JP2000502711A

JP2000502711A - 同種異系パラクリンサイトカイン腫瘍ワクチン

Info

Publication number: JP2000502711A
Application number: JP09524574A
Authority: JP
Inventors: エム．ジャフィー、エリザベス; エム．パードル、ドリュー; アイ．ルヴィッスキー、ハイアム
Original assignee: ザジョンズホプキンズユニヴァーシティスクールオブメディシン
Priority date: 1995-12-28
Filing date: 1996-12-26
Publication date: 2000-03-07
Also published as: DE69627527T2; EP0869803B1; ATE237338T1; WO1997024132A1; EP0869803A1; DE69627527D1; AU1355697A; ES2191784T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、（ａ）腫瘍細胞株を得て、（ｂ）該腫瘍細胞株を、未修飾の腫瘍細胞株と比べて増加したレベルのサイトカインを産生することができるように修飾し、（ｃ）該腫瘍細胞株を得た腫瘍と同じタイプの腫瘍である少なくとも１つの腫瘍を有する哺乳類宿主に、該腫瘍細胞株（該腫瘍細胞株は該宿主と同種異系であり、かつＭＨＣがマッチしていない）を投与することを含む癌の治療方法を提供する。本発明はまた、膵臓腫瘍細胞株、かかる腫瘍細胞株を得るための方法および培地、ならびに精製された膵臓腫瘍細胞株の細胞を含有する組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】同種異系パラクリンサイトカイン腫瘍ワクチン米国連邦が支援する研究および開発においてなされた発明に対する権利に関する陳述本発明はナショナルインスティテューツオブヘルスが与えた認可第ＣＡ６２９２４号、およびナショナルインスティテューツオブヘルスおよびナショナルキャンサーインスティテュートが共同で与えた認可第ＣＡ５７８４２号のもとで政府に援助されて成された。政府は本発明における一定の権利を有しうる。発明の技術分野本発明は同種異系腫瘍細胞株(allogeneic tumor cell line)、すなわち、宿主と遺伝子的に異なる腫瘍細胞株を用いる癌の治療方法に関する。詳細には、本発明は同種異系膵臓腫瘍細胞株を用いる膵臓癌の治療方法に関する。本発明はまた、膵臓腫瘍細胞株、かかる細胞株を得るための方法および培地、ならびに精製された膵臓腫瘍細胞株の細胞を含有する組成物に関する。発明の背景ヒト腫瘍細胞が細胞ゲノム中にその悪性表現型の原因となる複数の特異的改変を含むことが一般に認められている。これらの改変は細胞の増殖と分化を制御する遺伝子の発現または機能に影響を及ぼす。例えば、典型的にはこれらの変異は腫瘍遺伝子、またはγas のような細胞のトランスフォーメーションの正のエフェクター中に、および負の成長調節因子をコードする腫瘍抑制遺伝子（または劣性腫瘍遺伝子）中に認められ、その機能を失うとP53，Rb1，DCC，MCC，NF1,およびWT1のようなトランスフォームされた表現型の発現を結果としてもたらす。変異は膵臓癌腫（カルシノーマ）および結腸直腸癌腫（カルシノーマ）を含めた通常のヒト腫瘍の全てにおいて検出されている。今日までに、トランスフォーミングγas 遺伝子（すなわち、12，13および61番目の重要な位置の一つに改変されたアミノ酸を有する蛋白質をコードするH-γas，K-γas,またはN-γas の変異型）がヒトの癌で最も頻繁に同定された腫瘍遺伝子である。Barbacid，Ann ．Rev.Bio chem. ，56，779-827 (1987)により報告されているように、γas 腫瘍遺伝子は膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、直腸、および胃の癌腫（カルシノーマ）において；リンパ球系および骨髄系の造血腫瘍において；繊維肉腫および横紋筋肉腫のような間葉由来の腫瘍において；および黒色腫、奇形癌腫（テラトカルシノーマ）、神経芽細胞腫、およびグリオームを含めた他の腫瘍において見い出されている。Bos，Cancer Research, 49，4682-4689 (1989)に記載されているように、特に、γas 変異は膵臓の腺癌（アデノカルシノーマ）の患者の90 ％以上で同定されている。膵臓の腫瘍は非常に悪性であり、一般に死に到る。実際、膵臓癌は米国における癌関連死の原因の第５位である。現在行われている治療法は切除不可能な腫瘍（すなわち、局部的に進行したまたは転移性の癌）の患者には効果が少ないかまたは効果がない。同様に、切除することのできる局在的な疾患の患者にとって、現在の技術水準の放射線療法および化学療法と組み合わせたアジュバント療法は穏やかな効果しか示さないうえに、かなりの治療毒性の犠牲を払わなければならない。アジュバント療法を受ける癌患者の７１％以上は結局は再発性疾患により死ぬ。これらの理由から、現在、より効果的な治療が癌に、特に進行したおよび限定期の膵臓癌の両方に必要である。免疫療法は癌の治療において治療的アプローチになる可能性がある。免疫療法は、自然に発生する腫瘍を拒絶する免疫系の不全が腫瘍抗原に対して適切に応答する免疫系の不全に関連するという前提に基づいている。機能している免疫系において、腫瘍抗原はプロセシングされ、主要組織適合遺伝子複合体(major histo -compatibility complex,ＭＨＣ）クラスＩおよびII分子〔これはヒトの場合、「ヒト白血球関連」（“human leukocyte associated”,ＨＬＡ）分子ともいう〕においては細胞表面上に発現される。抗原と複合体を形成すると、ＭＨＣクラスＩおよびII分子はそれぞれＣＤ８⁺およびＣＤ４⁺Ｔ細胞により認識される。この認識により、二次的な細胞シグナルのセットと、細胞間の相互作用を媒介し、宿主防御を剌激して疾患を退ける特異的サイトカイン（すなわち可溶性のいわゆる「生物学的応答調節物質（biological response modifier）」）のパラクリン放出が生じる。次いでサイトカインの放出が抗原特異的T細胞の増殖をもたらす。従って、活性免疫療法は、腫瘍細胞を典型的には腫瘍の近傍に注射して、新たなあるいは増強された全身性免疫応答を生じさせることを含む。腫瘍に対する全身性Ｔ細胞応答を増強するこの免疫療法的アプローチの能力は先に開示されている。例えば、特に、国際出願ＷＯ９２／０５２６２、Fearon et al.，Cell，60, 397-403(1990)、およびDranoff et al.，Proc ．Nat1．Acad．Sci.，90，3539-35 43（1993）参照。注射された腫瘍細胞は通常その免疫原性を増強するために、非特異的アジュバントと混合したり、またはサイトカインもしくは他の免疫共同刺激分子を発現するように細胞を遺伝子的に修飾することにより改変されている。使用する腫瘍細胞は自己由来、すなわち、治療中の宿主と同じ宿主由来であってよい。あるいは、腫瘍細胞はＭＨＣがマッチする、すなわち同じか少なくとも幾つかは同じＭＨＣ複合体分子を有する別の宿主由来であってよい。臨床研究者らは、種々の理由により、ＭＨＣがマッチする腫瘍細胞より自己由来腫瘍細胞を使用することを好むこともあるし、逆のこともある。すなわち、各患者の腫瘍は、他の患者からの組織学的に類似する、ＭＨＣがマッチする腫瘍細胞で見い出される腫瘍抗原とは異なる独特の組み合わせの腫瘍抗原を発現するので、自己由来細胞が好ましい。例えば、Kawakami et al.，J ．Immunol.，148,63 8-643(1992); Darrow et al.，J ．Immunol.，142, 3329-3335（1989）およびHom et al.，J ．Immunother.，10，153-164 (1991)参照。ヒト黒色腫抗原を評価する研究により、同じＭＨＣタイプが同様に共有されているか否かにかかわらず、これまでに同定された全てのヒト腫瘍抗原が少なくとも５０％の患者の腫瘍で共有されていることが確認されている。患者自身の腫瘍からの細胞を用いれば、腫瘍またはＭＨＣ抗原をマッチさせる必要をなくすことができる。対照的に、自己由来腫瘍細胞ワクチンの使用は、ワクチン製造のために各患者を外科的に手術して患者の腫瘍のサンプルを得る必要があるので、ＭＨＣがマッチする腫瘍細胞が好ましい。