（1993）Biochem.Hiophys．Res．Commun．19 5，1019-1026．〕。５）フリン以外の酵素がHIV gp160 表層糖タンパク質をプロセシングすることが、〔１〕この前駆体を gp120／gp41へと活性化するLoVo細胞の能力に基づき〔 0hnishi，Y.，Shioda，T.，Nakayama，K.，Iwata，S.，Gotoh，B.，Hamaguchi， M．and Nagai，Y．（1994）J．Virol．68，4075-4079〕並びに〔２〕in vitro g p160がフリン及びPC1の双方により gp120／gp41へとプロセシングされることを実証する本発明者により紹介された結果に基づき〔Decroly，E.，Vandenbranden ，M.，Ruysschaert，J．M.，Cogniaux，J.，Jacob，G．S.，Howard，S．C.，Mar nd Seidah，N．G．（1994）J Biol Chem 269 (16)，12240-12247〕可能であるという証拠が示された。しかしながら、本発明者の研究所において、 gp160が様々な細胞系においてPACE４，PC1，PC２，PC５及びそのアイソフォームPC５／６− Ｂと一緒に発現されたとき、フリンが最も良好なgp160 のプロセシング酵素であることがわかった。また、LoVo細胞はたとえそれがフリン活性を欠くにしてもこの前駆体を効率的にプロセシングできうる。このことはフリンがAIDSウィルス g p160の良好な候補的なプロセシング酵素であるにもかかわらず、LoVo細胞の中に存在する別の、しかしながら不明な酵素もこの仕事を成し遂げることができることを示唆する。PC７は第２の候補的な酵素であると期待され、そして gp160の弱いプロセッサーであるPACE４ではないと考えられる。PC５も第三の候補でありうることは否定できない。しかしながら、PC５は研究した全てのCD４⁺ 細胞において発現されるわけではなかった。ラット脾臓PC７の推定ヌクレオチド及びアミノ酸配列この配列は図３に示し、そしてアミノ酸及びヌクレオチド配列はそれぞれSEQ ID NO:５及び６に規定する。図３を参照すると、活性部位Asp¹⁵⁰，His¹⁹¹及びSe r³⁶⁹（太字、下線付き）、オキシアニオンホールAsn²⁹²（太字）〔◆◆〕、並びに推定チモゲン活性化部位Arg Ala Lys Arg 〔↓〕が強調してある。これらのアミノ酸残基をまたぐアンチセンスオリゴヌクレオチドはPC７の発現を休止するものと考えられる。３つの推定Asn^{130.138.204.474}グリコシル化部位も示す〔● ●●〕。そのうち、Asn²⁰⁴は活性部位を占めるDNA ストレッチ内に位置する。システイン残基をまたぐアンチセンスオリゴヌクレオチドは適正にフォルディングする分子の発現に影響を及ぼしうる。これは特にCys^{195.208.300.361}残基が適任に位置するHis¹⁹¹，Asn²⁰⁴，Asn²⁹²及びSer³⁶⁹のそれぞれをコードする配列のまわりのDNA のストレッチの場合である（図３参照）。上記のアミノ酸残基は全てアンチセンスオリゴヌクレオチドのデガインにおける選り抜きの標的である。その他のAsn¹⁶³部位はPro¹⁶⁶残基の観点においてＮ−グリコシル化について有用でない。推定のSer，Thrリン酸化〔★★〕及ひTyr 硫酸化〔★〕部位を示し、そして予測のSer リン酸化を有する変異Arg Arg Gly Ser Leu 配列を示す。最後に、推定トランスメンブラン定着ドメインである疎水性配列に下線を付した：推定ポリアデニル化シグナルAATAAAも強調した。選定の開始メチオニンはヌクレオチド218 に認められ、36アミノ酸シグナルペプチド（−36〜−１）を供する。 in−phase ATG の存在及び停止コドンTAA を表示した。有用なデーターは免疫系及びウィルス感染症の病理学において重要な意味を有するであろう。これらの考察は以下に基づく：ａ）ラット及びヒトの双方に由来するPC７の触媒ドメインのアミノ酸配列はPC ７かフリンに対して類似の切断特異性を有し、そして単独塩基性残基及び塩基残基の対の双方を認識するであろうことがわかる。更に、フリンの有用な特異性に基づき〔Siezen，RJ，Creemers，JWM and Van de Ven，WJM（1994）Enr．