JP2000502902A - 膵臓癌に関連する新規ポリヌクレオチドｐａｎｃ１ａ及びｐａｎｃ１ｂ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、膵臓癌や他の癌にも関連するゲノム配列に関連するＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂと呼ばれるポリヌクレオチド配列を提供する。また本発明は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂアンチセンス分子を提供する。さらに本発明は、精製ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチド、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチドの抗体、アンタゴニスト並びにインヒビタ、及び製剤組成物を生産するための遺伝子工学的に実現される発現ベクタ及び宿主細胞、並びにそのポリペプチド、その抗体、アンタゴニスト及びインヒビタに基づく治療方法を提供する。特に本発明は、ポリペプチドを、膵臓癌の可能性が高い個体、並びに膵臓癌なった個体における膵臓癌の検出のための診断用組成物として用いることを提案する。また本発明は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに対するヌクレオチド配列に基づく治療方法及び組成物にも関連する。

Description

【発明の詳細な説明】 膵臓癌に関連する新規ポリヌクレオチドＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ 本発明は、１９９５年１２月２９日出願の米国特許第０８／５８１，２４０号 の一部継続出願であり、その全開示を本明細書に組み込んでいる。 技術分野 本発明は、膵臓癌に関連する新規ポリヌクレオチド配列、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰ ＡＮＣ１Ｂに関連し、膵臓癌の診断及び治療にＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを 利用することに関連する。 背景技術 膵臓は、胃の裏側下部及び十二指腸第１ループの上部をなして延在する臓器で ある。その重さは約１００グラムで、外分泌組織及び内分泌組織の両方からなる 。外分泌組織部分は結合組織隔膜により葉に分割されており、各葉はいくつかの 小葉に分割されている。これらの小葉は、小胞として知られる嚢を形成する分泌 細胞の葡萄状のクラスタから構成される。小胞は機能上の単位体であり、すべて の小胞は主要な膵管を形成するために合併する小葉間管部に排液する。それは肝 臓からの胆道を用いて互いに順番に結合し、十二指腸に中味を移す共通の胆道を 形成する。 膵臓腺房細胞は膵臓の全体積の８０％以上にもなり、胃腸管の消化を助ける様々 な酵素の分泌物内で機能する。 膵臓の内分泌組織部分はランゲルハンス島のような組織の島からなる。これら の散在性の島は、膵臓の全体積の約２％を構成する。膵臓内分泌細胞の基本的な 機能は、タンパク質、炭水化物及び脂肪の代謝に関連する一定のホルモンを分泌 することである。島により分泌されるホルモン は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドである。 膵臓癌は、１９９３年に２７，７００人の発病数と、２４，５００人の死亡数 にのぼっており、アメリカで癌による死者としては、第４位のとなっている（Ca ldas et al,(1994)Nature Gene 8:27-32）。その発病は女性より男性に多く、発 病のピークは６０〜７０歳である。膵臓の癌発病率は、糖尿病患者では２倍であ り、非喫煙者に対して喫煙者は２〜２．５倍である。 膵臓癌にかかった個体に対する生存期間の中央値は、診断時から６ヶ月である 。患者の約１０％は１年生存し、５年間の生存率は１〜２％である（Harrison Principles of Internal Medicine 11th edition,Braunwald et al editor s McGraw-Hill Book Co.,New York,pg.1381-1384）。 最近、Schutte 等((1995))Proc Natl Acad Sci 92:5950-5954）は、Lisitsyn 等により((1995)Proc Natl Acad Sci 92:151-155）記載されたような代表較差解 析（representational difference analysis: ＲＤＡ）法を用いて、１３ｑｌ． ３．で１−ｃＭ領域までの膵臓癌遺伝子地図作成において遺伝子欠失が示された 。その欠失部分は標識Ｄ１３５１７１及びＤ１３５２６０により挟まれ（flanke d）、遺伝性乳癌感染のＢＲＣＡ₂（６００１８５）を含むものと同定された６− ｃＭ領域内にある。上記 Schutte は、同じ遺伝子が多発性腫瘍タイプ内に含ま れることがあること、さらにその機能は顕性がん遺伝子ではなく、がん抑制遺伝 子の機能であることを示唆する。さらに１９９４年に Muller-Pillasch 等は、 ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及び日本の遺伝子データベース（ＤＤＢＪＤＤＢＩ） に、ＮＣＢＩ ＧＩ ５３３９４８と呼ばれるヌクレオチド配列を提示した。Ｎ ＣＢＩ ＧＩ ５３３９４８は膵臓癌細胞株ＰＡＴ Ｕにおいて示差的に発現されることがわかった。 サンガーゲノムセンター（Cambridge,ＵＫ）は、２型乳癌（ＢＲＣＡ２）に対 する原因となる遺伝子を含むと考えられるヒト染色体１３（１３ｑ１２）の領域 における大規模なゲノムＤＮＡ配列決定プロジエクトに関係しており、最近、未 完で、注釈のない形式ではあるが、Ｗｅｂサーバ上にこのＤＮＡ配列のいくつか の大きなフラグメントを公開した。 膵臓癌診断ための現在の方法は、血清アミラーゼ及びリパーゼ値を測定するこ とを含んでいるが、これらの値はすべての場合の１０％のみしか異常を示さない ことがわかっている。膵体及び膵尾の癌が発生した個体の血液、尿、便は、多く の場合正常であることを示す。また標準的な胃腸のＸ線写真は、膵頭の癌の存在 を示唆するかもしれないが、このタイプの癌にかかる全患者の５０％のみが異常 と診断されるにすぎない（Harrison's Principles of Internal Medicine supra ）。 膵臓癌を診断することの難しさ、並びに膵臓癌になった個々の患者の生存率の 低さを考えると、膵臓癌を早期に、しかも正確に検出する方法を有することが望 まれる。また膵臓癌の予防及び治療のための治療組成物及び方法を提供すること が望まれる。 発明の開示 本発明は第１図及び第２図に開示する新規ヌクレオチド配列、ＰＡＮＣ１Ａ（ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＰＡＮＣ１Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に関連 し、膵臓癌の診断、予防及び治療におけるＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの使用 に関連する。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、重複配列フラグメントを大きなヌクレオチ ド配列にアセンブルすることにより、配列アセンブリプロジェクトを作成及び管 理する、ＩＮＨＥＲＩＴ（登録商標）ＤＮＡ Ａｎａ ｌｙｓｉｓ ＳｕｓｔｅｍのＡＢＩ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ ｏｎ ｐａｒｔ（Applied Biosystems 社）を用いて同定された。ＰＡＮＣ１Ａ 及びＰＡＮＣ１Ｂは正常組織内に見出されるヌクレオチド配列からアセンブルさ れ、膵臓腺癌から得られる細胞株において示差的に発現されることが見出された ヌクレオチド配列ＧＩ ５３３９４８（ヒトＸＳ７ ｍＲＮＡ）に対するヌクレ オチド相同性を有することがわかった。第３図に示すように、ＰＡＮＣ１Ａは、 ＰＡＮＣ１Ａの第２１６番目〜第２７４番目の間の付加的な５７個の塩基を除い て、ＧＩ５３３９４８に厳密に一致する。ＰＡＮＣ１Ｂは、付加的な塩基も含む がＰＡＮＣ１Ａとは異なるＧＩ ５３３９４８の別の変異体である。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、サンガーゲノム配列への高い有意性のヌク レオチド配列相同性を有し、それゆえ第８図に示すように、染色体領域１３ｑ１ ２に対してマップすることがわかった。同じ理由で、Ｘｓ７は１３ｑ１２にマッ プされる。 第４図に示すように、膵臓から得られた０７１１７８及び１８０７７３と呼ば れるヌクレオチド配列フラグメント、並びにｈＮＴ−２細胞株（奇形癌細胞株） から得られる４９６０７１はＰＡＮＣ１Ａを作成するために集められた。第５図 に示すように、脊髄から得られる、５５５４０３と呼ばれるヌクレオチド配列フ ラグメント、並びに炎症性アデノイドから得られる０２０３８４は、ＰＡＮＣ１ Ｂを作成するために集められた。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、膵臓腺癌細胞株内に示差的に発現されるこ とが見出されたＧｅｎｂａｎｋ識別子（ＧＩ）５３３９４８、ヒトＸｓ７に対す るヌクレオチド配列相同性を示すが、ＧＩ ５３３９４８はいかなる染色体にも マップする、すなわちリンクすることは示されなかった。さらに上記 Schutte は、同形接合遺伝子欠失が乳癌感受性 に関連することが知られるＢＲＣＡ２遺伝子座と、染色体１３上の同じ領域にマ ップされる膵臓癌に関連することを示した。上記 Schutte は、その同じ遺伝子 が多発性腫瘍タイプに含まれること、さらに顕性がん遺伝子ではなくがん抑制遺 伝子を表すことを示唆した。 ＰＡＮＣ１Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド位置２１６−２７４ 間の付加的な５７ヌクレオチドのインサートを除いてＧＩ ５５５４０３と同じ であり、このインサートはリーディングフレームを保持している。