自己由来腫瘍細胞ワクチンの製造に必要な新鮮なヒト腫瘍外植片をインビトロで増殖させることは、労力集約型であり技術が要求され、高度に専門的な研究施設をもってしてもほとんどの組織学的タイプのヒト腫瘍で不可能であることが多い。さらに、各患者の腫瘍からのワクチンの製造は非常に高価である。また、培養において自己由来細胞の継代培養を続けると、このような細胞の抗原性組成は、その細胞株が由来する初代腫瘍（primary tumor）に比べて変化し、細胞がワクチンとして有効でなくなる可能性がかなりある。このような変化は株化された全ての細胞株で避けられないが、自己由来細胞を腫瘍ワクチンとして使用するについては、このアプローチを用いて治療中の各患者の最初に単離したそれぞれの細胞株の凍結保存品を維持する必要があるだろう。自己由来およびＭＨＣがマッチする細胞を腫瘍ワクチンとして用いることに関連するこれらの欠点に基づいて、Jaffee et al.，Seminars in Oncology，22，8 1-91 (1995)で報告されているように、他の研究者らは代わりの腫瘍ワクチンを探究してきた。Huang et al.，Science, 264, 961-965（1994）の最近の結果はこの提案と関連がある。すなわち、この研究以前には、腫瘍ワクチンストラテジーは、ワクチン接種腫瘍細胞がそれらのＭＨＣクラスＩおよびII分子上で腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞（antigen presenting cell，ＡＰＣ）として機能し、免疫応答のＴ細胞武装を直接活性化するという理解に基づいていた。対照的に、Huang らの結果は、ワクチン接種腫瘍細胞ではなくむしろ宿主の専門的なＡＰＣが免疫応答のＴ細胞武装を準備することを示す。腫瘍ワクチン細胞はＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインを分泌し、腫瘍骨髄由来ＡＰＣの領域を補充する。骨髄由来ＡＰＣはプロセシングのために腫瘍の細胞蛋白質の全体を取り込み、次いでそのＭＨＣクラスＩおよびII分子上で抗原性ペプチドを提示する。このようにして、ＡＰＣは免疫系のＣＤ４⁺およびＣＤ８⁺Ｔ細胞の両方の武装を準備し、宿主腫瘍の抗原性エピトープに特異的な全身性抗腫瘍免疫応答を生じさせる。これらの結果は癌治療において自己由来またはＭＨＣがマッチする腫瘍細胞を用いる必要がないかもしれないことを示唆する。他の結果は同種異系ＭＨＣ遺伝子（すなわち、同じ種の遺伝子的に異なる個体からの遺伝子）の導入が腫瘍免疫原性を増強しうることを示唆する。詳細には、 Jaffee et al.，（前記）およびHuang et al.,（前記）で報告されているように、あるケースでは、同種異系ＭＨＣクラスＩ分子を発現する腫瘍の拒絶反応は、その後の修飾されていない親腫瘍の抗原投与に対して増強された全身性免疫応答を生じさせた。これは、Itaya et al.，Cancer Res., 47，3136-3140 (1987)により「異種発生（xenogenization）」として記載された一般的現象の例（腫瘍細胞に外来抗原をコードする遺伝子を導入することにより腫瘍ワクチンの力価が増強される）を示すと考えられる。従って、自己由来またはＭＨＣがマッチする腫瘍細胞の使用に依存しない、またそのような使用に関連する困難性や欠点を回避する癌の治療方法、特に膵臓癌の治療方法に対する要求が依然としてある。本発明はこのような方法、ならびに該方法を実施するために必要な構成要素を提供する。本発明のこれらのそして他の目的および利点は、更なる発明の特徴とともに本明細書に記載する発明の説明から明らかとなるであろう。発明の要旨本発明は、（ａ）腫瘍細胞株を得て、（ｂ）該腫瘍細胞株を、未修飾の腫瘍細胞株と比べて増加したレベルのサイトカインを産生することができるように修飾し、（ｃ）該腫瘍細胞株を得た腫瘍と同じタイプの腫瘍である少なくとも１つの腫瘍を有する哺乳類宿主に、該腫瘍細胞株を投与することを含む癌の治療方法を提供する。該腫瘍細胞株は該宿主と同種異系であり、かつＭＨＣがマッチしていない（not MHC-matched）。特に、本発明は同種異系膵臓腫瘍細胞株を用いる膵臓癌の治療方法を提供する。本発明はまた、膵臓腫瘍細胞株、かかる腫瘍細胞株を得るための方法および培地、ならびに精製された膵臓腫瘍細胞株の細胞を含有する組成物を提供する。好適な実施態様の説明本発明の癌の治療方法は、（ａ）腫瘍細胞株を得て、（ｂ）該腫瘍細胞株を、未修飾の腫瘍細胞株と比べて増加したレベルのサイトカインを産生することができるように修飾し、（ｃ）該腫瘍細胞株を得た腫瘍と同じタイプの腫瘍である少なくとも１つの腫瘍を有する哺乳類宿主に、該腫瘍細胞株を投与することを含む含む。投与された腫瘍細胞株は該宿主と同種異系であり、かつＭＨＣがマッチしていない。癌本発明の方法は癌治療に用いることができる。本発明において「癌の治療」とは、治療的応答を達成する目的で本明細書に記載する腫瘍細胞株を宿主に投与することを包含する。特に、治療的応答は腫瘍抗原に対する全身性免疫応答（すなわち、Ｔ細胞応答）である。このような応答は腫瘍増殖の減衰および／または腫瘍退縮をモニターすることにより評価することができる。「腫瘍増殖」は腫瘍の大きさおよび／または腫瘍の数の増加を包含する。「腫瘍退縮」は腫瘍質量の減少を包含する。本発明において「癌」は、異常な細胞増殖と接触阻止現象のないことを特徴とする癌、特に上皮由来の癌を包含し、このことは腫瘍形成により証明することができる。この語は腫瘍内に局在化する癌、および腫瘍内に局在化していない癌（例えば、腫瘍から浸潤により局所的に拡大した癌細胞）を包含する。従って、本発明による治療に関して、いかなるタイプの癌も標的にすることができる。例えば、このアプローチは好ましくは、切除した癌の局所アジュバント療法、および膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、直腸、および胃の癌腫（カルシノーマ）のような腫瘍増殖の局所コントロールを含めた幾つかの臨床計画に適用することができるが、これらに限定されるものではない。またこの方法は好ましくは、腫瘍が肉腫（例えば、繊維肉腫または横紋筋肉腫）、リンパ球系または骨髄系の造血腫瘍、または黒色腫、奇形癌腫（テラトカルシノーマ）、神経芽細胞腫、またはグリオームを含めた他の腫瘍（これらに限定されるものではない）であるとき治療に用いることができる。好ましくは本発明の方法は膵臓癌の治療に用いることができる。従って、本発明はまた、（ａ）膵臓腫瘍細胞株を得て、（ｂ）該腫瘍細胞株を、未修飾の腫瘍細胞株と比べて増加したレベルのサイトカインを産生することができるように修飾し、（ｃ）少なくとも１つの膵臓腫瘍を有する哺乳類宿主に、該腫瘍細胞株（該腫瘍細胞株は該宿主と同種異系であり、かつＭＨＣがマッチしていない）を投与することを含む膵臓癌の治療方法を提供する。この癌の治療方法は広範な種類の異なる宿主を用いて効果的に行うことができる。例えば、本方法は種々の真核生物宿主で行うことができるが、好ましくは、げっ歯類、サル、チンパンジー、ネコ、イヌ、有蹄類（例えば反芻動物またはブタ）、ならびに特にヒトの宿主を含めた哺乳類宿主（これらに限定されるものではない）で行うことができる。腫瘍細胞株本明細書に記載するように、「腫瘍細胞株」は腫瘍に元来由来する細胞を包含する。このような細胞は典型的には、インビボで何らかの変化を受けて、理論的に培養において無限増殖性を有する。すなわち、限られた時間の間だけ培養することができる初代細胞と異なる。さらに、このような細胞は好ましくは感受性動物に注射された後、腫瘍を形成することができる。本発明によれば、腫瘍細胞株はいかなる腫瘍由来であってもよく、例えば、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、直腸、および胃の癌腫（カルシノーマ）；リンパ球系または骨髄系の造血腫瘍；繊維肉腫または横紋筋肉腫のような間葉由来の腫瘍；または黒色腫、奇形癌腫（テラトカルシノーマ）、神経芽細胞腫、またはグリオームを含めた他の腫瘍が挙げられる。好ましくは腫瘍細胞株は膵臓腫瘍由来である。癌の治療方法において用いられる腫瘍細胞株はいかなる適当な手段によっても得ることができるが、好ましくは、（ａ）哺乳類宿主から腫瘍のサンプルを得て、（ｂ）該腫瘍サンプルから単細胞懸濁液を形成させ、（ｃ）該腫瘍細胞をペレットにし、（ｄ）該腫瘍細胞をプレーティングすることを含む一般的な方法で得る。より詳細には、腫瘍のサンプルは典型的に外科手術の時に得ることができる。腫瘍サンプルは続いて滅菌操作を用い、組織損傷を最小限にするようにして処理および操作する。