JP2000502260A

JP2000502260A - 多型遺伝子配列の評価方法およびｈｌａ型の同定におけるその使用

Info

Publication number: JP2000502260A
Application number: JP9523796A
Authority: JP
Inventors: スチーブンス，ジョン，ケイ．; ダン，ジェームズ，エム．; ロイシュナー，ジェームズ; グリーン，ロナルド，ジェイ．
Original assignee: ビジブルジェネティクスインコーポレイテッド
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-19
Publication date: 2000-02-29
Also published as: EP0870059B1; CA2239896A1; DE69620791T2; WO1997023650A3; EP0870059A2; AU718670B2; CA2239896C; DE69620791D1; WO1997023650A2; AU1426297A; US5834189A

Abstract

(57)【要約】サンプル中の多型遺伝子座の対立遺伝子タイプが，最初にサンプルを，ポリメラーゼ，ヌクレオシド供給原料，１種のチェーンターミネーティングヌクレオシドおよび配列決定プライマーを含有する配列決定反応混合物と混合し，異なる長さの複数個のオリゴヌクレオチドフラグメントを形成させ，ついでオリゴヌクレオチドフラグメントの長さを評価して同定される．標準配列決定操作の場合と同様に，フラグメントの長さが伸長プライマー中のチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当するタイプの塩基の位置を指示する．しかしながら，各タイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドについての４種の同時反応の実施および評価に代えて，サンプルは異なるタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドを含有する高々３種の，好ましくは１種のみの配列決定反応混合物と混合する．この試験から得られた情報を，サンプルについて他の付加的試験を実施する前に評価する．多くの場合，１種の配列決定反応を用いて単一の塩基のみの位置を評価することによって，サンプルの対立遺伝子のタイピングが可能である．

Description

【発明の詳細な説明】多型遺伝子配列の評価方法およびＨＬＡ型の同定におけるその使用発明の背景疾患状態の存在または感受性を決定するための遺伝子試験は医学的看護の改善に信じがたい機会を提供し，このような試験の可能性は同定される疾患関連遺伝子および／または突然変異の数が絶えず増加することから，ほとんど毎日増加を続けている．しかしながら，このような可能性を実現するために克服しなければならない大きな障害は，試験の高い経費である．これは多数の変動の試験の必要性が，試験操作を定常的な試験としては到底実施できないほど極めて高価にしていると思われる．それは高度に多型の遺伝子の場合とくに著しい．ＤＮＡ配列における変化の試験は標的核酸分子の完全な配列決定によって進められるが，本分野の技術者の多くは，それがいつか定常的に行われるようになるにはこのような試験があまりにも高価すぎると考えている．ＤＮＡ配列の変化はまた，Oritaら，Genomics 5： 874-879（1989）により報告された「一本鎖コンフォーメーション多型」（ＳＳＣＰ）と呼ばれる技術または Sarkar ら，Geno mics 13：441-443（1992）によって報告されたジデオキシ-フィンガープリンティング（ddＦ）と呼ばれるその改良法により検出できる．ＳＳＣＰおよびdd Ｆはいずれも，ＤＮＡフラグメントが非変性電気泳動ゲル上で電気泳動的に分離される場合に生成するバンドのパターンを評価する．このパターンはフラグメントのサイズの組合せおよび非変性フラグメントの三次元コンフォーメーションの組合せに依存する．すなわち，このパターンはフラグメントのバンドの理論的間隔が等しくないことから，配列決定には使用できない．米国特許第5,545,527 号および国際特許公開ＷＯ96/07761号（引用により本明細書に導入される）に記載された階層的アッセイ法は，有意に多数の結果が興味ある遺伝子配列の不存在を不正に指示することはあっても，このような遺伝子配列の存在を不正に指示する結果を生じることは稀な一連の異なる試験法を用いることによって試験あたりの経費を体系的に低下させる機構を提供する．この階層に用いられる試験は多くの場合，異なる種類の分子試験の組合せ，たとえばイムノアッセイ，オリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーション試験，オリゴヌクレオチドフラグメント分析，および直接の核酸配列決定の組合せである．本出願は，単独でまたは階層試験プロトコールの一部として，とくに高度に多型の遺伝子に有用な特定タイプの試験に関する．この試験の使用の特定の例にはヒトＨＬＡ遺伝子の対立遺伝子型の決定へのその適用があるが，その試験は既知配列の多くの遺伝子への適用が可能であり，本発明をＨＬＡに限定されるものと解釈すべきではない．ヒトＨＬＡ遺伝子は組織抗原と免疫応答に関連する遺伝子のクラスターである主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の部分である．ＭＨＣ遺伝子内には，個体間の組織および臓器移植の成功に極めて重要な２群の遺伝子がある．ＨＬＡクラスＩ遺伝子は細胞傷害性Ｔ胞によって自己を非自己から識別するために用いられる移植抗原をコードする．ＨＬＡクラスII遺伝子，または免疫応答遺伝子は，個体が特定の抗原に対して強力な応答を装備可能か否かを決定する．ＨＬＡ遺伝子の両クラスとも高度に多型であり，実際にこの多型が宿主の免疫応答の潜在能力に重要な役割を果たしている．他方，この多型はまた同種組織を移植された宿主に免疫学的な負担を課すことになる．その結果，組織ドナーとレシピエントの間のＨＬＡタイプの注意深い試験およびマッチングが，同種組織および骨髄の移植の成功の主要な要因となる．ＨＬＡ遺伝子のタイピングは２つの基本的な線に沿って，すなわち血清学的におよび核酸をベースとして進められている．血清学的なタイピングの場合には，ある種のＨＬＡタンパク質に特異的な抗体が開発されている．これらの試験のパネルはドナーまたはレシピエント組織のタイプを評価するために実施できる．核酸をベースとするアプローチでは，ＨＬＡ遺伝子のサンプルを配列特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせて特定の対立遺伝子単位または対立遺伝子群を同定する．場合によっては，ＨＬＡ遺伝子の配列決定によるＨＬＡタイプの決定も提案されている（Santamaria Pら，”HLA Class l Sequence-Based Typing”,Human mmunlogy 37： 39-50，1993）．これらのすべての場合に，各個体のサンプルそれぞれについて実施される試験パネルは膨大で，ＨＬＡタイピングの費用が極めて高価につくという結果を生じる．したがって，これに匹敵するまたはさらに優れた信頼性をもって実質的にこの経費を低下させるＨＬＡタイピングの方法が望まれる．本発明の目的はこのような方法を提供することにある．発明の概要本発明の方法は，標準配列決定法の改良を，好ましくは遺伝子材料のサンプルの対立遺伝子型についての情報を得るための能率化された方法を提供できる改良されたデータ分析法と組合せて使用する．すなわち本発明によれば，サンプル中の多型遺伝子座の対立遺伝子型が，最初にサンプルを鋳型依存性核酸ポリメラーゼ，Ａ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド供給原料，１種のチェーンターミネーティングヌクレオチドおよび配列決定プライマーを含有する配列決定反応混合物と，鋳型依存性プライマー伸長に適して複数個の長さの異なるオリゴヌクレオチドフラグメントを形成するのに適当な条件下に混合し，ついでオリゴヌクレオチドフラグメントの長さを評価することにより同定される．標準配列決定操作の場合と同様に，フラグメントの長さは，配列の変動によって生じる可能性があるコンフォーメーション変化とは無関係に，各フラグメントの実際の長さが決定されるように，変性ゲル上で評価することができる．したがって，観察されるバンドは，伸長プライマー中のチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する塩基のタイプの位置を指示する．本発明の方法はしかしながら，４種の同時反応，各タイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドのそれぞれの実施および評価ではなく，本発明の方法ではサンプルは異なるタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドを含有する高々３種の配列決定反応混合物と同時に混合される点で標準配列決定操作とは異なる．好ましくは，サンプルは１種のチェーンターミネーティングヌクレオチドのみを含む１種の反応混合物のみと混合され，この試験から得られる情報は，サンプルについてさらに付加的試験が行われる前に評価される．多くの場合，１個の塩基のみの位置の評価がサンプルの対立遺伝子のタイピングを可能にする．この場合は，さらに試験を実施する必要はない．すなわち，本発明の方法の使用は実験室の処理可能量を上昇させることが可能で（同数の装置で４倍までのサンプルの処理ができる），すべてのサンプルについて４種すべての塩基の配列を決定する場合に比較して，試験あたりの経費はファクター４まで低下させることができる．図面の簡単な説明図１は，単一多型遺伝子のタイピングへの本発明の適用を示す．図２は，ヘテロ接合対立遺伝子を識別するための本発明を用いる改良方法を例示する．図３は，完全な配列決定後もなおヘテロ接合ペアが不明瞭なままの場合を例示する．図４は，単一塩基配列決定反応において介在塩基数を評価するための対照レーンの使用を例示する．図５は，自動化ＤＮＡ配列決定装置からの結果を示す．図６は，配列決定結果のピークごとの相関を示す．図７は，最も接近した他のピークからの分離に対してプロットされた各データピークの最大のプロットを示す．図８Ａ〜Ｃは，Chlamydia trachomatis のタイピングに対する本発明の適用を例示する．発明の詳細な説明本出願において使用される用語は本技術分野内では標準的なものではあるが，一部の用語について，その明確性を保証するために以下に定義を示す．１．「対立遺伝子」は多型遺伝子座におけるヌクレオチド配列の特定のバージョンを意味する．２．「多型性」はある集団内で遺伝子座に見出される変動性を意味する．３．「多型部位」は集団内で変動する遺伝子座における与えられたヌクレオチド位置を意味する．４．「遺伝子」または「遺伝子座」は与えられゲノム内の特定のヌクレオチド配列を意味する．５．遺伝子座におけるヌクレオチドの「部位」または「位置」は一般に遺伝子のｃＤＮＡ配列またはゲノム配列から得られる遺伝子中のヌクレオチドに割当られた番号を意味する．６．ヌクレオチドのアデニン，シトシン，グアニンおよびチミンは場合によりそれぞれＡ，Ｃ，ＧまたはＴの記号によって表される．多型遺伝子座内の特定の位置における塩基の同一性に関する知識がその遺伝子座の対立遺伝子型を決定するのに十分であることは以前から本技術分野の熟練者には明らかであったが，この知識が配列決定操作の修飾を導くことはなかった．むしろ，この知識は対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションアッセイや，対立遺伝子特異的ライゲーションアッセイのような技術を開発させることになった．しかしながら，本技術分野ではその可能性に気がつかなかったにもかかわらず，特定の患者のサンプル中にどの対立遺伝子が存在するかの決定には，多型遺伝子座の４つすべてのヌクレオチドの配列を決定することは必ずしも必要ではない．遺伝子座のある対立遺伝子は，４種未満，多くの場合ただ１種のヌクレオチドの位置の同定に基づいて識別が可能である．この所見は多型遺伝子座における対立遺伝子の改良された同定のための本発明の方法の開発を可能にする．簡単な例には，図１のように２種の対立遺伝子のみが知られている多型の部位が考えられる．この場合，遺伝子座とくに位置101 におけるＡヌクレオチドの位置の同定で，対立遺伝子１または対立遺伝子２のいずれが存在するかが識別される．