ＰＡＮＣ１Ｂ もＧＩ ５５５４０３への相同性を有するが、ＰＡＮＣ１Ａよりさらに異なるヌ クレオチド配列を有する。 Ｈｘｓ７へのＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの変異は、別のスプライシングイ ベントを示すかもしれないし、あるいは Schutte によりがん抑制遺伝子である と示唆され、多発性腫瘍タイプと考えられる、膵臓癌遺伝予における腫瘍を示す かもしれない。例えばＸｓ７配列において失われた配列は明らかに、タンパク質 の活性を変化させ、ことによるとタンパク質を不活性にすることさえできる。 （４９６０７１から得られる）ＰＡＮＣ１Ａに対する全コード化領域は、その まま配列され、第９図において開示される（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに対するヌクレオチド配列、或いはそのフラグ メント、並びにそれらがコード化するポリペプチドのアミノ酸配列は、膵臓癌及 び例えば乳癌のような他のタイプの癌を早期に、しかも正確に検出するための診 断方法の開発に対して基礎を提供するであろう。例えば、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡ ＮＣ１Ｂから得られるヌクレオチド配列は、膵臓癌または他の癌が発生する危険 性がある個体及び発生した個体からの生検用細胞及び組織のハイブリダイゼーシ ョンアッセイにおいて用いることができる。 さらにＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに対するヌクレオチド配列は、膵臓癌の 予防及び治療のために、アンチセンス配列、精製ポリペプチド並びに抗体のよう な、治療法開発のための基礎を提供する。例えば、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１ Ｂから得られるヌクレオチド配列は、膵臓癌の予防或いは治療をするために試み において、その遺伝子が同じ遺伝子座にマップされる膵臓癌或いは他の癌が発生 する危険性がある個体及び発生した個体に投与することができる。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに対してここに開示されるポリヌクレオチド配 列、或いはその変異体は、膵臓癌に関連する疾患及び状態の診断をするためのオ リゴヌクレオチドプローブを設計するための基礎を提供する。そのようなプロー ブは、重い臨床症状が発現する前に、癌を診断するために用いることができる。 また本発明は、膵臓癌発生の危険性がある個体及び膵臓癌が発生した個体のゲノ ムＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂヌクレオチド配列の発現を低減にする、或いは 無くすために用いることができるＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂアンチセンス分 子を提供する。また本発明は、ヌクレオチド配列のin vitro或いはin vivo生成 のための、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂからなる発現ベクタ及び宿主細胞にも 一部関連する。 また本発明はＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチド、或いはそのフラグ メントまたは変異体の使用に関連し、それゆえ抗ＰＡＮＣ１Ａ或いは抗ＰＡＮＣ １Ｂ抗体を生成すること、さらには膵臓癌を予防或いは治療するために治療上用 いることができるＰＡＮＣ１Ａ或いはＰＡＮＣ１Ｂポリペプチドのアンタゴニス ト或いはインヒビタをスクリーニングすることに関連する。 さらに本発明は、膵臓癌発生の危険性がある患者及びに既に発生した患者に対 して、精製ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチド、或い はその変異体からなる組成物を投与することに関連する。 また本発明は、膵臓癌を含むＰＡＮＣ１Ａ或いはＰＡＮＣ１Ｂの異常発現を含 む、疾患状態の診断、予防並びに治療のための抗ＰＡＮＣ１Ａ或いは抗ＰＡＮＣ １Ｂ抗体、或いは他のアンタゴニストまたはインヒビタからなる組成物に関連す る。 ここに開示するＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリヌクレオチド配列、オリゴ ヌクレオチド、フラグメント、その一部すなわちアンチセンス分子は、細胞及び 組織内のＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ ｍＲＮＡのレベルを検出し、かつ計量 するための診断検査法において用いることができる。例えばここに開示するＰＡ ＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリヌクレオチド配列は、遺伝子発現における異常性 を診断するための溶液、膜或いは組織に基づくアッセイにおいて、近縁な、或い は同一の配列を検出するために用いることができる。本発明はさらに精製ＰＡＮ Ｃ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂからなる細胞及び組織におけるＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮ Ｃ１Ｂを検出するための診断検査法及びキットを提供し、ポジティブコントロー ル、並びに抗ＰＡＮＣ１Ａ及び抗ＰＡＮＣ１Ｂ抗体として用いることができる。 そのような抗体は、ＰＡＮＣ１Ａ或いはＰＡＮＣ１Ｂの発現、またはその遺伝子 欠失或いは変異体の発現に関連するあらゆる疾患状態或いは条件を検出するため に、溶液用、膜用或いは組織用技術において用いることができる。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂアンチセンス分子、抗ＰＡＮＣ１Ａ及び抗ＰＡ ＮＣ１Ｂ抗体、ＰＡＮＣ１Ａ或いはＰＡＮＣ１Ｂのアンタゴニスト或いはインヒ ビタは、例えば膵臓癌に関連するＰＡＮＣ１Ａ或いはＰＡＮＣ１Ｂの発現を抑制 、或いは中和する際に、治療目的で用いることができる。本発明はＰＡＮＣ１Ａ 或いはＰＡＮＣ１Ｂの異常発現に関連する疾患状態を治療するための薬品組成物 を提供する。 また本発明は、膵臓癌発生の危険性がある個体、或いは発生した個体に、本発 明のヌクレオチド配列を導入するための遺伝子治療方法を使用することを含む。 図面の簡単な説明 第１図はＰＡＮＣ１Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のヌクレオチド配列を示す 。これと第２図に示される配列はＤＮＡＳＴＡＲ ｓｏｆｔｗａｒｅ(ＤＮＡＳ ＴＡＲ社,Madison ＷＩ)のｍｕｌｔｉｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍを用いて生成された。 第２図はＰＡＮＣ１Ｂのヌクレオチド配列を示す。 第３図はＰＡＮＣ１Ａ（ここで７１１７８と呼ばれる）、ＰＡＮＣ１Ｂ（ここ で２０４８３と呼ばれる）並びにＧＩ ５３３９４８（ＸＳ７と呼ばれる）ヌク レオチド配列を示す。 第４図はクローン番号７１１７８，１８０７７３及び４９６０７１を用いるＰ ＡＮＣ１Ａ群を示す。 第５図はクローン番号５５５４０３及び０２０３８４を用いるＰＡＮＣ１Ｂ群 を示す。 第６図はＰＡＮＣ１Ａ、ＰＡＮＣ１Ｂ並びにＢＲＡＣ２遺伝子座を有するＧＩ ５５５４０３（Ｈｘｓ７）の配列の略図である。 第７図はＰＡＮＣ１Ａ、ＰＡＮＣ１Ｂ並びにＸｓ７間の推定アミノ酸配列相同 性を示す。 第８Ａ−８Ｅ図はＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂのアセンブリ並びにサンガー ゲノム配列において用いられる個々のヌクレオチド配列間のヌクレオチド相同性 を示す。 第９図はＰＡＮＣ１Ａの全コード化領域に対するヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）を示す。開始ＡＴＧは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド位置１４８ から開始する。その翻訳はＭａｃＤＮＡｓｉｓＰｒｏ（登録商標）ｓｏｆｔｗａ ｒｅ（日立ソフトウエアエンジニアリング社 SanBruno ＣＡ）を用いて作成さ れた。 発明を実施するための形態 本発明は第１図及び第２図に開示する新規ヌクレオチド配列、ＰＡＮＣ１Ａ及 びＰＡＮＣ１Ｂに関連し、さらに膵臓癌の診断、予防及び治療におけるＰＡＮＣ １Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの使用に関連する。 ここで用いるような「核酸配列」はオリゴヌクレオチド配列、ヌクレオチド配 列或いはポリヌクレオチド配列、並びにそのフラグメント或いは一部を示し、さ らにセンス鎖或いはアンチセンス鎖のいずれかを表す２本鎖或いは１本鎖である ゲノム、或いは合成起源（synthetic origin）のＤＮＡ或いはＲＮＡを示す。同 様にここで用いるような「アミノ酸配列」はペプチド配列或いはタンパク質配列 、またはその一部を示す。 ここで用いるようなＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、自然発生型或いは異型 、或いは自然、合成、半合成或いは組換えのいすれかの任意の源からの、ウシ、 ヒツジ、ブタ、ウマ、ネズミ或いは好適にはヒトを含む任意の種からのＰＡＮＣ １Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを示す。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、重複配列フラグメントを大きなヌクレオチ ド配列にアセンブルすることにより、配列アセンブリプロジェクトを作成及び管 理するＩＮＨＥＲＩＴ（登録商標）ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｓｔｅｍの ＡＢＩ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐａｒｔ（Applied Bi osystems 社）を用いて同定される。