JP2000502893A

JP2000502893A - がんを扱うためのヌクレオチド配列、タンパク質、薬剤および診断剤

Info

Publication number: JP2000502893A
Application number: JP9522549A
Authority: JP
Inventors: タレマン，アダム; アムソン，ロベール; コーエン，ダニエル
Original assignee: フォンダシオン・ジャン・ドセ―セフ
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 2000-03-14
Also published as: ATE307886T1; EP0868512A2; EP0868512B1; WO1997022695A3; EP0868512B9; DE69635349T2; WO1997022695A2; DE69635349D1; CA2240449A1

Abstract

(57)【要約】 (a) 配列番号１から11のいずれかに従った配列、または以下を含む等価の遺伝子：(b) 上記(a) に従った配列のいずれかとハイブリッド形成する配列、(c) 上記(a) もしくは(b) と80％以上の相同性を示す配列、または(d) 上記(a) 、(b) もしくは(c) に従った遺伝子によりコードされるタンパク質をコードするか、もしくは等価のタンパク質をコードする配列、を含む遺伝子に対応するヌクレオチド配列、およびその用途。特に、がんの制御および治療における追跡調査。これらの遺伝子は、TSAP 1からTSAP 8およびヒトTSAP 3(HUMSIAH)と命名された、TSAP（腫瘍サプレッサ−活性化経路）群、およびTSIP 1およびTSIP 2と命名されたTSIP(腫瘍サプレッサ−阻害経路)群中にあり、両方の種類の遺伝子は、細胞アポトーシス−特にp53 により誘導される−中にそれぞれ活性化もしくは阻害される配列に対応する。

Description

【発明の詳細な説明】がんを扱うためのヌクレオチド配列、タンパク質、薬剤および診断剤本発明は、腫瘍抑制の分子経路に関与する遺伝子の証明と、こうして証明された遺伝子の、或る種の遺伝的機能不全(malfunction)、特にがん、を処置するための使用とに関する。本発明は、p53 抑制遺伝子により誘発されるアポトーシスの過程で発現または抑制されるメッセンジャーRNA に対応したcDNAの分離により可能となったものである。腫瘍の抑制、或いは反対にがん化の過程におけるp53 遺伝子の重要性をよりよく理解するには、発生と細胞アポトーシスの時点での細胞サイクル中に起こる分子事象の包括的な分析が必要となる。正常な細胞から腫瘍細胞への変化は、一連の分子事象を必要とする、数段階で起こる一つの過程である。生理学的レベルでは、これらの事象は、腫瘍細胞が外部信号に無関係になること、および内部調節解除(internal deregulation)により制御されない成長を生ずることに現れる。このいわゆる「悪性」形質転換（腫瘍化）に対しては２種類の遺伝子群が関与する。一方はがん遺伝子（オンコジーン）であり、他方は抑制遺伝子、即ち、がん抑制遺伝子である。がん遺伝子は、そのがんにおける調節解除（たいていは突然変異または転座により起こる）のために、新生物の成長を促進する正の信号を誘導する。これに対し、抑制遺伝子は、既に欠失してしまったか、例えばプロモーターの突然変異のせいで発現されていないか、またはこのタンパク質の構造および機能を変質させる突然変異のために、がんにおいて、正常であればこの異常な成長を遅くするような信号を供給することができない。その結果、抑制遺伝子の機能不全は新生物形質転換（腫瘍化）に寄与する。本発明の目的は、正常では腫瘍抑制に関与する遺伝子であって、その何らかの起こりうる機能不全を監視および治療することができる遺伝子を分離することである。特に、このような遺伝子の分離により、遺伝子置換治療を実施するか、あるいはタンパク質または非タンパク質の薬理作用物(pharmacological agent)−この薬理作用物は、プロモーターに作用してこれらの遺伝子の活性化および発現を、直接的または間接的に誘導する−を合成する、あるいはこれらの抑制遺伝子の生理学的作用を模倣する薬理作用物を合成することが可能になる。最終的な目的は、腫瘍の成長を阻害するか、さらに良くはこれらの腫瘍細胞のアポトーシス過程を誘発する、即ち、腫瘍細胞の「自殺」を引き起こすことである。本発明は、このアポトーシスに関与する遺伝子の証明に関する。即ち、各細胞はその内部に生理学的な細胞死のプログラムを含んでいる。これはまた、身体のホメオスタシス（恒常性）を維持し、異常な細胞増殖が、それがたとえ本来は悪性ではなくても、定着するようになるのを防止するための発生に関与する生理学的な１過程でもある。アポトーシスに関与する最も重要な抑制遺伝子の１つはp53 遺伝子である。その正常な機能では、この遺伝子は細胞成長およびアポトーシス過程を制御する。特に、がんの発生を回避するために細胞成長を阻止し、アポトーシス過程の誘発の原因となっているのはこの遺伝子である。従って、p53 に対して接合しない(n ullizygous)マウスは腫瘍形成にずっと敏感であることが証明されている。がんにおいては、p53 遺伝子が変質していることが非常に多く、これがアポトーシスのメッセージに対する媒体として作用することができないタンパク質の産生を生ずることもまた証明されている。本発明の技術思想で採用しているのは、この特徴である。かくして、本発明は、p53 遺伝子が機能不全であると、直接的な置換治療を行うことが不可能であるか、または少なくとも非常に困難であるらしいという知見に基づくものである。即ち、がんで見られるようにp53 が突然変異していると、正常なp53 の生理学的作用が無効になる。そのため、これまではp53 のレベルで直接的に作用させた置換治療は、少なくとも初期には放棄する必要があった。