J．Bio chem．222，255-266〕、PC７は、切断部位がArg-Glu-Lys-Arg-↓であり、そして Glu がＰ３位を占めているHIV gp160 の如き切断部位（Ｐ３において）の３個残基前に存在する負に帯電したアミノ酸を有する前駆体を切断するのに一層良く適しうることが示唆される。ｂ）PC７は遍在分布し、そしてその発現はHIV ウィルスにより感染されうるCD ４⁺ 細胞を含む免疫系組織及び細胞において特に豊富である。従って、PC７は H IV gp160からgp12O／gp41への変換を阻害するためにそれに対する将来的なインヒビターが開発されうる選り抜きの標的である。インヒビターはとりわけ標的細胞中のPC７の発現を休止させることのできるアンチセンス核酸又はオリゴヌクレオチドでありうる。ｃ）科のその他の全てのメンバーが RRGDLである点、PC７のＰ−ドメイン内の RRGSL 配列の固有の存在は際立つ。これはPC７の固有性を意味し、そして RGD配列を認識する表層インテグリンレセプターとの可能な相互作用を否定しうる。PC ７の配列とスブリチリシン−ケキシン科のその他のメンバーとの整合この整合（図示せず）はPC７が祖先的なPC遺伝子生成物であることを示し、なぜならそれが４種の酵母株に由来する酵母ケキシン様酵素 Kex２，Krp，Kex１及びXRP-６を最も良く拠態するからである。哺乳動物PCにおいて、最も近縁したメンバーはPC1及びPC２である。命名法この新規の遺伝子生成物はPC７と称し、なぜならこれはスブチリシン−ケキシン科の７番目のメンバーであるからである。この名称PC７は最近、報告されたラット配列がこの科の７番目のメンバーであるということを誤って示唆するように公開された〔Tsuji．AS ら、Biochem Biophys．Res．Commun．202，1452-1459,1 994〕。しかしながら、配列整合は公開されたラットPC７配列が、公開されているラットPACE４〔Johnson，RC ら、Endocrinology 135，1178-1185，1994〕以外のなにものでもないことを明示した。従って、本発明者は名称PC７を保つことを決め、なぜならそれがコンバターゼの発見の順序におけるこの酵素のランクを正確に反映するからである。プローブとして有用なオリゴヌクレオチドラット及びヒトのPC７についてのヌクレオチド配列が得られたため、どれが様々な種におけるPC７の存在及び／又は量を検出するのに有用な保存配列であるかを推定することが今可能となった。ヒトとラットの配列の対比を図４に示す。この整合は38個のヌクレオチドストレッチ（SEQ ID NO:６のヌクレオチド1043と10 80との間にある）がラットとヒトとの間で絶対的に保存されていることを示し、それがこれらの種とその他の種におけるPC７の発現についての有効な特異的なプローブとして用いられることを示唆する。この配列をセンス及びアンチセンス方向で哺乳動物科のその他の６種のメンバーと対比したとき、本発明者は最良の整合性がラットのフリン、PC４，PC２及びPC５で計算され、63％の同一性であった。従って、高ストリンジェンシーで実施するハイブリダイゼーションは様々な哺乳動物種におけるPC７にとっての特異的なシグナルを供するであろう。以下のオリゴヌクレオチド及び長さ約15ヌクレオチド以上のその一部はストンジェンシー条件下でPC７にとっての同一の特異的なシグナルを供するであろう：これらは、SEQ ID NO:２及び３を有するオリゴヌクレオチド並びにその反転配列（SEQ ID NO:11及び12）と共に、PC７をコードする核酸、好ましくはmRNAの存在及び／又は量を慣用の検定手順（例えばノーザンブロット、in situ ハイブリダイゼーション）を検定するための診断試薬又は診断キットの成分として利用される。細胞サンプル（細胞、組織、そのリゼート又は細胞画分）を上記のオリゴヌクレオチドと選定の条件下で接触させ、そしてPC７の存在の指標としてハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの存在及び／又は量を検定する工程を含んで成る PC７の検出方法も新規である。