位置101 にＣが存在する第３の対立遺伝子が発見されたならば，その対立遺伝子の存在は，独立したＡおよびＴ反応での位置101 におけるＡおよびＴの不存在によってまたは位置101 におけるＣの存在によって識別できる．従来のように，図１の多型部位の対立遺伝子のタイプの評価のために．配列決定を用い続けたとすれば，Sangerら（Proc.Natl.Acad.Sci．USA 74： 5463-5467 ,1977）によって記述されたタイプの４つのジデオキシヌクレオチド「配列決定」反応がサンプルに同時に行われ，ついで４つの反応の生成物がポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析される（Current Protocols in Molecular Biology ,Ausubel,F.M.ら編，7.6.章，John Wiley & Sons，1995 参照）．このよく知られた方法では４つの配列決定反応のそれぞれで複数のプライマー伸長生成物が発生し，これらのすべてが特定の種類のジデオキシヌクレオチドで終わる．電気泳動ゲル上の各レーンは，したがって伸長生成物中の１つの種類の塩基の位置を反映するが，この特定の種類の塩基の間に介在するヌクレオチドの順序および種類は明らかにはしない．したがって，４つのレーンによって提供される情報を既知の配列決定操作と組合されて，全体として配列の複合像に到達する．本発明によれば，しかしながら，単一の配列決定反応が，独立に実施され評価されて，選択された塩基の各例の間に介在する塩基の数が与えられ，したがって選択された塩基のポジショナルな位置が正確に指示される．本発明の方法を最も単純化した図１の例に適用すると，最初にチェーンターミネーティングヌクレオチドとしてジデオキシ- Ａまたはジデオキシ- Ｔのいずれかを用い単一の配列決定反応が行われる．第３の対立遺伝子型が存在しないかあるいは未知である場合には，この単一の試験で特定の結果を得るのに十分である．第３の対立遺伝子型の存在が知られていて，サンプル中に存在する塩基が最初の試験で同定されなかった場合は，第２の配列決定試験をジデオキシ- Ｃまたは最初の試験で使用されなかったジデオキシ- Ａ/Ｔのいずれかを用いて実施し，対立遺伝子型の同定を解決することができる．別法として，この場合，対立遺伝子１または２および対立遺伝子３の間を十分識別するある種の他の試験たとえば対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションプローブまたは抗体試験を使用することができる．この例から明らかなように，本発明の方法は多型遺伝子座の「既知」の対立遺伝子を特異的に同定し，新しいこれまで記録されていない対立遺伝子の同定には必ずしも有用ではない．実際に，対立遺伝子の他のヌクレオチドが新しい様式に再配列されていた場合に，患者サンプルから得られた単一のヌクレオチド配列をユニークな対立遺伝子に相当すると誤って推定すると，未知の対立遺伝子が看過される可能性がある．本方法は多型遺伝子座の既知の対立遺伝子間の識別に特異的である（正しい単一ヌクレオチドの配列が選択された場合，新しい突然変異に偶然に遭遇する可能性はあるが）．したがって，既知の対立遺伝子が登録されたデータベースは常に最新にしておくことが本発明には極めて有用である．対立遺伝子の同定のための本発明の「４種未満」のヌクレオチドの分析の利点は，試薬および労働に対する経費の低減ならびに診断試験室で得ることができる患者サンプルの処理能率の増大である．これらの利点は，現実の全世界の実例をより正確に近似するシステムを考慮することにより，さらに劇的に証明される．この目的では，本発明者らは，既知のＨＬＡクラスII ＤＲ４対立遺伝子のみが存在して（これらのうちの５種の対立遺伝子，ＤＲＢ１^*0401，ＤＲＢ１^*0402, ＤＲＢ１^*0405，ＤＲＢ１^*0408，およびＤＲＢ１^*0409 が北米の人口の95％に見出される），これらの対立遺伝子が常にホモ接合体である集団を仮定した．単一のヌクレオチド配列決定を実施する順序を決定するために，対立遺伝子間の配列の差を評価して，最大の情報を生じる塩基，および２種またはそれ以上の塩基についての知識が明確なタイピングを生じる環境を決定する．これを行うのに，発明者らは最初に，たとえば，塩基Ａを観察し，サンプル内のＡ塩基の位置の知識からどの対立遺伝子が最終的に同定できるかを決定する．アプローチの１つの方法では，これは表１に示すように各多型部位における各対立遺伝子についての塩基を示す表を作成し，表中のＡが検出されたとした場合に観察されるパターンを決定することである．この１つの配列決定反応を用いてそれぞれのユニークなパターンが明確にタイピングできる．ＤＲ４対立遺伝子については，ＤＲＢ１^*0413およびＤＲＢ１^*0416を除くすべての対立遺伝子（最も広く分布する対立遺伝子のすべてが包含される）がユニークなパターンを生成する．他の塩基ではすべて効率的に同定できる対立遺伝子は少なく，したがってＡ反応を最初に実施する．さらに，与えられた任意のグループのサンプルがこの単一配列決定反応を用いて完全にタイピングできる可能性は極めて高い．この最初の配列決定反応を用いて明確にタイピングされなかったサンプルの場合は，そのサンプルについて任意の第２の配列決定反応を実施するとＤＲＢ１^*0413 およびＤＲＢ１^*0416 の間での識別が行われる．本発明の方法を用いた試験あたりの経費における有意性は容易に評価される．旧来の４ヌクレオチドＤＮＡ配列決定を用いて100 個のサンプルのＤＲ４対立遺伝子型を決定するには，計400 回の配列決定反応の実施が要求される．試験あたりの経費（試薬および労働）を20.00 ドルと仮定すると，この場合，患者あたりの経費は80,00 ドルになる．これに対して，本発明の方法を用いた試験では，すべてのサンプルについてＡの位置のための最初の試験のみが実施される．５％のサンプルがタイプＤＲＢ１^*0413 またはＤＲＢ１^*0416 陽性タイピングを生じるという統計的には考えられない事象を仮定しても，残りの５つのサンプルは第２の（Ｇ，ＣまたはＴ）配列決定反応を用いて試験され，その結果，５つのすべてのサンプルが明確にタイピングされたとする．これでも，本発明の方法を用いてこれらの100 のタイピングを実施するための経費は2,100 ドル，患者あたり 21ドルになる．実施された第２の配列決定反応でも試験したサンプルのすべてについてユニークなパターンを生じない場合もある．この場合には，第３の配列決定反応を実施する前に，最初の２つの配列決定反応の結果を合わせてみて，これらの複合結果をユニークな塩基パターンについて評価することが望ましい．すなわち，たとえば，第１および第２の配列決定反応が以下のように特徴づけることができる４つの対立遺伝子をもっているとする．ＡパターンＴパターン対立遺伝子１１３２２２１１対立遺伝子２１３２２４１１対立遺伝子３３４２２２１１対立遺伝子４３４２２３１１対立遺伝子２および対立遺伝子４はＴ- 配列決定反応単独からユニークな結果を与え，したがってこの情報に基づいてタイピングすることができる．対立遺伝子１および対立遺伝子３は，しかしながら，同じＴ- 配列パターンを有する．これらの２つの対立遺伝子は異なるＡ- 配列決定反応を有するので，それらは明確に識別可能で，組合わせたパターンに基づいてタイピングを行うことができて，さらに試験を行う必要はない．この配列決定反応数の実質的な低下は，この反応の実施に要求される試薬および労働の経費の低下を意味する．さらに，各サンプルは電気泳動によって分析しなければならなので，実施が必要な電気泳動の試行数も低下する．たとえば，40 のレーンがある自動化ＤＮＡシークエンサー，たとえば Pharmacia A.L.F．（登録商標，Pharmacia，Uppsala，Sweden）では，それぞれ４レーンを用いる10例の患者サンプルに比較し，ゲル上１回の試行で40例の患者サンプルが処理できる．レーンあたり４種の蛍光染料の使用が可能な Applied Biosystems Inc．377（登録商標，Foster City，CA）のようなシステムでは，レーンあたり１例の患者のサンプルに比し，４例の患者のサンプルを各レーンに流すことができる．ネットワーク化された高速ＤＮＡシークエンサーを，異なる装置から得られたデータと組合わせることができるソフトウエアと一緒に使用すると，たとえば Microgene Blaster（登録商標）シークエンサーとGene Objects （登録商標）ソフトウエア［いずれも Visible Genetics Inc，Tronto，Canada から入手可能な OpenGen e（登録商標）システムのパーツである］を用いると，この方法はまたさらに効率を高めることができる．この同じ方法論は実際，任意の既知の多型遺伝子座に適用して，その遺伝子座の有効な特徴を得ることができる．たとえば，高度な多型を示すヒト白血球抗原 (ＨＬＡ）遺伝子システムにおける対立遺伝子の同定（Parham,P．ら，”Natureo f Polymorphism in HLA-A，-B and -C Molecules”,Proc.Natl.Acad.Sci．USA85 : 4005-4009，1988 ）にはこの方法から多大の利益が得られる．さらに，この方法はヒトの多型に限定されるものではない．それは他の動物，植物，細菌，ウイルスまたはかびにも使用できる．それは生物体の混合サンプル中に存在する対立遺伝子変異体の識別に使用することができる．ヒトまたは動物の診断においては，この方法は生体サンプル中に細菌またはウイルスのどのような亜種が存在するかの同定に使用できる．この診断は病原体の薬物抵抗性株が個体内に存在するか否かを決定するために必須である．特定の既知の多型遺伝子について以上概略を述べた方法でのアッセイ法の開発ののちの，本発明の方法の第１工程は，この方法を使用して試験する材料の適当なサンプルを得ることである．本発明を用いて試験される遺伝子材料は，染色体ＤＮＡ，メッセンジャーＲＮＡ，ｃＤＮＡ，または多型の評価のために試験に付される核酸ポリマーの他の任意の形態であり，多種の起源たとえば全血，腫瘍細胞，精子および毛嚢を含む組織サンプルに由来する材料とすることができる．場合により，サンプルは，ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）増幅を用いて興味ある特定の遺伝子配列が濃縮されたサンプルを作成するために増幅することが有利である．この目的での増幅プライマーは問題の遺伝子座に高度に選択性であるように設計するのが有利である．たとえば，ＨＬＡクラスＩ試験では，グループ特異的および遺伝子座特異的増幅プライマーが，米国特許第5,424,184 号，および Cerebら，"Locus-specific amplification of HLA class I genes fromg enomic DNA： locus-specific sequences in the first and third introns ofH LA-A，-B and -Calleles."Tissue Antigens 45： 1-11，1995 （これらは引用により本明細書に導入される）に開示されている．適当なサンプルが得られたならば，サンプルを第１の配列決定反応混合物と混合する．この反応混合物は鋳型依存性核酸ポリメラーゼ，Ａ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド供給原料，１種のチェーンターミネーティングヌクレオチドおよび配列決定プライマーを含有する．鋳型依存性核酸ポリメラーゼの選択は，本発明の成功には重要ではない．しかしながら，好ましいポリメラーゼは，Thermo Sequenase（登録商標），American Life Sciencesにより市販されている熱安定性ポリメラーゼ酵素である．他の適当な酵素には通常の Sequenase（登録商標）および配列決定反応に用いられる他の酵素がある．適当な配列決定プライマーの選択は一般に，イントロンまたはエキソンのいずれかで，評価される遺伝子の多型領域の付近（約 300 nt 以内）の多型領域に対し５’（センスまたはアンチセンス鎖上のいずれか）に位置し，その遺伝子のすべての既知の対立遺伝子中で高度に保存されている遺伝子部分を見出すことによって行われる．ついで，このような領域に高度に特異的にハイブリダイズする配列決定プライマーを用い，多型領域を通して配列を決定する．プライマーの品質の他の態様，たとえばパリンドローム配列の欠如，および好ましいＧ/ Ｃ含量は米国特許第5,545,527 の場合と同じである．上述の要求をすべて満足できる１種のプライマーを選択できない場合がある．