組織サンプルを滅菌容器内の氷上に置き、クリーンベンチ(labor atory laminar flow hood)に移す。腫瘍細胞株の単離に用いる腫瘍の部分を小片に細切する。腫瘍の残りの部分は−７０℃で保存する。次いでコラゲナーゼＩの溶液を用いて、腫瘍の薄片を単細胞懸濁液に消化する。この消化は室温でまたは加温して行うことができる。好ましくは、消化は３７℃で混合物を振とうしながら、例えば振とうインキュベーター中で行う。次いで単細胞懸濁液をペレットにし、このペレットを少容量の組織培養培地に再懸濁することができる。再懸濁した細胞を培養における細胞の増殖に適当な組織培養培地に、約２×１０⁵腫瘍細胞／ｍｌの密度で播種することができる。好ましくは培地は、重炭酸塩緩衝系および種々のアミノ酸とビタミンを利用する培地のような、多くのタイプの細胞培養の増殖を維持するための広範な適用性を有するものである。最適には培地はＲＰＭＩ−１６４０培地である。培地は必要に応じて（例えば、腫瘍細胞の増殖に必要なとき、または未分化状態で腫瘍細胞を維持するのに必要なとき）、種々の追加の因子を含有してもよい。培養物は約５〜７％ＣＯ₂の存在下、約３５〜４０℃で維持することができる。腫瘍細胞培養物は必要に応じて、すなわち、典型的には１〜１０日毎に流加し再培養することができる。腫瘍細胞はまた、初代腫瘍培養物（primary tumorcul tures）以上に増殖し得る他の細胞（例えば、間質細胞）を除去するためにディファレンシャルトリプシナイゼーション（differential trypsinization）に付してもよい。好ましくは、そのようなディファレンシャルトリプシナイゼーションは約５〜１０日毎に行う。腫瘍細胞の実質的に純粋な培養物が得られたと考えられるとき、必要に応じて、培養物の相対純度を決定するために、また得られた腫瘍細胞株を特徴付けるために種々の試験を行うことができる。例えば、本明細書でさらに説明するような、細胞株中の特定の遺伝子配列の存在、または特定の表現型形質を調べることができる。腫瘍細胞株を単離する方法は、好ましくは、膵臓腫瘍細胞株を単離するために用いることができる。このような膵臓腫瘍細胞株は同様に、膵臓癌の治療方法に用いることができ、（ａ）哺乳類宿主から膵臓腫瘍のサンプルを得て、（ｂ）該腫瘍サンプルから単細胞懸濁液を形成させ、（ｃ）該腫瘍細胞をペレットにし、（ｄ）該腫瘍細胞をプレーティングすることにより得ることができる。従って、本発明は、実質的に精製された腫瘍細胞株、特に実質的に精製された膵臓腫瘍細胞株を提供する。望ましくは、単離工程の一部として、膵臓腫瘍細胞を、膵臓腫瘍細胞の培養に最適化された増殖培地にプレーティングする。好ましくは、この培地はＲＰＭＩ −１６４０培地である。最適にはこの培地はさらに胎児血清、インスリン、およびインスリン様増殖因子１および２を含有する。好ましくは胎児血清はウシ胎児血清であり、約５〜約３０％、より好ましくは約１０〜約２５％、最適には約20 ％の濃度で含有される。また、好ましくはインスリンはヒトインスリンであり、培地中に約０．０２〜約２．０Ｕ／ｍｌ、より好ましくは約０．１〜約１．０Ｕ／ｍｌ、最適には約０．２Ｕ／ｍｌの濃度で含有される。インスリン様増殖因子１および２はそれぞれ、好ましくは培地中に約０．００１〜約０．１μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．００５〜約０．０５μｇ／ｍｌ、最適には約０．０１μ ｇ／ｍｌの濃度で含有される。培地および培地成分は容易に入手可能であり、例えば、市販業者から得ることができる。そのような市販業者には、JRH Biosciences (Lenexa，KS)，Gibco BR L (Gaithersberg，MD)，Hyclone Labs．(Logan，UT)，Sigma Biosciences (St.L ouis，MO)，Cell Sys．Corp．(Kirkland，WA)，Intergen Co．(Purchase，NY),E li Lilly and Co.(Indianapolis,IN),Biofluids,Inc.(Rockville,MD)および同様の製品を製造する他の業者が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは腫瘍細胞株（望ましくは膵臓腫瘍細胞株である）は、腫瘍遺伝子または腫瘍抑制遺伝子中に変異を含み、腫瘍細胞株の腫瘍形成性、および宿主腫瘍からの由来を確認することができる。変異はtγk，ks3，hst，γas，myc，p53,m as，Rb1，DCC，MCC，NF1,およびWT1を含めた（これらに限定されるものではない）いかなる腫瘍遺伝子または腫瘍抑制遺伝子中で起こってもよい。最適には腫瘍細胞株はγas 変異を含む。好ましくは変異はH-γas，K-γas,およびN-γasのγ as遺伝子のうちの一つのコドン12，13または61に存在する。最適には変異はγas 遺伝子のコドン12、好ましくはK-γas 遺伝子のコドン12に存在する。 γas 変異により特徴付けられる腫瘍細胞株を用いることは、γas 遺伝子を腫瘍形成性にする変異が、例えばBos，（前記）およびBarbacid,（前記）により報告されているように既に特徴付けられているので有利である。これは、γas 腫瘍蛋白質を生じさせることが知られているアミノ酸の変換を組み入れたペプチドを容易に合成することができ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の標的として評価できることを意味する。これらのペプチドに対する宿主免疫応答はワクチン接種の前および後のどちらでも評価することができる。腫瘍細胞株（好ましくは膵臓細胞株）は、該腫瘍細胞を他の細胞から区別するさらなる性質によっても特徴付けることができ、例えば、インビトロまたはインビボにおける細胞生存をモニターするために用いることができる。そのような性質の例として、特定の蛋白質（望ましくは細胞表面蛋白質）に対する抗体染色が挙げられる。好ましくは、本発明の膵臓腫瘍細胞株は、サイトケラチンに対する抗体を用いる組織化学的染色を行ったとき、サイトケラチン染色を示す。従って、本発明は、Panc 4.14.93，Panc 1.28.94，Panc 6.3.94，Panc 8.13.94，Panc 9.6.94，Panc 12.1.94，Panc 2.3.95，Panc 4.3.95，Panc 4.21.95，Panc 5.4.9 5,および特にPanc 10.5.92を含めた好適な膵臓腫瘍細胞株を提供するが、これらに限定されるものではない。サイトカイン本発明の癌治療方法において、好ましくは、腫瘍細胞株（例えば、膵臓腫瘍細胞株）は未修飾の腫瘍細胞株、または修飾された腫瘍細胞株が由来する親腫瘍細胞株と比べて増加したレベルのサイトカインを産生することができるように修飾されている。「サイトカイン」は、この語が当業者に理解されているように、宿主に存在する腫瘍に対する宿主免疫系の応答性を増強するいかなる免疫強化蛋白質（糖蛋白のような修飾蛋白質を含む）でもよい。好ましくはサイトカインはそれ自体は宿主に対して免疫原性ではなく、免疫系の細胞の活性を活性化または増強することにより免疫を増強する。本明細書で用いるように、サイトカインはインターフェロン（例えば、ＩＦＮ α、ＩＦＮβ、およびＩＦＮγ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１１）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦαおよびＴＮＦβ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、マクロファージコロニー剌激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような蛋白質を包含する。好ましくはサイトカインはいかなる源からのＧＭ−ＣＳＦでもよく、最適にはサイトカインはマウスまたはヒトＧＭ −ＣＳＦである。本発明において腫瘍細胞株を「修飾する」とは、対象とするサイトカインの発現増加をもたらすことのできるベクターを腫瘍細胞株に与えることを含む。「ベクター」は、プラスミド、ウイルスまたは他のビヒクルのようなＤＮＡ分子を包含し、これは一またはそれ以上の異種または組換えＤＮＡ配列（例えば、機能的プロモーターおよびおそらくエンハンサーの制御下にある、対象とするサイトカイン遺伝子またはサイトカインをコードする配列）を含有し、この語が当業者に理解されているようにベクターとして機能し得るものである。