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは正常組織 において見出されるヌクレオチド配列からアセンブルされ、膵臓腺癌から得られ る細胞株において示 差的に発現されることが見出されたヌクレオチド配列ＧＩ ５３３９４８（ヒト ＸＳ７ ｍＲＮＡ）へのヌクレオチド相同性を有することがわかった。第３図に 示すように、ＰＡＮＣ１Ａは、ＰＡＮＣ１Ａの第２１６番目〜第２７４番目の間 の付加的な５７個の塩基を除いて、ＧＩ ５３３９４８に厳密に一致する。ＰＡ ＮＣ１ＢはＰＡＮＣ１Ａとは異なるＧＩ ５３３９４８の変異体である。ＰＡＮ Ｃ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、染色体領域１３ｑ１２にマップするサンガーゲノム 配列に対するヌクレオチド配列相同性を有することがわかった。 ここで用いるような「自然発生」とは、自然界に見出されるｍＲＮＡを有する ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを示し、「生物的活性の」とは、自然発生ＰＡＮ Ｃ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの構造的、調節的或いは生化学的機能を有するＰＡＮＣ １Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを示す。同様に、「免疫学的活性」とは、自然体、組換え 体或いは合成体ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ、或いはその任意のオリゴペプチ ドの特性を定義し、それらは適当な動物或いは細胞において特定の免疫反応を誘 発し、さらに特定の抗体と結合する。 ここで用いるような用語「誘導体」とは、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの化 学修飾を示す。そのような修飾の例示は、水素と、アルキル基、アシル基或いは アミノ基の置換であろう。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチド誘導体は 、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの本質的な生物学的特性を保持するポリヌクレ オチドをコード化する。 ここで用いるような用語「精製」とは、核酸配列或いはアミノ酸配列いずれか の分子が自然環境から取り除かれ、それらが自然に結合される少なくとも１つの 他の組成物から隔離、すなわち分離されていることを示す。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂコード化配列 ＰＡＮＣ１Ａ(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１)及びＰＡＮＣ１Ｂ(ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：２)のヌクレオチド配列が第１図及び第２図にそれぞれ示される。ＰＡＮＣ １Ａの全コード化領域が第９図（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に示される。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、膵臓腺癌細胞株において示差的に発現され ることが見出されたＧｅｎｂａｎｋ識別子（ＧＩ）５３３９４８、ヒトＸｓ７へ のヌクレオチド配列相同性を示すが、ＧＩ ５３３９４８はいかなる染色体にも マップする、すなわちリンクすることは示されなかった。さらに上記 Schutte は、同形接合遺伝子欠失が乳癌感受性に関連することが知られるＢＲＣＡ２遺伝 子座と、染色体１３上の同い領域にマップされる膵臓癌に関連することを示した 。上記 Schutte は、その同じ遺伝子が多発性腫瘍タイプに含まれること、さら に顕性がん遺伝子ではなく、がん抑制遺伝子を表すことを示唆した。 ＰＡＮＣ１Ａは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド位置第２１６番目〜 第２７４番目の間の付加的な５７個のヌクレオチドのインサートを除いてＧＩ ５５５４０３と同じであり、そのインサートはリーディングフレームを保持して いる。ＰＡＮＣ１ＢもＧＩ ５５５４０３への相同性を有するが、ＰＡＮＣ１Ａ 以上に異なるヌクレオチド配列を有する。 Ｈｘｓ７へのＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの変異は、別のスプライシングイ ベントを示すかもしれないし、あるいは Schutte によりがん抑制遺伝子である と示唆され、多発性腫瘍タイプと考えられる、膵臓癌遺伝子における腫瘍を示す かもしれない。 ＤＮＡ配列決定のための方法は当業者には周知であり、ＤＮＡポリメラーゼＩ ，Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）のクラノウフラグメント（ＵＳ Biochemical 社,Cleveland ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ(Perkin elmer社,Foste r City ＣＡ)、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ(Amersham 社,ChicagoIL)、或いは Gi bco ＢＲＬ（Gaithersburg ＭＤ）Methods 社から市販されているＥＬＯＮＧＡ ＳＥ増幅システムのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌ クレアーゼとの組み合わせ、のような酵素を使用して、一本鎖テンプレート及び 二本鎖テンプレートとの両方に対して開発されており、対象となるＤＮＡテンプ レートにアニールされたオリゴヌクレオチドプライマからＤＮＡを延長する。連 鎖終了反応生成物は電気泳動を用いて分離され、組み込まれ、標識された前駆体 を介して検出される。最近の機械化反応プレパラート、配列分析並びに解析にお ける改善は、１日当たりに画定できる配列数を拡大できるようにした。好適には この処理は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ２２００（Hamilton 社，R eno NV）、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２００；MJ Reserch 社，Watertown MA）並びにＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（F oster City CA）Ｃａｔａｌｙｓｔ８００及び３７７及び３７３ＤＮＡシーケン サのような装置を用いて自動化される。 任意の特定ｃＤＮＡライブラリの品質はｃＤＮＡのパイロットスケール解析を 実行することにより、さらにはクローン含有ベクタ、λ或いはＥ．ｃｏｌｉＤＮ Ａ、ミトコンドリア或いは反復ＤＮＡ、並びに公的データベースに厳密に或いは 相同的に一致するクローンのパーセンテージを検査することにより画定される。 延長ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリヌクレオチド配列 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂのポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ ：１或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２からの部分的なヌクレオ チド配列と、プロモータ及び調節素子のような上流配列を検出するための当業者 には周知の様々な方法とを用いて延長することができる。 Gobinda 等（1993; ＰＣＲ Methods Applic 2:318-22）は既知の遺伝子座に隣接 する未知の配列を検索するために汎用プライマを用いる直接的な方法として「制 限部位ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」を開示する。まずゲノムＤＮＡが、既 知の領域に対する特異なリンカ配列及びプライマに対して、プライマ存在下で増 幅される。増幅された配列は、その同じリンカプライマ及び最初のプライマの内 部にある別の特異なプライマを用いてＰＣＲの２巡目にかけられる。ＰＣＲの各 巡回の生成物は、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用 いて配列決定される。 逆ＰＣＲは既知領域に基づく分岐プライマを用いて配列を増幅、すなわち延長 するために用いることができる(Triglia 等（1988）NucleicAcids Res 16:8186) 。プライマはＯｌｉｇｏ４．０（National Biosciences社,Plymouth ＭＮ）或い は別の適切なプログラムを用いて設計され、長さが２２−３０ヌクレオチドにな り、５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８−７２℃の温度で標的配列にア ニールする。その方法はいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域におけ る適切なフラグメントを生成する。そのフラグメントはそれから分子内ライゲー ションにより流布され、ＰＣＲテンプレートとして用いられる。 キャプチャＰＣＲ（Lagerstrom Ｍ等（1991）ＰＣＲ Methods Applic1:111-19 ）は、ヒト及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤＮ ＡフラグメントのＰＣＲ増幅をするための方法である。またキャプチャＰＣＲは 多数の制限酵素の消化及びライゲーションを必要とし、ＰＣＲ前にＤＮＡ分子の 未知の部分に設計された二本鎖配列を配置する。 