JP2000502899A

JP2000502899A - ポリケチド結合糖生合成遺伝子

Info

Publication number: JP2000502899A
Application number: JP9523805A
Authority: JP
Inventors: サマース，リチヤード・ジー，ジユニア; カツツ，レナード; ドナデイオ，ステフアノ; ステイバー，マイケル・ジエー
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1995-12-21
Filing date: 1996-12-23
Publication date: 2000-03-14
Also published as: WO1997023630A3; US5998194A; MX9804995A; WO1997023630A2; EP0874548A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ポリケチド結合糖の生合成に関与する酵素をコードするサッカロミセス．エリスラエア（Saccharomyces.erythraea）からの単離されたポリヌクレオチドを提供する。また、新規グリコシル化修飾ポリケチドの製造のための、該ポリヌクレオチドの使用方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ポリケチド結合糖生合成遺伝子発明の分野本発明は、遺伝子操作により特異的ポリケチド類似体の生合成を誘導する方法に関する。特に、糖の生合成遺伝子を操作して、予想される正確な構造の新規グリコシル化修飾マクロライドを製造する。発明の背景ポリケチドは、多数の重要な抗生物質、抗真菌化合物、抗癌化合物および抗寄生虫化合物（例えば、エリスロマイシン、アンホテリシン、ダウノルビシンおよびアベルメクチン）を含む天然物の大きなクラスである。それらの合成は、アシルエステルの秩序立った縮合により進行して、種々の長さ、側鎖および還元パターンの炭素鎖を生成し、それらの炭素鎖は特異的に環化され、ついで修飾されて成熟ポリケチドを与える。多数のポリケチドでは、成熟は、環化炭素鎖への１以上の糖残基の付加を含む。糖残基は、成熟ポリケチドの生物活性に決定的に重要である場合が多い。ストレプトマイセス（Streptomyces）属およびそれと密接に関連しているサッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）属は、ポリケチド代謝産物の驚異的な生産体である。これらの化合物は商業的に重要であるため、ストレプトマイセスの遺伝学の研究には多大な努力がなされている。その結果、ストレプトマイセスに関して多くのことが公知であり、これらの生物内にＤＮＡを導入するためのいくつかのクローニングベクターが存在する。多数のポリケチドが同定されているにもかかわらず、改善された特性を有する新規グリコシル化修飾(本明細書で定義される)ポリケチド構造を得ることが依然として必要とされている。そのような分子を得るための現在の方法は、生物サンプルのスクリーニングおよび既存ポリケチドの化学修飾を含み、それらは共に、多くの経費と時間を要する。現在のスクリーニング方法は、分子の総体的な特性（すなわち、抗微生物活性、抗真菌活性など）に基づくものであり、得られた分子の構造を演繹的に知ることや、改善された特性を前もって決定することは、共に、事実上不可能である。既存構造の標準的な化学修飾の利用には成功しているが、そのような化学修飾は、入手可能な化合物型の数に制限されてしまう。さらに、多段階化学合成の収率が低いため、このアプローチの実用性が制限されてしまうことが多い。ポリケチドに結合した糖残基に対する以下の修飾は、現時点では特に困難であるか又は非効率的である：特異的ヒドロキシルまたはメチル基の立体化学の変化、特異的ヒドロキシル基の酸化状態の変化、および特異的炭素の脱酸素。したがって、そのような変化が特定して達成された分子を得ることが必要とされており、このことは、予想された構造を有する改変されたグリコシル化修飾ポリケチド分子の製造技術の改良に相当するであろう。本発明は、ポリケチド結合糖の生合成に関与する糖生合成遺伝子の遺伝子配列を提供することにより、これらの問題点を克服するものである。発明の概要本発明は、１つの態様において、単離された一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）であって、（a）（i）図 4A（配列番号１）の約 54 位ヌクレオチドから約 1136位ヌクレオチドまでのセンス配列、（ii）配列番号１の約 1147位ヌクレオチドから約 2412 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（iii）配列番号１の約 2409 位ヌクレオチドから約 3410 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（iv）図 4B（配列番号２）の約 80位ヌクレオチドから約 1048 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（v）配列番号２の約 1048 位ヌクレオチドから約 2295 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（vi）配列番号２の約 2348 位ヌクレオチドから約 3061 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（vii）配列番号２の約 3214 位ヌクレオチドから約 4677 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（ viii）配列番号２の約 4674 位ヌクレオチドから約 5879 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（ix）配列番号２の約 5917 位ヌクレオチドから約 7386 位ヌクレオチドまでのセンス配列、および（x）配列番号２の約 7415 位ヌクレオチドから約 7996 位ヌクレオチドまでのセンス配列よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）の配列と相補的な配列；（ｃ）発現されると、（ａ）の配列にコードされるポリペプチドをコードする配列；および（ｄ）（ａ）および（ｂ）の配列と厳密な条件下でハイブリダイズする類似配列を含むヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。好ましい分子は、ＤＮＡ分子である。もう１つの実施態様においては、該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である。もう１つの実施態様においては、本発明のＤＮＡ分子は、発現ベクター中に含有されている。発現ベクターは、好ましくは、該ポリヌクレオチドに作動的に結合したエンハンサー−プロモーターをさらに含む。好ましい実施態様においては、該ベクター中のＤＮＡ分子は、前記の好ましい配列の１つである。特に好ましい実施態様においては、該ベクター中のＤＮＡ分子は、配列番号２の約 80 位ヌクレオチドから約 1048 位ヌクレオチドまでの配列である。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。好ましくは、該宿主細胞は、サッカロポリスポラ・スピーシーズ（Saccharopolyspora spp.）、ストレプトマイセス・スピーシーズ（ Streptomyces spp.）および大腸菌（E．coli）よりなる群から選ばれる細菌細胞である。本発明はまた、糖残基の合成およびポリケチドに対するその付加を支配するＤＮＡ内の特定された変化を設計し導入することによる新規グリコシル化修飾ポリケチド構造体の製造法を提供する。１つの方法においては、特異的グリコシル化修飾ポリケチドの生合成は、ポリケチド産生微生物の遺伝子操作により行ない、該遺伝子操作は、前記のものから糖生合成遺伝子含有ＤＮＡ配列を単離し、ポリケチド結合糖の生合成またはポリケチドに対するその結合を引き起こす１以上のＤＮＡ断片を、該遺伝子含有ＤＮＡ配列内で同定し、１以上の特定された変化を該ＤＮＡ断片中に作製して、改変ＤＮＡ配列を得、該改変ＤＮＡ配列（該改変ＤＮＡ配列は、翻訳されると、該特異的グリコシル化修飾ポリケチドの産生を引き起こしうる改変された酵素活性を与える）をポリケチド産生微生物中に導入して、もとの配列を置換し、該特異的グリコシル化修飾ポリケチドの形成に適した条件下で、該改変ポリケチド産生微生物の培養を成長させ、該培養から該特異的グリコシル化修飾ポリケチドを単離する工程を含む。２番目の方法においては、特異的グリコシル化修飾ポリケチドの生合成を、前記のものから糖生合成遺伝子含有ＤＮＡ配列を単離し、ポリケチド結合糖の生合成またはポリケチドに対するその結合を引き起こす１以上のＤＮＡ断片を、該遺伝子含有ＤＮＡ配列内で同定し、該ＤＮＡ断片の鎖配向を逆転させて、改変ＤＮＡ配列（これは、転写されると、アンチセンスｍＲＮＡの産生を引き起こす）を得、該改変ＤＮＡ配列を、該アンチセンスｍＲＮＡに結合しうるｍＲＮＡを有するポリケチド産生微生物中に導入して、該特異的グリコシル化修飾ポリケチドを産生しうる改変ポリケチド産生微生物を得、該特異的グリコシル化修飾ポリケチドの形成に適した条件下で、該改変ポリケチド産生微生物の培養を成長させ、該培養から該特異的グリコシル化修飾ポリケチドを単離することにより行なう。３番目の方法においては、特異的グリコシル化修飾ポリケチドの生合成を、前記のものから糖生合成遺伝子含有ＤＮＡ配列を単離し、ポリケチド結合糖の生合成またはポリケチドに対するその結合を引き起こす１以上のＤＮＡ断片を、該遺伝子含有ＤＮＡ配列内で同定し、該ＤＮＡ断片をポリケチド産生微生物中に導入して、該ＤＮＡ断片の転写および翻訳により、該特異的グリコシル化修飾ポリケチドを産生しうる改変ポリケチド産生微生物を得、該特異的グリコシル化修飾ポリケチドの形成に適した条件下で、該ＤＮＡ断片を含有する該改変ポリケチド産生微生物の培養を成長させ、該培養から該特異的グリコシル化修飾ポリケチドを単離することにより行なう。好ましくは、前記方法の糖生合成遺伝子含有ＤＮＡ配列は、 L−ミカロースおよび／または D−デソサミンの生合成に関与する酵素活性をコードする遺伝子を含む。より好ましくは、該糖生合成遺伝子含有ＤＮＡ配列は、配列番号２の約 80 位ヌクレオチドから約 1048 位ヌクレオチドまでの配列を含む。本発明は、臨床的に有用な抗生物質の過半数を提供する生物であるストレプトマイセス（Streptomyces）およびサッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）からの糖生合成遺伝子を操作するのに特に有用である。図面の簡単な説明図 1A は、エリスロマイシン生合成遺伝子クラスターの体制および生合成遺伝子の遺伝的名称を示す。図 1B は、エリスロマイシン生合成遺伝子をエリスロマイシン生合成におけるそれらの役割と広範に関連づけるエリスロマイシン生合成の簡略スキームを示す。７個の eryB 遺伝子（eryBI-eryBVII）は、L−ミカロースの生合成またはエリスロノリド B 環に対するその結合を引き起こし、６個の eryC 遺伝子（eryCI-eryCVI）は、D−デソサミンの生合成または 3−α−ミカロシルエリスロノリド B 環に対するその結合を引き起こす。破線矢印は、エリスロマイシンB を経由する経路が、エリスロマイシン A に至る主要な天然生合成経路でないことを示している。図２は、L−ミカロースの生合成に関して提案されているスキームおよび特定の工程を引き起こす eryB 遺伝子を示す。図３は、D−デソサミンの生合成に関して提案されているスキームおよび特定の工程を引き起こす eryC 遺伝子を示す。図 4A（1-4）は、糖生合成遺伝子 eryCII（54〜1136に相当）、eryCIII（1147 〜2412 に相当）および eryBII（2409〜3410 に相当）のヌクレオチド配列（配列番号１）を、該オープンリーディングフレームの対応する翻訳（それぞれ、配列番号３、配列番号４および配列番号５）と共に示す。アミノ酸に関する標準的な一文字コードを、ここに記載するそれらの対応する核酸コドンの下に示す。図 4B（1-9）は、糖生合成遺伝子 eryBIV（80〜1048 に相当）、eryBV（1048 〜2295 に相当）、eryCVI（2348〜3061 に相当）、eryBVI（3214〜4677 に相当）、eryCIV（4674〜5879 に相当）、eryCV（5917〜7386 に相当）およびeryBVII （7415〜7996 に相当）のヌクレオチド配列（配列番号２）を、推定オープンリーディングフレームの対応する翻訳（それぞれ、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号 10、配列番号 11および配列番号 12）と共に示す。アミノ酸に関する標準的な一文字コードを、ここに記載するそれらの対応する核酸コドンの下に示す。図 5A は、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea）の eryBIV 遺伝子にコードされる糖生合成酵素(配列番号６)と、エルシニア・シュードツベルクローシス(Yersiniapseudotuberculosis)の ascF 遺伝子[Thorson ら, J. Ba cteriol.,176:5483（1994）］、サルモネラ・エンテリカ（Salmonellaenterica ）の rfbJ 遺伝子［Jiang ら，Mol．Microbiol.，5:695（1991）］、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomycesgriseus）の strL 遺伝子［Pissowotzkiら , Mol．Gen．Genet.241:193（1993）］および大腸菌（Escherichia coli）の ga lE遺伝子［Lemaire および Hill，Nucl．Acids Res．14:7705（1986）］にコードされる糖生合成酵素（それぞれ配列番号 13、配列番号 14、配列番号 15 および配列番号 16）との間のアミノ酸配列の同一性を示す。この図面およびアミノ酸配列の同一性を比較している他の図面においては、大文字は、種間のコンセンサス（同一）アミノ酸または該コンセンサス残基の保存的置換アミノ酸を表す。また、各図面では、「Consensus（コンセンサス）」と表示されている配列は、保存アミノ酸の便宜的表現にすぎず、実在するいずれのポリペプチド配列を表現するものでもない。図 5B は、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea）の eryBVII 遺伝子にコードされる糖生合成酵素（配列番号 12）と、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomycesgriseus）の strM 遺伝子［Pissowotzki ら，Mol．Ge n．Genet.241:193（1993）］、サルモネラ・エンテリカ（Salmonellaenterica）の rfbC 遺伝子［Jiang ら，Mol．Microbiol.，5:695（1991）］、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersiniaentercolitica）［Zhang ら，Mol．Microbiol.，9: 309（1993）］の rfbF 遺伝子、およびエルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）の ascE 遺伝子［Thorson ら，J．Bacteriol. ，176:5483（1994）］にコードされる糖生合成酵素（それぞれ配列番号 17、配列番号 18、配列番号 19および配列番号 20）との間のアミノ酸配列の同一性を示す。図 5C は、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea）の eryCIV 遺伝子にコードされる糖生合成酵素（配列番号 10）と、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea）の ervCI 遺伝子［Dhillon ら，Mol．Microbiol .， 3:1405（1989）］、エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudot uberculosis）の ascC 遺伝子［Weigel ら，Biochemistry，31:2129（1992）,Th orson ら，J．Am．Chem．