適当なウイルスベクターとしては、シミアンウイルス４０、ウシパピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターまたは他のＤＮＡ配列に関して「組換え」というときは、天然から単離された際には通常結合していないＤＮＡ配列が結合していることを単に意味するだけである。「遺伝子」は蛋白質をコードするいかなる核酸配列でもよく、または初期ｍＲＮＡ分子である。遺伝子はコーディング配列に加えていかなる非コーディング配列（例えば、調節配列）を含んでいてもよいが、「コーディング配列」は非コーディングＤＮＡを含まない。「プロモーター」はＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによりＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である。「エンハンサー」は近傍の遺伝子の転写を剌激または阻害するＤＮＡのシス作動性エレメントである。転写を阻害するエンハンサーは「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーはどちらの方向にも、数キロ塩基対（ｋｂ）まで離れていても、さらに転写領域の下流に位置していても機能し得る点で、エンハンサーはプロモーターにのみ見つかる配列特異的ＤＮＡ結合蛋白質とのＤＮＡ結合部位（これは「プロモーターエレメント」とも呼ばれる）と異なる。真核生物腫瘍細胞、または特に哺乳類のような動物腫瘍細胞（例えば、ヒト腫瘍細胞）に核酸を導入するために適したいかなる適当なベクターも用いることができる。好ましくは、ベクターは腫瘍細胞と適合性であり、例えば、サイトカイン遺伝子またはコーディング配列の発現を付与することができるものであり、腫瘍細胞内で安定に維持されるか、相対的に安定に維持される。望ましくはベクターは複製の開始点を含む。好ましくはベクターはいわゆる「マーカー」機能も含み、該「マーカー」機能によりベクターを同定し選択することができる（例えば、抗生物質耐性遺伝子）。サイトカインコーディング配列が導入されるとき（すなわち、それ自体のプロモーターを有するサイトカイン遺伝子と対照的に）、最適にはベクターは、コーディング配列の発現を制御することができ、コーディング配列に機能的に連結するプロモーターも含有する。プロモーターがコーディング配列の転写を指示することができるとき、コーディング配列はプロモーターに「機能的に連結する」（例えば、コーディング配列とプロモーターの両方が一緒になって天然または組換えサイトカイン遺伝子を構成するとき）。本明細書で用いるように、サイトカイン「遺伝子」または「コーディング配列」は、該遺伝子またはコーディング配列が、サイトカインの特徴的な機能（すなわち、宿主免疫応答を刺激する能力）を有する蛋白質を発現させることができる、または該蛋白質内に発現されうるのであれば、天然から単離したか、または全合成もしくは部分合成したかにかかわらず、サイトカインのゲノミックまたはｃＤＮＡ配列、そのより大きい配列およびより小さい配列およびその変異体を包含する。これらは、遺伝子またはコーディング配列を修飾する手段は当分野でよく知られており、商業的に入手可能なキットを用いて行うこともできる（例えば、Ne w England Biolabs，Inc.，Beverly，MA; Clontech，PaloAlto，CA)。サイトカイン遺伝子またはコーディング配列は適当ないかなる源からのものでもよく、例えば、ヒトのようないかなる哺乳類種から単離されたものでもよい。しかしながら、好ましくは、サイトカイン遺伝子またはコーディング配列はＧＭ−ＣＳＦ配列を含有し、特にヒトまたはマウスＧＭ−ＣＳＦｃＤＮＡ配列を含めたヒトまたはマウスＧＭ−ＣＳＦ遺伝子またはコーディング配列を含有する（例えば、Ca ntrell et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci.，82，6250-6254 (1985)に記載）。本発明の組換えベクターにおいて、好ましくはすべての適切な転写、翻訳およびプロセシングシグナル（例えば、スプライシングおよびポリアデニレーションシグナル）は、サイトカイン遺伝子またはコーディング配列がそれが導入された腫瘍細胞内で適切に転写および翻訳されるように、ベクター上に正しく配置されている。宿主細胞内での適切な発現を確実にするためのこのようなシグナルの操作は、当業者の知識および技術の範囲でよく知られている。サイトカイン遺伝子はそれ自体のプロモーターにより制御される（すなわち、機能的に連結する）が、別のプロモーター（構成的プロモーターを含む）、例えば、アデノウイルスタイプ２（Ａｄ２）またはタイプ５（Ａｄ５）主要後期プロモーター（ＭＬＰ）および三分リーダー（tripartite leader）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター／エンハンサー、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列（ＲＳＶ− ＬＴＲ）、およびその他のものをサイトカインコーディング配列の発現を命令するために用いることもできる。あるいは、組織特異的プロモーター（すなわち、所定の組織で優先的に活性化され、その活性化が起こった組織内で結果として遺伝子産物を発現するプロモータ−）をベクター中に用いることができる。そのようなプロモーターとしては、膵臓腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Swift et al.，Cell，38 ,639-646 (1984)およびMacDonald，Hepatology，7, 425-515，(1987)に記載）；膵臓β細胞で活性なインスリン遺伝子調節領域（Hanahan，Nature，315, 115-12 2 (1985)に記載）；アルブミンまたはα₁−アンチトリプシンの肝細胞特異的プロモーター（Frain et al.，Mol ．Cell．Biol.，10，991-999 (1990)およびCili berto et al.，Ce11，41，531-540 (1985)に記載）；および共に肝臓で活性なアルブミンおよびα₁−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Pinkert et al.,Genes and Devel. ，1, 268-276（1987）およびKelsey et al.，Genes andDevel.，1, 1 61-171 （1987）に記載）が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、結腸癌腫（カルシノーマ）に対する癌胎児性抗原（Schrewe et al.,M ol.Cell Biol., 10, 2738-2748(1990)に記載）のような腫瘍特異的プロモーターをベクター中に用いることができる。同じ系統の中で、異なる発生段階で選択的に活性化されるプロモーター（例えば、グロビン遺伝子は胎児と成人では異なって転写される）を特定のタイプの癌の遺伝子治療に用いることができる。別の選択肢は、ＩＬ−８プロモーター（ＴＮＦに対して応答性である）、または６−１６プロモーター（インターフェロンに対して応答性である）のような誘導性プロモーターを用いることであり、あるいは宿主に存在するかまたは外来的に投与することのできる、他のサイトカインまたは他の因子に応答性である他の同様のプロモーターを用いることである。サイトカイン誘導性プロモーターを使用することはサイトカイン遺伝子の自己誘導性発現を可能にするというさらなる利点がある。本発明によれば、所望の結合能とプロモーター強度を有する限り、どのようなプロモーターも突然変異誘発により変化させることができる。従って、本発明は、上記で定義するようなサイトカインをコードする核酸配列を含有し、本発明の癌治療方法で使用することのできるベクターを提供する。特に、本発明はＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列を含有する組換えベクターを提供する。よって、好ましくは、本発明はｐｃＤＮＡ１／Ｎｅｏと呼ばれるベクターを提供する。これは本明細書でさらに説明する。本発明の方法において、インビトロで細胞（好ましくは株化された腫瘍細胞株の細胞であり、特に膵臓腫瘍細胞株である）にサイトカイン遺伝子またはコーディング配列を導入するために組換えベクターを使用することができる。インビトロで細胞にベクターを運ぶために種々の方法を使用することができる。