むろん、これらのオリゴヌクレオチド又はそれより短いサブセット、並びにPC７をその他の種と整合させたときの保存配列に基づいてデザインされたその他のオリゴヌクレオチドが増幅方法におけるプライマーとして利用できる。PC ７に対する特異的な抗体の開発ラットとヒトのPC７のペプチド配列の整合を図５に示す。配列 HisGlnLeuGlyLysAlaAlaLeuGlnHis (SEQ ID NO:９;SEQ ID NO:５のアミノ酸残基 265〜274 に対応）は２種間で絶対的に保存されていた。それはその他のPCと２個のアミノ酸同一性のみを有していた（下線）。このペプチド配列は従ってPC７に特異的な抗体を生起するための選り抜きの配列と考えられる。ラットPC７に固有なその他の17個のアミノ酸配列もPC７に対して特異的な抗体の生産を及ぼすことのできる抗原と推定される： (SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:５のアミノ酸 485〜501 に対応）。この配列はＣ末端領域に位置し、それはPC７と科のその他のメンバーとの最大の相違度を示した。この領域は様々な種の組織又は細胞におけるPC７を認識する抗体の生産を可能にする種間の十分な類似の度合いを示すであろうと仮定する。当業界に公知の技術を利用することによりこれらのペプチドに対して生起させた抗体が得られ、そして慣用の検定手順（例えばウェスタンブロット、免疫組織化学、イムノアッセイ）においてPC７の存在及び／又は量を検定する診断試薬又は診断キットの成分として用いられる。細胞サンブル（細胞、組織、そのリゼート又は細胞画分）を特定の抗−PC７診断試薬と、PC７に対する抗体の結合を可能にする条件下での接触、そしてPC７の存在の指標として結合抗体の存在及び／又は量を検定することを含んて成るPC７の検定方法も新規である。その他の哺乳動物PC７酵素のプロービング PC７ DNAの一部又は全体をその他の種における同じ酵素をクローニグするため、cDNAもしくはゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとしてのcDNA、又は本明細書に概略する PCRプログラムのいづれかを利用して、用いることができうる。上記の診断キット及び方法に有用なオリゴヌクレオチドは PCR を開始するためのプライマーとして利用し得る。組換プラスミド及び宿主慣用の技術及び市販のプラスミドを用い、様々な組換プラスミドがこの度構築できうる。発現ベクターは適合性宿主細胞においてPC７を生産するのに極めて有用てある。PC７のcDNAをPRcCMV又はpCDNA-neo(Invitrogen)の如き発現ベクターの中にアンチセンス方向で全体的に又は部分的に挿入し、そしてこれらの宿主細胞においてこれらの組換ベクターをトランスフェクション又はリポフェクションにより導入し、これらの細胞内でのPC７遺伝子の発現を休止させることも考慮される。この手順はPC７の存在が所望されないタンパク質前駆体を生産する細胞系において利用してよく、又はPC７の生産の欠如に関連する病気を曝露するために用いてよい。PC７欠陥（休止PC７）である遺伝子導入マウスの生産は関連の病気が曝露されるであろう「ノックアウト」動物モデルとして特に考慮され、但しかかる休止化が胚又は新生動物に対して致命的でないことが前提とされる。ダウン症候群及びアルツハイマー病のマーカーとしてのPC７天然PC７を認識する特異的なPC７抗体を用い、我々は関連の被検者から死後に得た数多くのダウン症候群及びアルツハイマー病脳におけるPC７免疫反応性を評価した。コントロールとして、我々は正常な脳の免疫反応性を調べた。標的とした領域は海馬、並びに前頭及び側頭皮質とした。PC７の染色はダウン症患者の 1 00％及びアルツハイマー病脳の70％に認められ、そしてコントロールでは認められなかった。神経病（プラク、タングル等）を有する高齢者のコントロール脳のみが若干のPC７免疫反応性を示した。従って、我々はPC７がアルツハイマー病におけるプラクについての非常に良好なマーカーである、更には早期マーカーであると考えた。従って、脳の中のPC７の測定はADの早期発症を推定する手段でありうる。大脳骨髄流体又は末梢（よりはるかにアクセス可能な標的）のいづれかにおけるPC７の測定がこの病気の発症のある程度の指標を供しもしうる可能性もある。PC７の機能は予防的であり得、それ故その遺伝子発現の活性化又は遺伝子導入を介するPC７の過剰発現はプラク及びタングルの発症を防ぐ新規のアプローチを開発する手段でありうる °