従って、本発明は、上記の困難を迂回するために、p53 の下流側に位置する遺伝子の研究に関連するものである。正常なp53(野生型p53)により活性化または阻害される遺伝子を分離するため、アポトーシスが既に誘発されている細胞と、それと同じ悪性細胞、より具体的には正常な機能のp53 を発現している細胞と、突然変異して、その機能が発がん性となったp53 を発現している細胞、の遺伝子発現について包括的なストリーミングを行った。発現した遺伝子(上記の２種類の細胞内に発現されたメッセンジャーRNA)の比較により、差別的に（differentially）発現した遺伝子、即ち、一方の細胞では発現するが他方の細胞では発現しない遺伝子（この遺伝子は活性化または阻害することができる）を同定することが可能となった。これらの遺伝子が、ある場合にはその欠失により、他の場合にはその存在により、ガン化の過程に関与することが容易に導き出された。この差別化の研究を実施するのに用いた方法は、Liang およびPardeeが1992年に報告した方法（ポリメラーゼ連鎖反応の手段による真核mRNAの差別的発現(dif ferential display)）である。今まで、抑制に関与する遺伝子は、ポジショナルクローニングによるか、または二重ハイブリッドを用いて分離されてきた。最初の方法では、統計学的な計算により、かなり特異的なタイプのがん、特に家族性起源のもの、の候補であった抑制遺伝子の染色体内での位置について最大の可能性がどこであるかを計算することが可能になった。二重ハイブリッド系では、所定の遺伝子と相互作用するタンパク質を次々に分離することが可能になる。この問題に対して本発明により採用された手法では、ある機能に直接結びついた配列を分離することが可能になる。その結果、EST 類のランダム配列決定とは異なり、分離されたその配列は、その機能が既知で、p53 抑制遺伝子により誘発されるアポトーシス過程に関与する配列となる。より正確には、この方法を、Moshe Orenが報告した細胞モデルで使用した。このモデルは、p53 遺伝子の安定な突然変異体でトランスフェクションされたマウス骨髄腫瘍細胞を含んでいる。この遺伝子の発現は温度感受性である。即ち、この細胞を37℃で培養すると、産生するタンパク質は変異タンパク質となる。つまり、これは腫瘍抑制として作用することができず、従って対応する細胞系は悪性細胞の形態で発生する。これに対し、32℃の温度では、発現するp53 タンパク質は、天然のタンパク質と同様に、サプレッサーとして作用することができ、対応する細胞系が悪性になるのを防止する。この組織的な研究により、p53 により誘発される抑制カスケード(cascade)に関与する遺伝子を分離することが可能になった。このため、本発明はこれらの新規な配列、これらの配列を含む遺伝子、ならびにこれらの配列を診断と治療の両方、さらには抗新生物製品の試験用のモデルの創出、に使用することに関する。本発明は、まず最初に、下記を含む遺伝子に対応するヌクレオチド配列、ならびにそれらの用途、特にがんの抑制および治療の追跡調査における用途、に関する： (a) 配列番号１から10のいずれかに従った配列、または下記を含む等価の遺伝子： (b) 上記(a) に従った配列のいずれかとハイブリッド形成する配列、 (c) 上記(a) もしくは(b) と80％以上の相同性を示す配列、または (d) 上記(a) 、(b) もしくは(c) に従った遺伝子によりコードされるタンパク質をコードするか、もしくは等価のタンパク質をコードする配列。また、本発明は、p53 により誘発される抑制カスケードに関与するヒト遺伝子、ならびにこの遺伝子の配列を診断と治療の両方、さらには抗新生物製品の試験用のモデルの創出、に使用すること、および抗ウイルス剤としてのそれら遺伝子の用途に関する。従って、本発明はまた、下記を含む遺伝子に対応するヌクレオチド配列、ならびにそれらの用途、特にがんの抑制および治療の追跡調査における用途、にも関する： (a) ヒトTSAP 3遺伝子もしくはHUMSIAH(ショウジョウバエのセブンインアブセンシア(seven in absentia)のヒト相同体)に対応する、配列番号11に従った配列、または下記を含む等価の遺伝子： (b) 上記(a) に従った配列のいずれかとハイブリッド形成する配列、 (c) 上記(a) もしくは(b) と80％以上の相同性を示す配列、または (d) 上記(a) 、(b) もしくは(c) に従った遺伝子によりコードされるタンパク質をコードするか、もしくは等価のタンパク質をコードする配列。配列１〜11に関して、本発明は、その遺伝子全体に対応するヌクレオチド配列と、この遺伝子の断片に対応するヌクレオチド配列の両方を包含し、特に、後述するように、それらが等価のタンパク質をコードする場合にそうである。ヌクレオチド配列は、DNA 配列とRNA 配列のどちらでも同様に十分であり、またそれらの薬理学的性質を改善するか、もしくは同定を可能にするためにヌクレオチドの一部が非天然ヌクレオチドである配列であってもよい。上記(b) に述べた配列（配列１から11について）は、本質的に全体的または部分的に相補性の配列である（特に既述の場合において）。上記(a) および(b) の配列（配列１から10について）は、それが由来するマウス遺伝子だけでなく、相同性により対応するヒト遺伝子への接近も与える。かくして、本発明は、既に述べた遺伝子と強い相同性を示す遺伝子のヌクレオチド配列にも関する。この強い相同性は、好ましくは該遺伝子の本質的部分について80％以上、または一般的には配列の少なくとも50％であり、好ましくはこれらの部分についての相同性は90％以上である。最後に、該遺伝子があるタンパク質をコードする場合、本発明はまた、遺伝暗号の縮重を考慮して、同じタンパク質、ならびに等価のタンパク質、つまり同じ効果を生ずるタンパク質、特に欠失が起こったか、および／もしくは点突然変異を受けたタンパク質をコードする他の配列にも関する。