２個以上のプライマーを一部のサブグループの遺伝子座の間で試験する必要があるかもしれない．これらの場合には，プライマーの一つを用いて配列決定反応を試みる必要がある．ハイブリダイゼーションが成功し，配列決定反応が進行したならば，その結果を対立遺伝子の同一性の決定に使用できる．配列決定反応が起こらなかった場合には，他のプライマーを使用する必要がある．配列決定反応混合物を多重サイクルで処理すると，その間にプライマーは伸長し，ついでサンプルからの鋳型ＤＮＡから分離し，新たなプライマーが鋳型と再アニーリングする．これらのサイクルの終了時に，生成物のオリゴヌクレオチドフラグメントをゲル電気泳動によって分離し検出する．この過程は本技術分野において周知の通りである．好ましくはこの分離は，1995年12月12日に出願された国際特許出願ＰＣＴ/ＵＳ95/15951号の一部継続出願である米国特許出願08/353, 932 号に記載された装置により，国際特許出願ＰＣＴ/ＵＳ95/14531号に記載の薄いミクロゲルを用いて実施される．これらの出願はすべて引用により本明細書に導入される．本発明の実施は，遺伝子座内のヌクレオチドの位置を単一のヌクレオチド配列決定を用いて正確に同定する技術的に進歩した方法によって支援される．この結果は，ジデオキシ- 配列決定/ 電気泳動分析を用いる単一ヌクレオチド配列決定の技術において，いかに多くのヌクレオチドが２つの同定されたヌクレオチドの間に落ちるか：Ａ＿＿＿ＡまたはＡ＿＿＿＿ＡＡを決定することが課題になる場合がある．多くの場合，とくに短い配列決定反応生成物（200 nt 未満）が検査されるときは，反応生成物の電気泳動による分離が高度に予想可能なパターンに従うのでほとんど困難はない．コンピューターまたは人力で，単にギャップを測定し，他の場合にはギャップ内に落ちる一つずつのピークの数を決定することによって，２つの同定されたヌクレオチドの間に存在するヌクレオチドの数を容易に決定することができる．問題は，配列決定反応フラグメントの分割および分離が消失する長い電気泳動試行に関連して起こる．さらに温度，電場の強さまたは他の操作パラメーターを維持する整合性の喪失はピークの間のスペーシングに不整合を招いて，解釈を不明瞭にすることがある．このような曖昧さは対立遺伝子の正確な同定を妨害する．これらの問題を解消する一つの簡単な方法は，たとえば４種すべてのジデオキシヌクレオチドを含む反応を実施することにより，配列決定される遺伝子座からのすべての可能なヌクレオチドフラグメント長を同定する「対照」レーンを全サンプルとともに設けることである．対照レーンは，図３のように同定されるヌクレオチドの間のギャップに存在するヌクレオチド数を正確に指示する．このような対照レーンには放射性標識オリゴヌクレオチドとオートラジオグラフ分析を用いる「手動」配列決定（Current Protocols in Molecular Biology,A usubel,F.M.ら編，7.章，John Wiley & Sons，1995 参照）でも，または自動化レーザー蛍光システムでも，任意の配列決定フォーマットを使用できる．２つの同定されたヌクレオチドの間にあるヌクレオチド数の測定によらない対立遺伝子の改良された同定方法が米国特許出願08/497,202号に開示されている．略述すれば，この方法は，自動化レーザー蛍光ＤＮＡ分析システムから受信されるデータシグナルの現実の形状（波形）によるものである．この方法では，患者サンプルの波形を，遺伝子の既知の対立遺伝子を表す波形のデータベースと比較する．サンプルの波形と最もよくマッチする既知の波形でサンプル中の対立遺伝子を同定する．ＨＬＡタイピングを含めて場合により適用可能な，試験の迅速化および経費の低減を促進する本発明の他の実施態様には，単一の反応混合物に２種のチェーンターミネーティングヌクレオチドの同時使用が包含される．たとえば，ddＡＴＰおよびddＣＴＰの混合物を含有する単一の反応を最初に実施できる．配列決定ゲル上に観察されるピークはＡまたはＣのいずれかであり，識別できない（異なる標識で染料標識したターミネーターを使用しない限り）．しかしながら，場合により，この情報で対立遺伝子の本質の同定に十分である．たとえば，図１に示す単純な３つの対立遺伝子の場合には，配列情報でＴ対立遺伝子が明瞭に同定される．さらに複雑な多型遺伝子では，一方は第１の反応に含まれたのと同じで他方は第１の反応混合物に含まれたのとは異なる２種のチェーンターミネーティングヌクレオチドを包含する第２の配列決定試行を行う．これらの２つの配列決定操作は３種の塩基の位置を明確にまた第４の塩基の位置を差によって，計２回だけの反応での決定を可能にする．以下に述べるように一部の波形はヘテロ接合体混合物を表す場合がある．データベースはマッチング過程にすべての変動の可能性が包含されることを保証するために，すべての既知のヘテロ接合体の組合せからの波形を包含しなければならない．患者のサンプルにヘテロ接合体の可能性がある場合には，ソフトウエアはヘテロ接合体の可能な対立遺伝子メンバー間の識別を補助するために実施すべき次の分析試験をユーザーに通報するように設計される．ヘテロ接合体多型遺伝子座には，特殊な考慮を必要とする．患者サンプル中の同一の遺伝子座に２以上の変異体が存在する場合に，単一のレーン配列決定を共有する配列決定プライマー部位で開始すると，複雑な結果が得られる．この問題はまた，旧来の４レーン配列決定にも認められる（Santamaria Pら，"HLA Class I Sequence-Based Typing”,Human Immunology37： 39-50，1993）．しかしながら，図２に本発明を用いてヘテロ接合体対立遺伝子を識別する改良された方法を例示する．ヘテロ接合対立遺伝子により生じる問題を図２ａに例示する．Ａレーンの単一ヌクレオチド配列決定から観察されるデータはユニークな対立遺伝子の存在を指摘することはできない．遺伝子座がヘテロ接合であるか，または新しい対立遺伝子が見出されたかのいずれかである（十分に研究された遺伝子座では新しい対立遺伝子は稀であり，ヘテロ接合の可能性が推定される）．この問題は分析される患者サンプル中の対立遺伝子の混合から生じる．たとえば，観察されるデータは対立遺伝子１および対立遺伝子２の付加的組合せから生じる．２種より多い対立遺伝子の可能性がある場合には，それらが観察されるデータにより生じ得るかどうかを調べるために，既知の対立遺伝子変異体のそれぞれを観察されるデータと対比する必要がある．各ヘテロ接合体ペアはそれ自身の独特なパターンを有する．図２ｂは対立遺伝子３および４は，これらの対立遺伝子中のあるＡヌクレオチドがデータ中に現れていないので，観察されるデータの基礎となり得ないことを例示する．したがって，それらは考慮から除外される．残りの対立遺伝子５，６および７は，観察されるデータを発生させるために他と組合わせて使用できる．ヒトゲノムＤＮＡの場合には，任意の１つの遺伝子座に２種の対立遺伝子のみが一般に存在できる（各染色体から１つ）．したがって，それらの付加的に組合わさって観察されるデータを生じることができるかどうかを決定するためには，すべての既知の対立遺伝子を組合わせる必要がある（実際に，既知および推定ヘテロ接合体ペアのデータの外観を準備して付加的データベースに保存しておくと分析を容易にすることができる）．図３ｂでは，対立遺伝子５および６の組合せが観察されるデータ中に生じ，５と７または６と７の組合せはいずれも所望の結果を与えない．したがって対立遺伝子３〜７のみが既知である場合には，組合わせて観察されるデータを生じる可能性がある２つの対立遺伝子は５と６のみである．対立遺伝子の同定はこの基盤に基づいて行うことができる．図３ｃのように，２つ以上の対立遺伝子のペアを組合わせて観察されるデータが得られる場合には，どちらの対立遺伝子ペアが存在するのかを識別するため，他のヌクレオチドの相対位置を決定する必要がある．他の特定のタイプのヌクレオチドの同定は，どちらの対立遺伝子ペアが存在するのかの決定に有効である．図３ｄはさらに，時として観察されるデータが１つの対立遺伝子についてはホモ接合であるようにみえるが，実際にそれは，示唆された対立遺伝子を含むかまたは含まないヘテロ接合ペアを構成することを示している．このような混乱を招く可能性がある対立遺伝子は，可能なヘテロ接合体を遮蔽することによって，既知の対立遺伝子データベース中に同定することができる．これらの対立遺伝子の同定はさらに，ヘテロ接合が観察されるデータに基づくかどうかを確認できる試験を行わなければ確認することはできない．観察されるデータに対し既知の対立遺伝子を比べるすべての分析は，高速コンピューター分析の使用により支援できるので便利である．稀に図４のように，すべての４種のヌクレオチドの配列決定でも，どの対立遺伝子ペアが存在するかを同定できない場合もある．とくに識別の臨床的必要性が低い場合に，このような曖昧さが記録される可能性がある．別法として高緊縮性のハイブリダイゼーションプローブが，それらは特定の対立遺伝子変異体の存在を同定できるので使用されることがある．ハイブリダイゼーションプローブのプロトコールは本技術分野において周知である（Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.ら編，6.4.章，John Wiley & Sons,1995 参照）．時として，配列決定反応生成物の量の定量的測定が，特定の遺伝子座に唯一の対立遺伝子または両者がＡをもつかを識別するのに十分なことがある．しかしながら，配列決定ピーク高の定量的分析は分析を稀にしか支援できないことは経験的に見出されている．定量的分析は「対立遺伝子脱落」の問題の解決に，より有用であることが分かっている．対立遺伝子脱落の場合は，配列決定プライマーが２つの対立遺伝子の一方で配列決定反応の開始を果たせなかったという理由のみで，配列決定反応で見掛けのホモ接合が同定される．これはプライマーの標的部位へのハイブリダイゼーションまたはチェーン伸長の開始を妨害する配列決定プライマー部位自体での不均質性から生じる（この問題は本発明による配列決定プライマーが一般的にゲノムの高度に保存された領域にハイブリダイズするように設計されているので稀である）．対立遺伝子脱落はゲノムＤＮＡから両対立遺伝子を定量的ポリメラーゼチェーン反応（Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel,F.M.ら編，15章， John Wiley & Sons，1995 参照）を用いて増幅することにより解決される．配列決定プライマーがＰＣＲプライマーのペアの一つとして用いられる．問題の対立遺伝子をまたぐＤＮＡフラグメントが定量的に増幅される．一方の対立遺伝子のみが増幅された場合には，反応終了時にＰＣＲ産物の量が期待された量の半分しかない．定量的分析は自動化ＤＮＡ配列決定装置により観察される増幅されたバンドのピーク高に基づいて行うことができる．複数個の病原体は，単一ヌクレオチド配列決定からでも，より複雑な結果を生じることがある．複雑性は患者サンプル中に存在する病原体変異体の限りのない数から起こる．たとえば，ウイルスおよび細菌は，それらを宿主免疫系の検出からの回避を可能にするドメインをコードする可変性表面抗原を有する．この可変性の問題を回避するために，検査に選ばれる遺伝子座は好ましくは病原体のすべての変異体内で高度に保存されている，たとえばリボソームＤＮＡまたはＤＮＡの機能的に重要なタンパク質コード領域である．病原体の可変性領域を分析しなければならない場合には，観察されるデータと既知の対立遺伝子の間の一連の広範にわたる比較がいずれの対立遺伝子が観察されるデータの実質的な成分ではないかを決定することによる診断を支援できる．本発明の方法は，配列決定反応のための成分を提供するテイラーのキットの構築に役に立つ．実施例に記載するように，これらの成分には配列決定のためのオリゴヌクレオチド配列決定プライマー酵素，ヌクレオシドおよびジデオキシヌクレオシドプレパレーション，ならびに反応のための緩衝剤が包含される．しかしながら，慣用のキットとは異なり，任意の与えられたアッセイに必要な各タイプのジデオキシヌクレオシドの量が同じではない．すなわちＡ配列決定反応が最初にすべてのサンプルについて実施されるアッセイであるためには，キット中のジデオキシ- Ａの量は他のジデオキシヌクレオシドの量の５〜10倍以上とする．以下の実施例は本発明の態様の例示を包含するが，いかなる意味でも本発明を限定するものではない．実施例１個々の患者サンプル中に存在するＨＬＡクラスII遺伝子対立遺伝子の同定は，本発明の方法を用いて実施できる．