例えば、そのような方法としては、エレクトロポレーション、リポソームを用いる膜融合、ＤＮＡでコーティングしたマイクロプロジェクタイルを用いる高速発砲法、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、修飾ウイルス核酸を用いるインフェクション、単細胞への直接マイクロインジェクションなどが挙げられる。他の方法も利用可能であり、当業者に知られている。このように、本発明は、未修飾の腫瘍細胞株と比べて増加したレベルのサイトカイン（好ましくはＧＭ−ＣＳＦ）を産生することができるように修飾されている、実質的に精製された腫瘍細胞株を提供する。修飾された腫瘍細胞により産生されたサイトカインのレベルは、免疫剌激応答を得る目的で本発明に関して重要である。好ましくは、修飾された（例えば、トランスフェクトされたまたは形質転換された）腫瘍細胞株は、未修飾の（すなわち、親の）腫瘍細胞株で観察されるサイトカインのレベルより増加したレベルのサイトカインを産生する。より好ましくは、修飾された細胞株は３５ｎｇ／10⁶ 細胞／２４時間より多いサイトカイン分泌を生じさせるレベルのサイトカインを産生する。修飾された腫瘍細胞株の投与哺乳類宿主への腫瘍細胞株の修飾された細胞の「投与」とは、修飾された（すなわち、サイトカイン産生性）腫瘍細胞を宿主に実際に物理的に導入することをいう。修飾された腫瘍細胞株を宿主に導入する、いかなるそして全ての方法を本発明では意図している。該方法はいかなる特定の導入手段に依存するものではなく、またそのように解釈すべきではない。導入手段は当業者によく知られており、本明細書においても例示されている。好ましくは、修飾された腫瘍細胞株は、該細胞株を得た腫瘍と同じタイプの腫瘍である少なくとも１つの腫瘍を有する宿主（すなわち、該宿主はそれ以上の腫瘍を有していてもよい）に投与される。「同じタイプの腫瘍」とは、組織学的に類似の、すなわち、治療すべき組織／器官の構造および性質の点で類似の腫瘍を包含する。投与された腫瘍細胞株は宿主腫瘍と共通する幾つかの抗原（例えば、腫瘍抗原またはＭＨＣ抗原）を有しうると予想されるが、本発明の目的の為に、投与された腫瘍細胞と宿主腫瘍とは共通のＭＨＣ抗原を有する必要はない。同様に、投与された腫瘍細胞株と宿主腫瘍の間で腫瘍抗原が異なっていてもよく、腫瘍細胞株の投与が宿主腫瘍に対する全身性（すなわち、Ｔ細胞媒介）応答をもたらすことができるのに十分な共通性があることが好ましい。従って、本発明は宿主に対して同種異系の（すなわち、遺伝子的に異なる）、宿主とＭＨＣがマッチしていない腫瘍細胞株の投与を包含する。本発明によれば、腫瘍細胞株が宿主と共通のＭＨＣ抗原をいずれも共有していないとき、または腫瘍細胞ワクチンを用いるときに典型的にＭＨＣがマッチするＭＨＣ抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩ抗原、特にＨＬＡ−Ａ２）のいずれも宿主と共有していないとき、腫瘍細胞株は宿主と「ＭＨＣがマッチしていない（not MHC-matched）」ということである。本発明はインビボにおける腫瘍へのサイトカインのパラクリン送達を行うので、好ましくは、遺伝子的に修飾された腫瘍細胞株（例えば、修飾された膵臓腫瘍細胞株）は治療すべき腫瘍のごく近傍に投与される。「ごく近傍」とは、修飾された腫瘍細胞により放出されるサイトカインが宿主細胞腫瘍に治療的効果を及ぼすことができるような距離を意味する。最適には、修飾された腫瘍細胞株は腫瘍自体には直接注射しない。また、好ましくは、修飾された腫瘍細胞株（例えば、修飾された膵臓腫瘍細胞株）を、投与の前に細胞複製およびインビボにおける腫瘍形成の可能性を防止するために放射線照射する。腫瘍細胞を放射線照射するには、通常、腫瘍細胞を組織培養プレートにプレーティングし、¹³⁷Ｃｓ源を用いて室温で照射する。好ましくは、細胞を約５０〜約２００ｒａｄ／分、より好ましくは約１２０〜約140 ｒａｄ／分の線量速度で照射する。好ましくは、大部分の細胞、すなわち好ましくは約１００％の細胞のインビトロにおける増殖を阻害するのに十分な総線量を細胞に照射する。よって、望ましくは、約１０，０００〜２０，０００ｒａｄ、最適には約１５，０００ｒａｄの総線量を細胞に照射する。さらに、修飾された腫瘍細胞株（例えば、トランスフェクトされた膵臓腫瘍細胞株）は、最適には免疫原性を増強するために投与の前に処理される。好ましくは、この処理は、本明細書で説明するように、さらに遺伝子操作、例えば、他のサイトカインまたは免疫共同刺激機能を導入するような遺伝子操作、または例えば、フロイント完全または不完全アジュバント、細菌およびマイコバクテリアの細胞壁成分を含有するエマルジョンなどを含めた非特異的アジュバント（これらに限定されるものではない）との混合を含む。使用方法同種異系腫瘍細胞株、特に同種異系膵臓腫瘍細胞株を、患者自身の腫瘍に対する全身性抗腫瘍免疫応答を生じさせる目的で、組織学的に類似の腫瘍を有する患者にワクチン接種するために用いることができる。投与を容易にするために、修飾された同種異系腫瘍細胞株（すなわち、修飾された同種異系膵臓腫瘍細胞株）を、適当なそして医薬的に許容しうる担体または希釈剤と共にインビボ投与に適した医薬組成物または移植片（インプラント）に製造することができる。このような組成物または移植片（インプラント）を製造する手段は当分野で知られている（例えば、Remington's Pharmaceutical Scien ces ，第16版，Mack編，(1980)参照）。適当な場合、腫瘍細胞株は錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、座剤、注射剤、吸入剤、またはエアロゾル剤のような固体、半固体、液体または気体状の製剤に、それぞれの投与経路用の通常の方法で製剤化することができる。標的組織または器官に到達するまで組成物の放出および吸収を防止または最小限にするために、あるいは組成物の時間が定められた放出を確実にするために当分野で公知の手段を利用することができる。しかしながら、好ましくは、本発明の組成物の効果をなくさない医薬的に許容される形態を用いる。従って、望ましくは、修飾された同種異系腫瘍細胞株（すなわち、修飾された同種異系膵臓腫瘍細胞株）は、平衡塩類溶液、好ましくはハンクスの平衡塩類溶液を含有する医薬組成物に製造することができる。従って、本発明は医薬的に許容される担体および腫瘍細胞株を含有する医薬組成物を提供する。好ましくは、本発明は医薬的に許容される担体および膵臓腫瘍細胞株、詳細には該腫瘍細胞株がPanc 10.5.92であり、特にPanc 10.5.92のような、腫瘍細胞株が増加したレベルのサイトカイン（最適にはＧＭ−ＣＳＦ）を産生するように修飾されている腫瘍細胞株を含有する医薬組成物を提供する。医薬投与形態において、組成物は単独でまたは適当な組み合わせで、ならびに他の医薬的に活性な化合物および治療方法と組み合わせて用いることができる。例えば、癌の治療（特に膵臓癌の治療）に本発明の方法を適用する場合、このような治療は他の癌（特に膵臓癌）の治療手段（例えば、外科的切除、放射線照射、化学療法など）と組み合わせて用いることができる。本発明の医薬組成物は、特定の効果を達成するために種々の経路により、また哺乳類（特にヒト）の体の種々の部位に送達することができる。一以上の経路を投与に用いることができるが、ある特定の経路が別の経路よりも迅速かつ効果的な反応を与えることが当業者には理解されるであろう。局所または全身送達は、体腔への製剤の適用または滴注、エアロゾルの吸入または通気を含む投与により、あるいは筋肉内、静脈内、門脈内、肝臓内、腹腔内、皮下、または皮内投与を含む非経口導入により行うことができる。好ましくは送達は皮内投与により行うことができる。本発明の組成物は、単独でまたは他の活性薬剤との適当な組み合わせで、各投与単位（例えば、茶さじ１杯、錠剤、液剤、または座剤）が所定量の組成物を含む単位投与形態で提供することができる。本明細書で用いる「単位投与形態」という語は、ヒトおよび動物の患者にとって単回投与形態として適当な物理的に分離した単位をいい、各単位は所望の効果を生じさせるのに十分な量として算出された所定量の本発明の組成物を、単独でまたは他の活性薬剤と組み合わせて、適当な場合、医薬的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクルと共に含有する。本発明の新規な単位投与形態の詳細については、特定の宿主における医薬組成物に関連する特定の薬力学により決定される。