本発明にかかる配列は、より具体的には、細胞アポトーシスの時点で誘導または阻害される配列、特にp53 により誘導されるものである。該遺伝子は、TSAP、即ち「腫瘍サプレッサー活性化経路(Tumor Suppressor Ac tivated Pathway)」中で一緒にグループ分けされたものが、それぞれ配列番号１から８および11(HUMSIAH)に対応する、TSAP 1からTSAP 8およびヒトTSAP 3と命名され、TSIP、即ち「腫瘍サプレッサー阻害経路(Tumor Suppressor Inhibited Pathway)」中でグループ分けされたものが、配列番号９および10に対応するTSTP 1およびTSIP 2と命名される。配列番号１から10に対応する配列の特徴は添付の表に含まれている。 TSAP遺伝子に対応するヌクレオチド配列（ヒトTSAP 3またはHUMSIH を含む）は、アポトーシス過程において発現される配列であるのに対し、発がんの過程はこれらの配列が発現されない場合に起こる。従って、下記の点が興味ある： ―発がんに対するより大きな感受性を生ずるかもしれない対応する遺伝子における異常の検出、および ―置換治療法を計画することが可能になる。これらの遺伝子は、発がん過程以外の他の過程にも介在することができることも想起しなければならない。従って、p53 は、いわばゲノムの完全性の保護者である。このような状況下では、TSAPまたはTSIP遺伝子は疑いなくこの制御機能に関与する。従って、上に説明した検出および治療法はこのゲノムの起こりうる全ての変形物をカバーすることができる。これに対し、TSIP遺伝子は、発がん中に発現されるが、アポトーシス中には発現されない。従って、この場合も、TSIP遺伝子中のあらゆる起こりうる異常を検出すること、および阻害／阻止治療法を計画することが興味ある対象となる。置換治療は、遺伝子治療によって、即ち、TSAP遺伝子を、これをin vivo で発現させることができる要素と一緒に導入することにより、行うことができる。遺伝子治療の原理は知られている。特異的なウイルス性または非ウイルス性ベクター、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、またはポックスウイルスベクター、を使用することができる。その期間の大部分、これらのベクターは、組み込みが有りまたは無しに、TSAP発現性のビヒクルとして作用する欠陥形態で使用される。このベクターは、合成ベクター、つまりウイルス配列を模倣したベクターであってもよく、または特にVICAL 社により開発された技術に従って、裸のDNA またはRNA からなるものでもよい。ほとんどの場合、組織または器官に特異的な発現を確実にする標的要素を供給する必要がある。即ち、制御されないアポトーシスの現象の活性化を考慮することはできない。従って、本発明は既に説明した全てのベクターにも関する。本発明はまた、既に説明したような発現ベクターにより形質転換される細胞、ならびに形質転換細胞の培養により得ることができるタンパク質にも関する。タンパク質産生のための発現系は、前述したベクターのような真核系と、細菌細胞中における原核系のいずれでもよい。本発明の重要な特徴の一つは、アポトーシスにおける数種類の遺伝子の関与を証明したことである。即ち、遺伝子治療を用いてこれらの遺伝子の一つを過発現 (overexpress)させると、いくつかの遺伝子については、その細胞内で他の調節解除された遺伝子が既に発現されている細胞、即ち、悪性細胞、のアポトーシスだけを生ずることがある。本発明はまた、細胞アポトーシス中に誘導された場合に、既に述べたヌクレオチド配列の少なくとも一つ、特にTSAP 1からTSAP 8までとヒトTSAP 3遺伝子の細胞性発現を確実にするか、反対に細胞アポトーシス中に阻害された場合に、既に述べたような少なくとも一つの細胞配列、特にTSIP 1およびTSIP 2の細胞性発現の阻害を確実にする、薬剤としての化合物にも関する。例えば、遺伝子治療以外の手法、特にセンスもしくはアンチセンス戦略におけるヌクレオチド配列、つまりTSIP発現を阻止することができるか、または反対に上流方向に作用して、TSAP発現を促進させる配列、の使用を構想することができる。 TSAPに対応するタンパク質またはTSIPに対応する阻害性の抗体を供給することを含む、直接的な置換戦略を構想することもできる。最後に、その活性がTSAPを活性化させるか、その発現産物の作用を模倣するか、またはTSTPを阻害するか、もしくはその発現産物の作用を阻止することである非タンパク質分子の使用を構想することもできる。これらの産物は、実施例で説明する修飾細胞を用いて、試験すべき産物を培養細胞中に導入し、アポトーシス現象の出現を検出することにより、容易に試験することができる。DNA 、 RNA またはタンパク質を使用する戦略では、その産物はもちろん、ここに記載される配列に従って作製される。本発明は、特に上記薬剤の抗新生物薬としての使用に関する。しかし、ヒトTSAP 3遺伝子(HUMSIAH)の産物はまた、実施例２を読めば明らかなように、抗ウイルス薬としても使用することができる。従って、本発明は上記薬剤の抗ウイルス薬としての使用にも関する。本発明はまた、本発明に係る配列の全部または一部の用途の用途にも関し、がんに対する疾病素質を判定する診断剤として、ヌクレオチドプローブとしてもしくは増幅プライマーとして、さらには、がん、本発明に係る配列によりコードされるタンパク質の全部または一部に対応する抗原、もしくは対応する抗体、特にモノクローナル抗体、適当であれば培養後のもの、に対する疾病素質を判定する診断剤として使用することができる。複数の診断方法が知られている。例えば、これは分離および可能な増幅後の可変部分のミクロシークエンシング用の技法、またはRFLP型の検出方法、または特にまっすぐな増幅でよい。差別的な方法は、特に、正常なTSAPまたはTSIPと異常なものとの相違を証明することができる。