たとえば，ＤＲＢ１は少なくとも107 の既知の対立遺伝子をもつ多型ＨＬＡクラスII遺伝子である（Bodmerら，Nomenclature for Factors of the HLA System,1994.Hum.Imm.41-20,1994）．患者サンプルＤＲＢ１対立遺伝子の広範な血清学的サブタイプは最初グループ特異的プライマーを用いて対立遺伝子を増幅する試みにより決定される．ゲノムＤＮＡは，標準技術たとえばプロテイナーゼＫ蛋白分解を用いて，患者サンプルから調製される．対立遺伝子の増幅はクラスIIＰＣＲ緩衝液中において実施する． 10ｍＭ Tris ｐＨ 8.4 50ｍＭＫＣ１ 1.5ｍＭＭｇＣｌ₂ 0.1％ゼラチン 200 μＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ 12 pmol の各グループ特異的プライマー 40 ng の患者サンプルのゲノムＤＮＡグループは別個に増幅する．用いたグループ特異的プライマーは，ＤＲ１生成物サイズ 5'- プライマー:TTGTGGCAGCTTAAGTTTGATT ［配列番号：1］ 195 & 196 3'- プライマー:CCGCCTCTGCTCCAGGAG ［配列番号：2］ CCCGCTCGTCTTCCAGGAT ［配列番号：3］ＤＲ２（15および16） 5'- プライマー:TCCTGTGGCAGCCTAAGAG ［配列番号：4］ 197 & 213 3'- プライマー:CCGCGCCTGCTCCAGGAT ［配列番号：5］ AGGTGTCCACCGCGCGGCG ［配列番号：6］ＤＲ3.8.11.12.13.14 5'- プライマー:CACGTTTTCTTGGAGTACTCTAC ［配列番号：7］ 270 3'- プライマー：CCGCTGCACTGTGAAGCTCT ［配列番号：8］ＤＲ４ 5'- プライマー：GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA ［配列番号：9］ 260 3'- プライマー：CTGCACTGTGAAGCTCTCAC ［配列番号：10］ CTGCACTGTGAAGCTCTCCA ［配列番号：11］ＤＲ７ 5'- プライマー：CCTGTGGCAGGGTAAGTATA ［配列番号：12］ 232 3'- プライマー:CCCGTAGTTGTGTCTGCACAC ［配列番号：13］ＤＲ９ 5'- プライマー：GTTTCTTGAAGCAGGATAAGTTT ［配列番号：14］ 236 3'- プライマー：CCCGTAGTTGTGTCTGCACAC ［配列番号：15］ＤＲ10 5'- プライマー：CGGTTGCTGGAAAGACGCG ［配列番号：16］ 204 3'- プライマー:CTGCACTGTGAAGCTCTCAC ［配列番号：17］上記グループの5'- プライマーは末端を蛍光団，たとえば5'- 末端をフルオレセイン染料で標識される．反応混合物はよく混合する．2.5単位のTaqポリメラーゼを加え，熱サイクリングの直前に混合する．反応管を Robocycler Gradient 96 （Stratagene,Inc）中に入れて以下のように熱サイクリングに付す．１サイクル 94℃ ２分 10サイクル 94℃ 15秒 67℃ １分 20サイクル 94℃ 10秒 61℃ 50秒 72℃ 39秒１サイクル 72℃ ２分電気泳動分析の準備ができるまで氷上で４℃に冷却する．７回の反応（各グループ特異的プライマーセットについて１回）を実施する．増幅後，各２μl のＰＣＲ産物をプールし，100 ％ホルムアミドと５mg/mlのデキストランブルーからなる負荷緩衝液 11 μl と混合する．生成物を，自動蛍光検出装置たとえば Pharmacia A.L.F．（登録商標，Uppsala，Sweden ）中６％ポリアクリルアミド電気泳動ゲルに流す．サイズの決定は既知サイズのフラグメントの移動距離に基づいて実施する．血清学的グループは増幅が成功したフラグメントの長さによって同定する．両対立遺伝子が同じ血清学的グループに属すると１つのフラグメントのみが現れ，一方，２つの異なるグループからの対立遺伝子を含有するヘテロ接合体では２つのフラグメントが現れる．血清学的グループが決定したならば，グループ内での特異性を本発明の単一ヌクレオチド配列決定によって決定する．上記からの各陽性グループを配列分析のために個々に増幅する．ＰＣＲ増幅プライマーはビオチン化3'- プライマーａｍｐＢ： 5'ビオチン- CCGCTGCACTGTGAAGCTCT-3' ［配列番号：8］と上述の適当な 5'- プライマーである．増幅条件は上述の方法と同じである．増幅後，配列決定を以下の配列決定プライマー 5'- GAGTGTCATTTTCTTCAA ［配列番号:18］を用いて実施する．ＰＣＲ産物（10μl）を10 μl の洗浄 Dynabeads Ｍ-280（製造業者の推薦による，Dynal，Oslo，Norway ）と混合し室温で１時間インキュベートする．このビーズを１×ＢＷ緩衝液（10mＭ Tris，ｐＨ 7.5，１ｍＭＥＤＴＡ，２ｍＭＮａＣｌ）50μl，ついで１×ＴＥ緩衝液（10mＭ Tris，１ｍＭＥＤＴＡ） 50μl で洗浄する．洗浄後，ビーズを 10 μl のＴＥに再懸濁し，その3μl を配列決定反応用に採取する．配列決定反応液の組成は，３μl 結合ビーズ３μl 配列決定プライマー（計 30 ng）２μl 10×配列決定緩衝液（260 mM Tris，ｐＨ 9.5，65mＭＭｇＣｌ₂）２μl Thermo Sequenase（登録商標，American Life Science, Cleveland ）保存溶液から 1:10 に希釈３μl Ｈ₂ Ｏ最終容量＝13μl である．この配列決定反応混合物を氷上に保持する． 3 μl の配列決定反応混合物を採取し，所望のターミネーション反応に応じて以下の混合物の１つに 3μl 加える．Ａターミネーション反応： 750 μＭ各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ,2.5 μＭ dd ＡＴＰＣターミネーション反応： 750 μＭ各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，2.5 μＭ dd ＣＴＰＧターミネーション反応： 750 μＭ各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，2.5 μＭ dd ＧＴＰＴターミネーション反応： 750 μＭ各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，2.5 μＭ dd ＴＴＰターミネーション反応総容６μl ターミネーション反応混合物を Robocycler 中 25サイクルに付す（十分であることが分かれば減らす）． 95℃ 30秒 50℃ 10秒 −70℃ 30秒サイクリング後，100 ％ホルムアミドと５mg/ml のデキストランブルーからなる負荷緩衝液 12 μl を加え，適当な容量を自動ＤＮＡ配列決定装置，たとえば Pharmacia A.L.F．に負荷する．対立遺伝子の同定には，図５のように，自動ＤＮＡ配列決定装置からの結果の分析が要求される．フラグメント長の分析により，患者サンプルからの１つの対立遺伝子はＤＲ４血清学的サブタイプからのものであることが分かった（データは示していない）．ついで単一ヌクレオチド配列決定を実施し，可能なＤＲ４対立遺伝子間の識別を行った．レーン１は患者サンプルのＣヌクレオチドの単一ヌクレオチド配列決定（すなわち上記Ｃターミネーション反応を用いる）の結果を例示する．レーン２および３は，22の既知ＤＲ４対立遺伝子の２つについてのＣヌクレオチド配列の結果を示す．20の他の対立遺伝子についての類似の結果は，データベースに保存する．患者サンプルはついで米国特許出願ＵＳ08/497,202号に開示された１または２以上の方法を用いて既知の対立遺伝子と比較する．図５では，レーン１は最初にデータベース結果とのアラインメントを要する．アラインメントには，以前にアラインされたデータベースの結果との高度の重複（すなわち共通部分の最大化）を提供するために，１または２以上の正規化係数の決定が必要である（レーン１の結果のストレッチもしくはシュリンク）．アラインメント係数は上述のアプリケーションの Genetic Algorithm 法もしくは他の方法を用いて計算できる．正規化係数をついでレーン１に適用する．アラインされたレーン１の結果は，ついで22の既知対立遺伝子のそれぞれに体系的に相関させる．相関はピーク毎のベースで図６に例示するように行う．個別的な配列決定反応ターミネーション生成物を示すアラインされた患者データ流中のそれぞれのピークを同定する（配列決定のアーティファクトを示す微小なピークは無視する）．各ピーク下の面積をピーク最大の限界半径内において計算する（すなわち，A.L. F.Sequencer の結果についての20データ点）．同じ点の既知の対立遺伝子の曲線下面積について同様の計算を行う．ついで，重複領域の細長い面積を比較する．適正な変動たとえば80％の閾値以下の相関は，ピークが患者のデータ流中に存在し，他にはないことを指示する．１つのピークがなければ，既知対立遺伝子はサンプルの可能なアイデンティファイアーとして拒絶される．逆の比較も行われる．既知データ流中のピークを同定し患者サンプルの結果と１個ずつ比較する．この場合も１つのデータ流中における他に存在しないピークの存在はサンプルのアイデンティファイアーとして既知データ流を除外する．図５では，対立遺伝子ＤＲＢ１^*0405 についてのレーン２は患者サンプル中に見出されないピーク（Ｘ印を付す）を有する．アラインされたレーン１とレーン２の間のピークの比較は，Ｘ印を付したピークで閾値以下に落ちる．レーン３は既知の対立遺伝子ＤＲＢ１^*0401 の部分についてである．この場合には，各ピークは他のデータ流において相関を有することが見出される．ＤＲＢ１^*0401 はしたがって，患者サンプルを同定できる（結果は比較に通常用いられる 200〜 300nt よりはるかに短く，したがって患者サンプルの同定は完全な診断配列が比較されるまで確認されない）．実施例２結果は，上記実施例１により患者サンプルから得られる．サンプルの結果は以下のように「テキスト」ファイルに変換する．各ピークの最大の位置を定め最も近い他のピーク（ノイズを示す微小なピークは無視する）からの分離に対してプロットする（図７）．互いに最も近いピークは単一ヌクレオチド分離を示すものと推定し，単一ヌクレオチド分離についての狭い範囲を決定する．可能な単一ヌクレオチド分離の倍数によりすべてのピークの配置を試みる一連のタイムトラックが提案される．サンプルデータの最大と最良の相関を示す（最小自乗分析による）タイムトラックを正しいタイムトラックとして選択する．ピークの最大を，ついでタイムトラックにプロットする．ピーク間のスペースを他のヌクレオチドを表すと推定する．ついで１種のヌクレオチドすべての位置および中間単一ヌクレオチドステップを同定するテキストファイルを発生させる．患者サンプルのテキストファイルをすべての既知対立遺伝子に対し比較する．最良のマッチを示す既知対立遺伝子はサンプルを同定する．実施例３ＨＬＡクラスIIＤＲＢ１血清学的グループには，22の対立遺伝子が知られている．単一ヌクレオチド配列決定反応の階層を用いると，どの対立遺伝子が存在するかの同定に必要な反応の数を最小限にすることができる．反応は上述の実施例１の方法に従って実施する．唯一のＤＲＢ１対立遺伝子がＤＲ４サブタイプであることがグループ特異的反応から確立された場合には，ついでその対立遺伝子の同定を以下の工程によって実施する．１．Ａヌクレオチド配列を決定する．これで22の既知対立遺伝子の16が同定される．ついで，２．Ｇヌクレオチド配列を決定する．これで22の既知対立遺伝子の10が同定される．ついで，３．ＡおよびＧの配列決定結果をコンピューター分析によって合体させる．すべての22の既知対立遺伝子が同定される．患者サンプルがいずれかの工程で同定された場合には，そのサンプルについては以下の工程を実施する必要はない．実施例４実施例１におけるグループ特異的反応が患者サンプル中に２つのＤＲ４対立遺伝子の存在を指示した場合には，22の既知対立遺伝子から，253 の可能な対立遺伝子ペアの組合せ（22のホモ接合体＋231 ヘテロ接合体）がある．この場合も，単一ヌクレオチド配列決定反応の階層を用いて，どの対立遺伝子ペアが存在するかの同定に必要な反応の数を最小限にすることができる．反応は上述の実施例１の方法に従って実施する．１．配列Ｇ：10のホモ接合体ペアおよび64のヘテロ接合体ペアが識別される．２．配列Ａ：16のホモ接合体ペアおよび23のヘテロ接合体ペアが識別される．３．