Soc.,115:6993（1993），Thorson ら， J．Bacterio 1.， 176:5483（1994）］、ストレプトマイセス・ピウセチウス(Streptomycesp eucetius)の dnrJ遺伝子[Stutzman-Engwallら，J．Bacteriol.,174:144（1992）］、ストレプトマイセス・アルボニガー（Streptomyces alboniger）のprg1 遺伝子［Lacalle ら，EMBOJ.，11:785（1992）］、およびストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）の strS 遺伝子［Distler ら，Gene,115:105 （1992）］にコードされる糖生合成酵素（それぞれ配列番号 21、配列番号 22、配列番号 23、配列番号 24 および配列番号 25）との間のアミノ酸配列の同一性を示す。図 5D は、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea）の eryBV および eryCIII 遺伝子にコードされる糖生合成酵素（それぞれ配列番号７および配列番号４）と、ストレプトマイセス・ピウセチウス（Streptomyces peucetius ）の dnrS遺伝子［Otten ら，Ｊ．Bacteriol.，177:6688（1995）］にコードされる糖生合成酵素（配列番号 26）との間のアミノ酸配列の同一性を示す。図 5E は、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea）の eryCVI 遺伝子にコードされる糖生合成酵素（配列番号８）と、ストレプトマイセス・アンボファシエンス(Streptomyces ambofaciens)の srmX 遺伝子[Geistlichら，Mo l.Microbiol.，6:2019（1992）］、ストレプトマイセス・プルプラセンス（Stre ptomyces purpurascens）の rdmD 遺伝子［GenBank受託： U10405］にコードされる糖生合成酵素（それぞれ配列番号 27 および配列番号 28）およびラット（R attus norvegious）のグリシンメチルトランスフェラーゼ［Ogawa ら，Eur．J.B iochem．168:141（1987）］（配列番号 29）との間のアミノ酸配列の同一性を示す。図 6A〜6D は、それぞれ実施例１〜４において生成したと考えられる化合物を示し、Ｉ型（図6A）、II型（図 6B）およびIII型（図 6Cおよび 6D）改変から生成した化合物を表す。図７は、実施例２に記載する発現プラスミド pASX2 の構築を示す。図７〜13 では、以下の略語を使用する：amp、アンピシリン耐性遺伝子；tsr、チオストレプトン耐性遺伝子；ROP、プラスミド合成遺伝子のレプレッサー；eryBI、eryBII 、ervBIII、 eryBIV、eryBV、eryBVI、eryBVII、eryCI、eryCII、eryCIII、eryCIV、eyCV および eryCVI、ミカロースの合成またはマクロライド環に対するその結合（eryB ）またはデソサミンの合成またはマクロライド環に対するその結合（eryC）に関与するエリスロマイシン生合成遺伝子［遺伝子の上の細い矢印は、その相対サイズおよび転写の方向を示す］；ori-E. coli、大腸菌（E.coli）において機能するＤＮＡ複製の起点（特定の実施例においては、ColEl起点）；ori-Streptomyce s、ストレプトミセス（Streptomyces）において機能するＤＮＡ複製の起点（特定の実施例においては、pJV1 起点）［Servin-Gonzalez ら，Microbiology，141 :2499（1995）］；p-ermE*、エリスロマイシン耐性遺伝子の修飾プロモーター；ｔ-fd、バクテリオファージfd の遺伝子 VIII 転写ターミネーター；PCR、ボリメラーゼ連鎖反応。制限酵素部位は、それらの標準的な商品名（すなわち、BamH I、EcoRI など）で示されている。プラスミド合成スキーム中の大きな矢印に添えられている略語は、プラスミド構築に含まれる各工程を要約している。これらの工程については、関連する実施例において十分に説明する。図８は、実施例２に記載の ervBVII アンチセンス発現プラスミド pASBVII の構築を示す。図 9A は、担体プラスミド pK1 の構築を示す。図 9B〜E は、全 eryB 遺伝子を運ぶプラスミド pKB6（実施例３に記載）の構築を示す。図 10 は、実施例３に記載の発現プラスミド pX1 の構築を示す。図 11 は、実施例３に記載の eryB 発現プラスミド pXSB6 および pXB6 の構築を示す。図 12A〜B は、実施例４に記載の全 eryC 遺伝子を運ぶプラスミド pKC4 の構築を示す。図 13 は、実施例４に記載の eryC 発現プラスミド pXSC4 および pXC4 の構築を示す。発明の詳細な説明Ｉ．本発明本発明は、ポリケチド結合糖の生合成またはポリケチドに対するそれらの結合を引き起こす酵素またはその断片をコードする単離され精製されたポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドを含有するベクター、それらのベクターで形質転換された宿主細胞、それらのポリヌクレオチドおよびベクターを使用する新規グリコシル化ポリケチドの製造法、および単離され精製された組換えポリペプチドおよびそのポリペプチド断片を提供する。 II．定義本明細書で開示し特許請求する本発明の目的に関して、以下の用語を定義する。本発明で用いる「ポリケチド」なる語は、抗生物質、抗真菌化合物、抗癌化合物および抗寄生虫化合物を含む（これらに限定されるものではない）天然物の大きな多様なクラスを意味する。抗生物質としては、種々の型のアントラサイクリンおよびマクロライド（ポリエンおよびアベルメクチンならびにエリスロマイシンなどの古典的なマクロライド）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。「グリコシル化ポリケチド」なる語は、１以上の糖残基を含有する任意のポリケチドを意味する。「グリコシル化修飾ポリケチド」なる語は、個々のポリケチドの非修飾または天然形態と比べて変化したグリコシル化パターンまたは立体配置を有するポリケチドを意味する。本発明で用いる「ポリケチド産生微生物」なる語は、天然で、あるいは適当に操作（すなわち遺伝的に操作）された後で、ポリケチドを産生しうる任意の微生物を含む。放線菌およびそれらが天然で産生するポリケチドには、以下の表１に記載のものが含まれるが、これらに限定されるものではない（参考として本明細書に組入れる Hopwood，D．A．および Sherman ，D．H.，Annu.Rev．Genet.，24:37-66（1990）を参照されたい）。ポリケチドを天然で産生するポリケチド産生微生物の他の具体例には、種々のアクチノマデュラ（Actinomadura）、ダクチロスポランギウム（Dactylosporang ium）およびノカルジア（Nocardia）株が含まれる。本発明で用いる「糖生合成遺伝子」なる語は、糖生合成酵素をコードするサッカロポリスポラ・エリスラエア（Saccharopolyspora erythraea）からのＤＮＡ配列を意味し、サッカロポリスポラ・エリスラエアから得られるものと同一または類似した他のポリケチド産生微生物からのＤＮＡ配列を包含する意である。本発明で用いる「糖生合成酵素」なる語は、ポリケチド結合糖ならびにそれらの誘導体および中間体の生合成および／または結合に関与するポリペプチドを意味する。「ポリケチド結合糖」なる語は、ポリケチドに結合することが知られているか、あるいは本明細書に記載する方法によりポリケチドに結合しうる糖を意味する。「糖誘導体」なる語は、天然でポリケチドに結合しているが、非修飾または天然形態と比べて改変されている糖を意味し、単なる例示として、N−3−α−デスジメチル D−デソサミン、D− ミカロース、4−ケト−L−ミカロース、4−ケト−D−ミカロース、3−デスメチル L−ミカロースおよび 3−デスメチル D−ミカロースが含まれる。「糖中間体」なる語は、糖生合成経路において産生される中間体化合物を意味する。本発明で用いる「eryB」なる語は、デオキシ糖 L−ミカロースの生合成に特異的に関与する酵素をコードするＤＮＡ配列を意味する。本発明で用いる「eryC」なる語は、デオキシ糖 L−デソサミンの生合成に特異的に関与する酵素をコードするＤＮＡ配列を意味する。 III．ポリヌクレオチドエリスロマイシンの生合成を決定するサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sa ccharopolyspora erythraea （Sac.erythraea））染色体のセグメントの体制、および糖 L−ミカロースおよび D−デソサミンの生合成を決定する対応遺伝子（それぞれ、eryB および eryC と称される）を、図 1A に示す。各糖の生合成には数個の遺伝子が必要であり、これらの遺伝子はお互いの中で点在していることが分かる。各遺伝子は、チミジンジホスホ−4−ケト−6−デオキシグルコース（TDP−グルコース）からの L−ミカロースまたは D−デソサミンの生合成における一工程または数工程を触媒する酵素をコードしていると予想され、これらの工程の概要を図２および図３に示す。L−ミカロースの場合（図２に示す）、これらの工程は、（１）C-2″脱酸素、（２）C-2″/C-3″エノイル還元、（３）C-5″エピマー化、（４）C-3″C-メチル化、（５）C-4″ケト還元、および（６）エリスロノリド B への転移を含む。図３に示す D−デソサミンの場合は、これらの工程は、（１）C-4′/3′異性化、（２、３）C-3′脱酸素および還元、（４）C-3′アミノ化、（５、６）N-3a′ N-ジメチル化およびミカロシルエリスロノリド Bへの転移を含む。遺伝子のこの分類（eryB クラスまたはeryC クラスのいずれかに属しているとするもの）は、まずエリスロマイシン産生株において（すなわちインビボで）関心のある野生型遺伝子を改変してそれらの発現を不活性化することにより決定された。ついで、そのような改変から生じたエリスロマイシン産物を分析した。改変によりエリスロノリド Bの蓄積を引き起こした（L−ミカロースが欠損しているか又はエリスロノリド環に対する L−ミカロースの結合が生じていないことを示す）遺伝子は、eryB 遺伝子として分類した。改変により 3−α−L−ミカロシルエリスロノリド B の蓄積を引き起こした（D−デソサミンが欠損しているか又は 3−α−L−ミカロシルエリスロノリド B環に対する D−デソサミンの結合が生じていないこと示す）は、eryC遺伝子として分類した。したがって、本発明において eryB または eryC として同定したそのようなすべての遺伝子が、L−ミカロースまたは D−デソサミンの合成に関与していることに注目すべきである。eryB および eryC にコードされるポリペプチドの予想される機能的活性については、後でさらに詳しく検討することにする。したがって、本発明は、１つの態様において、グリコシル化ポリケチドの産生に関与する酵素をコードする、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．eryth raea）からの単離され精製された eryB および eryC ポリヌクレオチドを提供する。糖生合成酵素をコードする本発明のポリヌクレオチドは、単離された一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドであって、（ａ）（ｉ）図 4A（配列番号１）の約 54 位ヌクレオチドから約 1136 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（ii）配列番号１の約 1147 位ヌクレオチドから約 2412 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（iii）配列番号１の約 2409 位ヌクレオチドから約 3410 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（iv）図 4B（配列番号２）の約 80 位ヌクレオチドから約 1048 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（v）配列番号２の約 1048 位ヌクレオチドから約 2295 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（vi）配列番号２の約 2348 位ヌクレオチドから約 3061 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（vii）配列番号２の約 3214 位ヌクレオチドから約 4677 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（viii）配列番号２の約 4674 位ヌクレオチドから約 5879 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（ix）配列番号２の約 5917 位ヌクレオチドから約 7386 位ヌクレオチドまでのセンス配列、および（x）配列番号２の約 7415 位ヌクレオチドから約 7996 位ヌクレオチドまでのセンス配列よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）の配列と相補的な配列；（ｃ）発現されると、（ａ）の配列にコードされるポリペプチドをコードする配列；および（ｄ）（ａ）の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする類似配列を含むヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。好ましいポリヌクレオチドはＤＮＡ分子である。もう１つの実施態様においては、該ポリヌクレオチドはＲＮＡ分子である。糖生合成遺伝子のヌクレオチド配列および推定アミノ酸残基配列を、図 4A（1 -4）および図 4B（1-9）に記載する。図 4A（1-4）（配列番号１）および図 4B （1-9）（配列番号２）のヌクレオチド配列は、糖生合成遺伝子の２つの異なるクラスターのセンス鎖の完全長ＤＮＡクローンを表し、センス鎖（上側に示す）とその相補体との両方を表すと意図される。センス鎖の下に示すアミノ酸配列は、（i）配列番号１の約 54 位ヌクレオチドから約 1136 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（ii）配列番号１の約 1147 位ヌクレオチドから約 2412 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（iii）配列番号１の約 2409 位ヌクレオチドから約3 410 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（iv）配列番号２の約80 位ヌクレオチドから約 1048 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（v）配列番号２の約 1048 位ヌクレオチドから約 2295 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（vi）配列番号２の約 2348 位ヌクレオチドから約 3061 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（ vii）配列番号２の約 3214 位ヌクレオチドから約 4677 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（viii）配列番号２の約 4674 位ヌクレオチドから約 5879 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（ix）配列番号２の約 5917 位ヌクレオチドから約 7386 位ヌクレオチドまでのセンス配列、および（x）配列番号２の約 7415位ヌクレオチドから約 7996 位ヌクレオチドまでのセンス配列よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドに対応する。前記の（i）−（x）のヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドは、それぞれ配列番号３〜配列番号12 に記載する。本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記ＤＮＡ配列とハイブリダイズする類似ＤＮＡ配列を意図する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野においてよく知られており、約 80 ％〜90％を超える配列同一性の程度を定めるものである。