本発明はまた、上記の配列を利用したモデルにも関する。 PCR 法、または他の増幅法を用いて、特にヒトTSAP 3遺伝子(HUMSIAH)を、この遺伝子の構造を利用して分離してもよい。必要ならこの遺伝子をビットごとに合成することもできる。最後に、本発明はLiang Pardee(1)の方法の改良に関する。これは、PCR 増幅において、Don et al.(2)に記載されているように、段階的な減少(「タッチダウン」)を行うことを含む。本発明の他の特徴は、特に下記の図面を参照しながら、以下の実施例を読むことから明らかとなろう。 −図１−1200βイメージャーを用いたmRNAの差別的発現の定量化。 37℃でLTR6細胞からおよび32℃で４時間後にLTR6細胞から誘導されたmRNAへのハイブリッド形成。０から500 までの縦軸の数字は、0.15mmあたりに検出されたカウント数に対応し、ハイブリッド形成信号に比例する。 C1：差別的発現をしないクローンを用いて発現したmRNA； C2：サイクリンG(Cyclin G)を用いた、32℃に対応するmRNAの誘導を示す正の対照； MER-LTR ：32℃でのこの配列の誘導を示す； TSAP 1〜TSAP 8：アポトーシスの誘発後の最初の４時間における８つの活性化 mRNAの差別的発現； TSAP 1およびTSAP 2：アポトーシスの誘発後の最初の４時間に阻害される２つのmRNAの差別的発現。 −図２−ノーザンブロット分析Ａ：TSAP 3プローブとのハイブリッド形成；Ｂ：マウスsiah 1b プローブとのハイブリッド形成；トラック１と２：それぞれ37℃と32℃で培養されたM1骨髄性白血病細胞（クロンS6）のポリＡ＋mRNA；トラック３と４：それぞれ37℃と32℃で培養されたLTR6細胞のポリＡ＋mRNA；矢印はTSAP 3 1.９kb 転写物−マウスsiah 1bの差別的発現を示す；下段：GAPDH；Ｃ：プローブとしてTSAP 3を用いた組織分布；１：心臓、２：脳、３：脾臓、４：肺、５：肝臓、６：骨格筋、７：腎臓、８：精巣矢印は1.9 および2.4 kb転写物を示す；下段：β−アクチン。 −図３−TSAP 3プローブを用いたin situ ハイブリッド形成の分析；Ａ：32℃で４時間培養し、アンチセンスTSAP 3プローブとハイブリッド形成したM1細胞；Ｂ：32℃で４時間培養し、センスTSAP 3プローブとハイブリッド形成したLTR6 細胞；Ｃ：37℃で培養し、アンチセンスTSAP 3プローブとハイブリッド形成したLTR6 細胞；Ｄ〜Ｆ：32℃でそれぞれ1.2 および４時間培養し、アンチセンスTSAP 3プローブに対してハイブリッド形成したLTR6細胞；Ａ欄の棒：10μｍ；矢印は細胞質中のTSAP 3 mRNA の蓄積を示す。 −図４−TSAP 1 cDNA配列と、ラットβ４ホスホリパーゼC に対応するヌクレオチド配列との比較。 −図５−TSAP 2 cDNA配列と、多重内分泌新生物(MEN 1)遺伝子座に位置する亜鉛フィンガータンパク質(ZEM 1)に対応するヌクレオチド配列との比較； −図６−TSAP 3 cDNA配列と、ショウジョウバエのseven in absentia(sina)遺伝子に対応するヌクレオチド配列との比較； −図７−ヒト(HUMSIAH) 、マウス(MMSIAH 1B)およびショウジョウバエ(DROSIN A) という異なる種のsina遺伝子の産物の比較； -図８−TSIP 2 cDNA配列と、アルツハイマー病に関与するAD3 遺伝子のマウス S182転写物のcDNA配列との比較。材料と方法細胞培養物温度感受性突然変異体、val 135 p53(LTR6)(3)で安定にトランスフェクションされるM1細胞とM1骨髄性白血病細胞（クローンS6）これらの細胞は、10％FCS を含有するRPMI 1640 培地を用いて、５％ CO₂および37℃で培養する。温度を変化させるためには、培養液を32℃で第２のインキュベータに移す。本実験で行った全ての分析において、12時間後および24時間後にアポトーシスの存在について細胞を試験する。ディファレンシャル（差別的）cDNAの検討標準的な実験条件下で試験を実施し、結果の完全な再現性を得るために、オリジナルプロトコル(1)の下記の変更を行った。常に、Fast Track （Invitrogen、サンディエゴ、カルフォルニア）を利用したoligo dTカラムで２回精製したポリＡ＋mRNAが用いられる。それぞれ20μｍずつのdNTP(Boehringer-Mannheim)を用いて0.05μｇのポリＡ＋で逆転写(M-MLV逆転写酵素、Gibco BRL)した後、最後のPCR 混合物には追加のdNTPを添加しない。 PCR(GeneAmp PCR システム9600、Perkin Elmer Cetus)の前に、94℃での「ホットスタート」を５分間行う。試料を氷水中ですばやく冷却する。10サイクルまたは50℃〜40℃の「タッチダウン」(2)を実施（94℃30秒−50℃１分−72℃30秒）した後、35サイクル（94℃30秒−40℃１分−72℃30秒）を行い、72℃で５分の最後の伸長を行う。PCR 産物を、非変性６％ポリアクリルアミドゲル(4)で分離する。ゲルは乾燥せずに曝す。M1S6とLTR6を37℃で、この２つの細胞系を32℃で４時間培養した後で比較することにより、それぞれの差別的提示を行う。完全な再現性を確認するために、この差別的提示の操作を３つの異なる実験でくり返す。異なって現れるバンドをゲルから切り取り、溶出させ、再増幅させる(1)。このPCR 物をTAクローニングシステム（Invitrogen、サンディエゴ、カリフォルニア）を用いて、提供された指示に従ってサブクローニングする。各連結反応に対して、自動化ABI システムを使用して10個の組み換えクローンを配列決定する。RNA の抽出とノーザンブロットプローブおよび分析全RNA をTrizol(Life Technologies)を用いて抽出する。