ＡおよびＧの配列決定結果をコンピューター分析によって合体させる．すべての既知ホモ接合体と169 の既知ヘテロ接合体対立遺伝子が同定される．４．配列Ｃ：５のホモ接合体ペアおよび18のヘテロ接合体ペアが識別される．５．配列Ａ，ＣおよびＧの配列決定結果をコンピューター分析によって合体させる．すべての既知ホモ接合体と219 のヘテロ接合体ペアが同定される．６．配列Ｔ：１のホモ接合体ペアおよび５のヘテロ接合体ペアが識別される．７．配列Ａ，Ｃ，ＧおよびＴの配列決定の結果をコンピューター分析によって合体させる．既知ホモ接合体すべてと225 のへテロ接合体ぺアが同定される．８．４ヌクレオチドの配列決定の終了時に，対立遺伝子ぺアがまだ識別できない場合には，どのぺアが存在するかを識別するため，本発明に従い，配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用することができる．患者サンプルがいずれかの工程で同定された場合には，そのサンプルについては以下の工程を実施する必要はない．この実施例では，分析された患者サンプル中にすべての対立遺伝子が同等に表示されると仮定している．ある対立遺伝子がその集団中で優先される場合には，それらの対立遺伝子に限定した反応を最初に実施して，実施する反応の総数を減少させるのが有利である．実施例５実際，ＨＬＡクラスＩＣ遺伝子のすべての対立遺伝子を，エキソン２および３ゲノムＤＮＡの配列単独に基づいて決定できる（Cereb,N.ら,"Locus-specificam plification of HLA class I genes from genomic DNA: locus-specificsequenc es in the first and third introns of HLA-A，-B and-Calleles."TissueAntig ens 45: 1-11，1995 ）．用いたプライマーは，すべてのＣ- 対立遺伝子の多型エキソン２および３を増幅し，偽遺伝子またはＢもしくはＡ対立遺伝子を共増幅することはない．これらのプライマーは，Ｃ- 遺伝子座のイントロン１，２および３のＣ- 特異的配列を利用する．患者サンプル中の対立遺伝子の同定は実施例１の方法を以下のように変更して実施する．患者サンプルのＤＮＡは標準方法（Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel,F.M.ら編，John Wiley & Sons，1995 ）に従い調製する．ＨＬＡクラスＩＣ遺伝子エキソン２の増幅には以下のプライマーを用いる．順プライマー：イントロン１プライマー名：Ｃ211 5'- AGCGAGTGCCCGCCCGGCGA-3' 配列番号:19 逆プライマー；イントロン２プライマー名：Ｃ2 Ｒ12 5'- ビオチン-ACCTGGCCCGTCCGTGGGGGATGAG-3' 配列番号:20 アンプリコンサイズ 407 bp 増幅は 15.6 ｍＭ硫酸アンモニウム，67ｍＭ Tris-ＨＣｌ(ｐＨ 8.8)，5μＭＥＤＴＡ，1.5 mＭＭｇＣｌ₂，0.01％ゼラチン，0.2 ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰ）および 0.2ｍＭの各増幅プライマーからなるＰＣＲ緩衝液中で実施した．増幅の前に，40 ng の患者サンプルＤＮＡ，ついで 2.5単位のTaqポリメラーゼ（Roche Molecular）を添加する．増幅サイクルは以下の通りとする．１分 96℃ ５サイクル 96℃ 20秒 70℃ 45秒 72℃ 25秒 20サイクル 96℃ 20秒 65℃ 50秒 72℃ 30秒５サイクル 96℃ 20秒 55℃ 60秒 72℃ 120秒別個の反応でのＨＬＡクラスＩＣのエキソン３の増幅には以下のプライマーを用いる．順プライマー；イントロン２-エキソン３境界プライマー名：Ｃ3l2 Ｅ3 5'- ビオチン-GACCGCGGGGCCGGGGCCAGGG-3' 配列番号:21 逆プライマー；イントロン３プライマー名：Ｃ3 Ｒl3 5'-GGAGATGGGCAAGGCTCCCCACT-3' 配列番号:22 アンプリコンサイズ 333 bp エキソン２について掲げたのと同じ反応条件をＤＮＡの増幅に使用する．次に配列決定反応を実施例１の方法に従い，以下の5'-蛍光標識配列決定プライマーの１つを用いて実施する．エキソン２：順配列決定 5'-CGGGACGTCGCAGAGGAA-3'（イントロン３）配列番号:25 エキソン２：逆配列決定 5'-GGAGGGTCGGGCGGGTCT-3'（イントロン２）配列番号:24 エキソン３：順配列決定 5'-CCGGGGCGCAGGTCACGA-3'（イントロン１）配列番号:23 選択されるターミネーション反応は順または逆プライマーのいずれが選ばれるかに依存する．付録１には，順プライマーを用いる（すなわち，配列決定鋳型がアンチセンス鎖である）場合に識別される対立遺伝子を掲げる．配列決定に逆プライマーを使用すると，選択されるターミネーション反応は相補性のものである（ＴにはＡ，ＧにはＣ，およびそれらの逆）．ＨＬＡクラスＩＣのホモ接合対立遺伝子は以下の配列決定順序によって効率的に識別される．１．センス鎖Ａヌクレオチド配列を決定する．35の既知ホモ接合体中の24が同定される．ついで，２．センス鎖Ｃヌクレオチド配列を決定する．35の既知ホモ接合体中の16が同定される．ついで，３．ＡおよびＣの配列決定結果をコンピューター分析によって合体させる．35 の既知ホモ接合体中の31が同定される．４．センス鎖Ｇヌクレオチド配列を決定する．35の既知ホモ接合体中の14が同定される．ついで，５．Ａ，ＣおよびＧの配列決定結果をコンピューター分析により合体させる． 35の既知ホモ接合体中の33が同定される．残りの２つの対立遺伝子，Ｃｗ^*12022.hla およびＣｗ^*12021.hla はエキソン２および３のみのヌクレオチド配列決定では識別できない．これらの対立遺伝子間の識別には，本発明によりさらに反応が実施される．患者サンプルがいずれかの工程で同定された場合には，そのサンプルについては以下の工程を実施する必要はない．ヘテロ接合体は同一の基盤で分析され，単一ヌクレオチド配列決定反応の順序は，どの反応でサンプルの最も多数が識別されるかを調べて決定し（データは示していない），それらの反応を最初に実施する．この実施例では，分析される患者サンプル中のすべての対立遺伝子が同等に表示されると仮定している．ある対立遺伝子がその集団中で優先される場合には，それらの対立遺伝子に限定した反応を最初に実施して，実施する反応の総数を減少させるのが有利である．実施例６１つのリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）変異体（Asn291 Ser）は早発性の動脈硬化症においてＨＤＬコレステロールのレベルの低下に伴って認められる．この変異体はエキソン６のセンス鎖のヌクレオチド1127にＡのＣへの単一ミスセンス突然変異を有する．この変異体は本発明により以下のように識別される．患者サンプルからのＬＰＬ遺伝子のエキソン６を，エキソン６の５’境界に近いイントロン５に位置する５’ＰＣＲプライマーで増幅する． 5'-GCCGAGATACAATCTTGGTG-3' ［配列番号:26］ 3'ＰＣＲプライマーはエキソン６中，Asn291 Ser突然変異から短い距離に位置し，ビオチンで標識されている． 5'- ビオチン-CAGGTAACATTTTGCTGCTTC-3' ［配列番号:27］ＰＣＲ増幅反応は，Reymer，PWA ら，”A ipoprotein lipase mutation（Asn2 9lSer）is associated with reduced HDL cholesterol levels in prematureath erosclerosis.”Nature Genetics 10: 28-34，1995 に詳述された方法に従って実施した．配列決定分析はついで実施例１のThermo Sequenase（登録商標，Amersham）法に従い，上述の５’ＰＣＲプライマーの蛍光標識型を用いて実施した．有害な対立遺伝子がそのセンス鎖のヌクレオチド1127にＣを有することから，Ｃターミネーション配列決定反応を実施した．反応の結果を自動ＤＮＡ配列決定装置に記録し，1127部位で分析した．患者のサンプルはその部位にＣをもつか，またはもたないかのいずれかである．Ｃが存在すれば，患者は「不健康」な対立遺伝子を有するとして同定される．Ｃが存在しない場合は対立遺伝子の「健康」型と同定される．患者記録はこれに基づいて作成される．実施例７健康管理者は最近ゲノタイプの感染をもつ疾患の範囲の分子疫学的関連を決定するために，Chlamydia trachomatis 株間の識別を探究している（Dean，D.ら， ”Major Outer Membrane Protein Variants of Chlamydia trachomatis AreAsso ciated with Severe Upper Genital Tract Infections and Histopathologyin S an Francisco.”J.Infect.Dis．172: 1013-22，1995参照）．本発明によればC.t rachomatis の存在ならびに純粋および混合培養液のゲノタイプが，C.trachoma tis の ompl 遺伝子（外膜タンパク質１）の検査によって決定できる． ompl遺伝子は，15の既知ゲノタイプ間の識別に使用できる少なくとも４種の可変配列（ＶＳ）を有す（Yuan，Y.ら，”Nucleotide and Deduced Amino AcidSe quence for the Four Variable Domains of Major Outer Membrane Proteinsof the 15 Chlamydia trachomatis Serovars.”Infect.Immum．57: 1040-1949,1989 ）．論理的には，可能性のある混合培養液中に検出可能な量のゲノタイプの存在を測定するために，特定の位置に，ゲノタイプ間でユニークなヌクレオチドを見いだす方法を探索しなければならない．たとえばゲノタイプＨは位置 284にユニークなＡを有する．他のゲノタイプはこのＡを共有しないので，それはゲノタイプＨの診断法になる．この基盤で，単一ヌクレオチド配列決定の好ましい順序が以下のように決定される．患者サンプルを得て，標準ＳＤＳ/プロテイナーゼＫ法を用いＤＮＡを抽出した．サンプルは，別法（Dean,D．ら，"Comparison of the major outer membran eprotein sequence variant regions of B/Ba isolates:amolecularepidemiolog ic approach to Chlamydia trachomat is infections."J．Infect.Dis．166:383 -992，1992）によっても調製された．略述すれば，サンプルをl×ＰＢＳで１回洗浄し，14,000g で遠心分離し，ジチオスレイトールとTris ＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁し，ＰＣＲの前に煮沸した．１μl のサンプルを 50 ｍＭＫＣｌ，10 mＭ Tris-Ｃｌ（ｐＨ 8.1），1.5ｍＭＭｇＣｌ2，100ｐＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰならびにｄＴＴＰ，2.5Ｕのampli- TaqＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus，Foster City，CA），および 150 ngの各プライマーを含有する l00μl の反応容量中で使用した．上流プライマーはF 11： 5'-ACCACTTGGTGTGACGCTATCAG-3' ［配列番号:28］［塩基対（bp）位置 154-176］，下流プライマーはＢ11： 5'-CGGAATTGTGCATTTACGTGAG-3' ［配列番号:29］（bp位置 1187-1166］とした．サーモサイクラーの温度像は，95℃45秒，55℃１分および72℃２分とし，最終サイクル後に72℃で10分の最終伸長を実施した．