Parker ＪＤ 等（1991;Nucleic Acids Res 19:3055-60）は、歩行ＰＣＲ、す なわち未知の配列の検索ができる標的遺伝子歩行のための方法を教示する。Ｐｒ ｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（登録商標）、Clontech 社（PaloAlto ＣＡ）から入 手できる新しいキットは、ＰＣＲ、入れ子状（nested）プライマ並びにプロモー タファインダライブラリを用いて、ゲノムＤＮＡ内を歩行する。この過程はライ ブラリをスクリーニングする必要性を避け、イントロン／エクソン接合部を探し 出すのに有用である。 別のＰＣＲ方法としては、Guebler 等による１９９５年６月７日出願の米国特 許第０８／４８７，１１２号「Improved Method for Obtaining Full Length cD NA Sequences 」があり、参照してここで組み込んでおり、ＸＬ−ＰＣＲ（登録商 標）（Perkin elmer 社,Foster City ＣＡ）を用いて、ヌクレオチド配列を増幅 、並びにまた延長する。 完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするための好適なライブラリは、大きさが選 択され、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリである。また無作為に初回抗原さ れた（primed）ライブラリは、遺伝子の５′及び上流領域を含むより多くの配列 を含むということが好適である。無作為に初回抗原されたライブラリは、オリゴ ｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを生成しないなら特に有用ある。ゲノムラ イブラリはイントロンを得るために、そして５′配列を延長するために有用であ る。 大きさを解析する或いは配列分析する、すなわちＰＣＲ生成物のヌクレオチド 配列を確認するための新しい方法は毛細管電気泳動である。迅速な配列分析のた めのシステムは、Perkin elmer 社、BeckmanInstruments 社（Fullerton ＣＡ） 並びに他の企業から入手できる。毛細管電気泳動は、電気泳動分離のための流動 可能ポリマ、レーザ活性化される４つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに対し て１つ）並びにＣＣＤカメラによる放射された波長の検出を用いる。出力／光強 度は適切な ソフトウエア（例えば Perkin elmer 社製の Genotyper（登録商標）及び Seque nce Navigator（登録商標））を用いて電気信号に変換され、サンプルのロード からコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御され る。毛細管電気泳動は特定のサンプルの限定された量の中に存在するＤＮＡの小 片の配列分析に特に適している。３０分間でＭ１３ファージＤＮＡの３５０ｂｐ までの転写配列が報告されている（Ruiz-Martinez ＭＣ等（1993）Anal Chem 65 :2851-8）。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの発現 本発明に従って、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリヌクレオチド配列、フラ グメント、融合タンパク質或いはその機能的等価物をコード化するＰＡＮＣ１Ａ 及びＰＡＮＣ１Ｂポリヌクレオチド配列が、適切な宿主細胞内のＰＡＮＣ１Ａ及 びＰＡＮＣ１Ｂの発現を管理する組換えＤＮＡ分子を生成するために用いること ができる。遺伝子コードの固有の縮退により、概ね同一か或いは機能的に等価な アミノ酸配列をコード化するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：２のヌクレオチド配列以外のＤＮＡ配列は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂそ れぞれをクローニングし、かつ発現するために用いられる。当業者には理解でき るように、非自然発生コドンを有するＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂコード化ヌ クレオチド配列を生成することが有利である。特定の原核宿主或いは真核宿主に より好まれるコドン（Murray Ｅ等（1989）;NucleicAcids Res 17:）は選択する ことができ、例えば、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ発現率を増大させたり、或 いは自然発生配列から生成された転写産物ではなくて、より長い半減期のような 所望特性を有する組換えＲＮＡ転写産物を生成したりする。 また本発明の範囲に含まれるものとして、最も厳密な状態への中間の 状態下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１或いはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にハイブリダ イゼーションできるポリヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーション条件 は、Wahl 等（1987,Methods Enzymol 152:399-407）により教示され、ここで参 照して組み込んでいるように、核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づいており、 以下に説明するように、定義された「厳密さ」を与える。 「最大の厳密さ」は典型的に約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの下５℃）で発生 し、「高い厳密さ」はＴｍの下約５〜１０℃で発生し、「中間の厳密さ」はＴｍ の下約１０〜２０℃で発生し、「低い厳密さ」はＴｍの下約２０〜２５℃で発生 する。当業者には理解できるように、最も厳密なハイブリダイゼーションは、同 一のポリヌクレオチド配列を同定、すなわち検出するために用いることができる が、一方中間の（或いは低い）厳密さのハイブリダイゼーションは類似の、すな わち関連のあるポリヌクレオチド配列を同定、すなわち検出するために用いられ る。 ここで用いるような用語「ハイブリダイゼーション」は「核酸鎖が塩基対合を 通る相補鎖と結合する過程」を示す（Coombe Ｊ（1994）Dictionary of Biotech nology ,Stockton Press 社,New York）。ポリメラーゼ連鎖反応技術において実 行されるような増幅は、Dieffenbach ＣＷand ＧＳ Dveksler（1995，PCR Prime r,a Laboratory Manual ，ColdSpring Harbor Press 社,New york）に記載される 。 ここで用いられるような「遺伝子欠失」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチ ド、若しくはアミノ酸残基が欠けているヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の いずれかにおける変化として定義される。 ここで用いられる用語「挿入」或いは「付加」は、自然発生ＰＡＮＣ１Ａ及び ＰＡＮＣ１Ｂに比べて、結果的に１つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはアミ ノ酸残基の加わえられるヌクレオチド配列或いはアミ ノ酸配列の変化である。 ここで用いるような「置換」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはア ミノ酸を異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えることに起因する。 変異体ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリヌクレオチド配列は、本発明により 用いることができ、異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結 果的に同一の或いは機能的に等価のＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチド をコード化するポリヌクレオチドとなる。また変異体ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ １Ｂタンパク質も本発明により用いることができ、結果的に機能的等価なＰＡＮ Ｃ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂとなる限りにおいて、アミノ酸残基の欠失、挿入並びに 置換を含んでもよい。アミノ酸置換は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの生物活 性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性並び にまた両親媒性についての類似性に基づいて行われる。例えば負の電荷に帯電し たアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正の電荷に帯電したアミ ノ酸はリシン及びアルギニンを含み、同じ親水値を持つ帯電しない極性頭基を有 するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アス パラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン並びにチロシン を含む。 本発明の範囲に含まれるものとして、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂのアレル がある。ここで用いる「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＰＡＮＣ１Ａ及び ＰＡＮＣ１Ｂの別の形態である。