OligotexdTキット(Qi agen、カリフォルニア)を用いてポリＡ＋ RNAを調製する。30μｇの全RNA または２μｇのポリＡ＋RNA を１％アガロース／１×MOPS／２％ホルムアルデヒドゲルで分離し、既報(5)のようにナイロン膜(Hybond N＋、Appligene、フランス)上に移す。既報(5)の通り、ノーザンブロットをTSAPおよびTSAP挿入物上でＰ³²標識プローブとハイブリッド形成させ、洗浄する。野生型p53 の機能が既に誘導されていることをチェックするため、ノーザンブロットをサイクリンＧプローブ(6 )とハイブリッド形成させる。負荷されたmRNAの量に対する対照として、ブロットをGAPDHプローブとハイブリッド形成させる。異なるノーザンブロット(Clonte ch、カリフォルニア)を同じ条件下で使用し、対照として、β−アクチンプローブとハイブリッド形成させる。LTR6の場合のRT-PCR産物を、下記のsiah1b プライマーを用いて増幅する：5'CAGTAAACCACTGAAAAACC3'および5'CAAACCAAACCAAAAC CAC3’。サブクローニングされたPCR 産物を対照siah 1b プローブとして使用する。このノーザンブロットを−80℃に10日間曝す。スロットブロットノーザンブロット分析により得られた結果の再現性。TSAPクローンのPCR 物(2 00ngのゼータプローブブロッティング膜、Bio-Rad、製造業者の指示に従う)を置いてブロットを作製し(Dio-Rad、Hercules、カリフォルニア)、37℃で培養し、次に32℃で４時間培養しておいた、LTR6細胞のRNA に対応するＰ³²標識cDNAブローブ(Superscript II、Gibco-BRL、Life Technologies)とハイブリッド形成させる。サイクリンＧを含有するクローンのPCR 産物もこの膜に付着させ、正の対照として使用する。このスロットブロットを 80℃に一晩曝す。定量的イメージ分析これは、1200βイメージャー（Biospace Instruments、パリ、フランス）を用いて、２つのノーザンブロット（TSIP 1およびTSIP 2に対して）、ならびに全ての対照cDNAおよびTSAP 1〜8のスロットブロットについて行う。図１のグラフに示された定量的分析に対して、各ピークから一定の数を差し引く。この定数は、 cDNAを全く含有しないスロットにおけるパックグラウンド・ノイズの平均値を測定することにより算出される。βイメージャーの結果は、スロットブロットの数を一晩計数し、可変露出時間を用いたオートラジオグラフィーによってそれらを確認することにより得た。これらのオートラジオグラムは、βイメージャーを用いて得られた測定がそうであるように、32℃と37℃の活性の間で同じ相対的な定性的変動を示す。In-situ ハイブリッド形成(7、8) 細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で３回洗浄し、PBS 中４％パラホルムアルデヒドで10分間「サイトスピン(cytospin)」および固定した後、70％エタノール中で保存する。ジゴキシゲニン-11-ウリジン-5'-トリホスフェート(DIG)およびビオチン-11-UTP でラベルしたTSAP 3のRNA 転写物を、上述した操作(Boehringer-Ma nnheim)に従って分析に使用する。ハイブリッド形成したジゴキシゲニンでラベルされた株を検出するために、切片をSAD-10（10nmの金標識ヒツジ抗DIG 抗体を 1/1000に希釈、Biocell 英国）中で培養する。共焦レーザー顕微鏡を用いて分析を行う。実施例１ Liang およびPardeeの方法を用いたcDNAの差別化の検討は、遺伝子発現における変化を検出する非常に強力で効率的な道具となる。それでも、先に指摘したように、この方法を最初に報告された通りに適用した場合に認められた或る種の再現性の問題を解消するために、オリジナルのプロトコルを修正する必要があった。完全な再現性は、「ホットスタート」、次いで「タッチダウン」をPCR 法に導入した場合に認められた。しかしながら、分離および再増幅した後に、差別的に現れたバンドが、cDNAに隣接する領域内に移行したRNA から生ずるバンドでしばしば汚染される。これらのプローブをノーザンブロットにじかに使用すると誤差を生ずる。そのため、第２のPCR 産物をサブクローニングし、単一プローブ組み換え体の欠除のために使用したノーザンブロット分析を行った。選択した各バンドの場合で少なくとも10 の組み換えサブクローンの系統的配列決定により、これが興味あるクローンの選択に非常に有効であることを示した。現状の知識では、p53 遺伝子は、非常に多岐にわたる起原の最多数のがんにおいて突然変異を生じている腫瘍サプレッサーであり、温度感受性変異体val-13 5P53 の使用は、G-1 期の細胞成長の停止または細胞死のプログラムの開始の誘発における野生型p53 の機能に関する非常に多様の情報を提供することが既に以前より示されている。今まで、腫瘍抑制に至るp53 の上流および下流の分子経路はあまりよく明らかになってなかった。 p53 の下流のいくつかの遺伝子はこれまでに同定されている。これらは、詳しくはgadd 45、mdm 2 、mck、マウス内在性レトロウイルスLTR 、p21-waf.及びサイクリンＧである。本発明では、p53 をその活性なサプレッサー形態で発現している細胞中、あるいは不活性p53 遺伝子を発現している腫瘍細胞中で異なった発現がなされている 11個の遺伝子の存在を証明した。図１は、32℃で活性化された、即ち野生型p53 の機能が活性化され細胞のアポト−シスを生じているこれらの遺伝子のうちの８つの差別的発現に対応するハイブリダイゼーションシグナルの定量化を示す。