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 ＴＧ０１Ｎ 33/50 33/53 Ｄ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号０８／５４５，５６２ (32)優先日平成７年10月19日(1995．10．19) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者クレティアン，ミシェルカナダ国，ケベックエイチ２ブイ１ゼット８，モントリオール，ヌメロ 104, シュマンコート−サント−カテリーヌ, １

Claims

【特許請求の範囲】１. ラット組織から単離され、SEQ ID NO:５に規定のアミノ酸配列を有する、名称PC７の精製プロホルモンコンバターゼ。２. 請求項１記載のプロホルモンコンバターゼをコードする核酸。３. SEQ ID NO:６に規定のヌクレオチド配列、又はその一部もしくはその変異体を有し、ここで前記一部は長さが約15ヌクレオチド以上である、請求項２記載の核酸。４. 請求項１記載のラットプロホルモンコンバターゼに対応するヒトプロホルモンコンバターゼの触媒組成の一部をコードする核酸であって、SEQ ID NO:４に規定のヌクレオチド配列、又はその一部もしくはその変異体を有し、ここで前記一部は長さが約15ヌクレオチド以上である、核酸。５. 請求項１に記載のプロホルモンコンバターゼのペプチドフラグメント。６. SEQ ID NO:９又は10に規定のアミノ酸配列を有する、請求項５記載のプロホルモンコンバターゼのペプチドフラグメント。７．請求項１記載のプロホルモンコンバターゼ又は請求項５もしくは６記載のペプチドフラグメントに対して特異的な抗体。８. 請求項７記載の抗体を含んで成る、PC７の存在及び／又は量を検定するための診断試薬。９. 請求項８記載の診断試薬を含んで成る、PC７の存在及び／又は量を検定するための診断キット。 10. SEQ ID NO:２，SEQ ID NO:３，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO 12，SEQ ID NO :７の全体又は一部、及びSEQ ID NO:８の全体又は一部より成る群から選ばれるヌクレオチド配列を有し、前記一部がストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下でPC７コード配列と特異的にハイブリダイズ可能である、オリゴヌクレオチド。 11. SEQ ID NO:３，SEQ ID NO:８及びSEQ ID NO:11より成る群から選ばれるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。 12. SEQ ID NO:５のPC７アミノ酸残基Arg¹³⁷，Ala¹³⁸，Lys¹³⁹，Arg¹⁴⁰，Asp¹⁸⁶ ，His²²⁷，Cys²³¹，Asn²⁴⁰，Cys²⁴⁴，Asn³²⁸，Cys³³⁶，Cys³⁹⁷又はSer⁴⁰⁵をまたぐ長さ15ヌクレオチド以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は哺乳動物種のPC７におけるその対応物。 13. 請求項10記載のオリゴヌクレオチドを含んで成る、PC７をコードする核酸、好ましくはメッセンジャーRNAの存在及び／又は量を検定するための診断試薬。 14. 請求項13記載の診断試薬を含んで成る、PC７をコードする核酸、好ましくはメッセンジャーRNAの存在及び／又は量を検定するための診断キット。 15. 請求項２，３及び４のいづれか１項記載の核酸を含んで成る組換 DNAベクター。 16. 組換哺乳動物発現ベクターである請求項15記載の組換 DNAベクター。 17. 前記核酸が前記ベクターの中にアンチセンス方向で挿入されている、請求項16記載の組換 DNAベクター。 18. 