「類似」なる修飾語は、類似ポリペプチド（すなわち糖生合成酵素に関して）をコードするヌクレオチド配列を意味し、類似ポリペプチドは、同類的な相違を有するに過ぎず、糖生合成酵素の通常の特徴および活性を保有しているポリペプチドである（類似ポリペプチドについては、後でより詳しく説明する）。本発明はまた、前記ＤＮＡ配列の天然に生じる対立遺伝子変異および突然変異（ただし、それらの変異および突然変異が、発現に際して後記の本発明の糖生合成遺伝子をコードする場合に限られる）を意図する。当該技術分野でよく知られているとおり、遺伝暗号の縮重のため、前記糖生合成遺伝子およびその断片にコードされるポリペプチドと同じポリペプチドをコードしうる多数の他のＤＮＡおよびＲＮＡ分子が存在する。したがって、本発明は、発現に際して配列番号３〜配列番号 11 のポリペプチドまたはそれらの断片をコードする他のＤＮＡおよびＲＮＡ分子を意図する。糖生合成遺伝子にコードされるアミノ酸残基配列が同定されたら、個々のアミノ酸残基のすべてのトリプレットコドンの知見を利用して、そのようなすべてのコードＲＮＡおよびＤＮＡ配列を記載することが可能である。本明細書中に具体的に開示する以外のＤＮＡおよびＲＮＡ分子のうち、単に或る特定のアミノ酸についてのコドンの変化により特徴づけられるＤＮＡおよびＲＮＡ分子は、本発明の範囲に含まれる。 20 個の一般のアミノ酸およびそれらの典型的な略語、記号およびコドンは、当該技術分野でよく知られている（例えば、 Molecular Biology of the Cell，第２版，B．Alberts ら，Garland Publishing Inc., New York and London, 1989を参照されたい）。当該技術分野ではよく知られているとおり、コドンは、ｍＲＮＡ分子中のヌクレオチドのトリプレット配列を構成し、それ自体は、ＤＮＡ分子中に存在する塩基チミジン（T）の代わりに塩基ウラシル（U）を有することにより特徴づけられる。ポリヌクレオチド内の同じアミノ酸残基についてのコドンの単純な変化は、コードされるポリペプチドの構造を変化させないであろう。例えば、配列１で認められるとおり、セリンについての ACG コドンは、126〜128 位ヌクレオチド、そして 420〜422 位および 561〜563 位にも存在する。しかしながら、同配列で認められるとおり、セリンは、TCG コドン（例えば、192〜194 位ヌクレオチド参照）および TCC コドン（例えば、204〜206位ヌクレオチド参照）にコードされることも可能である。セリンについての後者のコドンをセリンについての ACG コドンで置換しても（あるいはその逆を行なったとしても）、配列番号１のＤＮＡ配列は実質的に変化せず、同じポリペプチドが産生する。同様に、列挙されているコドンを他の等価なコドンで置換することも、本発明の範囲から逸脱することなく同様に可能である。また、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子であってもよい。本発明で意図されるＲＮＡ分子は、前記の任意のＤＮＡ配列と相補的であるか又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。代表的で好ましいＲＮＡ分子は、本発明の糖生合成酵素をコードするｍＲＮＡ分子である。 IV．ポリペプチド本発明は、もう１つの態様において、糖生合成酵素であると合理的に考えられるポリペプチドを提供する。本発明の糖生合成酵素は、約 21kdal〜約 47kdal のポリペプチドである。図 5A〜5E に記載するとおり、ある eryB および eryC 遺伝子にコードされる予想ポリペプチドの類似体が種々の種で同定されており、 PRETTY ルーチン（Genetics Computer Group（GCG）Sequence Analysis Softwar e Package，Madison，WI）を用いてそれらの配列を比較した。他のこれらの糖生合成遺伝子のポリペプチドと ervB および eryC 遺伝子にコードされるポリペプチドとの間に存在するアミノ酸配列の同一性の程度に基づき、ある酵素活性が e ryB および eryC ポリペプチドに起因するものであると合理的に考えることができる。例えば、eryBIV 遺伝子にコードされるポリペプチドの類似体が、エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）および大腸菌（Escherichiacoli）において同定されている（図 5A を参照されたい）。290〜328 のアミノ酸残基を有する種々の類似体が同定されており、アミノ酸配列同一性が低いことにより特徴づけられる（例えば、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac. erythraea）の ery BIV 遺伝子にコードされる糖生合成酵素と大腸菌（E．coli）の galE 遺伝子にコードされる糖生合成酵素との間の同一性は、アミノ酸レベルで 20％である）。しかしながら、保存されているアミノ酸配列モチーフGxxGxxG（Gはアミノ酸グリシンを表し、ｘは他の任意のアミノ酸残基を表す）が、示されている全類似体の最初の 30アミノ酸残基内で見出される。galE 遺伝子にコードされるポリペプチドはエピメラーゼであることが判明しているため（そのメカニズムはケト還元を含む（Bauer ら，Proteins 12：372（1992）））、eryBIV 遺伝子産物は、ケトレダクターゼであると合理的に予想される。図 5B に示すとおり、eryBVII 遺伝子にコードされる糖生合成酵素の類似体が、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、サルモネラ・エンテリカ（Sa1monella enterica）、エルシニア・エンテルコリチカ（Yersinia entercolitica）およびエルシニア・シュードツベルクローシス（ Yersinia pseudotuberculosis）において同定されている。183〜200 アミノ酸残基を有する種々の類似体が同定されており、アミノ酸配列同一性が中等度であることにより特徴づけられる。例えば、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac. erythraea）の eryBVTII 遺伝子にコードされる糖生合成酵素とサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enter ica）の rfbC 遺伝子またはストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces gr iseus）の strM遺伝子にコードされる糖生合成酵素との間のアミノ酸レベルでの同一性は、それぞれ 37％および 61％である）。さらに、これらの個々のポリペプチド（eryBVII のものを含む）に共通の特徴は、それらが L−糖の生合成のみに関連しており、D−糖の生合成には関連していないことである。したがって、e ryBVII の遺伝子産物は、糖の立体化学を「D」配置から「L」配置へ変換する C- 5エピメラーゼとして機能すると合理的に予想される。図 5C に記載するとおり、ervCIV 遺伝子にコードされる糖生合成酵素の類似体が、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）およびエルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）において同定されている。図5C に記載するとおり、eryCI および eryCIV のタンパク質産物の予想アミノ酸配列は、互いに 34％の配列同一性を共有し、エルシニア・シュードツベルクローシス(Yersinia pseudotuberculosis）からの asc C にコードされる予想アミノ酸配列に対してそれぞれ 27％および 25％の配列同一性を有する。ascC にコードされる酵素は、L−アスカリロースの C-3 位に位置するヒドロキシル基を除去することが示されている（Liu および Thorson，An nu．Rev．Microbiol．48:223（1994））。したがって、eryCI または eryCI Vにコードされるポリペプチドの少なくとも１つは、脱酸素反応において機能する酵素であると予想される。さらに、ascC 遺伝子にコードされる酵素は生化学的補因子ピリドキサミンを必要とし、この補因子は、生化学的アミノ基転移反応で使用されるのと同じ補因子である。そのため、ascC にコードされるポリペプチドに対して中等度の配列類似性を有するいくつかのタンパク質類似体（例えば、ストレプトマイセス・ピウセチウス（Sreptomyces peucetius）からの dnrJ、ストレプトマイセス・アルボニガー（Sreptomyces alboniger）からのprgl およびストレプトマイセス・グリセウス（Sreptomyces griseus）からの strs）は、アミノ糖生合成においてトランスアミナーゼとして機能すると提案されている（Thorson ら，J．Am．Che m．Soc．115:6993（1993））。D−デソサミンの生合成は脱酸素とアミノ基転移の両方を必要とするため、eryCI またはeryCIV 遺伝子にコードされるポリペプチドの少なくとも１つはアミノ基転移反応において機能すると予想するのが合理的である。図 5D に記載するとおり、eryBV および eryCIII にコードされる予想ポリペプチドは、アミノ酸レベルで 43％の同一性を共有し、それ自体が、それらの個々の糖に関して同様の活性を有していると推定することができる。しかしながら、図２および３に示すとおり、L−ミカロースおよび D−デソサミン生合成の提案されている経路には共通の工程がない。これらのポリペプチドは、同様の糖生合成機能を有するというよりむしろ、（少なくともサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）においては）L−ミカロースおよび D−デソサミンをそれぞれエリスロノリド Bおよび 3−α−ミカロシルエリスロノリド Bに結合させるように機能するヌクレオチジル糖トランスフェラーゼであると予想される。図 5E に記載するとおり、eryCVI 遺伝子にコードされるポリペプチドの類似体が、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Sreptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・プルプラセンス（Sreptomyces purpurascens）およびラット（Rattusnorvegicus）において同定されている。237〜293 のアミノ酸残基を有する種々の類似体が同定されており、アミノ酸同一性が低度から中等度であることにより特徴づけられる。例えば、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sa c．erythraea）の eryCVI遺伝子にコードされる糖生合成酵素とラット（Rattusn orvegicus）のグリシンメチルトランスフェラーゼとの間の同一性は、アミノ酸レベルで 26％である。さらに、これらの糖生合成酵素は、生化学的機能が公知（Ogawa ら，Eur．J．Biochem.168:141（1987））のラットグリシンメチルトランスフェラーゼと共通の配列モチーフ LDVACGTG（配列番号 30＝図 5E のConsen sus(コンセンサス)配列における 64〜71 位アミノ酸）を共有する。したがって、これらのポリペプチドは N−メチルトランスフェラーゼであると予想される。本発明は、もう１つの態様において、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sa c．erythraea）からの組換え C-4″ケトレダクターゼを提供する。本発明の組換えサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea） C-4″ケトレダクターゼは、約 322又はそれ以下のアミノ酸残基のポリペプチドである。好ましい組換えサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）C-4″ケトレダクターゼは、配列番号２の約 80 位ヌクレオチドから約 1048 位ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列にコードされるものである。本発明はまた、本明細書中に記載する配列と実質的に重複していて、開示配列と類似した生物活性を示すアミノ酸残基配列を意図する。そのような意図される配列は、アミノ酸残基配列または型の最小の変化（そのわずかな変化は、前記糖生合成酵素の基本的な性質および生物活性を変化させないものである）で特徴づけられる類似配列（例えば、同類置換された配列）を含む。ポリペプチドの生物学的機能を実質的に変化させることなく、該ポリペプチドの構造を修飾し変化させることができろことは、当該技術分野でよく知られている。例えば、ある与えられたポリペプチドにおいて、容易に認識可能な機能喪失を伴うことなく、あるアミノ酸を他のアミノ酸で置換することができる。そのような変化を施す場合には、側鎖置換基の相対類似性（例えば、それらのサイズ、電荷、疎水性、親水性など）に基づいて、アミノ酸残基などの置換を行なうことができる。参考として本明細書に組入れる米国特許第 4,554,101 号に記載のとおり、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：Arg（+3.0）; Lys（+3.0） ; Asp（+3.0）; Glu（+3.0）; Ser（＋0.3）; Asn（+0.2）; Gln（+0.2）; Gly （0）; Pro（-0.5）; Thr（-0.4）; Ala（-0.5）; His（-0.5）; Cys（-1.0）; Met（-1.3； Val（-1.5）; Leu（-1.8）; Ile（-1.8）; Tyr（-2.3）; Phe（-2. 5）および Trp（-3.4）。アミノ酸残基は、同様の親水性値（例えば、プラスマイナス2.0以内の値のもの）を有する別のアミノ酸残基で置換することができ、それでもなお生物学的に等価なポリペプチドが得られると理解される。同様に、ハイドロパシー指数（hydropathic index）の類似性に基づいて置換を行なうことができる。各アミノ酸残基には、その疎水性および荷電特性に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられている。それらのハイドロパシー指数値は、Ile（+4.5）; Val（+4.2 ）; Leu（+3.8）; Phe（+2.8）; Cys（+2.5）; Met（+1.9），Ala（+1.8）; G1y （-0.4); Thr（-0.7）; Ser（-0.8）; Trp（-0.9）; Tyr（-1.3）; Pro（-1.6） ; His（-3.2）; Glu（-3.5）; Gln（-3.5）; Asp（-3.5）; Asn（-3.5）; Lys（ -3.9）およびArg（-4.5）である。ハイドロパシー指数に基づいて置換を行なう場合には、プラスマイナス2.0以内の値が好ましい。Ｖ．新規グリコシル化ポリケチドの製造本発明は、もう１つの熊様において、新規ポリケチド構造体のインビボでの一般的な製造法であって、関連ポリケチドを天然で産生する生物の遺伝情報を選択的に改変し、不活性化または増強させることによる製造法を含む。すなわち、本発明においては、eryB および／または eryC 遺伝子を操作し、ついでそれらを種々のポリケチド産生微生物中に導入することにより、所望の構造の新規ポリケチドを製造する。これらの操作により、「グリコシル化修飾」ポリケチド（すなわち、天然形態と比ベて改変されたグリコシル化パターンまたは立体配置を有するポリケチド）が形成される。例えば、「グリコシル化修飾」ポリケチドは、追加的な糖基（既存のものでない場合）が結合しているポリケチド、天然の糖の代わりに異なる糖（例えば、糖中間体）が結合しているポリケチド、または欠落した糖基を有する（糖基が既に存在していた位置において）ポリケチドである。Ｉ型およびII型改変（後で更に説明する）の場合、グリコシル化修飾ポリケチドは、（１）糖結合酵素（すなわち、ポリケチド構造に対する糖の結合に関与する酵素）の非生産または（２）糖生合成酵素の非生産のいずれかを引き起こすメカニズムにより生じることが可能である。前者の場合は、糖を結合させるように機能する酵素が欠損するため、糖はポリケチドに結合しないであろう。