これらの活性化遺伝子は TSAP(腫瘍サプレッサー活性化経路：tumor suppressor activated pathway)と称され、対照的に、２つの実験において、37℃で発現している２つの遺伝子は32℃で部分的に阻害されることが観察され、このことはプログラムされた細胞死の間これらが阻害されていることを意味する。これらの遺伝子はTSIP（腫瘍サプレッサー阻害経路tumor suppressor inhibited pathway）と称される。 TSAP 1〜TSAP 3の異なった活性化配列の相同性分析から、これらの遺伝子は既知であることが分かった。対照的に、他のcDNA、即ちTSAP 4〜8のcDNAは既知遺伝子とあまり相同性を示さない。その発現がアポトーシスの間阻害されている、TSIP 1に対応するcDNAは、既知遺伝子と何ら相同性を示さない。その発現がアポトーシスの間阻害されているTSIP 2に対応するcDNAは、アルツハイマー病の代謝経路に関与する(Sherrington et al.)AD3遺伝子のS182転写物と高度の相同性を示す（図８）。従って、p53 依存性代謝経路に作用させることによりアルツハイマー病の代謝経路に働きかけることが可能である。従って、本発明は、TSIP 2の細胞性発現を確実にし、アルツハイマー病の治療を目的とする、医薬としての化合物にも関し、またアルツハイマー病の疾病素質を判定する診断薬において、ヌクレオチドプローブとして、もしくは増幅用プライマーとしてTSIP 2配列の全部もしくは一部を用いることに、さらにまたTSTP 2 によりコードされるタンパク質の全部もしくは一部に対応する抗原、もしくは抗体、特に対応するモノクローナル抗体（適当であれば培養後の）にも関する。野生型p53 によりその発現が阻害される遺伝子に関して提唱しうる仮説は、これらの遺伝子は、腫瘍抑制の過程の制御された下流である発がん性配列をコードするかもしれない、あるいはその下流の発現制御がアポトーシスによる細胞死と共に生じるのは構造性のもしくは細胞骨格性のタンパク質の問題であるというものである。 TSAP 1は、ラットのベータ４ホスホリパーゼＣと相同性である。TSAP 1配列は、ヌクレオチド3967と3985の間のPLC と100 ％の同一性を示し、ヌクレオチド39 86と4116の間では82％の同一性、ヌクレオチド4070と4220では85％の同一性を示す（図４）。PLC 、チロシンキナーゼ受容体シグナル経路に関与すること、及びホスファチジルイノシトール−4,5 ジホスフェートのジアシルグリセロールとイノシトール−1,4,5 −トリホスフェートへの加水分解を触媒とすることが知られている。しかし、この実験ではPLC は p53−媒介アポトーシスにおいて下流の標的であることが示唆される。 TSAP 2は、これと亜鉛フィンガータンパク質(ZFM 1)(多重内分泌新生物(MEN 1)遺伝子座に位置する)との間で保存された配列を示し、ヌクレオチド259 と2 99 の間では92％の、ヌクレオチド418 と458 との間では100 ％の、ヌクレオチド645 と685 との間では92％の同一性である（図５）。MEN 1は、下垂体の前葉及び上皮小体及びすい臓の島(ilot)の細胞に影響する腫瘍の発生に関与する常染色体性の優性疾患である。特に、ZFM とPLC のイソ酵素の両者が、MEN 1に対する感受性に関する遺伝子を含む同じ染色体領域、即ち11q13、に共に位置することを証明したことが興味深い。マウスにおいては、この相同領域は染色体19B に位置する。TSAP 1とTSAP 2が、p53 に応答して活性化されることが見い出されたことは、これらの遺伝子がより広域な腫瘍抑制経路に属すること、及びp53 はMEN 1と共同して働きうることを示すかもしれない。 TSAP 3はsiah 1bと同じである。この遺伝子はショウジョウバエのセブンインアブセンシア(seven in absentia)(sina)遺伝子の脊椎動物の相同体である。既述のクローンはマウス相同体と94％の同一性を示す(ヌクレオチド1496〜1634)（図６）。この遺伝子由来の1.9kb メッセンジャーの差別的発現が、TSAP 3プローブを用いたノーザンブロット分析により検出された（図2A）。これは既述のsiah 1b 配列の同じ領域に対応する第２のプローブを用いて確認される（図2B）。図 2Cは、1.9 及び2.4kb の大きさのmRNAを別々及び同時に検出するTSAP 3プローブを用いた、この遺伝子の組織分布を示し、siahプローブを用いた際の上記結果に対応する。in-situ ハイブリッド形成は、TSAP 3 mRNA はアポトーシス誘導後１時間で迅速に誘導されることを示す（図3D）。その発現は、２及び４時間後に増加する（図3E及び3F）。有糸分裂に入った細胞ではシグナルは何ら検出されない。 Carthew とRubin は、seven in absentia ショウジョウバエにおいては目の形成に必要であることを示した。一方、この遺伝子の変異体はショウジョウバエにおける発生により総括的な役割を果たす。マウスの相同体は２つの群、即ちsiah 1とsiah 2に分けられ、これらのタンパク質は、すべて異常であるショウジョウバエの seven in absentiaに関して一定程度保存される。本発明者らの結果は、TSAP 3/siah 1bはp53 腫瘍制御遺伝子により誘導される M1細胞における細胞死のプログラムにおいて活性化されることを示す。この遺伝子は核の亜鉛フィンガータンパク質をコードするので、これが、p53 シグナルの下流である調節性転写因子であるかもしれない。この結果はまた、ショウジョウバエにおける発生に関与する遺伝子と主要な腫瘍抑制経路の直接の関連を示す。実施例２ mRNAの差別的分析により得られた、上記マウスcDNA断片(TSAP 3)を、ヒトcDNA ライブラリーから1.1 kb断片を単離するためのプローブ作製に用いる。この断片は次いでRACE-PCR法により全コーディング領域を含むように伸長された。図７はヒトsina遺伝子(TSAP 3)のcDNA及びアミノ酸配列を示す。