前記核酸がSEQ ID NO:５に規定の配列のPC７アミノ酸残基Arg¹⁰¹，Ala¹⁰ 2，Lys¹⁰³，Arg¹⁰⁴，Asp¹⁵⁰，His¹⁵¹，Cys¹⁹⁵，Asn²⁰⁴，Cys²⁰⁸，Asn²⁹²，Cys³⁰ ⁰ ，Cys³⁶¹もしくはSer³⁶⁹をまたぐ、又は哺乳動物種のPC７の対応のアミノ酸残基をまたぐ15個以上のヌクレオチドを含む、請求項17記載の組換 DNAベクター。 19. 請求項15〜18のいづれか１項記載の組換 DNAベクターを含んで成る組換宿主細胞。 20. 請求項２又は３記載の核酸を発現する組換宿主細胞の培養、及び前記細胞又は培養培地からのPC７の回収の２種を含んで成るPC７の製造方法。 21. 塩基性アミノ酸残基を有し、且つ請求項１記載のプロホルモンコンバターゼにより切断可能な配列を含んで成るタンパク質前駆体からタンパク質を製造する方法であって、前記前駆体をプロホルモンコンバターゼの存在下に置くか、又は前記タンパク質前駆体及びこのプロホルモンコンバターゼを同時発現する細胞を培養し、そして前記タンパク質を回収する、工程を含んで成る方法。 22. 前記タンパク質前駆体がHN gp16O糖タンパク質であり、そして前記タンパク質がHN gp120及び／又はgp41糖タンパク質より成る、請求項21記載の方法。 23. 様々な哺乳動物種の細胞又は組織内のPC７の存在及び／又は量を検定する方法であって：前記細胞、組織、そのリゼートもしくは細胞画分を請求項８記載の診断試薬と、前記細胞又は組織の構成成分に対する前記診断試薬の結合を支持する条件下で接触させ；そして前記細胞又は組織内のPC７の存在及び／又は量の指標として結合した前記診断試薬を測定する、工程を含んで成る方法。 24. 様々な哺乳動物種の細胞又は組織内のPC７をコードする核酸、好ましくはメッセンジャーRNAの存在及び／又は量を検定する方法であって：前記核酸を請求項13記載の診断試薬と、前記診断試薬の前記核酸に対するハイブリダイゼーションを支持する条件下で接触させ；そして前記細胞又は組織内のPC７をコードする核酸の存在及び／又は量の指標としてハイブリダイズした前記診断試薬を測定する；工程を含んで成る方法。 25. 様々な哺乳動物種の細胞又は組織内のPC７をコードする核酸、好ましくはメッセンジャーRNAの存在及び／又は量を検定する方法であって、前記核酸を、ポリメラーゼ式増幅方法において前記核酸のフラグメントの増幅を開始するプライマーとしての請求項10記載の少なくとも一種のオリゴヌクレオチドと接触させる；そして前記細胞又は組織内のPC７をコードする核酸の存在及び／又は量の指標として増幅生成物を測定する；工程を含んで成る方法。 26. 哺乳動物細胞内でPC７をコードする遺伝子の発現を休止させる方法であって、請求項11又は12記載のオリゴヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含んで成る方法。 27. 哺乳動物細胞内でPC７をコードする遺伝子の発現を休止させる方法であって、請求項17又は18記載の組換ベクターを前記細胞に導入する工程を含んで成る方法。 28. 前記哺乳動物細胞がHIVによる感染に対して感受性である、請求項26又は 27記載の方法。 29. HIV gp160エンベロープ糖タンパク質の活性化の予防を供する、請求項2 8記載の方法。 30. HIVによる感染に対して感受性である被検体のAIDSの発症の予防を供する、請求項29記載の方法。 31. 前記組織がアルツハイマー病の典型的なプラク又はタングルである、請求項23記載の方法。 32. アルツハイマー病の診断を供する、請求項31記載の方法。 33. 請求項11もしくは12記載のオリゴヌクレオチド又は請求項17もしくは18 記載の組換ベクターを含んで成る組成物。 34. フリンの発現の休止させるためのアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンス核酸を発現する組換ベクターを更に含んで成る、請求項33記載の組成物。 35. HIV 感染に対して感受性である組織をターゲッティング可能な小胞にオリゴヌクレオチド又は組換ベクターの少なくとも一部が封入されている、請求項 33又は34記載の組成物。 36. 前記小胞がナノエリトロソーム又はリポソームである、請求項35記載の組成物。 37. 前記小胞が、前記組織に特異的な膜マーカーに特異的に結合するリガンドに対してその表層において複合している、請求項36記載の組成物。