後者の場合は、生合成経路からの糖中間体（欠損する酵素によって決まる）が産生され、該糖中間体は糖結合酵素に適当な基質と認識されればポリケチドに結合し、認識されなければ結合しないであろう。III型改変（これについても後で詳細に説明する）の場合、グリコシル化修飾ポリケチドは、追加的または異なる糖（すなわち、ある特定のポリケチド産生株において通常は見出されないもの）がポリケチドに結合することを介して生じる。仮定されているこれらのメカニズムは、本明細書中に記載する新規方法についての理解を深めるためのものに過ぎず、Ｉ型、 II型およびIII型改変がグリコシル化修飾ポリケチドを産生する実際のメカニズムは現在のところ不明であることに注意すべきである。第１の型の改変（本発明ではＩ型改変と称する）では、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）、またはグリコシル化ポリケチドの他に L−ミカロース、D−デソサミンまたはそれらと密接に関連している誘導体（例えば、ミカミノース（４−ヒドロキシ D−デソサミン））を産生する別の生物の染色体中に、遺伝的に改変された eryB および／または eryC 遺伝子を導入する。eryB および／または eryC 遺伝子の遺伝的改変は、非機能的酵素の合成を引き起こす。その改変された遺伝子は、適当な株に導入されると、その対応する野生型遺伝子と置換され、糖生合成に関与する或る特定の酵素活性を発現する能力の喪失をその株に引き起こさせる。その結果、グリコシル化修飾ポリケチドは、Ｉ型改変に関して既に説明したメカニズムを介して産生される。本明細書中に記載するＩ型の変化においては、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac. erythraea）染色体の eryB および／または eryC 遺伝子中の特異的な突然変異は、１）所望の糖生合成遺伝子のＤＮＡ配列を特異的に改変し、２）適当な宿主の染色体中で組換えを引き起こしうる適当なベクター中に該改変配列をサブクローニングし、３）そのサブクローニングされた配列を含有するベクターを適当な宿主中に導入して、野生型対立遺伝子を突然変異対立遺伝子で置換することを含む３工程の方法により達成される。第１工程は、該ＤＮＡ配列中で欠失、塩基対変換またはフレームシフトを引き起こす標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて行なう。第２工程は、同様に標準的な組換え法を用いて、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea）または所望の宿主中で複製されないベクター中に該改変配列をサブクローニングすることを含む。最終工程では、適当な宿主中に該ベクターを導入し、この場合、遺伝子置換の方法により、野生型対立遺伝子を該改変対立遺伝子で置換する。Ｉ型の変化で用いるすべての技術は、当業者によく知られている。実施例１では、eryB 遺伝子の遺伝子置換の方法を例示する。実施例１で示すとおり、関心のある eryB 遺伝子を突然変異させ、隣接する上流および下流のＤＮＡ配列と共に、複製しないサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythra ea）プラスミドベクター中にクローニングする。ついで突然変異対立遺伝子および隣接ＤＮＡを保持するベクターを、プロトプラスト形質転換法により宿主株に導入する。該宿主細胞染色体中への該プラスミドの組換えを誘導するために、形質転換体を選択条件（すなわち、ある特定のプラスミドマーカーの発現を要求する条件）下で再生させる。すなわち、該プラスミドは自律複製されないため、それが該細胞内で維持され選択条件下で或る特定のマーカーを発現するためには染色体中に存在していなければならない。該プラスミド上の突然変異に隣接する２つのＤＮＡセグメントの１つと該染色体内のその相同対応物との間の単一の相同的組換えを該再生細胞が受ける際に、挿入が生じる。ついで、染色体からのプラスミド喪失を誘導するマーカーに関して選択することなく、該細胞を成長させる。該突然変異に隣接する第２ＤＮＡセグメントとその相同染色体対応物との間の第２の組換えを該細胞が受けた後に、この喪失が生じる。この第２の組換え事象は、該プラスミド配列および染色体からの野生型対立遺伝子の喪失を引き起こすが、該突然変異対立遺伝子は維持される。Ｉ型の変化の変法においては、糖生合成酵素（または結合酵素）の非生産を、プロモーターの不活性化および／または転写ターミネーターの挿入の代替メカニズムにより達成することができる。これらの変法は、遺伝子配列自体でなく遺伝子転写に関与する調節メカニズムに影響を及ぼす。本発明で用いる「プロモーター」は、ＲＮＡの転写の開始を制御するＤＮＡ分子の領域を意味する。そのような領域は、ＲＮＡポリメラーゼ（すなわち、ＲＮＡ分子の合成に関与する酵素）に結合することが知られている。この形熊のＩ型の変化（すなわち、プロモーターの不活性化）は、１）所望の遺伝子のプロモーター領域を同定し、２）該プロモーター領域を突然変異により作動不能にする２つの工程を含む。前記の置換メカニズムの場合と同様、そのような突然変異は、プロモーター配列中に欠失を作製することにより、あるいは塩基対変換により達成することができる。プロモーターが単一の遺伝子の転写を制御している場合は、そのプロモーターの不活性化は、その特定の遺伝子の発現を阻止するであろう。勿論、該プロモーターが全オペロン（すなわち、発現が単一のプロモーターにより制御される一連の遺伝子）の発現を制御している場合は、プロモーターの不活性化は、そのオペロン内の全遺伝子の発現を有効に阻止するであろう。同様に、糖生合成酵素（または結合酵素）の非生産を、不活性化すべき遺伝子の上流に転写ターミネーターを挿入することにより引き起こすことができる。本発明で用いる「転写ターミネーター」は、ＲＮＡボリメラーゼに転写を停止するように指令するヌクレオチド配列である。転写ターミネーターの一例として、U 残基の伸張が後に続くステム−ループ構造を形成しうるパリンドローム配列が挙げられる（例えば、バクテリオファージ fd の遺伝子 VIII の後に続く転写ターミネーター（Beckおよび Zink，Gene，16:35（1981）））。この方法により糖生合成遺伝子の産生の変化を引き起こすことは、１）不活性化すべき関心のある遺伝子または遺伝子群（オペロン配置の場合）を同定し、２）そのような遺伝子の上流のＤＮＡ領域内に転写ターミネーター配列をクローニングすることを含む。転写ターミネーターは、ＲＮＡ転写に関与するポリメラーゼを停止させ（該シグナリング領域またはその近傍において）、それにより任意の下流の配列の転写を妨げる。したがって、糖生合成遺伝子の発現を直接引き起こすプロモーターの不活性化、転写の挿入などの変化も、本発明の範囲内に含まれると意図される。第２の場合（本発明でII型改変と称されるもの）には、eryBおよび／または e ryC 遺伝子を、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）又はストレプトマイセス（Streptomyces）中の遺伝子の発現を許容しうるプロモーターに関してアンチセンス配向でベクター上に配置する。ついで該ベクターをポリケチド産生微生物中に導入する。このベクターの構築の結果、野生型ｍＲＮＡの翻訳を妨害するアンチセンスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）生産される。Ｉ型の操作と同様、正常なミカロース、デソサミンおよび／または密接に関連した糖残基が欠損しているか又は糖中間体で置換されている新規グリコシル化修飾ポリケチドが生産されるであろう。 II型の変化の場合には、（１）特異的糖生合成遺伝子をアンチセンス（すなわち逆）配向で発現ベクター中にサブクローニングし、（２）該アンチセンス発現ベクターを所望の株に導入する２工程の方法により、アンチセンス発現による e ryB および／または eryC 遺伝子の不活性化を行なう。第１工程は、宿主として大腸菌（E．coli）またはストレプトマイセス（Streptomyces）のいずれかを、そして、ストレプトマイセスプロモーターを含有するように合体させうる発現ベクター（いずれかの宿主内で複製可能なもの）を使用する標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて行なう。ストレプトマイセスプロモーターは、商業的に入手可能な任意のストレプトマイセスプラスミドまたはストレプトマイセス−大腸菌シャトルプラスミドから得ることができる。第２工程では、適当なストレプトマイセス株にアンチセンス発現ベクターを導入し、発現プラスミドを細胞内に維持するために形質転換細胞を選択条件下で増殖させる。実施例２に記載のとおり、不活性化すべき遺伝子を、その逆配向でストレプトマイセスプロモーター（これは複製サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．e rythraea）プラスミド中に含有されている）の下流にサブクローニングする。ついで、アンチセンス遺伝子を保持するプラスミドを、プロトプラスト形質転換により宿主株に導入する。自律複製プラスミドを細胞中に維持するために、選択条件下で形質転換体を再生させる。ついで該アンチセンス遺伝子を発現させて、選択された遺伝子の天然の対立遺伝子のｍＲＮＡと相補的なアンチセンスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を生成させる。標準的なヌクレオチド塩基対相互作用により、アンチセンスｍＲＮＡと天然ｍＲＮＡとが、天然ｍＲＮＡのリボソーム結合部位を塞ぐＲＮＡ二重鎖を形成する。この相互作用は、天然ｍＲＮＡのリボソームでの翻訳を妨げ、そのｍＲＮＡにコードされる酵素の対応する合成を妨げる。このようにして、アンチセンス配向で発現される遺伝子の同一性に対応した糖生合成における特異的な酵素的過程が阻止され、これが新規糖中間本の産生につながり、該新規糖中間体が宿主微生物のポリケチド環に結合すると新規グリコシル化修飾ポリケチドが生成する。別法として、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）染色体の非必須領域（例えば、eryK 遺伝子の直ぐ上流の領域（図１））からのフランキングＤＮＡを含む非複製サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）ベクターを使用して、アンチセンス発現ベクターを構築することができる。ついで、Ｉ型改変の構築について記載したのと同様にして相同的組換えにより該アンチセンス構築物を染色体中に安定に挿入するために、このベクターを使用することができる。第３の場合（本発明で III 型改変と称されるもの）には、所望の構造の新規グリコシル化修飾ポリケチドの製造は、eryB および／または eryC 遺伝子の全部またはサブセットを複製ベクター上に配置し、これらの遺伝子を一括して「異なる」ポリケチド産生生物(すなわち、eryB および／または ervC 遺伝子を取り出した微生物以外の生物)中に導入することにより行なう。例えば、eryB および／または eryC 遺伝子をサッカロポリスポラ・エリスラエア（Stac. erythraea）から取り出し、ストレプトマイセス・ビオラセオニガー（Streptomyces violaceoniger）またはストレプトマイセス・ベネズエラエ（St reptomycesvenezuelae）中に導入することが可能である。この場合、ミカロース、デソサミン、それらの生化学的中間体および／またはそれらと密接に関連している誘導体が合成され、これら又はいずれかの糖残基を必ずしも保持していないポリケチド化合物の特異的な位置に結合することになる。そのように操作された宿主中で産生されうる新規グリコシル化ポリケチドのいくつかの例を、図６に示す。 III 型の変化においては、ミカロースおよび／またはデソサミンの生合成のための遺伝子を、以下のもう１つの簡便な２工程方法により、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea）以外のポリケチド産生生物中に導入する：１）ervBおよび／または eryC 遺伝子の全部またはサブセットを、ストレプトマイセスプロモーターの下流の複製プラスミド上で合体させ、２）該プラスミドを該ポリケチド産生生物に導入する。第１工程は、宿主として大腸菌（E.coli）および／またはストレプトマイセス（Streptomyces）を使用する標準的な組換えＤＮＡ操作を必要とする。第２工程は、入手可能ないくつかのストレプトマイセスベクターまたは大腸菌−ストレプトマイセスシャトルベクターからの１以上のプラスミド、ストレプトマイセス中で機能する１以上のプロモーター、および該プラスミドを保持する株の存在に関する選択を必要とする。実施例３および４に記載のとおり、eryB および／または eryC 遺伝子のセットを、所望の宿主中で機能する適当なプロモーターの下流の複製ベクター上に一緒に順次サブクローニングする。ついで、グループ化された遺伝子を保持するプラスミドを、エレクトロポレーションにより、あるいはプラスミドマーカーに関する選択を利用するプロトプラストの形質転換により宿主株に導入する。一般的方法材料、プラスミドおよび細菌株制限エンドヌクレアーゼ、T4 DNA リガーゼ、コンピテント大腸菌（E.coli）D H5α細胞、X-gal、IPTG およびプラスミド pUC18、pUC19 および pBR322 を、Be thesda Research Laboratories（BRL）を、New England Biolabs（Brverly，MA）から購入した。プラ（Madison，WI）から入手し、プラスミド pIJ4070 および pIJ702を John Innes Institute（Norwich，England）から入手し、プラスミド pWHM3 および pWHM4 （J．Bacteriol．1989 171:5872）を C.R．Hutchinson，University of Wiscons in（Madison，WI.）から入手した。[α-³²P]dCTP、Hybond^TM-Nナイロンメンブレン、および Megaprime ニックトランスレーションキットを、 Bioproducts（Rockland，ME.）から入手した。大腸菌−サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）シャトルプラスミド pWHM3 および pWHM4（Vara ら，J Bacteriol，171:5872(1989)）および pAIX を保持する大腸菌（E．coli） K12 株は、ブダペスト条約の条項に基づき Agricultural ResearchCulture Coll ection(NRRL)(1815 N．University Street，Peoria,Illinois 61604）に1995年1 2月５日から寄託されており、寄託の日から30年間、または最後の寄託の請求後５年間、または当該米国特許の存続期間のうちのいずれか遅い期間の間保管される。プラスミド pWHM3、pWHM4 および pAIX には、それぞれ受託番号 NRRL B-21512、NRRL B-21513 および NRRL B-21514 が付与されている。サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea）NRRL2338 株も、Agricult ural Research Serviceのカルチャーコレクションから入手可能である。1０μg/ ml チオストレプトンを含有する寒天培地上でスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の 10⁸細胞をプレーティングし、37℃で 48 時間増殖させた後で生存体を拾い上げることにより、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcusaureus）Th^R（チオストレプトン耐性）を得た。チオストレプトンは、Sigma Chemical（St．Louis，MO）から入手した。他のすべての化学物質および試薬は、特に示さない限り、標準的な市販元から入手した。ＤＮＡの操作制限エンドヌクレアーゼ消化、アガロースケル電気泳動、低融点アガロースゲルからのＤＮＡ断片の単離、ＤＮＡの連結、アルカリ溶解による大腸菌（E.coli ）からのプラスミドの単離、および LB 寒天プレート上でのアンピシリン耐性（ 150μg/ml）に関する選択を利用する大腸菌の形質転換には、標準的な条件を用いた（Sambrook ら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview，NY,1989）。サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）およびストレプトマイセス（St reptomyces）の種［エス・フラジアエ（S. fradiae）、エス・セレステス（S. c elestes）、エス・ビオラセオニガー（S．violaceoniger）、エス・ハイグロスコピクス（S．hygroscopicus）、エス．ベネスエラエ（S.venezuelae）など］からの全ＤＮＡを、文献記載の方法(Hopwoodら， Genetic Manipulation of Stre ptomyces，A LaboratoryManual，John Innes Foundation，Norwich，UK (1985)) に従い調製した。アガロースゲルからのＤＮＡのHybond^TM-Nナイロンメンブレンへの転移、および Megaprime^TM ニックトランスレーティッドプローブを使用するサザン分析は、製造業者の指示に従い行なった。ＤＮＡ断片の増幅合成デオキシオリゴヌクレオチドを、ABI Model 380A シンセサイザー（Appli ed Biosystems，FosterCity，CA）により製造業者の推奨に従い合成した。ＤＮＡ断片の増幅は、Perkin Elmer （PCR）により行なった。反応液は、dATP（200μM）、dTTP（200 μM）、dCTP（250μM）および dGTP（250pM）を含有する 100μl容量の PCR 緩衝液(10mM KCl、10mM (NH₄)₂SO₄、20mM Tris-HCl 100pmolの各プライマー、１μｇの鋳型ＤＮＡ（サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）NRRL2338 からの染色体反応混合物を 30 サイクルに付した。各サイクルは、96℃で 35秒の１ピリオドおよび 72℃で２分の１ピリオドよりなるものであった。反応産物を可視化し、低融点アガロースから精製した。実施例中に記載の PCR プライマーは、図４の ervB および eryC遺伝子のヌクレオチド配列から誘導した。サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．ervthraea）の形質転換および遺伝子置換公開されている方法（Yamamoto ら，J Antibiotics，39:1304(1986)）により、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea）株のプロトプラストを調製し、大腸菌（E.coi）から単離されたミニプレップＤＮＡで形質転換した。p WHM4 誘導体の場合には、文献記載のとおりに（Weber ら，Gene，68:173(1988) ）、プロトプラストを再生させ、チオストレプトン（最終濃度 20μg/ml）を重層することにより非組込み形質転換体を選択した。pWHM3 誘導体の場合には、Weber ら，Gene，68:173(1988)に記載されているとおりに、チオストレプトン含有寒天プレート（15μg/ml）上で組込み形質転換体を選択した。SGGP培地中での２ラウンドの非選択的増殖の後でTh^R表現型の喪失をモニターし（Yamamoto ら，J Antibiotics，39:1304(1986)）、ついでプロトプラスト化および段階希釈を非選択寒天培地上で行なった。再生されたプロトプラストを、チオストレプトン含有培地上でレプリカ平板法に付した。Th^S（チオストレプトン感受性）コロニーが10^-1の頻度で生じた。いくつかのTh^Sコロニーのサザンハイブリダイゼーションにより、突然変異対立遺伝子の保持を確認した。発酵サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）またはストレプトマイセス（Streptomyces）細胞を、100ml の SCM培地（1.5％可溶性デンプン、2.0％ Difco Soytone、0.15％酵母エキス、0.01％CaCl₂）中に接種し、３〜６日間増殖させる。ついで全培地を 10 リットルの新鮮な SCM 培地中に接種する。発酵槽は、一定の通気および pH7.0を維持しながら 32℃で４〜７日間作動させる。発酵の終了後、４℃で遠心分離することにより細胞を取り出し、さらに使用するまで発酵ビールを低温で維持する。pXC4、pXB6 などのプラスミドを維持するための抗生物質選択が必要な場合には、100ml の開始培養および 1 0 リットルの発酵槽にチオストレプトン（10μg/ml）を加える。以下の実施例により本発明に対する理解が深まるであろう。実施例は本発明の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。以下の記載および本明細書の全体において引用されている文献は、参考として本明細書に明示的に組入れるものとする。実施例１：4″−デオキシ−4″−オキソ−エリスロマイシン Aを産生するサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac. erythraea）ERBIV の構築および特徴づけＡ．プラスミド pRBIV の構築 ervBIV 遺伝子を含む 4.3kbの Pst-HindIII 断片をプラスミドpAIX5 から単離し、PstＩ-HindIII で消化された pUC19 中にサブクローニングして、プラスミド pUCBIV を得た。形質転換し大腸菌（E．coli）から該プラスミドを単離した後、MunI で消化して 370bp の断片を遊離させることにより pUCBIV との同一性を確認した。ついでプラスミド pUCBIV を制限酵素 NcoI で切断し、制限部位をクレノウ酵素で埋め、該プラスミドを再連結して、プラスミド pNCOBIV（これはこの段階で eryBIV 遺伝子のフレームシフト突然変異を保持している）を得た。形質転換し大腸菌（E.coli）から該プラスミドを単離した後、NsiI および HindIII で消化して 1.59kb の断片を遊離させることにより pNCOBIV との同一性を確認した（NsiI 部位は、NcoI 部位を埋め再連結することにより形成させた）。最後に、プラスミド pNCOBIV を HindIIIおよび SstI で消化し、改変 eryBIV 遺伝子を保持する 3.2kb の断片を単離し、HindIII およびSstI で消化された pWHM3 中に連結して、プラスミド pRBIV を得た。形質転換し大腸菌（E.coli）から該プラスミドを単離した後、KpnI で消化して 5.2kb、4.4kbおよび 0.72kb の断片を遊離させることにより pRBIV との同一性を確認した。Ｂ．サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．ervthraea）ERBIV の構築一般的方法において記載したとおりに、サッカロポリスポラ・エリスラエア（ Sac．erythraea）のプロトプラストをプラスミド pRBIV で形質転換し、組込み形質転換体を選択した。一般的方法において記載したとおりに、非選択的増殖による構成要素の分析により eryBIV 遺伝子の野生型コピーが不活性突然変異体コピーで置換されているサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac. erythraea）を得た。プラスミド pUCBIV から単離された 1.58kb の NcoI-HindIII断片（図 4B の 681〜2214 に相当）をプローブとして使用して、NocI で消化されたサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）ＤＮＡおよびNcoI-NsiI で消化されたサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）ＤＮＡのサザン分析を行なうことにより、遺伝子置換を確認した。野生型サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac. erythraea）および野生型レゾルバント（resolvant）は、NcoI または NcoI-NsiI のいずれかで消化された場合、ハイブリダイズする 2.75kb のＤＮＡ断片を示し、一方、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea ）ERBIV 株は、NcoIまたは NcoI-NsiI で消化された場合、それぞれ 16kb のＤＮＡ断片または 2.75kb のＤＮＡ断片のいずれかとのハイブリダイゼーションにより特徴づけられる。Ｃ．サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．ervthraea）ERBIV からの4″ −デオキシ−4″−エリスロマイシン Aの単離、精製および特性一般的方法において記載したとおりに、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea） ERBIV 株を SCM 培地中で４日間発酵する。ついでサッカロポリスポラ・エリスラエア(Sac.erythraea)ERBIV の発酵ブロスを４℃に冷却し、pH4.0 に調整し、塩化メチレンで１回抽出する。水層を pH9 .0 に再調整し、塩化メチレンで２回抽出し、合わせた塩基性塩化メチレン抽出物を濃縮して固本残渣を得る。それをメタノール中で温浸（digestion）し、メタノール中の Sephadex LH-20 のカラム上でクロマトグラフィーに付す。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus） Th^Rなどの感受性生物に対する生物活性に関して画分を試験し、活性画分を合わせる。合わせた画分を濃縮し、n−ヘプタン、ベンゼン、アセトン、イソプロパノール、0.05M（pH7.0）水性リン酸緩衝液（５：10：３：２：５,v/v/v/v/v）よりなる溶媒系の上相（10 ml）中で残渣を温浸し、同じ系中 Ito Coil Planet Centrifuge 上のクロマトグラフィーに付す。活性画分を合わせ、濃縮し、塩化メチレンと希薄水酸化アンモニウム（pH9.0）とに分配する。塩化メチレン層を分離し濃縮して、所望の生成物を白色の泡として得る。実施例2： 3−α−D−ミカロシル−5−β−D−デソサミノイル−12−ヒドロキシ −エリスロノリド B を産生するサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．eryt hraea）ER720（pASBVII）の構築および特徴づけＡ．プラスミド pASX2 の構築（図７参照） ermE*プロモーターを保持する 290bp の EcoRI-BamHIセグメントをプラスミド pIJ4070 から単離し、EcoRI-BamHI で消化された pWHM4 DNA 中に連結して、pA SX1 を得る。形質転換し大腸菌（E．coli）から該プラスミドを単離した後、Apa LI で消化して3.9kb、2.5kb、1.2kb、0.5kb および 0.4kb の断片を遊離させることにより pASX1 との同一性を確認する。バクテリオファージfd遺伝子 VTII転写ターミネーター(t-fd)(Beck ら，(1978)Nucl.Acids Res．5:4495）の（＋）および（−）鎖に対応し、酵素PstI、SphI および XbaI の制限酵素部位ならびに BamHI およびHindIIIに適合し得る突出末端を含む配列番号 31（5′−GATCCAGCG TCTGCAGGCATGCTCTAGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGT-3 ′）および配列番号32（5′−AGCTACGTTGAAAATCTCCAAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCCT TTAATTGTATCTAGAGCATGCCTGCAGACGCTG-3′）の２個のオリゴヌクレオチドを合成し、ついで約 250ng の各オリゴヌクレオチドを TE 緩衝液中で混合し、99℃まで１分間加熱する。該溶液をゆっくり室温まで冷却して、該オリゴヌクレオチドを自己相補性によりアニールさせ、ついで、アニールしたオリゴヌクレオチドを、BamHI HindIII で消化された pASX1 中に連結して、pASX2 を得る。形質転換し大腸菌（E．coli）から該プラスミドを単離した後、ErmE*プロモーターおよびバクテリオファージ fd ターミネーターを含有する 1.2kb の EcoRI-SaII 断片のＤＮＡ配列決定によりpASX2 との同一性を確認する。Ｂ．プラスミド pASBVII の構築（図８参照） 7398〜7996 位等価体（図４）を含む、eryBVII 遺伝子を保持する 598 塩基対のＤＮＡセグメントを、配列番号33（5′−GATCGCATGCTCTAGAGTACGTGAGCTGGCGGT GGCGGGC-3′）および配列番号34（5′-GATCCGGATCCGCATGCTTCACCTGCCGGTGCTGGCG GG-3′）の２個のオリゴヌクレオチドを使用する PCR により増幅する。該精製 PCR 産物を BamHI-XbaI で消化した後、該 PCR 断片を、BamHI-XbaI で消化された pASX2 中に連結して、pASBVII を得た。形質転換し大腸菌（E．coli）から該プラスミドを単離した後、880bp の EcoRI-XbaI 挿入のＤＮＡ配列決定により p ASBXVIIとの同一性を確認する。Ｃ．サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）ER720（pASBVII）の構築サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）FR720 株のプロトプラストをプラスミド pASBVII で形質転換し、形質転換体をチオストレプトン（15μg/ml）で選択する。形質転換を確認するために、全ＤＮＡを T h^Rコロニーから単離し、大腸菌（E．coli）を形質転換するのに使用する。形質転換し大腸菌（E．coli）から該プラスミドを単離した後、酵素 PvuIIおよびBam HI での制限分析により 1.48kb の断片を遊離させることにより pASBVII との同一性を確認する。pASBVII を含有することが判明したサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac. erythraea）のコロニーを、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea）ER720（pASBVII）と称することにする。Ｄ．サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．ervthraea）ER720（pASBVII）からの3−α−D−ミカロシル−5−β−D−デソサミノイル−12−ヒドロキシ−エリスロノリド B の単離、精製および特性一般的方法において記載したとおりに、チオストレプトン選択下の SCM 培地中でサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea）ER720（pASBVII）を３日間発酵する。ついで該発酵ブロスを４℃に冷却し、pH4.0 に調整し、塩化メチレンで１回抽出する。水層を pH9.0 に再調整し、塩化メチレンで２回抽出し、合わせた抽出物を濃縮して固体残渣を得る。これをメタノール中で温浸し、メタノール中の Sephadex LH-20 のカラム上でクロマトグラフィーに付す。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）Th^Rなどの感受性生物に対する生物活性に関して画分を試験し、活性画分を合わせる。合わせた画分を濃縮し、n−ヘプタン、ベンゼン、アセトン、イソプロパノール、0.05M（pH7.0）水性リン酸緩衝液（5：10：3：2：5,v/v/v/v/v）よりなる溶媒系の上相（10ml）中で残渣を温浸し、同じ系中 Ito Coil Planet Centrifuge 上のクロマトグラフィーに付す。活性画分を合わせ、濃縮し、塩化メチレンと希薄水酸化アンモニウム（pH9.0）とに分配する。塩化メチレン層を分離し濃縮して、所望の生成物を白色の泡として得る。実施例３：3−デス−オレアンドロシル−3−ミカロシルオレアンドマイシンを産生するストレプトマイセス・アンティバイオティカス（Streptomvces antibioti cus） ATCC11891（DXB6）の構築および特徴づけＡ．プラスミド pKB6 および中間体の構築（図９参照）ｉ）プラスミド pK1 の構築 pBR322（GenBank 受託第 J01749号）およびpUC（GenBank 受託第 X02514号）のＤＮＡ配列が公知である。