この配列は、C3HC4 亜鉛フィンガーモチーフを有する282 アミノ酸タンパク質をコードする。このタンパク質はまた、RNA へ結合しうるタンパク質と相似性を示す。このアミノ酸配列はショウジョウバエ、マウス及びヒト遺伝子の間で極めて高度に保存されている（図７）。組織分布は、ヒトsinaが偏在的に発現され、2.3kb のmRNAをコードすることを示し、胎盤においては、2.5kb 大きさの追加の転写物が存在する。特異的ヒトsinaプライマーを用いたPCR 法によりCEPHY40 及びBAC ライブラリーを分析することにより、８つのYAC(350-1000kb)と２つのBAC(100 及び125kb) を単離できた。 YAC 及びBAC クローンを用いた、in situ ハイブリダイゼーション(FISH)によるけい光発光はseven in absentia は染色体16q12-13に位置することを示し、これは、種々のがん、特に胸部のがん(9)、ウイルムス腫瘍(10-12)、ローレンス− ムーン−バード−ビードル症候群(13)及びベックウイズ−ヴィーデマン症候群における腫瘍制御遺伝子の候補である遺伝子を含む領域にある。フランス特許出願No.9515146 において指摘されているように、p53 の温度感受性変異体で安定にトランスフェクションされたマウスM1細胞は、32℃でアポトーシスの誘導に続いて、seven in absentia の活性化を示すことが見出された。マウスTSAP 3はp53 遺伝子により誘導されたアポトーシスモデルにおいて単離されるという事実から、TSAP 3(HUMSIAH)遺伝子の分析をヒトの生理学的アポトーシスのモデルに広げることは理にかなっている。このモデルは腸において報告されており、そこでは細胞が陰窩の底部から絨毛の先端部分へ移行し、内腔へ放出される前にアポト−シスにより死滅する。これらのアポトーシス細胞はTUNEL 法により特異的に標識される。さらに、ヒトにおける生理的アポトーシスでは、この同じ細胞がin-situ ハイブリダイゼーションによればTSAP 3(HUMSIAH)遺伝子に対して陽性である。最後に、腫瘍抑制におけるヒトTSAP 3遺伝子の関与を研究するためには、単一の遺伝子よりもすべての遺伝子に基づくモデルが用いられる。このモデルはH-1 パルボウイルスの生物学的特徴に基づく。この分野での非常に精力的研究により、最近20年にわたり、パルボウイルスはその正常な対象を生かす一方、腫瘍細胞を好んで殺す。モデルの作製のために、以下の仮説が提唱された：細胞変性効果に感受性の腫瘍からのH-1 パルボウイルスの細胞変性効果に抵抗性の細胞を選択することが可能であれば、この抵抗性はこれらの抵抗性細胞の悪性表現型における変化によるものであるかもしれない。ヒトK562赤白血病細胞から選択されたKS細胞の場合にはこれを証明できた。K562親細胞はH-1 パルボウイルスの細胞変性効果に感受性であるが、KS細胞は抵抗性である。これらの抵抗性細胞は野性型p53 を再び発現し、in vitroでもin vivo でも抑制される表現型を有する。これらの観察を他の細胞で確認するために、ヒトU937単球白血病のモノクローンからUS3 及びUS4 娘細胞を選択した。これらのクローンはH-1 パルボウイルスの細胞変性効果に抵抗性であり、悪性の表現型のin vivo 復帰を示す。20個の細胞における表面マーカーの分析は、U937とUSクローンの間には分化の段階では移動がないことを示し、これは悪性の表現型の抑制は最終の分化によらないことを示す。 K562もU937細胞もp53 を発現しない。p53 を再発現するKS細胞と反対に、US3 とUS4 細胞はp53 を再発現しない。にもかかわらず、US3 とLUS4細胞は悪性のU9 37親細胞に比べてWAF-1 の活性化を示すことができた。別のp53 非依存性経路におけるこのようなWAF-1 の活性化は、最近報告されており、現在の結果からは、 US3 及びUS4 クローンはこの別のWAF-1 経路を用いていると思われる。 sina遺伝子は、M1細胞、及び野性型p53 を再発現するKS細胞において誘導されうる、野生型p53により活性化される。 U937親細胞はsina mRNA を非常に低度にしか発現しないのに対し、悪性表現型が復帰し、p21 ^waf-1 を再発現しているUS3 及びUS4 娘細胞では、このmRNAの発現が活性化される。興味あることに、sinaは、TUNEL 分析と組み合わせたin-situ ハイブリダイゼーションのためのsinaプローブを用いて二重標識することによって証明されるように、アポトーシスが誘導された細胞において活性化される。これは、系統発生においてよく保存されているヒトsina遺伝子がアポトーシス及び腫瘍抑制に関与していることを証明している。 sinaがp53 とWAF-1 経路の共通部分に位置することはさらに重要なことである。さらに、U937、US3 及びUS4 モデルを用いて、悪性親細胞とこれに直接由来する娘細胞を分子レベルで比較する包括的生物学的モデルを用いることにより、サプレッサー分子は、機能的に関連していることを証明することができた。これらの実験は、特異的ヒト腫瘍抑制遺伝子にサプレッサー表現型を付与するためにはこれらの遺伝子を移動させる必要はないこと、及び、反対に腫瘍復帰は、腫瘍細胞の遺伝物質中に常に存在する調節系の制御下にある−たとえ、その再活性化が必要な場合でも−ことを示す。表クローンの特徴 ^* 5'プライマーの図および配列は、Bauer et al （4）が報告したものに一致。＃ラットβ-4- ホスホリパーゼC mRNA(RATPHOSCB) § ヒトmRNA(HUMMENlC: HUMZFMlC: HUMZFMlA: HUMMENlA) ¶ siah-１BmRNA(MMSIAH1B) ◎ AD3、マウスS182 mRNA 転写物（ヒトS182 mRNA 相同体）(Sherrington et a l.)