ついで１μlのＰＣＲ産物それぞれを，２つの別個の入れ子 100μl 反応混合物に，ＶＳ１（可変配列１）およびＶＳ２に隣接する以下のプライマー対：ＭＦ21 5'-CCGACCGCGTCTTGAAAACAGATGT-3' ［配列番号:30］，およびＭＢ22 5'-CACCCACATTCCCAGAGAGCT-3' ［配列番号:31］ならびにＶＳ３およびＶＳ４に隣接する以下のプライマー対：ＭＶＦ３ 5'-CGTGCAGCTTTGTGGGAATGT-3' ［配列番号:32］，およびＭＢ４ 5'-CTAGATTTCATCTTGTTCAATTGC-3' ［配列番号:33］と用いた（Dean D. & Stephens RS．”Identification of individual genotype sof Chlamydia trachomatis in experimentally mixed infections and mixedin fections among trachoma patients．”J.Clin.Microbiol．32: 506-10，1994参照）．これらのプライマーセットはプロトタイプ C.trachomatis 血清型Ａ-ＫおよびＬ1-3 をBa，Da，IaおよびＬ2a を含めて均一に増幅する．各生成物のサンプル（l0μl）を1.5％アガロースゲル上に流し，増幅産物のサイズを確認した．すべてのＰＣＲ産物は（GeneClean；Bio 101，La Jolla，CA）製造業者の説明書に従い精製した．ＰＣＲにより C.trachomatis の存在について陽性であったサンプルすべてを単一ヌクレオチド配列決定により ompl ゲノムタイピングに付した．配列決定反応のための増幅は上述のように，少なくともプライマーのいずれかの一方を５’ ビオチン化した型の上述の増幅プライマー対を用いて実施した．ビオチン化鎖を Dynal ビーズで分離し，選択されたターミネーション反応を実施例１のように，ＭＦ2lまたはＭＶＦ3の５’蛍光標識型を用いて行った．ターミネーション反応の選択はゲノタイプ間の所望の分割の程度に依存する．臨床的C.trachomatis サンプルの１〜３％が混合ゲノタイプを含有するにすぎない．それにもかかわらず，他の病原体たとえばＨＩＶ，ＨＰＶおよびＣ型肝炎はより一般的に混合されている．これらすべての病原体について，ヘテロ接合サンプルを識別する方法をもつことは重要である． C.trachomatis ＶＳ１についてのＴターミネーション反応の最初の 25 nt は図８Ａに例示したように，ゲノタイプの３グループ間の識別に使用できる．図８Ａのサンプル１で観察された結果は，少なくともグループ１の１つおよび少なくともグループ３の１つの検出可能なゲノタイプの存在を証明する．グループ２は検出されない．さらに高い分割を所望の場合には，さらに反応が必要である．可能性のあるグループ 1s 間の識別には，ＶＳ１Ａ反応が行われる．図８Ｂには可能なＡの結果を例示する．サンプル１の観察された結果は位置257 にＡを示している．このＡはＥ，ＦまたはＧゲノタイプのみによって提供されることがある．ＴトラックはすでにＦおよびＧ両者の不存在については確立されているので，Ｅはそのゲノタイプ間に存在するに違いない．さらに，283 におけるＡの不存在はＤもＦもＧも存在しないことを指示している．Ｅの存在とＤ，ＦおよびＧの不存在が記録されるものと思われる．Ｅのほかに，他のグループ１ゲノタイプも存在する可能性があるが，それらの存在はＥによって効率的に遮蔽されるので現われない．これらの他の可能性あるコントリビューター間の識別には，必要ならば他の単一ヌクレオチドターミネーション反応を実施できる．本研究者らは，存在する可能性があり，識別が必要なゲノタイプ間がどの単一ヌクレオチド反応で効率的に識別されるかを単純に決定する．また，Ｔ反応においてグループ１のみの存在を示したサンプル２は，268 におけるＡの不存在により，Ba のみからなることが明らかである．これは，ヌクレオチドの存在および不存在の両者がある環境においてあるゲノタイプの存在の決定に使用できることを示している．ＶＳ１のみについてのＣおよびＧターミネーション反応の最初の 25 nt は，研究者がいずれの反応を選択して実施するかを示すために図８Ｃに包含させる．さらに高い分割程度を所望の場合には，ＶＳ２，ＶＳ３およびＶＳ４4のターミネーション反応が実施される．そのゲノタイプのみでなくＤ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，ＩおよびＫゲノタイプの変異体も (Dean,D. ら,"Major 0uter Membrane Protein Variants of Chlamydia trachomatis Are Associated with Severe Upper Genetic Tract Infectionsand Histopathology in San Francisco.”J.Infect.Dis．172: 1013-22，1995に開示されたように），上述の単一ヌクレオチド配列決定反応を用いることによって識別される．実施例８ＨＬＡクラスＩＣの対立遺伝子頻度はカナダ人では以下のように分布する．Ｃｗ１ 5.5 Ｃｗ２ 4.4 Ｃｗ４ 10.0 Ｃｗ５ 6.4 Ｃｗ６ 9.4 Ｃｗ７ 28.9 ＣＷ９ 7.2 Ｃｗ10 5.7 Ｃｗ11 0.5 未知/ の他 22.0 このデータに基づくとカナダ人のサンプルでは最先にＣｗ７対立遺伝子（すなわちＣｗ^*0701〜Ｃｗ^*0704）を含むホモ接合体およびヘテロ接合体をまず識別するターミネーション反応を実施することが好ましい．これに引き続いて，Ｃｗ４，Ｃｗ４およびＣｗ９等を実施すべきである．Ｃｗ７はＣ/ Ｇ分析に基づいて優先的に識別される（可能な組合せ134から122，付録２参照）．（残りの496からさらに320 が加わる）．Ｃｗ４もＣ/Ｇ分析に基づき優先的に識別される（69から57）．（残りの561からさらに385とともに）．すなわち，ターミネーション反応の好ましい順序は次の通りである．１．患者サンプルのエキソン２およびエキソン３についてセンス鎖Ｃヌクレオチド配列を決定する．２．患者サンプルのエキソン２およびエキソン３についてセンス鎖Ｇヌクレオチド配列を決定する．ついで，３．ＧおよびＣの配列決定結果をコンピューター分析によって合体させて，少なくとも１つのＣｗ７またはＣｗ４対立遺伝子を含有する179/195 の可能な対立遺伝子ペアを包含する630 の可能な組合せから，442 が同定される（カナダの人口の38.9％）．４．エキソン２および３についてセンス鎖Ａヌクレオチド配列を決定する．５．Ａ，ＣおよびGの配列決定結果をコンピューター分析により合体させる．残りの未決定のヘテロ接合体を同定する．この時点後にも識別できない組合せはエキソン２および３のみのヌクレオチド配列決定では識別できない２つの残りの対立遺伝子Ｃｗ^*12022 およびＣｗ^*1202 1 のみである．これらの対立遺伝子間の識別には，本発明による反応をさらに実施してもよい．これらの対立遺伝子はサイレント突然変異でのみ相違するので，それらはアミノ酸レベルでは同一であり，実際には識別の必要はないことに留意すべきである．サンプルの記録としては単に１つの対立遺伝子と，Ｃｗ^*12022またはＣｗ^*12021 のいずれかの存在が単に確認できる．患者サンプルがいずれかの工程で同定された場合には，そのサンプルについては以後の工程を実施する必要はない．実施例９サンプルのＨＬＡ- ＤＲＢＩ対立遺伝子型の分析は実施例１に従って，２つのチェーンターミネーティングヌクレオチドを用いて実施できる．患者のサンプルＤＮＡ（実施例１のように予め増幅する）100 ngを標識配列決定プライマー： 5'-GAGTGTCATTTCTTCAA-3' ［配列番号:18］ 30 ng （計５ｐＭ）と２×配列決定緩衝液（52ｍＭ Tris-ＨＣｌ，ｐＨ9.5,13 ｍＭＭｇＣｌ₂）中で 2UのThermo Sequenase 酵素（Amersham LifeSciences,C leveland）と最終容量３μl に混合する．この配列決定プレミックスは使用の準備が整うまで氷上に保持し，以下のターミネーター混合物の１つの３μl と混合する．Ａ/ Ｃターミネーション反応： 750 μＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，およびｄＴＴＰ；ならびに2. ５μＭのddＡＴＰ，2.5μＭのddＣＴＰ，Ａ/ Ｇターミネーション反応： 750 μＭの各ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，およびｄＴＴＰ；ならびに2. 5μＭのddＧＴＰ，2.5μＭのddＡＴＰ．総ターミネーション反応容量:６μl ターミネーション反応混合物は Robocycler 中で30サイクルの熱サイクル（または十分であることが分かったならば減らす）に付す． 95℃ 40秒 50℃ 30秒 68℃ 60秒サイクルに付したのち，100 ホルムアミドと５mg/ml のデキストランブルーからなる負荷緩衝液 12 μl をターミネーション反応混合物に加え，適当な容量（すなわち，1.5 μl ）を自動ＤＮＡ配列決定装置，たとえば VisibleGenetics 0pen Gene（登録商標）システムに負荷する．付録１ＨＬＡクラスＩＣ遺伝子座:エキソン２および３に基づく対立遺伝子分析 Strasburg データベースから得られる配列インターネットアドレス＝ftp://FTP.EMBL-Heidelberg.DE/pub/database ＨＬＡクラスＩＣ遺伝子座の35既知対立遺伝子 35 の対立遺伝子は，35のホモ接合体ペアまたは630 のヘテロ接合体ペアとして組合わせられる．ホモ接合体ペアは以下の順序の単一ヌクレオチド配列決定により識別される：Ａを用いる非ユニーク配列：Ａを用いるユニーク配列：ｃを用いる非ユニーク配列：ｃを用いるユニーク配列：Ｇを用いる非ユニーク配列：Ｇを用いるユニーク配列：Ｔを用いる非ユニーク配列：Ｔを用いるユニーク配列：ＡＣを用いる非ユニーク配列：ＡＣを用いるユニーク配列：ＡＧを用いる非ユニーク配列：ＡＧを用いるユニーク配列：ＡＴを用いる非ユニーク配列：ＡＴを用いるユニーク配列：ＣＧを用いる非ユニーク配列：ＣＧを用いるユニーク配列：ＣＴを用いる非ユニーク配列：ＣＴを用いるユニーク配列：ＧＴを用いる非ユニーク配列：ＧＴを用いるユニーク配列：ＡＣＧを用いる非ユニーク配列：ＡＣＴを用いる非ユニーク配列：ＡＣＴを用いるユニーク配列：ＡＧＴを用いる非ユニーク配列：ＡＧＴを用いるユニーク配列：ＣＧＴを用いる非ユニーク配列：ＣＧＴを用いるユニーク配列：ＡＣＧＴを用いるユニーク配列：

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１２月１０日（１９９７．１２．１０）【補正内容】明細書多型遺伝子配列の評価方法およびＨＬＡ型の同定におけるその使用発明の背景疾患状態の存在または感受性を決定するための遺伝子試験は医学的看護の改善に信じがたい機会を提供し，このような試験の可能性は同定される疾患関連遺伝子および／または突然変異の数が絶えず増加することから，ほとんど毎日増加を続けている．しかしながら，このような可能性を実現するために克服しなければならない大きな障害は，試験の高い経費である．これは多数の変動の試験の必要性が，試験操作を定常的な試験としては到底実施できないほど極めて高価にしていると思われる．それは高度に多型の遺伝子の場合とくに著しい．ＤＮＡ配列における変化の試験は標的核酸分子の完全な配列決定によって進められるが，本分野の技術者の多くは，それがいつか定常的に行われるようになるにはこのような試験があまりにも高価すぎると考えている．ＤＮＡ配列の変化はまた，0rita ら，Genomics 5： 874-879（1989）により報告された「一本鎖コンォーメーション多型」（ＳＳＣＰ）と呼ばれる技術または Sarkar ら，Genomi cs 13： 441-443（1992）によって報告されたジデオキシ-フィンガープリンティング（ddＦ）と呼ばれるその改良法により検出できる．ＳＳＣＰおよびdd Ｆはいずれも，ＤＮＡフラグメントが非変性電気泳動ゲル上で電気泳動的に分離される場合に生成するバンドのパターンを評価する．このパターンはフラグメントのサイズの組合せおよび非変性フラグメントの三次元コンフォーメーションの組合せに依存する．すなわち，このパターンはフラグメントのバンドの理論的間隔が等しくないことから，配列決定には使用できない．ＥＰ- Ａ-0 351 138号には，ＤＮＡポリメラーゼとして用いられる酵素のタイプの改変により短い範囲のフラグメントサイズにわたってほぼ等しい強度のバンドを与えることを意図するＤＮＡの配列決定方法が開示されている．この酵素は等しい量でまたは濃度範囲 1.4〜4.5 μＭに及ぶ異なる量で提供される４種すベてのチェーンターミネーター（ddＡＴＰ，ddＣＴＰ，ffＧＴＰおよびddＴＴＰ）とともに使用される．