配列番号 35（5′-GATCACATGTTCTT TCCTGCGTTATCCCCTG-3′）および配列番号36（5′-GATCGGATCCATGCATGTCTAGAGCAT CGCAGGATGCTGCTGGC-3′）の２個のオリゴデオキシヌクレオチドを使用する PCR により、pBR322 の 1673〜2478 位等価体を含む 805nt のＤＮＡセグメントを増幅する。該精製 PCR 産物をAflIIおよび BamHT で消化した後、該断片を、AflII Iおよび BamHI で消化された pUC19 中に連結して、プラスミド pK1 を得る。形質転換し大腸菌（E.coli）から単離した後、PvuII 消化で 0.55kb および 2.55k b の断片を遊離させることによりプラスミド pK1 との同一性を確認する。プラスミド pK1 は、プラスミドコピー数を制御する pBR322 のROP 領域を含有する。 ii）プラスミド pKB1 の構築配列番号37(5′-GAATGCATCCTGGAAAGCGAGCAAATGCTCCGGTG-3′)および配列番号3 8（5′-GATCTAGAGCTAGCCGGCGTGGCGGCGCGTG-3′）の２個のデオキシオリゴヌクレオチドを使用する PCR により、配列番号２で示す配列の 56〜2296 位等価体を含む eryBIVおよび eryBV 遺伝子を保持する2.24kbのＤＮＡセグメントを増幅する。NsiI および XbaI で消化した後、該断片を、NsiI および XbaI で消化された pK1 中に連結して、5.3kb のサイズのプラスミド pKB1 を得る。形質転換し大腸菌（E．coli）から単離した後、KpnI 消化で 0.72kb、1 .14kb および 3.42kb の断片を遊離させることによりプラスミド pKB1 との同一性を確認する。 iii ）プラスミド pKB2 の構築配列番号39 (5′-GATCGCTAGCCGTGACCGGACCCTTACAGTGAGTG-3′)および配列番号 40(5′-GATCTAGACTTAAGTCATCCGGCGGTCCTGGTGTAGACGGC-3′）の２個のデオキシオリゴヌクレオチドを使用する PCR により、配列番号２で示す配列の 3121〜4677 位等価体を含む eryBVI 遺伝子を保持する 1．56kbのＤＮＡセグメントを増幅する。NheI および XbaI で消化した後、該断片を、NheI および XbaI で消化された pKB1 中に連結して、6.9kb のサイズのプラスミド pKB2 を得る。形質転換し大腸菌（E．coli）から単離した後、BamHI 消化で 0.22kb、0.40kb、2.6kb および 3.7kbの断片を遊離させることによりプラスミド pKB2 との同一性を確認する。 iv）プラスミド pKB3 の構築配列番号41(5′-GATCTTAAGAACCGGAGTTGCGAGTACGTGAGCTGGCG-3′)および配列番号42（5′-GATCTAGACCTAGGTCACCTGCCGGTGCTGGCGGGCTC- 3′）の２個のデオキシオリゴヌクレオチドを使用する PCR により、配列番号２で示す配列の 7385〜7987 位等価体を含むeryBVII 遺伝子を保持する 0.6kb のＤＮＡセグメントを増幅する。AflIIおよび XbaI で消化した後、該断片を、Afl IIおよびXbaI で消化された pKB2 中に連結して、7.5kb のサイズのプラスミド pKB3 を得る。形質転換し大腸菌（E．coli）から単離した後、PstI 消化で 1.1k b および 6.4kb の断片を遊離させることによりプラスミド pKB3 との同一性を確認する。 v）プラスミド pKB4 の構築配列番号43（5′-GATCCTAGGCCGCAGGAAGGAGAGAACCACG-3′）および配列番号44（5 ′-GATCTAGATTAATCACTGCAACCAGGCTTCCGGC-3′）の２個のデオキシオリゴヌクレオチドを使用する PCR により、配列番号１で示す配列の 2385〜3410 位等価体を含む eryBII 遺伝子を保持する 1.0kb のＤＮＡセグメントを増幅する。AvrII および XbaI で消化した後、該断片を、AvrII および XbaI で消化された pKB3 中に連結して、プラスミド pKB4 を得る。形質転換し大腸菌（E．coli）から該プラスミドを単離した後、BglIIおよび EcoRI で消化して 0.41kb、1.6kb、3.1k b および 3.4kbの断片を遊離させることにより 8.5kb のサイズとの pKB-4との同一性を確認する。 vi）プラスミド pKB5 の構築 eryBIII のＤＮＡ配列は既に報告されている（Haydock ら，(1991) Mol Gen G enet 230:120）。配列番号 45（5′-GATTAATTGGCCGCGGCGCCGCGCTCGTTATG-3′）および配列番号 46（5′-GATCTAGATAATTAATCATACGACTTCCAGTCGGGGTAG-3′)の２個のデオキシオリゴヌクレオチドを使用する PCR により、Haydockらに記載されている配列の 3965〜5232 位等価体を含む eryBIII遺伝子を保持する 1.3kb のＤＮＡセグメントを増幅する。MseIおよび XbaI で消化した後、該断片を、MseI および XbaI で消化された pKB4 中に連結して、9.8kb のサイズの所望のプラスミドpKB5 を得る。形質転換し大腸菌（E．coli）から単離した後、PstI で消化して 1.1kb、2.5kb および 6.1kb の断片を遊離させ、ゲル電気泳動により可視化することにより pKB5 との同一性を確認する。 vii）プラスミド pKB6 の構築 eryBI 遺伝子は既にマッピングされており（Haydock ら，（1991） Mol Gen G enet 230:120）、ervBI の両フランク上のＤＮＡ配列が公知である（GenBank 受託第 M112OO号）。配列番号 47（5′-GATTAATTAATGATCAAGCTGAAAATTGTTTGCATG-3′）および配列番号48（5′- GATCTAGACTGCCGGCTCAGCCTTCCCAGGTTCG-3′）の２個のデオキシオリゴヌクレオチドを使用する PCR により、Haydock らに記載されている地図の 1.1〜3.6 位等価本を含むeryBI 遺伝子を保持する2.5kb のＤＮＡセグメントを増幅する。PacI および XbaI で消化した後、該断片を、PacI および XbaIで消化された pKB5 中に連結して、12.3kb のサイズのプラスミド pKB6 を得る。形質転換し大腸菌（E.coli）から単離した後、BamHI で消化して 0.22kb、 0.40kb、1.4kb、2.6kb 、3.3kb および 4.4kb の断片を遊離させることにより、pKB6 との同一性を確認する。プラスミド pKB6 は、ミカロースの生合成およびポリケチドに対するその結合に関与する全 eryB 遺伝子（eryBI-eryBVII）を保持する。Ｂ．プラスミド pXSB6 の構築（図11参照）全 ervB 遺伝子を保持する pKB6(前記実施例 3(A)(vii)に記載のとおり調製したもの）の9.2kp の NsiI-XbaI セグメントを単離し、PstI-XbaI で消化された pASX2（前記実施例 2(A)に記載のとおり調製したもの）中に連結しで、pXSB6 を得る。形質転換し大腸菌（E．coli）から該プラスミドを単離した後、EcoRI 消化後の 0.41kb、1.9kb および 14.9kb の断片を観察することにより、17.2kb のサイズの pXSB6 との同一性を確認する。プラスミド pXSB6 は、大腸菌−ストレプトマイセスシャトルベクター上の ermE*プロモーターの下流の転写融合体中に全 eryB 遺伝子を保持する。Ｃ．プラスミド pXB6 の構築 i）プラスミド pN702 の構築（図10参照）酵素 EcoRI、BglII、NsiI および XbaI の制限酵素部位ならびに PstI および M1uI に適合し得る突出末端を含む配列番号 49（5′-GGAATTCAGATCTATGCATTCTA GAA-3′）および配列番号 50（5′-CGCGTTCTAGAATGCATAGATCTGAATTCCTGCA-3′）の２個のオリゴヌクレオチドを合成する。ついで約 250ng の各オリゴヌクレオチドを TE 緩衝液中で混合し、99℃まで１分間加熱する。該溶液をゆっくり室温まで冷却して、該オリゴヌクレオチドを自己相補性によりアニールさせ、ついで、アニールしたオリゴヌクレオチドを、PstI-MluI で消化された pIJ702 中に連結して、所望のプラスミド pN702 を得る。形質転換しストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）1326 から該プラスミドを単離した後、EcoR I-BamHI またはXbaI-BamHI で消化してから 0.75kb および 3.6kb の断片を観察することにより、4.3kbのサイズの pN7 02 との同一性を確認する。 ii）プラスミド pX1 の構築（図10参照） ermE*プロモーターを保持する 290bp の EcoRI-BamHI セグメントを pIJ4070 から単離し、EcoRI-BglII で消化された pN702 中に連結して、プラスミド pX1 を得る。得られた混合物は、所望のプラスミド pX1 を含有する。形質転換しストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）1326 から該プラスミドを単離した後、NsiI-BamHI で消化してから 1.0kb および3.6kb の断片を観察することにより、4.6kb のサイズのプラスミド pX1 との同一性を確認する。 iii）プラスミド pXB6 の構築（図11参照）全 eryB 遺伝子を保持する pKB6(前記実施例 3(A)(vii)に記載のとおり調製したもの）の 9.2kp のNsiI-XbaI セグメントを単離し、NsiI-XbaI で消化された pX1 中に連結して、所望のプラスミド pXB6 を得る。形質転換しストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）1326 から該プラスミドを単離した後、EcoRI 消化後に 0.41kb、1.9kb および 11.5kb の断片を観察することにより、13.8kb のサイズのプラスミド pXB6 との同一性を確認する。プラスミド pXB6 は、ストレプトマイセスプラスミド上の erm E*プロモーターとの転写融合体中に全 eryB 遺伝子を保持する。Ｄ．ストレプトマイセス・アンティバイオティカス（Streptomyces antibioti cus）ATCC11891（pXB6）の構築ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）1326（pXB6）から単離したプラスミド pXB6 の約 500μｇを、オレアンドマイシン生産体ストレプトマイセス・アンティバイオティカス（Streptomyces antibioticus）ATCC118 91 中にエレクトロポレーションし、チオストレプトンを含有する R3M 寒天プレート上に出現した得られた Thio^Rコロニーのいくつかを、それらのプラスミド含量に関して分析する。EcoRI 消化後に0.41kb、1.9kb および 11.5kb の断片を観察することにより、13.8kb のサイズのプラスミド pXB6 の存在を確認する。Ｅ．ストレプトマイセス・アンティバイオティカス（Streptomyces antibioti cus）ATCC11891（pXB6）からの 3−デス−オレアンドロシル−3−ミカロシルオレアンドマイシンの単離、精製および特性一般的方法において記載したとおりに、チオストレプトン選択下の SCM 培地中でストレプトマイセス・アンティバイオティカス（Streptomy ces antibioticus）ATCC11891（pXB6）を５日間発酵する。ついで該発酵ブロスを４℃に冷却し、pH4.0 に調整し、塩化メチレンで１回抽出する。水層を pH9.0 に再調整し、塩化メチレンで２回抽出し、合わせた抽出物を濃縮して固体残渣を得る。これをメタノール中で温浸し、メタノール中のSephadex LH-20 のカラム上でクロマトグラフィーに付す。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphyloco ccus aureus）Th^Rなどの感受性生物に対する生物活性に関して画分を試験し、活性画分を合わせる。合わせた両分を濃縮し、n−ヘプタン、ベンゼン、アセトン、イソプロパノール、0.05M（pH7.0）水性リン酸緩衝液（5:10:3:2:5,v/v/v/v/v ）よりなる溶媒系の上相（10ml）中で残渣を温浸し、同じ系中 Ito Coil Planet Centrifuge 上のクロマトグラフィーに付す。接近して溶出する活性画分を合わせ、濃縮し、塩化メチレンと希薄水酸化アンモニウム（pH9.0）とに分配する。塩化メチレン層を分離し濃縮して、所望の生成物を白色の泡として得る。実施例４：5−デス−カルコシル−5−デソサミノイルランカマイシンを産生するストレプトマイセス・ビオラセオニガー（Sreptomyces violaceoniger） NRRL28 34（pXC4）の構一および特徴づけＡ．プラスミド pKC4 および中間体の構築（図12参照） i）プラスミド pKC1の構築配列番号51(5′-GAATGCATCTGGCTGGGCGGAGGGAATTCATG-3′)および配列番号52 ( 5′-GATCTAGACTTAAGTCATCGTGGTTCTCTCCTTCCTGCGGC-3′)の２個のデオキシオリゴヌクレオチドを使用する PCR により、配列番号１に示す 33〜2413 位等価体を含む eryCII およびeryCIII 遺伝子を保持する2.4kb のＤＮＡセグメントを増幅する。該精製 PCR 産物を、NsiI および XbaI で消化した後、NsiIおよび XbaI で消化された pK1 中に連結して、5.5kb のサイズのプラスミド pKC1 を得る。形質転換し大腸菌（E．coli）から単離した後、EcoRI 消化で 2.2kb および 3.3 kb の断片を遊離させることにより、プラスミド pKC1 との同一性を確認する。 ii）プラスミドpKC2の構築配列番号53 （5′-GATCCTTAAGCTCCGGAGGGAGCAGGGATG-3′）および配列番号54 （5′-GATCTAGACCTAGGTCATCCGCGCACACCGACGAAC-3′）の２個のデオキシオリゴヌクレオチドを使用する PCR により、配列番号２で示す配列の 2331〜3063 位等価体を含む eryCVI 遺伝子を保持する 732bp のＤＮＡセグメントを増幅する。AflIIおよび XbaI で消化した後、該精製 PCR 断片を、AflII および XbaIで消化された pKC1 中に連結して、6.2kb のサイズのプラスミドpKC2 を得る。形質転換し大腸菌（E．coli）から単離した後、XbaI-EcoRI 消化で O.95kb、2.2kb および 3.1kb の断片を遊離させることにより、プラスミド pKC2 の同一性を確認する。 iii）プラスミド pKC3 の構築配列番号55（5′-GATCCTAGGCCGTCTACACCAGGACCGCCGG-3′）および配列番号56 （5′-GATCTAGATTAATCACCTTCCGCGCAGGAAGCCGC-3′）の２個のデオキシオリゴヌクレオチドを使用する PCR により、配列番号２で示す配列の 4650〜7386 位等価体を含む eryCIV および eryCV 遺伝子を保持する 2.7kb のＤＮＡセグメントを増幅する。AvrIIおよび XbaI で消化した後、該精製 PCR 断片を、AvrIIおよび XbaI で消化された pKC2 中に連結して、9.0kb のサイズのプラスミド pKC3 を得る。形質転換し大腸菌（E．coli）から単離した後、SphI消化で 4.0kb および 5.0kb の断片を遊離させることにより、プラスミド pKC3 との同一性を確認する。 iv）プラスミドpKC4の構築 eryCI 遺伝子のＤＮＡ配列は既に決定されている（GenBank受託第X15541号）。配列番号57（5′-GATCTTAAGCCGCCACTCGAACGGACACTCG-3′）および配列番号58 （5′-GATCTAGATCAAGCCCCAGCCTTGAGGG-3′）の２個のデオキシオリゴヌクレオチドを使用する PCR により、前記配列の 38〜1161 位等価体を含む eryCI 遺伝子を保持する1.1kb のＤＮＡセグメントを増幅する。