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年２月２０日（１９９８．２．２０）【補正内容】化合物。 22．請求の範囲第21項記載の医薬としての、前記ヌクレオチド配列を阻止する活性化ヌクレオチド。 23．請求の範囲第21項記載の医薬としての、前記ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に対するモノクローナル抗体。 24．がんの治療のための医薬としての、請求の範囲第18〜23項のいずれかの項記載の医薬。 25．アルツハイマー病の治療のための医薬としての、請求の範囲第18〜23項のいずれかの項記載の医薬。 26．診断薬、特にがんの疾病素質の判定および追跡調査のための診断薬としての、ヌクレオチドプローブもしくは増幅用プライマーとして用いるための請求の範囲第１〜10項のいずれかの項記載の配列の全部もしくは一部。 27．診断薬、特にがんの疾病素質の判定および追跡調査のための診断薬としての、請求の範囲第１〜10項のいずれかの項記載の配列によりコードされるタンパク質の全部もしくは一部に対応する抗原、または対応する抗体。 28．診断薬、特にアルツハイマー病の疾病素質の判定および追跡調査のための診断薬としての、ヌクレオチドプローブもしくは増幅用プライマーとして用いるための請求の範囲第１項、第５項および第７〜10項のいずれかの項記載の配列の全部もしくは一部。 29．診断薬、特にアルツハイマー病の疾病素質の判定および追跡調査のための診断薬としての、請求の範囲第１項、第５項および第７〜10項のいずれかの項記載の配列によりコードされるタンパク質の全部もしくは一部に対応する抗原、または対応する抗体。 30．抗ウイルス薬としての、請求の範囲第20項記載の医薬。 31．請求の範囲第16項記載の細胞の、抗新生物薬を同定するためのモデルとしての使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 14/82 14/82 16/32 16/32 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｐ 21/08 33/574 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＣＧ０１Ｎ 33/53 5/00 Ｂ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者コーエン，ダニエルフランス国、91600サビニュ―スール―オルジュ、リュー・ドゥ・ロム―オ―メスニエ、３

Claims

【特許請求の範囲】１．下記を含む遺伝子に対応するヌクレオチド配列： (a) 配列番号４から11のいずれかに従った配列、または下記を含む等価の遺伝子： (b) 上記(a) に従った配列のいずれかとハイブリッド形成する配列、 (c) 上記(a) もしくは(b) と80％以上の相同性を示す配列、または (d) 上記(a) 、(b) もしくは(c) に従った遺伝子によりコードされるタンパク質をコードするか、もしくは等価のタンパク質をコードする配列。２．遺伝子の細胞性発現が細胞アポトーシス中に誘導される、請求の範囲第１項記載の配列。３．下記を含む遺伝子に対応するヌクレオチド配列： (a) 配列番号１または３のいずれかに従った配列、または下記を含む等価の遺伝子： (b) 上記(a) に従った配列のいずれかとハイブリッド形成する配列、 (c) 上記(a) もしくは(b) と80％以上の相同性を示す配列、または (d) 上記(a) 、(b) もしくは(c) に従った遺伝子によりコードされるタンパク質をコードするか、もしくは等価のタンパク質をコードする配列、ただし、遺伝子の細胞性発現は腫瘍抑制により誘導される。４．下記を含む遺伝子に対応するヌクレオチド配列： (a) 配列番号２に従った配列、または下記を含む等価の遺伝子： (b) 上記(a) に従った配列のいずれかとハイブリッド形成する配列、 (c) 上記(a) もしくは(b) と80％以上の相同性を示す配列、または (d) 上記(a) 、(b) もしくは(c) に従った遺伝子によりコードされるタンパク質をコードするか、もしくは等価のタンパク質をコードする配列、ただし、遺伝子の細胞性発現は細胞アポトーシスにより誘導される。５．前記遺伝子の細胞性発現がp53 により誘導される、請求の範囲第１〜４項のいずれかの項記載の配列。６．細胞アポトーシスがp53 により誘導される、請求の範囲第２項または第４項に記載の配列。７．TSAP 1ないしTSAP 8およびヒトTSAP 3、または等価の遺伝子から選択される、請求の範囲第１〜６項のいずれかの項記載の配列。８．遺伝子の細胞性発現が細胞アポトーシス中に阻害されている、請求の範囲第１項記載の配列。９．細胞アポトーシスがp53 により誘導される、請求の範囲第８項記載の配列。 10．TSIP 1およびTSIP 2、または等価の遺伝子から選択される、請求の範囲第１項、第８項および第９項のいずれかの項記載の配列。 11．請求の範囲第１〜10項のいずれかの項記載の配列の細胞性発現のためのベクター。 12．ウイルス性ベクターである請求の範囲第11項記載の発現ベクター。 13．アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスまたはポックスウイルスである、請求の範囲第12項記載のベクター。 14．裸の核酸ベクターである請求の範囲第11項記載のベクター。 15．組織もしくは器官への標的化、および／または組織もしくは器官における特異的発現を確実にする配列を含む、請求の範囲第11〜13項のいずれかの項記載のベクター。 16．請求の範囲第11〜15項のいずれかの項記載の発現ベクターにより形質転換された細胞。 17．請求の範囲第16項記載の形質転換細胞を培養することにより得ることができ、請求の範囲第１〜10項のいずれかの項記載の配列によりコードされるタンパク質。 18．医薬としての、請求の範囲第11〜15項のいずれかの項記載のベクター、または請求の範囲第17項記載のタンパク質。 19．医薬としての、請求の範囲第１〜７項のいずれかの項記載のヌクレオチド配列もしくはその産物の少なくとも１つの細胞性発現を確実にする化合物。 20．請求の範囲第19項記載の医薬としての、前記配列の細胞性発現を確実にするヌクレオチドベクター。 21．医薬としての、請求の範囲第１項および第８〜10項のいずれかの項記載の細胞性遺伝子もしくはその産物の少なくとも１つの細胞性発現の阻害を確実にする化合物。 22．請求の範囲第21項記載の医薬としての、前記ヌクレオチド配列を阻止する活性化ヌクレオチド。 23．請求の範囲第21項記載の医薬としての、前記ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に対するモノクローナル抗体。 24．がんの治療のための医薬としての、請求の範囲第18〜23項のいずれかの項記載の医薬。 25．アルツハイマー病の治療のための医薬としての、請求の範囲第18〜23項のいずれかの項記載の医薬。 26．診断薬、特にがんの疾病素質の判定および追跡調査のための診断薬としての、ヌクレオチドプローブもしくは増幅用プライマーとして用いるための請求の範囲第１〜10項のいずれかの項記載の配列の全部もしくは一部。 27．診断薬、特にがんの疾病素質の判定および追跡調査のための診断薬としての、請求の範囲第１〜10項のいずれかの項記載の配列によりコードされるタンパク質の全部もしくは一部に対応する抗原、または対応する抗体。 28．診断薬、特にアルツハイマー病の疾病素質の判定および追跡調査のための診断薬としての、ヌクレオチドプローブもしくは増幅用プライマーとして用いるための請求の範囲第１項、第５項および第７〜10項のいずれかの項記載の配列の全部もしくは一部。 29．診断薬、特にアルツハイマー病の疾病素質の判定および追跡調査のための診断薬としての、請求の範囲第１項、第５項および第７〜10項のいずれかの項記載の配列によりコードされるタンパク質の全部もしくは一部に対応する抗原、または対応する抗体。 30．抗ウイルス薬としての、請求の範囲第20項記載の医薬。 31．抗新生物薬を同定するためのモデルである、請求の範囲第16項記載の細胞。 32．Liang およびPardeeの方法の改良法としての、PCR 増幅中に段階的減少を用いること。