好ましくは、本明細書でさらに説明するように、組成物中に十分な数の修飾された腫瘍細胞が存在し、宿主細胞によりサイトカインが発現されるように宿主内に導入され、続く腫瘍部位へのＡＰＣの補充により、残存する宿主腫瘍に対してこのような治療を行わないときに比べてより大きい免疫応答が生じる。従って、投与される宿主細胞の量は、投与経路を考慮に入れなければならないし、所望の治療（すなわち、免疫強化）応答を達成するために十分な数の腫瘍細胞が導入されるようにしなければならない。さらに、本明細書に記載する組成物に含有される各活性薬剤の量（例えば、各細胞当たりの接触する量、またはある体重当たりの量）は適用ごとに異なる。一般に、修飾された腫瘍細胞の濃度は好ましくは少なくとも約１×１０⁶〜約１×１０⁹腫瘍細胞、より好ましくは１×１０⁷〜約５ ×１０⁸腫瘍細胞を提供すれば十分であるが、より多い、例えば５×１０⁸細胞より多い、またはより少ない、例えば１×１０⁷細胞より少ない適当な量を利用することもできる。これらの値は、本発明を実施するために本発明の方法を最適化した後に、実施者により利用される各成分の範囲の一般的なガイダンスを与えるものである。本明細書に記載するそのような範囲は、特定の適用において正当だと認められるであろうように、成分のより多いまたはより少ない量の使用を排除するものではない。例えば、実際の投与量および投与スケジュールは、組成物が他の医薬組成物と組み合わせて投与されるかにより、または個人間の薬物動態、薬物素質、および代謝の相違により変わり得る。当業者は特定の状況における必要性に従って必要な調整を容易に行うことができる。さらに、組成物の有効量は癌細胞（特に膵臓癌細胞）の増殖を阻害することが知られている他の化合物との類似性によりさらに概算することができる。当業者はまた、本発明の組成物を投与したときに治療的（すなわち、全身性免疫）応答をモニターするための手段を知っている。特に、治療的応答は腫瘍増殖の減衰および／または腫瘍退縮をモニターすることにより評価することができる。治療に対する応答における腫瘍増殖の減衰または腫瘍退縮は、当業者に知られている幾つかのエンドポイント法（例えば、腫瘍の数、腫瘍質量または大きさ、または転移の減少／予防を含む）を用いてモニターすることができる。記載したこれらの方法は包括的なものではなく、特定の適用に適したさらなる方法が当業者には明らかであろう。実施例以下の実施例は本発明をさらに説明するものであり、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでないことは言うまでもない。実施例１この実施例は、本発明の同種異系腫瘍細胞株を得て培養する方法を説明する。１１の同種異系膵臓腫瘍細胞株をジョンズホプキンス病院で膵十二指腸切除を受けた患者から発生させた。これらの細胞株は、外科切除時に得た新鮮なヒト膵臓腫瘍外植片から発生した。すなわち、腫瘍切除のとき速やかに、検体を滅菌容器内の氷上に置き、実験室内の組織培養クリーンベンチ（laminar flow tissuec ulture hood）に移した。以後の全ての操作は標準的な滅菌組織培養技術を用い、種々の市販業者（例えば、JRH Biosciences (Lenexa，KS)，Gibco BRL(Gaithe rsberg，MD)，Hyclone Labs．(Logan，UT)，Sigma Biosciences (St．Louis，MO ),Cell Sys．Corp．(Kirkland，WA)，Intergen Co．(Purchase，NY)，Eli Lilly and Co．(Indianapolis，IN)，Biofluids，Inc．（Rockville，MD）および同様の製品を製造する業者）からの培地および試薬を用いて行った。腫瘍細胞株の単離に用いられる腫瘍の部分を、直径約数ミリメートルの大きさの小片に細切した。この小片を約１５ｍｇのコラゲナーゼＩを含有する溶液中に入れ、振とうインキュベーター中で３７℃にて単細胞懸濁液に消化した。次いで、膵臓腫瘍細胞懸濁液を重力遠心分離に５分間付し、細胞をペレットにした。このペレットを再懸濁し、２５ｃｍ²組織培養フラスコ中の２０％ウシ胎児血清、培地５００ｍｌ当たり１００単位（Ｕ）のヒトインスリン、および培地５００ｍｌ当たりそれぞれ５μｇのインスリン様増殖因子１および２を含有するＲＰＭＩ− １６４０培地に約１〜２×１０⁶個の生存細胞を播種することによりプレーティングした。培養物を２５ｃｍ²組織培養フラスコに入れ、約５〜７％ＣＯ₂の加湿インキュベーター内で約３７℃にてインキュベートした。初代細胞培養物を、５〜１０日毎にディファレンシャルトリプシナイゼーションに付し、初代膵臓腫瘍培養物以上に繰り返して増殖する間質細胞の大部分を除去した。得られた腫瘍細胞株を特徴付けるため、ならびに間質細胞および非悪性上皮細胞と比較して悪性上皮細胞の存在を評価するために幾つかの試験を用いた。すなわち、間葉由来の細胞から上皮由来の細胞を区別するために、サイトケラチンに対する抗体を用いる組織化学的染色を行った。得られた１１の腫瘍細胞株の全てを、主としてあるいはもっぱら上皮細胞のみに含まれるサイトケラチン染色により特徴付けた。これを表１に示す。表１．膵臓細胞株のサイトケラチン染色 ^*サイトケラチン７および１８また、発生した全ての腫瘍細胞株を、細胞株の起源が悪性であること、ならびに培養における細胞株の遺伝子安定性を実証するために、インビトロ培養の前に元の腫瘍検体で観察されるのと同じγas 変異を維持しているかを評価した。表１に示すように、これらの全ての株は、腫瘍細胞株が由来する元の腫瘍と同一の γas 変異を有することが確認された。腫瘍細胞株に存在するコドン１２変異はコードされたRas 腫瘍蛋白質にＡｓｐ→Ｇｌｙ変換を生じさせ、コドン１３修飾はＳｅｒ→Ｇｌｙ変換を生じさせる。さらに、全ての腫瘍細胞株は高レベルのＭＨＣクラスＩ抗原を発現することが観察された。４つの株のうち２つ（すなわち、Panc 10.5.92およびPanc 9.6.94）はまた、上昇したレベルのＭＨＣクラスII 抗原を発現する。膵臓腫瘍細胞株は培養で容易に増殖させることができ、倍加時間は約７２時間である。この実施例で用いた同種異系膵臓腫瘍細胞株を誘導する方法は、他の種類の同種異系腫瘍細胞株の発生および単離に同様に用いることができる。実施例２この実施例は、本発明の同種異系腫瘍細胞株を、増加した量のサイトカインを産生するように修飾する方法を説明する。サイトカイン顆粒球−クロファージコロニー剌激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、前臨床腫瘍モデルにおいて全身性抗腫瘍応答を生じさせることが他のサイトカインに比べて潜在的により強力なので（Dran off et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci.，90，3539-3542 (1993)）、実施例１に記載したPanc細胞株 10.5.92を同種異系腫瘍細胞株の代表例として使用し、ＧＭ− ＣＳＦを分泌するように修飾した。これを行うために、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をｐｃＤＮＡ１／Ｎｅｏにクローニングした。全てのクローニング反応およびＤＮＡ操作は当業者によく知られた方法を用いて行い、これは、例えば、Maniatis et al.，MolecularClon ing ：A Laboratory Manual ，第２版，（Cold Spring Harbor Laboratory，NY,( 1982)）に記載されている。これらの反応に用いられる酵素は市販業者（例えば、New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA; Clontech，Palo Alto，CA; Boehr in ger Mannheim，Inc.，Indianapolis，INなど）から得て、製造業者の推奨に従って用いた。プラスミドｐｃＤＮＡ１／Ｎｅｏは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下でヒトＧＭ−ＣＳＦサイトカインをコードする配列、および別のＣＭＶプロモーターによって同じく制御されるネオマイシン耐性遺伝子を含有する。ＣＭＶプロモーターは、大部分の真核細胞で相対的に高レベルの遺伝子発現を制御することができるので使用した（Boshart et al.，Cell，41，521-530( 1985)）。ヒト黒色腫細胞株に遺伝子を導入するためにこのベクターを用いる初期研究により、続くネオマイシン耐性に対する選択の後、３５ｎｇ／１０⁶細胞／２４時間より多いＧＭ−ＣＳＦの分泌レベルが達成されたことが確認される。