ＵＳ5,124,247 号も，核酸の配列決定方法を提供する．この方法では，すべての４種のチェーンターミネーターが量を変動させて使用される．チェーンターミネーターの組合せはたとえば，4:3:2:1 および 16:8:4:1 である．生成物のピークが異なる（識別可能であることを希望して）強度を有するように異なる比が使用される．米国特許第5,545,527 号および国際特許公開ＷＯ96/07761号（引用により本明細書に導入される）に記載された階層的アッセイ法は，有意に多くの結果が興味ある遺伝子配列の不存在を不正に指示することはあっても，このような遺伝子配列の存在を不正に指示する結果を生じることは稀な一連の異なる試験法を用いることによって試験あたりの経費を体系的に低下させる機構を提供する．この階層適当なサンプルが得られたならば，サンプルを第１の配列決定反応混合物と混合する．この反応混合物は鋳型依存性ヌクレオチドポリメラーゼ，Ａ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド供給原料，１種のチェーンターミネーティングヌクレオチドおよび配列決定プライマーを含有する．鋳型依存性ヌクレオチドポリメラーゼの選択は，本発明の成功には重要ではない．しかしながら，好ましいポリメラーゼは，Thermo Sequenase（登録商標）， American Life Sciences により市販されている熱安定性ポリメラーゼ酵素である．他の適当な酵素には通常の Sequenase（登録商標）および配列決定反応に用いられる他の酵素がある．適当な配列決定プライマーの選択は一般に，イントロンまたはエキソンのいずれかで，評価される遺伝子の多型領域の付近（約 300 nt 以内）の多型領域に対し５’（センスまたはアンチセンス鎖上のいずれか）に位置し，その遺伝子のすべての既知の対立遺伝子中で高度に保存されている遺伝子部分を見出すことによって行われる．ついで，このような領域に高度に特異的にハイブリダイズする配列決定プライマーを用い，多型領域を通して配列を決定する．プライマーの品質の他の態様，たとえばパリンドローム配列の欠如，および好ましいＧ/ Ｃは米国特許第5,545,527 の場合と同じである．上述の要求をすべて満足できる１種のプライマーを選択できない場合がある．２個以上のプライマーを一部のサブグループの遺伝子座の間で試験する必要がある．これらの場合には，プライマーの一つを用いて配列決定反応を試みる必要がある．ハイブリダイゼーションが成功し，配列決定反応が進行したならば，その結果を対立遺伝子の同一性の決定に使用できるる．配列決定反応が起こらなかった場合には，他のプライマーを使用する必要がある．配列決定反応混合物を多重サイクルで処理すると，その間にプライマーは伸長し，ついでサンプルからの鋳型ＤＮＡから分離し，新たなプライマーが鋳型と再アニーリングする．これらのサイクルの終了時に，生成物のオリゴヌクレオチドフラグメントをゲル電気泳動によって分離し検出する．この過程は本技術分野において周知の通りである．好ましくはこの分離は，1995年12月12日に出願された国際特許出願ＰＣＴ/ＵＳ95/15951号（ＷＯ96/18892号）の一部継続出願である米国特許出願08/353,932号に記載された装置により，国際特許出願ＰＣＴ/ＵＳ9 5/14531号（ＷＯ96/13717号）に記載の薄いミクロゲルを用いて実施される．これらの出願はすべて引用により本明細書に導入される．本発明の実施は，遺伝子座内のヌクレオチドの位置を単一のヌクレオチド配列決定を用いて正確に同定する技術的に進歩した方法によって支援される．この結果は，ジデオキシ-配列決定/ 電気泳動分析を用いる単一ヌクレオチド配列決定の技術において，いかに多くのヌクレオチドが２つの同定されたヌクレオチドの間に落ちるか：Ａ＿＿＿ＡまたはＡ＿＿＿＿ＡＡを決定することが課題になる場合がある．多くの場合，とくに短い配列決定反応生成物（200 nt 未満）が検査されるときは，反応生成物の電気泳動による分離が高度に予想可能なパターンに従うのでほとんど困難はない．コンピューターまたは人力で，単にギャップを測定し，他の場合にはギャップ内に落ちる一つずつのピークの数を決定することによって，２つの同定されたヌクレオチドの間に存在するヌクレオチドの数を容易に決定することができる．問題は，配列決定反応フラグメントの分割および分離が消失する長い電気泳動試行に関連して起こる．さらに温度，電場の強さまたは他の操作パラメーターを維持する整合性の喪失はピークの間のスペーシングに不整合を招いて，解釈を不明瞭にすることがある．このような曖昧さは対立遺伝子の正確な同定を妨害する．これらの問題を解消する一つの簡単な方法は，たとえば４種すべてのジデオキシヌクレオチドを含む反応を実施することにより，配列決定される遺伝子座からのすべての可能なヌクレオチドフラグメント長を同定する「対照」レーンを全サンプルとともに設けることである．対照レーンは，図３のように同定されるヌクレオチドの間のギャップに存在するヌクレオチド数を正確に指示する．このような対照レーンには放射性標識オリゴヌクレオチドとオートラジオグラフ分析を用いる「手動」配列決定（Current Protocols in Molecular Biology,A usubel,F.M.ら編，7.章，John Wiley & Sons，1995 参照）でも，または自動化レーザー蛍光システムでも，任意の配列決定フォーマットを使用できる．２つの同定されたヌクレオチドの間にあるヌクレオチド数の測定によらない対請求の範囲１．サンプル中の既知多型遺伝子座の対立遺伝子タイプの同定方法において，（ａ）サンプルを，鋳型依存性核酸ポリメラーゼ，Ａ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド供給原料，１種のチェーンターミネーティングヌクレオチドおよび配列決定プライマーを含有する１種または２種以上の配列決定反応混合物と，鋳型依存性プライマーの伸長に適当な条件下に混合し，伸長プライマー中のチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を指示する異なる長さの複数個のオリゴヌクレオチドフラグメントを形成させ，ついで（ｂ）オリゴヌクレオチドフラグメント長さを評価して伸長プライマー中のチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置（単数または複数）を決定する工程からなり，この場合，サンプルは異なる種類のチェーンターミネーティングヌクレオチドを含有する１種または３種までのの配列決定反応混合物と同時に混合する方法．２．サンプルは高々２種のチェーンターミネーティングヌクレオチドを含有する単一配列決定反応混合物と混合し，生成したオリゴヌクレオチドフラグメントの長さはサンプルをさらに配列決定反応混合物と混合する前に評価する「請求項１」記載の方法．３．サンプルは１種のみのチェーンターミネーティングヌクレオチドを含有する単一配列決定反応混合物と混合し，生成したオリゴヌクレオチドフラグメントの長さはサンプルをさらに配列決定反応混合物と混合する前に評価する「請求項１」記載の方法．４．サンプルを配列決定反応混合物と混合する前に，多型遺伝子座の量を濃縮するため，サンプルを増幅する「請求項１〜３」のいずれかに記載の方法．５．増幅はポリメラーゼチェーン反応増幅を用いて増幅する「請求項４」記載の方法．６．オリゴヌクレオチドフラグメントの長さは変性ゲル上電気泳動分離により評価する「請求項１〜５」のいずれかに記載の方法．７．サンプル中の多型遺伝子座の対立遺伝子のタイプを同定するキットにおいて，（ａ）サンプル中の遺伝子材料に多型遺伝子座の付近でハイブリダイズするような配列を有し，多型遺伝子座をまたぐチェーン伸長オリゴヌクレオチド生成物の発生を可能にする配列決定プライマー，および（ｂ）４種のチェーンターミネーティングヌクレオチドを包装して組合わせ，この場合，上記第１のチェーンターミネーティングヌクレオチドは他のいずれのチェーンターミネーティングヌクレオチドの量に対しても５倍以上の量で提供するキット．８．第１のチェーンターミネーティングヌクレオチドはジデオキシアデノシンである「請求項７」記載のキット．９．第１のチェーンターミネーティングヌクレオチドはジデオキシシトシンである「請求項７」記載のキッド 10．第１のチェーンターミネーティングヌクレオチドはジデオキシチミンである「請求項７」記載のキット． 11.第１のチェーンターミネーティングヌクレオチドはジデオキシグアノシンである「請求項７」記載のキット． 12．サンプル中の多型遺伝子の対立遺伝子タイプを決定する方法において，（ａ）サンプルの第１のアリコートを，鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ，Ａ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド供給原料，第１のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドおよび配列決定プライマーを含有する第１の配列決定反応混合物と鋳型依存性プライマーの伸長に適当な条件下に混合し，伸長プライマー中の第１の種のチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する塩基の種の位置を指示する異なる長さの複数個のオリゴヌクレオチドフラグメントを形成させ，（ｂ）オリゴヌクレオチドフラグメントの長さを評価して伸長プライマー中の第１のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を決定し，（ｃ）伸長プライマー中の第１のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を既知の遺伝子の対立遺伝子型に見出される位置と比較し，これによってサンプルを特定のタイプとして割り当てるかまたは遺伝子内のすべての４種の塩基が同時に明確に決定されず不明に割り当てられてさらに評価を行う工程からなるの方法． 13．伸長プライマー中の第１のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を既知の遺伝子の対立遺伝子型に見出される位置と比較したのちにもサンプルが不明の場合には，さらにサンプルの第２のアリコートを，鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ，Ａ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド供給原料，上記第１のタイプとは異なる第２のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドおよび配列決定プライマーを含有する第２の配列決定反応混合物と，鋳型依存性プライマーの伸長に適当な条件下に混合し，伸長プライマー中の第２のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を指示する異なる長さの複数個のオリゴヌクレオチドフラグメントを形成させ，オリゴヌクレオチドフラグメントの長さを評価して伸長プライマー中の第２のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を決定し，伸長プライマーの第１よび第２のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を遺伝子の既知の対立遺伝子型に見出される位置と比較し，これによってサンプルを特定のタイプとして割り当てるかまたは不明としてさらに評価を行う工程からなる「請求項12」記載の方法． 14．伸長プライマー中の第１および第２のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を既知の遺伝子の対立遺伝子型に見出される位置と比較したのちにもサンプルが不明の場合には，さらにサンプルの第３のアリコートを，鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ，Ａ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド供給原料，上記第１および第２のタイプとは異なる第３のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドおよび配列決定プライマーを含有する第３の配列決定反応混合物と，鋳型依存性プライマーの伸長に適当な条件下に混合し，伸長プライマー中の第３のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を指示する異なる長さの複数個のオリゴヌクレオチドフラグメントを形成させ，オリゴヌクレオチドフラグメントの長さを評価して伸長プライマー中の第３のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を決定し，伸長プライマー中の第１，第２および第３のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を遺伝子の既知の対立遺伝子型に見出される位置と比較し，これによりサンプルを特定のタイプとして割り当てるかまたは不明としてさらに評価を行う工程からなる「請求項13」記載の方法． 