アレルは変異、すなわち核酸配列の変化に起因 し、一般に変更されたｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生成し、そのｍＲＮＡ或い はポリペプチドの構造或いは機能は変更される場合されない場合がある。任意の 与えられた遺伝子はアレル形態がないもの、１つのもの、或いは多数のものがあ るかもしれない。 アレルを生じる通常の変異は一般に、核酸の欠失、付加並びに置換に起因する。 このタイプの各変化は単独で、或いは他の遺伝子の組み合わせで、１回或いはそ れ以上、与えられた配列内で生じるかもしれない。 本発明のヌクレオチド配列は、限定はしないが遺伝子生成物のクローニング、 プロセッシング並びにまた発現を変更する別形態を含んでおり、様々な理由によ りＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂコード化配列を変更するために設計されるかも しれない。例えば、変異は、当業者にはよく知られる技術、例えば新しい制限部 位の挿入、グリコシル化パターン変更、コドン選択の変化等による特定部位突然 変異誘発を用いて導入されることができる。 本発明の別の実施例では、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ自然配列、変更配列 或いは組換え配列が、異種の配列に結合され、融合タンパク質をコード化する。 例えば、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ活性のインヒビタに対するペプチドライ ブラリをスクリーニングする場合に、それは商用で入手可能な抗体により認知さ れる異種のペプチドを発現するキメラＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂタンパク質 をコード化するために有用であるかもしれない。また融合タンパク質はＰＡＮＣ １Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ配列と異種のタンパク質配列との間に位置する切断部位を 包含するように設計されることもあり、その結果ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ は切断され、異種の部分から分かれて精製されるかもしれない。 本発明の別の実施例では、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂのコード化配列は、 当業者によく知られた化学的方法を用いて、全体的に、或いは部分的に合成され る（Caruthers 等（1980）Nuc Acids Res Symp Ser7:215-223、Crea, Horn（198 0）Nuc Acids Res 9:2331、Matteucci,Caruthers（1980）Tetrahedron Lett 21: 719、Chow，Kempe（1981）Nuc Acids Res 9:2807-2817参照）。別法では、タン パク質自体がＰＡ ＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂアミノ酸配列を、全体的に或いは部分的に合成する化 学的方法を用いて生成されることができる。例えばペプチドは固相枝術により合 成され、樹脂から切断され、さらに分離高速液体クロマトグラフィにより精製さ れる（例えば Creighton（1983）ProteinsStructure And Molecular Principles ，ＷＨ Freeman and Co，Newyork）。合成されたペプチドの構成は、アミノ酸解 析或いは配列分析により確認することができる（例えば the Edman degradation procedure;Creighton,supra）。 直接ペプチド合成は固相技術（Roberge ＪＹ 等（1995）Science269:202-204 ）を用いて実行され、自動化した合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ ４３１Ａペプチド合成器を用いて、製造者により提供される使用説 明書に従って達成される。さらにＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂのアミノ酸配列 、或いはその一部は、直接合成中に変更され、並びにまた他のサイトカイン配列 、或いはその一部を有する化学的方法を用いて結合され、変異体ポリペプチドを 生成する。 発現系 生物活性ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを発現するために、ＰＡＮＣ１Ａ及び ＰＡＮＣ１Ｂに対するコード化したヌクレオチド配列、或いは機能的等価物は、 適切な発現ベクタ、すなわち挿入されるコード化配列の転写及び翻訳のために必 要な要素を含むベクタに挿入される。 当業者によく知られる方法が、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂコード化配列及 び適切な転写、或いは翻訳制御を含む発現ベクタを構成するために用いるられる 。これらの方法はin vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術並びに in vivo 組換え 、すなわち遺伝子組換えを含む。そのような技術は Maniatis 等(1989)Molecula r Cloning,A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press,Planview ＮＹ 及び Ausubel ＦＭ 等 CurrentProtocol i n Molecular Biology ,John Wilky ＆Sons,New John Wilky＆Sons,New Yorkに記 載されている。 種々の発現ベクタ／宿主系が、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂコード化配列を 含み、発現するために利用される。これらは、限定はされないが、変異体バクテ リオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクタを形質転換したバク テリア、酵母菌発現ベクタを形質転換した酵母菌、ウイルス発現ベクタ（例えば バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、ウイルス発現ベクタ（例えばカリフ ラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）に形質移入 、或いはバクテリア発現ベクタ（例えばＴｉ、或いはｐＢＲ３２２プラスミド） に形質転換された植物細胞系、或いは動物細胞系を含む。 これらの系は「制御素子」或いは「調節配列」は抵抗力及び特異性において異 なり、ベクタ非翻訳領域、エンハンサ、プロモータ及び３′非翻訳領域であり、 転写及び翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用する。利用される ベクタ及び宿主に依存して、構成的及び誘導性プロモータを含む、任意の数の適 切な転写及び翻訳素子が用いられる。例えば、バクテリア系においてクローニン グするとき、Bluescript（商標）phagemid（Stratagene 社，LaJolla ＣＡ）の ｈｙｂｒｉｄｌａｃＺプロモータ及びｐｔｒｐ−ｌａｃ ｈｙｂｒｉｄ並びに同 様の誘導性プロモータが用いられる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモータ は昆虫細胞において用いられる。植物細胞のゲノム（例えばheat shock,ＲＵＢ ＩＳＣＯ及びストレージタンパク質遺伝子）から引出される、或いは植物ウイル ス（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダ配列）から引出されるプロモータ 或いはエンハンサはベクタ内にクローン化される。哺乳動物細胞では、哺乳動物 遺伝子或いは哺乳動物ウイルスからのプロ モータが最適である。もしＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの多数の複製を含む細 胞株を発生させる必要があるなら、SV40 或いは ＥＢＶ に基づくベクタが、適 切な選択可能標識と共に用いられる。 バクテリア系では、多数の発現ベクタがＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに対す る使用に依存して選択される。例えば大量のＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂが抗 体を誘導するために必要とされるなら、容易に精製される融合タンパク質の高レ ベルの発現を可能とするベクタが望まれる。そのようなベクタは、限定はしない が、Ｅ.coli クローニング及び発現ベクタ Bluescript（商標）で、そこにおい てＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂコード化配列は、アミノ基末端メチオニン及び β−ガラクトシダーゼの後続する７残基に対する配列を用いてフレーム内におい てベクタに結合され、ハイブリッドタンパク質が生成されるものや、また pIN ベクタ（Van Heeke&Schuster（1989）Ｊ Biol Chem 264:5503-5509）及び同様の ものを含む。また ｐＧＥＸベクタ（Promage 社、Madison ＷＩ）もグルタチオ ン Ｓ−トランスファーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として異種ポリペ プチドを発現するため用いられる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性 であり、グルタチオンアガロースビードへの吸着に続き、遊離グルタチオンの存 在における遊離により分離した細胞から容易に精製できる。その系において生成 されたタンパク質はヘパリン、トロンビン或いは第 ＸＡ 因子プロテアーゼ切断 部位を含むように設計され、対象となるクローン化ポリペプチドは随意に ＧＳ Ｔ 部分から遊離される。 