これらの初期研究はｐｃＤＮＡ１／Ｎｅｏプラスミドが機能することを示す。さらに、これはマウスモデルにおいて適当な抗腫瘍免疫応答を生じさせるのに必要なＧＭ−ＣＳＦの量である。すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を担持するレトロウイルスベクターが形質導入された、またはされていない腫瘍細胞を種々の濃度で用いる希釈実験により、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍系において、３５ｎｇ／１０⁶細胞／２４時間より少ないＧＭ−ＣＳＦ分泌は、この閾値を越えるレベルの分泌で見られる強力な抗腫瘍免疫を生じさせることができないことが確認される。これらの知見は、関連する腫瘍抗原の源であるワクチン接種腫瘍細胞の部位に、直接、高い持続したレベルのＧＭ−ＣＳＦを送達することの重要性を強調する。 Panc株10.5.92にｐｃＤＮＡ１／Ｎｅｏをエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、続いて限界希釈法によりクローニングした。ＧＭ−ＣＳＦレベルをＥＬＩＳＡにより測定し、ＧＭ−ＣＳＦ依存性ＴＦ−１細胞を用いるバイオアッセイ（Kitamura et al.，Blood, 73，375-380 (1989)）により確認した。得られたトランスフェクトされた膵臓腫瘍細胞株で観察されたＧＭ−ＣＳＦ分泌レベルは約９０ｎｇ／１０⁶腫瘍細胞／２４時間である。トランスフェクトされた腫瘍細胞の放射線照射は、該細胞の複製を防止するが、該細胞がＧＭ−ＣＳＦを分泌し、培養において１週間まで代謝活性を維持することはできる。放射線照射は¹³⁷Ｃｓ源を用いて約１２０〜１４０ｒａｄ／分の線量速度で行い、約１５，０００ｒａｄの総線量を照射する。この実施例で用いた方法は、増加した量のサイトカインを産生することができる他の腫瘍細胞株を生じさせるのにも用いることができ、該腫瘍細胞株は同様にワクチンとして用いることができる。実施例３この実施例は、宿主へのＧＭ−ＣＳＦ投与に関するさらなる研究を説明する。さらなる研究により、ＧＭ−ＣＳＦ分泌がこのサイトカインの公知のパラクリン生理学に一致する必要があることが確認される。特に、前記の実施例で説明したように、分泌は関連する抗原（すなわち、腫瘍細胞）の部位で行われなければならず、高レベルが数日間にわたり維持されなければならない（Dranoff et al. ,（前記）；Golumbek et al.，Cancer Research, 53，1-4(1993)）。しかしながら、腫瘍細胞自体がＧＭ−ＣＳＦ分泌の源である必要はない(Golumbek et al.,( 前記))。レトロウイルス的に形質導入されたサイトカイン発現腫瘍細胞に見られるのと同様の免疫学的防御および組織学的浸潤が、腫瘍細胞と共に注射された生分解性ポリマーからＧＭ−ＣＳＦが徐々に放出されるときに起こりうる。また、第二の非交差反応腫瘍をＧＭ−ＣＳＦ分泌腫瘍と共に注射すれば、両方の腫瘍に対する免疫学的防御を生じさせることができる。しかしながら、単に腫瘍細胞と共に可溶性ＧＭ−ＣＳＦを注射することは、このサイトカインの持続した局所的レベルを与えないし、全身性免疫を生じさせない(Golumbek et al.，(前記))。従って、インビボにおけるサイトカインの送達に、宿主細胞とＭＨＣがマッチしない同種異系腫瘍細胞を用いることの有効性を調べた。マウスモデルでは、傍観者である同種異系腫瘍細胞によるＧＭ−ＣＳＦの送達によって生じる抗腫瘍免疫が、標的腫瘍細胞自体によりＧＭ−ＣＳＦが送達されるときに達成される抗腫瘍免疫に匹敵することが実証された。詳細には、これらの実験では、放射線照射したＣＴ２６結腸癌腫（カルシノーマ）細胞を、レトロウイルス的に形質導入されたＣＴ２６細胞により、あるいはレトロウイルス的に形質導入されたＢ１６−Ｆ１０細胞により送達されるＧＭ−ＣＳＦと共にＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下投与でワクチン接種した。２週間後、マウスに野性型株ＣＴ２６を注射により再度抗原投与した。このＣＴ２６腫瘍細胞株は何らかの内因性免疫原性を有する。しかしながら、ワクチン接種部位でＧＭ−ＣＳＦが分泌されたとき、同系のまたは同種異系の腫瘍のいずれによっても高い程度の防御がみとめられた。どの程度までか、あるいはどの機構によるかは明らかでないが、同種異系腫瘍細胞は抗腫瘍免疫を増強することができ、これらのデータはＧＭ−ＣＳＦの同種異系送達が少なくとも自己由来腫瘍送達と同じぐらい有効である可能性を強く示唆する。実施例４この実施例は、本発明の遺伝子的に修飾された同種異系腫瘍細胞株を宿主に投与することによる癌の治療方法を説明する。３５ｎｇ／１０⁶腫瘍細胞／２４時間より多いレベルのＧＭ−ＣＳＦを分泌する腫瘍細胞株を得て使用する。修飾された腫瘍細胞をトリプシン処理により組織培養フラスコから回収する。細胞を通常の生理食塩水を用いて洗浄し、ペレットにし、ハンクスの平衡塩類溶液、またはインビボに導入するために適当な他の塩溶液に再懸濁する。細胞は約１×１０⁷〜約１×１０¹⁰腫瘍細胞／ｍｌの濃度、最適には約１×１０⁸〜約５×１０⁹腫瘍細胞／ｍｌの濃度で再懸濁する。この再懸濁混合物の約０．１ｍｌをワクチンとして使用する。従って、好ましくは約１ ×１０⁶〜約１×１０⁹腫瘍細胞を注射し、そして最適には約１×１０⁷〜約５× １０⁸腫瘍細胞を全体として注射する。マウスでは修飾された腫瘍細胞を皮下注射するが、ヒトでは好ましくは細胞を皮内注射する。注射は好ましくは腫瘍の近傍にする。最適にはワクチンを腫瘍自体には直接注射しない。また、ヒトにおけるワクチン接種で用いる腫瘍細胞の量は、マウスにおけるワクチン接種で用いる量のおおよそ約１０倍以上である。修飾された腫瘍細胞のインビボでの複製を防ぐために、注射の前に修飾された腫瘍細胞を、例えば、実施例２に記載するように¹³⁷Ｃｓ源を用いて放射線照射することができる。修飾された腫瘍細胞はまた、その免疫原性を増強するように改変することができる。例えば、細胞をさらに遺伝子操作することができ（例えば、他のサイトカインまたは免疫刺激核酸配列を挿入することにより）、あるいは細胞を非特異的アジュバント（例えば、フロイント完全または不完全アジュバント、細菌およびマイコバクテリアの細胞壁成分を含有するエマルジョンなど）と混合することができる。本発明は種々の腫瘍、例えば、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、直腸、または胃の癌腫（カルシノーマ）；リンパ球系または骨髄系の造血腫瘍;繊維肉腫または横紋筋肉腫のような間葉由来の腫瘍；または黒色腫、奇形癌腫（テラトカルシノーマ）、神経芽細胞腫、またはグリオームを含めた他の腫瘍を有する哺乳類、特にヒトに用いることができる。好ましくは、本発明は膵臓癌の治療に用いることができる。また、患者は、本明細書で説明するような免疫療法の前、または免疫療法に加えて（すなわち、同時にまたは直後に続いて）、無制限数の癌治療用の方法（例えば、外科的切除、放射線照射、化学療法など）で治療し得ることが予想される。本明細書において明記した全ての文献（特許、特許出願、および刊行物を含む）は、言及したことで、その全体が本明細書に組み入れられるものである。好適な実施態様を強調して本発明を説明したが、当業者には好適な実施態様を変更しうることができ、本発明は、本明細書で特に説明した以外でも実施できることを意図していることが明らかであろう。従って、以下の請求の範囲により定義される発明の精神および範囲内に包含される全ての変形を本発明は包含する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年１月９日（１９９８．１．９）【補正内容】請求の範囲１．（補正後）初代腫瘍に由来しており、未修飾の腫瘍細胞株と比べて増加したレベルのサイトカインを産生するように修飾されている腫瘍細胞株を哺乳類宿主に投与することを含む哺乳類宿主の癌の治療方法であって、該哺乳類宿主は、該腫瘍細胞株が由来する腫瘍と同じタイプの腫瘍を少なくとも１つ有し、該腫瘍細胞株は該宿主と同種異系であり、かつＭＨＣがマッチしておらず(not MHC-match ed)、該腫瘍細胞株の該宿主への投与は該宿主の癌を治療する、癌の治療方法。２．（補正後）（ａ）哺乳類宿主からの初代腫瘍から腫瘍細胞のサンプルを得て、（ｂ）該腫瘍細胞のサンプルから単細胞懸濁液を形成させ、（ｃ）該腫瘍細胞をペレットにし、（ｄ）該腫瘍細胞をプレーティングすることにより、該腫瘍細胞株を初代腫瘍から由来して得る請求の範囲１記載の方法。