15．伸長プライマー中の第１，第２および第３のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を既知の遺伝子の対立遺伝子型に見出される位置と比較したのちにもサンプルが不明の場合には，さらにサンプルの第４のアリコートを，鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ，Ａ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド供給原料，上記第１，第２および第３のタイプとは異なる第４のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドおよび配列決定プライマーを含有する第４の配列決定反応混合物と，鋳型依存性プライマーの伸長に適当な条件下に混合し，伸長プライマー中の第４のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を指示する異なる長さの複数個のオリゴヌクレオチドフラグメントを形成させ，オリゴヌクレオチドフラグメントの長さを評価して伸長プライマー中の第４のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を決定し，伸長プライマー中の第１，第２，第３および第４のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を遺伝子の既知の対立遺伝子型に見出される位置と比較し，これによりサンプルを特定のタイプとして割り当てるかまたは不明としてさらに評価を行う工程からなる「請求項14」記載の方法．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ダン，ジェームズ，エム. カナダ国エム１ケイ４エス８オンタリオ，スカーバラ，シタデルドライブ 117 (72)発明者ロイシュナー，ジェームズカナダ国エム５エム４エム３オンタリオ，ノースヨーク，シルバンバレイウェイ 84 (72)発明者グリーン，ロナルド，ジェイ. イギリス国ビーエヌ３１エイチジーイーストサセックス，ホーブ，ランスダウンプレースナンバー２ 24

Claims

【特許請求の範囲】１．サンプル中の既知多型遺伝子座の対立遺伝子タイプの同定方法において，（ａ）サンプルを，鋳型依存性核酸ポリメラーゼ，Ａ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド供給原料，１種のチェーンターミネーティングヌクレオチドおよび配列決定プライマーを含有する配列決定反応混合物と，鋳型依存性プライマーの伸長に適当な条件下に混合し，伸長プライマー中のチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を指示する異なる長さの複数個のオリゴヌクレオチドフラグメントを形成させ，ついで（ｂ）オリゴヌクレオチドフラグメントの長さを評価して伸長プライマー中のチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置（単数または複数）を決定する工程からなり，この場合，サンプルは異なる種類のチェーンターミネーティングヌクレオチドを高々３種まで含有する配列決定反応混合物と同時に混合する方法．２．サンプルは高々２種のチェーンターミネーティングヌクレオチドを含有する単一配列決定反応混合物と混合し，生成したオリゴヌクレオチドフラグメントの長さはサンプルをさらに配列決定反応混合物と混合する前に評価する「請求項１」記載の方法．３．サンプルは１種のみのチェーンターミネーティングヌクレオチドを含有する単一配列決定反応混合物と混合し，生成したオリゴヌクレオチドフラグメントの長さはサンプルをさらに配列決定反応混合物と混合する前に評価する「請求項１」記載の方法．４．サンプルを配列決定反応混合物と混合する前に，多型遺伝子座の量を濃縮するため，サンプルを増幅する「請求項１〜３」のいずれかに記載の方法．５．増幅はポリメラーゼチェーン反応増幅を用いて実施する「請求項４」記載の方法．６．オリゴヌクレオチドフラグメントの長さは変性ゲル上電気泳動分離により評価する「請求項１〜５」のいずれかに記載の方法．７．サンプル中の多型遺伝子座の対立遺伝子のタイプを同定するキットにおいて，（ａ）サンプル中の遺伝子材料に多型遺伝子座の付近でハイブリダイズするように適合されたプライマー，および（ｂ）２種以上のチェーンターミネーティングヌクレオチドを包装して組合わせ，この場合，上記第１のチェーンターミネーティングヌクレオチドは他のいずれのチェーンターミネーティングヌクレオチドの量に対しても５倍以上の量で提供するキット．８．第１のチェーンターミネーティングヌクレオチドはジデオキシアデノシンである「請求項７」記載のキット．９．第１のチェーンターミネーティングヌクレオチドはジデオキシシトシンである「請求項７」記載のキット． 10．第１のチエーンターミネーティングヌクレオチドはジデオキシチミンである「請求項７」記載のキット． 11．第１のチェーンターミネーティングヌクレオチドはジデオキシグアノシンである「請求項７」記載のキット． 12．サンプル中の多型遺伝子の対立遺伝子タイプを決定する方法において，（ａ）サンプルの第１のアリコートを，鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ，Ａ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド供給原料，第１のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドおよび配列決定プライマーを含有する第１の配列決定反応混合物と，鋳型依存性プライマーの伸長に適当な条件下に混合し，伸長プライマー中の第１のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を指示する異なる長さの複数個のオリゴヌクレオチドフラグメントを形成させ，（ｂ）オリゴヌクレオチドフラグメントの長さを評価して伸長プライマー中の第１のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を決定し，（ｃ）伸長プライマー中の第１のタイプのチエーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を遺伝子の既知の対立遺伝子型に見出される位置と比較し，これによってサンプルを特定のタイプとして割り当てるかまたは不明としてさらに評価を行う工程からなるの方法． 13．伸長プライマー中の第１のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を遺伝子の既知の対立遺伝子型に見出される位置と比較したのちにもサンプルが不明の場合には，さらにサンプルの第２のアリコートを，鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ，Ａ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド供給原料，上記第１のタイプとは異なる第２のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドおよび配列決定プライマーを含有する第２の配列決定反応混合物と，鋳型依存性プライマーの伸長に適当な条件下に混合し，伸長プライマー中の第２のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を指示する異なる長さの複数個のオリゴヌクレオチドフラグメントを形成させ，オリゴヌクレオチドフラグメントの長さを評価して伸長プライマー中の第２のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を決定し，伸長プライマー中の第１および第２のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を遺伝子の既知の対立遺伝子型に見出される位置と比較し，これによってサンプルを特定のタイプとして割り当てるかまたは不明としてさらに評価を行う工程からなる「請求項12」記載の方法． 14．伸長プライマー中の第１および第２のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を遺伝子の既知の対立遺伝子型に見出される位置と比較したのちにもサンプルが不明の場合には，さらにサンプルの第３のアリコートを，鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ，Ａ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド供給原料，上記第１およぼ第２のタイプとは異なる第３のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドおよび配列決定プライマーを含有する第３の配列決定反応混合物と，鋳型依存性プライマーの伸長に適当な条件下に混合し，伸長プライマー中の第３のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を指示する異なる長さの複数個のオリゴヌクレオチドフラグメントを形成させ，オリゴヌクレオチドフラグメントの長さを評価して伸長プライマー中の第３のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を決定し，伸長プライマー中の第１，第２および第３のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を遺伝子の既知の対立遺伝子型に見出される位置と比較し，これによりサンプルを特定のタイプとして割り当てるかまたは不明としてさらに評価を行う工程からなる「請求項13」記載の方法． 15．伸長プライマー中の第１，第２および第３のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を遺伝子の既知の対立遺伝子型に見出される位置と比較したのちにもサンプルが不明の場合には，さらにサンプルの第４のアリコートを，鋳型依存性の核酸ポリメラーゼ，Ａ，Ｔ，ＧおよびＣヌクレオチド供給原料，上記第１，第２およぼ第３のタイプとは異なる第４のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドおよび配列決定プライマーを含有する第４の配列決定反応混合物と，鋳型依存性プライマーの伸長に適当な条件下に混合し，伸長プライマー中の第４のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を指示する異なる長さの複数個のオリゴヌクレオチドフラグメントを形成させ，オリゴヌクレオチドフラグメントの長さを評価して伸長プライマー中の第４のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を決定し，伸長プライマー中の第１，第２，第３および第４のタイプのチェーンターミネーティングヌクレオチドに相当する種類の塩基の位置を遺伝子の既知の対立遺伝子型に見出される位置と比較し，これによりサンプルを特定のタイプとして割り当てるかまたは不明としてさらに評価を行う工程からなる「請求項14」記載の方法． 16．サンプルはそれを配列決定反応混合物と混合する前に，多型遺伝子座の量を濃縮するために増幅させる「請求項12〜15」のいずれかに記載の方法． 17．増幅はポリメラーゼチェーン反応増幅を用いて行う「請求項16」記載の方法． 18．遺伝子はＨＬＡクラスＩ遺伝子である「請求項12〜17」のいずれかに記載の方法． 19．遺伝子はＨＬＡクラスII遺伝子である「請求項12〜17」のいずれかに記載の方法．