MseI および XbaI で消化した後、該断片を、MseI および XbaI で消化された pKC3 中に連結して、10.1kb のサイズのプラスミド pKC4 とを得る。形質転換し大腸菌（E．coli）から単離した後、KpnI 消化で 0.15kb、0.31kb、4.1kb および 5.5kb の断片を遊離させることにより、プラスミド pKC4 との同一性を確認する。プラスミド pKC4 は、デソサミンの生合成およびポリケチドに対するその結合に関与する全 eryC 遺伝子（eryCI-eryCVI）を保持する。Ｂ．プラスミド pKC4 の構築（図13参照）全 eryC 遺伝子を保持する pKC4 の6.9kp の NsiI-XbaI セグメントを単離し、PstI-XbaI で消化された pASX2(前記実施例2(A)に記載のとおりに調製したもの)中に連結して、大腸菌−ストレプトマイセスシャトルプラスミド上の ermE* プロモーターの下流に全 eryC 遺伝子が転写的に結合した 14.9kb のサイズの所望のプラスミド pXSC4 を得る。形質転換し大腸菌（E.coli）から単離した後、EcoRI 消化後の 0.29kb、2.2kb および 12.4kb の断片を観察することにより、プラスミド pXSC4 との同一性を確認する。Ｃ．プラスミド pXC4の構築（図13参照）全 eryC 遺伝子を保持する pKC4 の 6.9kb の NsiI-XbaI セグメントを単離し、NsiI-XbaI で消化されたpX1（実施例3(C)(ii)に記載のとおりに調製されたもの）中に連結して、ストレプトマイセスプラスミド上の ermE^*プロモーターの下流に全 ervC 遺伝子が転写的に結合した 11.5kb のサイズのプラスミド pXC4 を得る。形質転換しストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans） 1326 から該プラスミドを単離した後、EcoRI 消化後に 0.29kb、2.2kb および 9 .0kb の断片を観察することにより、プラスミド pXC4 との同一性を確認する。Ｄ．ストレプトマイセス・ビオラセオニガー（Sreptomvcesviolaceoniger）NR RL2834（pXC4）の構築ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）1326（pXC4）から単離したプラスミド pXC4 の約 500μgを、ランカマイシン生産体ストレプトマイセス・ビオラセオニガー（Sreptomyces viol aceoniger） NRRL2834 中にエレクトロポレーションし、チオストレプトンを含有する R3M 寒天プレート上に出現した得られたThio^Rコロニーのいくつかを、それらのプラスミド含量に関して分析する。該プラスミドの EcoRI 消化後に 0.29 kb、2.2kb および 9.1kb のサイズの断片を観察することにより、プラスミド pX C4 の存在を確認する。Ｅ．5 −デス-カルコシル−5−デソサミノイルランカマイシンの単離、精製および特性一般的方法において記載したとおりに、チオストレプトン選択下の SCM 培地中でストレプトマイセス・ビオラセオニガー（Sreptomyces violaceoniger）NRR L2834（pXC4）を５日間発酵する。ついで該発酵ブロスを４℃に冷却し、pH4.0に調整し、塩化メチレンで１回抽出する。水層をpH9.0に再調整し、塩化メチレンで２回抽出し、合わせた抽出物を濃縮して固体残渣を得る。これをメタノール中で温浸し、メタノール中の SephadexLH-20 のカラム上でクロマトグラフィーに付す。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylpcoccus aureus）Th^Rなどの感受性生物に対する生物活性に関して画分を試験し、活性画分を合わせる。合わせた画分を濃縮し、ｎ−ヘプタン、ベンゼン、アセトン、イソプロパノール、0.05M(pH7.0)水性リン酸緩衝液（5：10：3：2：5，v/v/v/v/v）よりなる溶媒系の上相（10ml）中で残渣を温浸し、同じ系中 Ito Coil Planet Centr ifuge 上のクロマトグラフィーに付す。活性画分を合わせ、濃縮し、塩化メチレンと希薄水酸化アンモニウム(pH9.0)とに分配する。塩化メチレン層を分離し濃縮して、所望の生成物を白色の泡として得る。前記の実施例では本発明の好ましい実施態様について例示しているが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。前記の例示は、新規グリコシル化修飾ポリケチド産物を合成を引き起こすサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea)および／またはストレプトマイセス（Streptomyces）中に導入することができる遺伝的改変型の作製にかかわる原理および方法論の説明に役立つものである。本発明では、例えば4″−デオキシ−4″−オキソ−エリスロマイシンＡの産生につながる単一のＩ型改変を特定しているが、他のＩ型変化を e ryB および／または eryC 遺伝子中に導入して新規グリコシル化修飾ポリケチド構造を得ることができることは当業者において明らかである。有用な新規化合物を与える追加的なＩ型改変には、例えば、3−α−D−ミカロシル−5−β−D−デソサミノイル−12−ヒドロキシ− エリスロノリドBを与えると考えられる eryBVII 遺伝子中の突然変異、およびN −3α′−デス−ジメチルエリスロマイシンAを与えると考えられるeryCVI 遺伝子中の突然変異が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、２個以上の異なる eryB および／またはeryC 遺伝子中のＩ型改変を組合せて、新規グリコシル化修飾ポリケチド構造を得ることができることは明らかである。有用な化合物を与える２個のＩ型改変の組合せには、例えば、3−α−D−4″−デオキシ−4″−オキソ−ミカロシル−5−β−D−デソサミノイル−12−ヒドロキシ −エリスロノリドBを与えると考えられる eryBIV および eryBVII 遺伝子中の突然変異、4″−デオキシ−4″−オキソ−（N−３α′−デス−ジメチル）−エリスロマイシンAを与えると考えられる ervBIV および ervCVI 遺伝子中の突然変異、および3−α−D−4″−デオキシ−4″−オキソ−ミカロシル−5−β−D−（ N−３α′−デス−ジメチル）−デソサミノイル−12−ヒドロキシ−エリスロノリドBを与えると考えられる ervBIV、eryBVII および eryCVI 遺伝子中の突然変異が含まれるが、これらに限定されるものではない。したがって、eryBII、eryBIV、 ery BV、eryBVI、eryBVII、eryCII、eryCIII、eryCIV、eryCV または eryCVI 遺伝子中のすべてのＩ型改変または２以上のＩ型突然変異の組合せ、前記の突然変異または突然変異の組合せを保持するサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.eryt hraea）株、および前記株から産生される対応するポリケチドが、本発明の範囲内に含まれる。本発明で特定する II 型突然変異は、自己複製プラスミド上のeryBVII 遺伝子を用いて構築したが、他の eryB 遺伝子およびervC 遺伝子をアンチセンス配向で発現させて、新規グリコシル化修飾ポリケチド構造を得ることができることは明らかである。追加的な II 型改変には、例えば、4″−デオキシ−4″−オキソ −エリスロマイシンAを与えると考えられる eryBIV 遺伝子のアンチセンス発現、およびN−3α′−デス−ジメチルエリスロマイシンAを与えると考えられる er yCVI 遣伝子のアンチセンス発現が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、当業者であれば、ermE^*プロモーター以外のプロモーター（例えば、pIJ702 の me1Cプロモーター）がアンチセンス発現に適しており、pWHM4 に加えて多数の自己複製ベクターがアンチセンス改変を運搬するように機能すると認識するであろう。また、当業者であれば、本発明には自己複製ベクターが必要ではなく、Ｉ型遺伝子改変の構築に用いたのと同じ原理を用いてアンチセンス改変を染色体中に直接導入することができると認識するであろう。染色体中に直接導入される II 型改変としては、例えば、実施例２に記載の eryBVII アンチセンス改変が挙げられ、この場合には、pWHM3 ベクター中の ermE-eryBVII-ファージ fd ターミネーター配置に隣接させるのに、eryK 遺伝子の直ぐ上流のＤＮＡセグメントを使用し、このベクターを染色体中に組込み、ついで該染色本から解離（resolve）させて、3−α−D−ミカロシル−5−β−D−デソサミノイル−12−ヒドロキシ−エリスロノリドBを産生すると考えられるサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）染色体のこの非必須領域中に安定に組込まれた ermE^*-eryBVII-ファージ fd ターミネーター配置を得る。したがって、eryBII、eryBIV、 eryBV、eryBVI、eryBVII、eryCI I、eryCIII、eryCIV、eryCV または eryCVI 遺伝子中のすべてのII型突然変異（自己複製プラスミド上に保持されているか該染色体の非必須領域中に組込まれているかにがかわらない）、前記の突然変異を保持するサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）株、および前記株から産生される対応するポリケチドが、本発明の範囲内に含まれる。本発明では、ストレプトマイセス・ビオラセオニガー（Sreptomyces violaceo niger）における5−デス−カルコシル−5−デソサミノイルランカマイシンの産生およびストレプトマイセス・アンティバイオティカス（Streptomycesantibiot icus）における3−デス−オレアンドロシル−3−ミカロシルオレアンドマイシンの産生につながるIII型改変が特定されているが、任意のポリケチド産生微生物中にIII型改変を導入して、新規グリコシル化修飾ポリケチドを得ることができることは明らかである。また、当業者であれば、eryB および eryCの両遺伝子を、ポリケチド産生微生物中に共形質転換したり、ポリケチド産生微生物中に導入される単一のベクター上で一緒にグループ化することができると認識するであろう。eryB および eryC の両遺伝子を一緒に使用するIII型変化としては、例えば、3−デス−（4″−O−アセチルアルカノシル(arcanosyl))−３−ミカロシル−5 −デス−カルコシル−5−デソサミノイルランカマイシンを与えると考えられるストレプトマイセス・ビオラセオニガー（Sreptomyces violaceoniger）中へのそれらの導入が挙げられる。本発明で特定するIII型改変は、ervB および eryC遺伝子の特定の遺伝的順序を示したが、当業者であれば、eryBおよび eryC 遺伝子の多数の異なる遺伝的配置から同様の結果が得られると認識するであろう。また、当業者であれば、eryBおよび／または eryC 遺伝子の或る配置のうち、それぞれの eryB および／または eryC 遺伝子の１以上を欠く配置が、ミカロースおよび／またはデソサミンの生合成（それぞれ図２および図３に概要を示す）における中間体化合物がボリケチドに結合した新規グリコシル化ポリケチドの産生につながると認識するであろう。eryB および／または ervC 遺伝子のサブセットのみを使用するIII型改変としては、例えば、プラスミド pXC4 を AflIIおよび AvrII で消化し、ついでＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理し再連結することにより除去された eryCVI 遺伝子を欠く pXC4 誘導体を、ストレプトマイセス・ビオラセオニガー（Sreptomyces violaceoniger）中に導入して、5−デス−カルコシル −5−（N−３α′−デス−ジメチルデソサミノイル）ランカマイシンを得ることが挙げられる。また、当業者であれば、ermE または ermE^*以外のプロモーター（例えば、プラスミドpIJ702 の melCプロモーター）、およびpWHM4 または pIJ 702 以外のベクターも III 型改変の構築に使用でき、これらの変型も勿論本発明の範囲内に含まれると考えるであろう。最後に、当業者であれば、本発明には自己複製ベクターが必要ではなく、異種宿主染色体の非必須領域が同定されれば、Ｉ型遺伝子改変の構築に用いたのと同じ原理を用いて糖生合成遺伝子の集合体を該異種宿主の染色体中に直接導入することができると認識するであろう。別法として、宿主遺伝子との部位特異的組換えを受けるプラスミドまたはバクテリオファージを使用して、eryBおよび eryC 遺伝子を宿主中に導入することにより、III 型改変を得ることもできる。eryBII、eryBIV、eryBV、eryBVI、eryBVII、eryCII、 eryCIII、eryCIV、eryCV または eryCVI 遺伝子の１以上を使用するすべての II I 型改変、前記の改変を保持するポリケチド産生株、および前記株から産生される対応するポリケチドが、本発明の範囲内に含まれる。さらに、Ｉ型改変と II 型改変との組合せを作製して、いくつかのＩ型 eryB および／または eryC 突然変異をサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．ery thraea）染色体の適当な座中に直接導入し、一方、自己複製ベクターまたは組込みベクターを使用する II 型改変により、他の eryB および／または ervC 遺伝子を不活性化することも可能である。例えば、Ｉ型改変（例えば、eryBIV 中の突然変異）と II 型改変（例えば、pASBVIIでの形質転換）の組合せは、3−α− D−4″−デオキシ−4″−オキソ−ミカロシル−5−β−D−デソサミノイル−12 −ヒドロキシ−エリスロノリドBの産生につながると考えられる。Ｉ型およびII 型の２以上の改変のすべての組合せ、そのような改変を保持するサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac. erythraea）株、およびそのような株から産生される対応するグリコシル化ポリケチドが、本発明の範囲内に含まれる。 eryB および／または eryC 遺伝子により説明する具本例の拡張として、eryB および／または eryC 遺伝子に類似した異種糖生合成遺伝子に、本明細書中に記載の方法を適用することが可能である。新規グリコシル化ポリケチドの産生につながる異種糖生合成遺伝子を保持する株の構築には、(i)他のいずれかのグリコシル化ポリケチド産生放線菌から該糖生合成遺伝子をクローニングし、（ii）クローニングされた遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、（iii）クローニングされた遺伝子を切出し、Ｉ型、II 型または III 型改変に適したベクター中に合体させ、（iv）ポリケチド産生微生物を形質転換し、該新規化合物に関してスクリーニングすることが必要である。このようにして、任意のポリケチド結合糖生合成遺伝子を、グリコシル化ポリケチド産生微生物のゲノムから正確に切出し、他の糖生合成遺伝子で改変し又はそれと共に配列させ、ついで同じまたは別のポリケチド産生微生物中に導入して、予想される構造の新規グリコシル化ポリケチドを作製することができる。したがって、例えば、3−デス−L−オレアンドロシル−3−D−オレアンドロシルオレアンドマイシンの産生につながる ery B および／またはeryC 遺伝子と同様の異種遺伝子のＩ型または II 型改変（例えば、ストレプトマイセス・アンティバイオティカス（Streptomyces antibioti cus）におけるL−オレアンドロースの合成のための eryBVII ホモログで見出されうるもの）が、本発明の範囲内に含まれる。同様に、ミカロースまたはデソサミン以外の糖の合成のための遺伝子の III 型集合体（例えば、ストレプトマイセス・ユウリテルムス(Streptomyceseurythermus)におけるアンゴロサミンの合成のための遺伝子中で見出されうるもの）、および5−デスーデソサミノイル−5 −アンゴロサミノイル−エリスロマイシン A の合成を引き起こすサッカロポリスポラ・エリスラエア(Sac．ervthraea)中へのそれらの形質転換が、本発明の範囲内に含まれる。当業者であれば、本明細書に記載のＩ型、II 型および III 型の遺伝子操作ならびにそれらを導入するポリケチド産生微生物は決して除外されないと認識するであろう。