酵母菌、Saccharomyces cerevisiae では、α因子、アルコールオキシダーゼ 及び ＰＧＨ のような構成的或いは誘導性プロモータを含む多数のベクタが用い られる。再検討する場合には、Ausubel 等(前出)及び Grant等（1987）Methods Enzymol 153:516-544 を参照されたい。 植物発現ベクタを用いる場合には、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂコード化配 列の発現は、多数の任意のプロモータにより駆動される。例えば CaMV の 35Ｓ 及び 19Ｓ プロモータ（Brisson 等（1984）Nature310:511-514）のようなウイ ルス性プロモータは、単独で、或いは ＴＭＶ（Takamatsu 等（1987）ＥＭＢＯ Ｊ 6:307-311）からのω−リーダ配列に関連して用いられる。別法では、ＲＵＢ ＩＳＣＯ(Coruzzi 等（1984）ＥＭＢＯＪ 3:1671-1680）、Broglie 等（1984）S cience 224:838-843）の小サブユニット、或いは熱ショックプロモータ（Winter Ｊ及び Sinibaldi ＲＭ（1991）Results Probl Cell Differ 17:85-105）のよ うな植物プロモータが用いられる。これらの構成は直接 ＤＮＡ 形質転換或いは 病原体媒介形質移入により植物細胞内に導入される。そのような技術を再検討す る場合には、Hobbs Ｓ及び Murry ＬＥ、McGraw Yearbook of Science andTechn ology（1992）McGraw Hill NY,pp191-196及び Weissbach andWeissbach（1988） Methods for Plant MolecularBiology,AcademicPress ＮＹ,pp421-463を参照さ れたい。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを発現するために用いることができる別の発現 系は昆虫系である。１つのそのような系では、Autographacalifornica 核多角体 病ウイルス（AcNPV）がベクタとして用いられ、Spodoptera frugiperda細胞或い は Trichoplusiaの幼虫において異種遺伝子を発現する。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡ ＮＣ１Ｂコード化配列は、ポリヘドリン遺伝子にような、ウイルスの非必須領域 内にクローニングされ、ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれる。ＰＡＮＣ １Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの挿入が成功した場合には、ポリヘドリン遺伝子を不活性 にし、コートタンパク質膜が欠如した変異体ウイルスを生成する。変異体ウイル スはそれからS.frugiperda 細胞或いは TrichopIusia の幼虫に感染するために 用いられ、その中でＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ発現される （Smith 等（1983）Ｊ Virol 46:584、Engelhard ＥＫ 等（1994）Proc NatAcad Sci 91:3224-7）。 哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス性発現系が利用することができる。アデ ノウイルスが発現ベクタとして用いられる場合には、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ １Ｂコード化配列は、後期プロモータ及び三連リーダ配列からなるアデノウイル ス転写／翻訳複合体内に結合される。ウイルス性ゲノムの非必須 E1 或いは E3 領域における挿入により、結果的に感染した宿主細胞におけるＰＡＮＣ１Ａ及び ＰＡＮＣ１Ｂを発現することができる生存可能ウイルスになる(Logan 及び Shen k(1984)Proc NatAcad Sci 81:3655-3659)。さらにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ ）エンハンサのような転写エンハンサは哺乳類宿主細胞内の発現を増加させるた めに用いることができる。 また特定の開始信号が、挿入されるＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂコード化配 列の有効な翻訳のために必要となる。これらの信号は ＡＴＧ 開始コドン及び隣 接配列を含む。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ、その開始コドン及び上流配列が 適切な発現ベクタ内に挿入される場合には、それ以上の翻訳制御信号は必要では ない。しかしながらコード化配列、或いはその一部のみが挿入される場合には、 ＡＴＧ 開始コドンを含む外来の翻訳制御信号が与えられなければならない。さ らに、開始コドンは正確なリーディングフレームにある必要があり、全インサー トの転写を確実に行わなければならない。外来転写素子及び開始コドンは、自然 及び合成両方の様々に由来することができる。発現の効果は、細胞系に適切なエ ンハンサの封入により強められる（Scharf 等（1994）Results ProblCell Diffe r 20:125-62、Bitter 等（1987）Methods Enzymol 153:516-544）。 さらに宿主細胞株は、挿入された配列を変更するための、或いは所望 の形式において発現したタンパク質を処理するための特性を求めて選択される。 そのようなポリペプチドの修飾は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル 化、グリコシレーション、リン酸化、リピデーション並びにアシル化を含む。ま たタンパク質の前駆体を切断する翻訳後処理は、正確な挿入、フォールディング 、並びにまた機能に対して重要である。ＣＨＯ,HeLa,ＭＤＣＫ,293,ＷＩ38等の ような異なる宿主細胞は、そのような翻訳後活性化のための特定の細胞用機械及 び特徴的な機構を有しており、正確に修飾し、かつ導入される外来タンパク質の 処理を確実に実行するために選択される。 長期的に、変異体タンパク質の高生産量を確保するためには、安定した発現が 望ましい。例えばＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを安定的に発現する細胞株は、 ウイルス由来の複製物、或いは内因性発現素子及び選択可能標識遺伝子を含む発 現ベクタを用いて形質転換される。ベクタの導入に続いて、細胞は、選択した媒 質に切り替えられる前に、濃縮された媒質内で１〜２日間成長させられる。選択 可能標識は選択物への耐性を与え、導入された配列をＤＮＡ内に安定的に結合す る細胞を同定できるようにする。細胞の耐性クランプは細胞タイプに適切な組織 培養技術を用いて増殖することができる。 選択系がいくつであっても形質転換された細胞株を取り出すために用いること ができる。限定はしないが、選択系は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ Wigler 等（1977）Cell 11:223）及びアデニンフォスフォリボシール転換酵素（ Lowy 等（1980）Cell 22:817）遺伝子を含み、それぞれ tk^-及び aprv^-細胞にお いて用いられる。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤の抵抗力は選択物を もとにして用いられる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する抵抗力を与 え（Wigler 等(1980)Natl Acad Sci 77:3567）、ｎｐｔはアミノグリコシッド剤 、ネオ マイシン及びＧ−４１８に対する抵抗力を与え（Colberre-Garapin 等（1981） Ｊ Mol Biol 150:1）、ａｌｓ或いはｐａｔはクロルスルフロン（chlorsulfuron ）、フォスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricin acet yltransferase）に対する抵抗力を与える（上記 Murry）。さらに選択可能遺伝 子は、例えば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにす るｔｒｐＢ、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用でき るようにするｈｉｓＤを記載している（Hartman 及び Mulligan（1988）Proc Na lt Acad Sci85:8047）。最近になって、形質転換体を同定するためばかりではな く、特定ベクタ系が要因となる一過性の或いは安定なタンパク質発現の量を計量 するために広く用いられるβ−グルクロニダーゼ、アントシアニン及びルシフェ リンのような標識を用いる、可視標識が非常によく用いられる（Rhodes ＣＡ等 （1995）Methods Mol Biol 55:121-31）。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを含む形質転換体の同定 標識遺伝子発現の存在／不在は、対象の遺伝子も存在することを示唆するが、 その存在及び発現は確認されるべきである。例えばもしＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮ Ｃ１Ｂが標識遺伝子配列内に挿入されるなら、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを 含む組換え細胞が標識遺伝子機能の存在により同定できる。別法では標識遺伝子 は、単一プロモータの制御下でＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ配列と連携して配 置することができる。