３．（補正後）初代膵臓腫瘍に由来しており、未修飾の膵臓腫瘍細胞株と比べて増加したレベルのサイトカインを産生するように修飾されている膵臓腫瘍細胞株を哺乳類宿主に投与することを含む哺乳類宿主の膵臓癌の治療方法であって、該啼乳類宿主は、該腫瘍細胞株が由来する腫瘍と同じタイプの腫瘍を少なくとも１つ有し、該腫瘍細胞株は該宿主と同種異系であり、かつＭＨＣがマッチしておらず、該腫瘍細胞株の該宿主への投与は該宿主の癌を治療する、膵臓癌め治療方法。４．（補正後）（ａ）哺乳類宿主からの初代膵臓腫瘍から腫瘍細胞のサンプルを得て、（ｂ）該腫瘍細胞のサンプルから単細胞懸濁液を形成させ、（ｃ）該腫瘍細胞をペレットにし、（ｄ）該腫瘍細胞をプレーティングすることにより、該膵臓腫瘍細胞株を初代膵臓腫瘍から由来して得る請求の範囲３記載の方法。５．（補正後）該腫瘍細胞株が由来する少なくとも１つの腫瘍のごく近傍で、該腫瘍細胞株を該哺乳類宿主に投与する請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の方法。６．（補正後）該腫瘍細胞株を投与の前に放射線照射する請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の方法。７．（補正後）該腫瘍細胞株を、免疫原性を増強するために投与の前に処理する請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の方法。８．（補正後）該腫瘍細胞株を、遺伝子操作により、または非特異的アジュバントとの混合により処理する請求の範囲７記載の方法。９．（補正後）該腫瘍細胞株が腫瘍遺伝子または腫瘍抑制遺伝子中に変異を含む請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の方法。１０．（補正後）該変異がγas 遺伝子中にある請求の範囲９記載の方法。１１．（補正後）該サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の方法。１２．（補正後）初代膵臓腫瘍に由来し、実質的に精製された膵臓腫瘍細胞株。１３．（補正後）該腫瘍細胞株が、未修飾の腫瘍細胞株と比べて増加したレベルのサイトカインを産生するように修飾されている請求の範囲１２記載の腫瘍細胞株。１４．（補正後）該サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである請求の範囲１３記載の腫瘍細胞株。１５．（補正後）該腫瘍細胞株が、H-γas，K-γasまたはN-γas のコドン１２、１３または６１に変異を含み、細胞表面サイトケラチン、高レベルのＭＨＣクラスＩ抗原および上昇したレベルのＭＨＣクラスII抗原を発現する請求の範囲１３記載の腫瘍細胞株。１６．（補正後）医薬的に許容される担体および請求の範囲１２〜１５のいずれか１項に記載の腫瘍細胞株の細胞を含有する医薬組成物。１７．（補正後）（ａ）哺乳類宿主からの初代膵臓腫瘍から腫瘍細胞のサンプルを得て、（ｂ）該腫瘍細胞のサンプルから単細胞懸濁液を形成させ、（ｃ）該腫瘍細胞をペレットにし、（ｄ）該腫瘍細胞を、胎児血清、インスリン、およびインスリン様増殖因子１および２を含有する増殖培地にプレーティングすることを含む、請求の範囲１２記載の腫瘍細胞株を得る方法。１８．（補正後）該培地がインスリンを約０．１〜約１．０Ｕ／ｍｌの濃度で、インスリン様増殖因子１を約０．００５〜約０．０５μｇ／ｍｌの濃度で、およびインスリン様増殖因子２を約０．００５〜約０．０５μｇ／ｍｌの濃度で含有する請求の範囲１７記載の方法。１９．（補正後）インスリンを約０．１〜約１．０Ｕ／ｍｌの濃度で、インスリン様増殖因子１を約０．００５〜約０．０５μｇ／ｍｌの濃度で、およびインスリン様増殖因子２を約０．００５〜約０．０５μｇ／ｍｌの濃度で含有する初代膵臓腫瘍細胞の培養用増殖培地。２０．（削除）２１．（削除）２２．（削除）２３．（削除）２４．（削除）２５．（削除）２６．（削除）２７．（削除）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者パードル、ドリューエム. アメリカ合衆国、メリーランド州 20833、ブルックヴィル、ジェームズクリークコート、19400 (72)発明者ルヴィッスキー、ハイアムアイ. アメリカ合衆国、メリーランド州 21117、オウイングズミルズ、ウォータースパウトコート、12624

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）腫瘍細胞株を得て、（ｂ）該腫瘍細胞株を、未修飾の腫瘍細胞株と比べて増加したレベルのサイトカインを産生することができるように修飾し、（ｃ）該腫瘍細胞株を得た腫瘍と同じタイプの腫瘍である少なくとも１つの腫瘍を有する哺乳類宿主に、該腫瘍細胞株（該腫瘍細胞株は該宿主と同種異系であり、かつＭＨＣがマッチしていない（not MHC-matched））を投与することを含む癌の治療方法。２．該腫瘍細胞株を該腫瘍のごく近傍に投与する請求の範囲１記載の方法。３．該腫瘍細胞株を投与の前に放射線照射する請求の範囲１記載の方法。４．該腫瘍細胞株を、免疫原性を増強するために投与の前に処理する請求の範囲１記載の方法。５．該処理が遺伝子操作または非特異的アジュバントとの混合を含む請求の範囲４記載の方法。６．（ａ）哺乳類宿主から腫瘍のサンプルを得て、（ｂ）該腫瘍サンプルから単細胞懸濁液を形成させ、（ｃ）該腫瘍細胞をペレットにし、（ｄ）該腫瘍細胞をプレーティングすることにより該腫瘍細胞株を得る請求の範囲１記載の方法。７．該腫瘍細胞株が腫瘍遺伝子または腫瘍抑制遺伝子中に変異を含む請求の範囲１記載の方法。８．該サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである請求の範囲１記載の方法。９．（ａ）膵臓腫瘍細胞株を得て、（ｂ）該腫瘍細胞株を、未修飾の腫瘍細胞株と比べて増加したレベルのサイトカインを産生することができるように修飾し、（ｃ）少なくとも１つの膵臓腫瘍を有する哺乳類宿主に、該腫瘍細胞株（該腫瘍細胞株は該宿主と同種異系であり、かつＭＨＣがマッチしていない）を投与することを含む膵臓癌の治療方法。１０．該腫瘍細胞株を該腫瘍のごく近傍に投与する請求の範囲９記載の方法。１１．該腫瘍細胞株を投与の前に放射線照射する請求の範囲９記載の方法。１２．該腫瘍細胞株を、免疫原性を増強するために投与の前に処理する請求の範囲９記載の方法。１３．該処理が遺伝子操作または非特異的アジュバントとの混合を含む請求の範囲１２記載の方法。１４．（ａ）哺乳類宿主から膵臓腫瘍のサンプルを得て、（ｂ）該腫瘍サンプルから単細胞懸濁液を形成させ、（ｃ）該腫瘍細胞をペレットにし、（ｄ）該腫瘍細胞をプレーティングすることにより該膵臓腫瘍細胞株を得る請求の範囲９記載の方法。１５．該腫瘍細胞株が腫瘍遺伝子または腫瘍抑制遺伝子中に変異を含む請求の範囲９記載の方法。１６．該変異がγas 遺伝子中にある請求の範囲１５記載の方法。１７．該サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである請求の範囲９記載の方法。１８．実質的に精製された膵臓腫瘍細胞株。１９．該腫瘍細胞株がPanc 10.5.92である請求の範囲１８記載の腫瘍細胞株。２０．該腫瘍細胞株が、未修飾の腫瘍細胞株と比べて増加したレベルのサイトカインを産生することができるように修飾されている請求の範囲１８記載の腫瘍細胞株。２１．該サイトカインがＧＭ−ＣＳＦである請求の範囲２０記載の腫瘍細胞株。２２．医薬的に許容される担体および請求の範囲１８記載の腫瘍細胞株の細胞を含有する医薬組成物。２３．医薬的に許容される担体および請求の範囲１９記載の腫瘍細胞株の細胞を含有する医薬組成物。２４．（ａ）哺乳類宿主から膵臓腫瘍のサンプルを得て、（ｂ）該腫瘍サンプルから単細胞懸濁液を形成させ、（ｃ）該腫瘍細胞をペレットにし、（ｄ）該腫瘍細胞をプレーティングすることを含む、請求の範囲１８記載の腫瘍細胞株を得る方法。２５．該腫瘍細胞を、胎児血清、インスリン、およびインスリン様増殖因子１および２を含有する増殖培地にプレーティングする請求の範囲２４記載の方法。２６．胎児血清、インスリン、およびインスリン様増殖因子１および２を含有する膵臓腫瘍細胞の培養用増殖培地。２７．該培地がインスリンを約０．１〜約１．０Ｕ／ｍｌの濃度で、インスリン様増殖因子１を約０．００５〜約０．０５μｇ／ｍｌの濃度で、およびインスリン様増殖因子２を約０．００５〜約０．０５μｇ／ｍｌの濃度で含有する請求の範囲２６記載の培地。