したがって、簡便な宿主の選択およびＩ型、II 型または III 型改変の選択は、専ら、所望の新規グリコシル化ポリケチドの、天然対応物との関連性に基づく。したがって、Ｉ型、II 型および III 型改変は、内因性または外因性の糖生合成遺伝子を使用して任意のポリケチド産生微生物中で構築することができる。したがって、本明細書に記載の原理に従い任意のポリケチド産生微生物中で構築するＩ型、II 型および III 型突然変異またはそれらの種々の組合せ、およびそのような株から産生されるそれぞれのポリケチドは、本発明の範囲内に含まれる。産生微生物においてＩ型、II 型または III 型変化を作製することにより改変しうるグリコシル化ポリケチドには、例えば、マクロライド抗生物質（例えば、エリスロマイシン、タイロシン、スピラマイシンなど）、芳香族ポリケチド（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシンなど）、ポリエン（例えば、カンジシジン、アンホテリシンなど）および他の複合ポリケチド（例えば、アベルメクチン）が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載するエリスロマイシンの新規誘導体または修飾本は、4″−デオキシ−4″−オキソ−エリスロマイシンAなどのA誘導体として特定されているが、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）の野生型株は、エリスロマイシンA、エリスロマイシンB、エリスロマイシンCおよびエリスロマイシンDを含むエリスロマイシン化合物のファミリーを産生すると当業者に理解される。したがって、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）の修飾株（例えば、ERBIV 株）が、4″−デオキシ−4″−オキソ−エリスロマイシンA 、4″−デオキシ−4″−オキソ−エリスロマイシンB、4″−デオキシ−4″−オキソ−エリスロマイシンCおよび4″−デオキシ−4″−オキソ−エリスロマイシンDを含む4″−デオキシ−4″−オキソ−エリスロマイシンファミリーの対応メンバーを産生すると予想されるであろう。同様に、新規グリコシル化エリスロマイシン誘導体を産生するサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac.erythraea）の他のすべての修飾株が、前記誘導体のA、B、CおよびD形態を産生すると予想されるであろう。例えば、糖生合成遺伝子のＩ、II または III 型変化の追加的な修飾を導入することにより、6−デオキシエリスロマイシン、6,12−ジデオキシエリスロマイシンおよび6,7−アンヒドロエリスロマイシンを産生する修飾されたサッカロポリスポラ・エリスラエア(Sac.erythraea)株は新規グリコシル化修飾ポリケチドを産生すると予想されるであろう。したがって、本明細書に記載されている又はこれらの方法により製造される各新規エリスロマイシンのファミリーのすべてのメンバーが、本発明の範囲内に含まれる。所望のプラスミドを得るための方法、クローニング用宿主、ならびにベクターおよびクローニングし修飾すべき eryB および／または eryC 遺伝子の選択の変形および修飾で本明細書に記載されている以外のものが、当業者には認識されるであろう。例えば、本明細書には pWHM3、pWHM4 および pIJ702 の使用が記載されているが、前記プラスミドの全部または一部が他のＤＮＡセグメントで置換された同様に機能する他のベクターを使用することができる。例えば、pWHM3 および pWHM4 の pUC19 成分を、BRL から入手可能な pBR322 で置換したり、pWHM3 およびpIJ702 中の pIJ101 レプリコンまたは pWHM4 中の pJV1 レプリコンの異なるセグメントを使用したり、あるいはチオストレプトンまたはアンピシリン耐性以外の選択マーカーを使用することができる。これらは、すべて本発明の範囲内に含まれる多数の可能な例のほんの少数の例にすぎない。同様に、種々のＩ型、II 型および III 型改変を得るために本発明で特定している eryBおよび eryC 座のセグメントは、ゲノムＤＮＡまたは単離クローンの PCR 増幅により、あるいはサッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac．erythraea）から適当な制限断片を単離することにより産生される同じ機能をコードする種々の長さの他のセグメントで容易に置換することができる。同じ方法により、欠失、挿入または部位特異的突然変異誘発により対応遺伝子の異なる部分を改変して、本明細書に記載のものと機能的に等価なＩ型突然変異を作製することが可能である。また、対応遺伝子のより大きいまたは小さい部分を使用することにより、本明細書に記載のものと機能的に等価な II 型突然変異を作製することも可能である。また、本明細書に記載のものと同じまたは異なる直列順序で対応遺伝子のより大きいまたは小さいセグメントを使用することにより、III 型突然変異を作製することが可能である。追加的な修飾には、クローニングに使用する制限部位の変更、または前記の一般的方法の変更が含まれる。そのようなすべての変更が、本発明の範囲内に含まれる。また、当業者であれば、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Sac. erythraea）および他のポリケチド産生微生物を発酵し、本発明で特定する新規ポリケチドを抽出するために、異なる方法を利用することができると認識するであろう。そのようなすべての方法もまた、本発明の範囲内に含まれる。本明細書に記載する発明の多数の修飾および変形が、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り可能であり、したがって、添付の請求の範囲に示されている限定が課されるにすぎないことも明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 17/08 Ｃ１２Ｐ 17/08 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:48） (72)発明者カツツ，レナードアメリカ合衆国、イリノイ・60090、ホイーリング、プラム・クリーク・ドライブ・ 375 (72)発明者ドナデイオ，ステフアノイタリア国、イ―21040・ジエレンツアーノ、ビア・エール・レペテイ、34、レペテイ・リサーチ・センター (72)発明者ステイバー，マイケル・ジエーアメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレイズレイク、ウエスターフイールド・プレイス・162

Claims

【特許請求の範囲】１．単離された一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドであって、（ａ）（ｉ）配列番号１の約 54 位ヌクレオチドから約 1136位ヌクレオチドまでのセンス配列、（ii）配列番号１の約 1147位ヌクレオチドから約 2412 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（iii）配列番号１の約 2409 位ヌクレオチドから約 3410 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（iv）配列番号２の約 80 位ヌクレオチドから約 1048 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（v）配列番号２の約 1048 位ヌクレオチドから約 2295 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（vi）配列番号２の約 2348 位ヌクレオチドから約 3061 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（vii ）配列番号２の約 3214 位ヌクレオチドから約 4677 位ヌクレオチドまでのセンス配列、(viii）配列番号２の約 4674 位ヌクレオチドから約 5879 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（ix）配列番号２の約 5917 位ヌクレオチドから約 738 6 位ヌクレオチドまでのセンス配列、および（x）配列番号２の約 7415 位ヌクレオチドから約 7996 位ヌクレオチドまでのセンス配列よりなる群がら選ばれるヌクレオチド配列；（ｂ）（ａ）の配列と相補的な配列；（ｃ）発現されると、（ａ）の配列にコードされるポリペプチドをコードする配列；および（ｄ）（ａ）の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする類似配列を含むヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。２．ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．該ヌクレオチド配列が、（ｉ）配列番号１の約 54 位ヌクレオチドから約 1136 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（ii）配列番号１の約 1147 位ヌクレオチドから約 2412 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（iii）配列番号２の約 2348 位ヌクレオチドから約 3061 位ヌクレオチドまでのセンス配列、(iv)配列番号２の約 4674 位ヌクレオチドから約 5879 位ヌクレオチドまでのセンス配列、および（v）配列番号２の約 5917 位ヌクレオチドから約 7386 位ヌクレオチドまでのセンス配列よりなる群から選ばれる（a）のヌクレオチド配列である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。４．該ヌクレオチド配列が、（i）配列番号１の約 2409 位ヌクレオチドから約 3410 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（ii）配列番号２の約 80 位ヌクレオチドから約 1048 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（iii）配列番号２の約 1048 位ヌクレオチドから約 2295 位ヌクレオチドまでのセンス配列、（iv）配列番号２の約 3214 位ヌクレオチドから約 4677 位ヌクレオチドまでのセンス配列、および（v）配列番号２の約 7415 位ヌクレオチドから約 79 96 位ヌクレオチドまでのセンス配列よりなる群から選ばれる（a）のヌクレオチド配列である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。５．該ヌクレオチド配列が、配列番号２の約 80 位ヌクレオチドから約 1048 位ヌクレオチドまでのセンス配列を有する（a）のヌクレオチド配列である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．請求項２に記載のＤＮＡ分子を含んでなるベクター。７．該ポリヌクレオチドに作動的に結合したエンハンサー−プロモーターをさらに含んでなる、請求項６に記載のベクター。８．該ポリヌクレオチドが、請求項５に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載のベクター。９．請求項６または請求項７または請求項８に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。 10．細菌細胞である、請求項９に記載の形質転換宿主細胞。 11．該細菌細胞が、ストレプトマイセス（Streptomyces）および大腸菌（E．c oli）よりなる群から選ばれる、請求項 10 に記載の形質転換宿主細胞。 12．ポリケチド産生微生物の遺伝子操作により、特異的グリコシル化修飾ポリケチドの生合成を誘導する方法であって、（１）請求項１に記載の糖生合成遺伝子含有ＤＮＡ配列を単離し、（２）ポリケチド結合糖の生合成またはポリケチドに対するその結合を引き起こす１以上のＤＮＡ断片を、該遺伝子含有ＤＮＡ配列内で同定し、（３）１以上の特定された変化を該ＤＮＡ断片中に作製して、改変ＤＮＡ配列を得、（４）該改変ＤＮＡ配列（該改変ＤＮＡ配列は、翻訳されると、該特異的グリコシル化修飾ポリケチドの産生を引き起こしうる改変された酵索活性を与える）をポリケチド産生微生物中に導入して、もとの配列を置換し、（５）該特異的グリコシル化修飾ポリケチドの形成に適した条件下で、該改変ポリケチド産生微生物の培養を成長させ、（６）該培養から該特異的グリコシル化修飾ポリケチドを単離する工程を含んでなる方法。 13．該ＤＮＡ断片中の前記の特定された変化が、ポリケチド結合糖の生合成またはポリケチドに対するその結合に関与する少なくとも１つの酵素活性の不活性化を引き起こす、請求項 12に記載の方法。 14．該ポリケチド結合糖が L−ミカロースである、請求項 13に記載の方法。 15．該ポリケチド結合糖が D−デソサミンである、請求項 13に記載の方法。 16．ポリケチド産生微生物の遺伝子操作により、特異的グリコシル化修飾ポリケチドの生合成を誘導する方法であって、（１）請求項１に記載の糖生合成遣伝子含有ＤＮＡ配列を単離し、（２）ポリケチド結合糖の生合成またはポリケチドに対するその結合を引き起こす１以上のＤＮＡ断片を、該遺伝子含有ＤＮＡ配列内で同定し、（３）該ＤＮＡ断片の鎖配向を逆転させて、改変ＤＮＡ配列（これは、転写されると、アンチセンスｍＲＮＡの産生を引き起こす）を得、（４）該改変ＤＮＡ配列を、該アンチセンスｍＲＮＡに結合しうるｍＲＮＡを有するポリケチド産生微生物中に導入して、該特異的グリコシル化修飾ポリケチドを産生しうる改変ポリケチド産生微生物を得、（５）該特異的グリコシル化修飾ポリケチドの形成に適した条件下で、該改変ポリケチド産生微生物の培養を成長させ、（６）該培養から該特異的グリコシル化修飾ポリケチドを単離する工程を含んでなる方法。 17．ポリケチド産生微生物の遺伝子操作により、特異的グリコシル化修飾ポリケチドの生合成を誘導する方法であって、（１）請求項１に記載の糖生合成遺伝子含有ＤＮＡ配列を単離し、（２）ポリケチド結合糖の生合成またはポリケチドに対するその結合を引き起こす１以上のＤＮＡ断片を、該遺伝子含有ＤＮＡ配列内で同定し、（３）該ＤＮＡ断片を異なるポリケチド産生微生物中に導入して、該特異的グリコシル化修飾ポリケチドを産生しうる改変ポリケチド産生微生物を得、（４）該特異的グリコシル化修飾ポリケチドの形成に適した条件下で、該ＤＮＡ断片を含有する該ポリケチド産生微生物の培養を成長させ、（６）該培養から該特異的グリコシル化修飾ポリケチドを単離する工程を含んでなる方法。 18．該ＤＮＡ断片が、L−ミカロースの生合成またはポリケチドに対するその結合に関与する酵素活性をコードする１以上の遺伝子を含む、請求項 13 または請求項 16 または請求項 17 に記載の方法。 19．該ＤＮＡ断片が、D−デソサミンの生合成またはポリケチドに対するその結合に関与する酵素活性をコードする１以上の遺伝子を含む、請求項 13 または請求項 16 または請求項 17 に記載の方法。 20．該ＤＮＡ断片が、請求項８に記載の配列である、請求項13 または請求項 16 または請求項 17 に記載の方法。 21．配列番号１の約 54 位ヌクレオチドから約 1136 位ヌクレオチドまでのセンス配列、配列番号１の約 1147 位ヌクレオチドから約 2412 位ヌクレオチドまでのセンス配列、配列番号１の約 2409 位ヌクレオチドから約 3410 位ヌクレオチドまでのセンス配列、配列番号２の約 80 位ヌクレオチドから約 1048 位ヌクレオチドまでのセンス配列、配列番号２の約 1048 位ヌクレオチドから約 2295 位ヌクレオチドまでのセンス配列、配列番号２の約2348 位ヌクレオチドから約 3061 位ヌクレオチドまでのセンス配列、配列番号２の約 3214 位ヌクレオチドから約 4677 位ヌクレオチドまでのセンス配列、配列番号２の約 4674 位ヌクレオチドから約 5879 位ヌクレオチドまでのセンス配列、配列番号２の約 5917 位ヌクレオチドから約 7386 位ヌクレオチドまでのセンス配列、および配列番号２の約 7415 位ヌクレオチドから約 7996位ヌクレオチドまでのセンス配列よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド。 22．配列番号２の約 80 位ヌクレオチドから約 1048 位ヌクレオチドまでの配列にコードされる、請求項 31 に記載の単離されたポリペプチド。