標識遺伝子の発現は、誘導或いは選択に応じて、通常さら にＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの発現も示す。 別法では、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに対するコード化配列を含み、さら にＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを発現する宿主細胞が、当業者には周知の様々 な手順により同定できる。これらの手順は、限定はし ないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び、核 酸及びタンパク質の検出並びにまた定量するための膜用、溶液用或いは破片用技 術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイを含む。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリヌクレオチド配列の存在は、ＤＮＡ−ＤＮ Ａ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション或いは、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡ ＮＣ１Ｂのプローブ、一部、或いはフラグメントを用いる増幅により検出するこ とができる。核酸増幅に基づくアッセイは、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ配列 に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマを使用し、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮ Ｃ１ＢのＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出することを含む。ここで用 いるような「オリゴヌクレオチド」或いは「オリゴマ」とは、プローブ或いはア ンプリマ（amplimer）として用いることができる、少なくとも１０ヌクレオチド 、多い場合には６０ヌクレオチド、好適には１５〜３０ヌクレオチド、より好適 には２０〜２５ヌクレオチドからなる核酸配列を示す。 タンパク質に対する特定のポリクローナル及びモノクローナル抗体のいずれか を用いて、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチドの発現を検出し、測定す るための種々のプロトコルは当業者には周知である。例えば、そのプロトコルは 固相酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍 光性活性細胞選別法（ＦＡＣＥ）を含む。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペ プチド上で２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利 用する二部位モノクローナル用イムノアッセイ（two-site，monoclonal-basedim munoassay）は好適ではあるが、競合結合アッセイも用いられる。これらの並び に他の検査法は、他にもあるが、Hampton Ｒ 等（1990,Serologivcal Methods, ａ Laboratory Manual，ＡＰＳ Press,St Paul ＭＮ）及び Maddox ＤＥ 等（1983,Ｉ Exp Med 158:1211）に記載される。 さらに多くの標識及び結合技術は当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ ノ酸検査法において用いることができる。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに関連 する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプロ ーブを生成するための手段は、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端 標識化或いは標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含む。別法では、Ｐ ＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ配列、或いはその任意の部分が、ｍＲＮＡプローブ の生成のためにベクタ内にクローニングされる。そのようなベクタは当分野では 周知であり、商用で入手可能であり、Ｔ７，Ｔ３或いはＳＰ６並びに標識された ヌクレオチドのような適切なＲＮＡポリメラーゼの付加により、in vitro での ＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。 Pharmacia Biotech 社（Piscataway ＮＪ）、Promega 社（Madison ＷＩ）並 びにＵＳ Biochemical 社 (Cleveland ＯＨ)のようないくつかの企業がこれらの 手順に対する商用のキット及びプロトコルを提供する。適切なリポータ分子、す なわち標識は放射性核種、酵素、蛍光性、化学ルミネセンス或いは色素性因子及 び基質、補助因子、インヒビタ、磁気粒子或いはその類似のものを含む。そのよ うな標識の使用を教示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８ ５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２ ７７，４３７号、第４，２７５，１４９号並びに第４，３３６，２４１号を含む 。また、組換え免疫グロブリンが米国特許第４，８１６，５６７号に示されてお り、ここで参照して組み込んでいる。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの精製 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂヌクレオチド配列を有する形質転換さ れた宿主細胞は、細胞培養からコード化タンパク質を発現及び回収するための適 切な条件下で培養される。組換え細胞により生成されるタンパク質は、用いられ る配列並びにまたベクタに依存し、細胞内に分泌或いは含有されることができる 。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを含む発現ベクタは、原核細胞膜及び真核細胞 膜を通してＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを分泌させるシグナル配列を用いて設 計される。他の組換え構造は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを、可溶性タンパ ク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコード化するヌタレオチド配列 に結合することができる（Kroll ＤＪ等（1993）ＤＮＡ Cell Biol 12:441-53、 融合タンパク質を含むベクタに関する上記論議も参照されたい）。 またＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、タンパク質精製を容易にするために加 えられた１つ或いはそれ以上の付加的なポリペプチドドメインを用いて組換えタ ンパク質として発現される。そのような精製を容易にするドメインは、限定はし ないが、固定化金属上で精製することができるようにするヒスチジントリプトフ ァンモジュールのような金属キレートペプチド（Porath Ｊ（1992）Protain Exp r Purif 3:263-281）、固定化免疫グロブリン上で精製できるようにするタンパ ク質Ａドメイン、並びにＦＬＡＧＳ延長性／親和性精製システムにおいて用いら れるドメイン（Immunex 社、SeattleWA)を含む。精製ドメイン及びＰＡＮＣ１Ａ 及びＰＡＮＣ１Ｂ間の第ＸＡ因子或いはエンテロキナーゼのような切断可能リン カ配列の封入体は精製を容易にするために有用である。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの使用 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは膵臓癌、及び例えば乳癌のように膵臓癌遺伝 子と同じ遺伝子座に地図化される他の癌に関連するように現れる。第６図からわ かるように、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、遺伝 的な乳癌感受性に関連するＢＲＣＡ２遺伝子座と同じ遺伝子座に地図化される膵 臓癌に関連する遺伝子領域と、ヌクレオチド相同性を有する。ＰＡＮＣ１Ａは、 ＰＡＮＣ１Ａの第２１６番目〜第２７４番目の間の付加的な５７個の塩基を除い て、ＧＩ ５３３９４８に厳密に一致する。ＰＡＮＣ１Ｂは、付加的な塩基を含 むが、ＰＡＮＣ１Ａとは異なるＧＩ５３３９４８の別の変異体である。それゆえ ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ、或いはそのフラグメントまたは誘導体は、膵臓 癌或いは他の癌への発生の危険性がある、或いは発生した個体において、膵臓癌 或いは他の癌に関連するヌクレオチド配列を検出するための診断方法において用 いることができる。 さらにＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの配列は、膵臓癌に関連する遺伝子の活 性を変更する化合物をスクリーニングするためのもとを提供する。 さらに、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに対する完全なｃＤＮＡクローンにお いて含まれる配列をフランキングする非転写遺伝子領域は、膵臓或いは他のタイ プの癌に原因がある、或いは関連する変化を含むことができる。そのような領域 はプロモータ配列、ＣＡＡＴＴボックス、他の調節結合部位のような上流転写調 節配列、イントロン並びにエンハンサのような末端作用因子を含む３′フランキ ング配列を含む。遺伝子の全転写領域は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに対す る延長ｃＤＮＡクローン配列とサンガー遺伝子配列の配列とを比較することによ り画定されであろう。その後、そのような制御素子が周知のコンセンサス配列と の類似性により同定することができる。限定はしないが、トリヌクレオチド繰返 しのような、任意の繰返し配列の存在は、関連する変異に対する他のホットスポ ットを構成するであろう。 本発明の別の実施例では、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの活性を中 和することができる抗ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ抗体が、膵臓癌のような状 態、すなわち疾患状態を予防或いは治療するために用いられる。当分野において よく知られる手順は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチドに対する抗体 の生成のために用いられる。そのような抗体は、限定はしないが、ポリクローナ ル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント並びにＦａｂ発現ラ イブラリにより生成されるフラグメントを含む。中和抗体、すなわちＰＡＮＣ１ Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチドの生物活性を抑制する抗体は、、特に診断及び 治療に好適である。 抗体を生成する場合に、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は 、免疫学的特性を保持するＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチド或いは任 意の部分、フラグメント或いはオリゴペプチドを注入することにより免疫される ことができる。宿主種に依存して、種々のアジュバントが免疫学的反応を促進す るために用いられる。そのようなアジュバントは、限定はしないが、フロイント アジュバント、水酸化アルミニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシ チンのような表面活性物質アジュバント、プルロニックポリオルアジュバント、 ポリアニオンアジュバント、ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キ ーホールリンペットヘモシニアンアジュバント並びにジニトロフェノールアジュ バントを含む。ＢＣＧ（カルメット-ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウムパル ヴム は潜在的に有用なヒトアジュバントであり、精製ポリペプチドが全身性防御 を誘導するために免疫的に易感染性の個体に投与される。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、 培養中の連続細胞株による抗体分子の生成をもたらす任意の技術を用いて調製さ れる。これらは、限定はしないが、Koehler 及び Milstein（1975,Nature 256:495-497）に当初掲載されたハイブリドーマ技術、 ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor 等（1983）ImmunolToday 4:72、Cote 等（1983）ProcNatlAcadSci80:2026-2030）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（ Cote 等（1985）Monoclonal Antibodesand Cancer Therepy，Alan Ｒ Liss Inc, pp77-96）を含む。さらに「キメラ抗体」の生成、適切な抗原特異性を有する分 子を得るためのヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシング並びに生 物活性のために開発された技術が用いられる（Morrison 等（1984）Proc Natl A cad Sci81:6851-6855）、Neuberger 等（1984）Nature 312:604-608、Takeda等 （1985）Nature 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載され た技術（米国特許第４，９４６，７７８号）が、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ 特殊一本鎖抗体を生成するために適用される。 また抗体は、リンパ球集団における in vivo 生成を誘導することにより、或 いは Orlandi 等（1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837）並びに Winter Ｇ 及び Milstein Ｃ（1991,Nature 349:293-299）に開示されているような組換え 免疫グロブリンライブラリ或いは高特異結合試薬のパネルをスクリーニングする ことにより生成される。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに対する特異結合部位を含む抗体フラグメント も発生させることができる。例えばそのようなフラグメントは、限定はしないが 、抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ′）₂フラグメ ント及びＦ（ａｂ′）₂フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより発 生させることができるＦａｂフラグメントを含む。別法では、所望の特異性を有 するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速に、しかも容易に同定できるよう に、Ｆａｂ発現ライブラリが構成される（Huse ＷＤ等（1989）Science 256:127 5-1281）。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ特異抗体は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮ Ｃ１Ｂポリペプチドの発現に関連する状態及び疾患の診断のために有用である。 確立された特異性を有するポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいず れかを用いる競合結合アッセイ或いは免疫放射定量測定法のための種々のプロト コルが当分野ではよく知られている。そのようなイムノアッセイは一般に、ＰＡ ＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチドとその特異抗体（或いは類似のＰＡＮＣ １Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ結合分子）との間の複合体の形成、並びに複合体形成の測 定を含む。特異ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂタンパク質上で２つの非干渉性エ ピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナル 用イムノアッセイは好適ではあるが、競合結合アッセイも用いられる。これらの 検査法は Maddox DE 等（1983,Ｊ Exp Med 158:1211）において記載されている 。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ特異抗体を用いる診断検査法 抗ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ抗体は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの異 常発現、すなわち膵臓癌に関連する遺伝子の発現により特徴付けられる状態、障 害或いは疾患の診断のための有用である。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに対す る診断検査法は、ヒトの体液、細胞、組織或いはそのような組織の切片または抽 出物において、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチドを検出するための抗 体或いは標識を利用する方法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾が ある、なしに拘わらず用いることができる。しばしばポリペプチド及び抗体は、 電子対を共有するかしないかのいずれかで、それらをリポータ分子と結合するこ とにより標識される。非常に多くのリポータ分子が知られており、そのいくつか が上述された。 それぞれのタンパク質に対して特異なポリクローナル或いはモノクロ ーナル抗体を用いて、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチドを測定するた めの種々のプロトコルが当分野では周知である。その例として、固相酵素イムノ アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）並びに蛍光性活性細胞 選別法（ＦＡＣＥ）がある。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチド上で２ つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位 モノクローナル用イムノアッセイは好適ではあるが、競合結合アッセイも用いら れる。これらの検査法は、他にもあるが、Maddox DE等（1983,Ｉ Exp Med 158:1 211）において記載されている。 疾患の診断に対する基礎を提供するために、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポ リペプチド発現に対する通常値、すなわち標準値が確立されなければならない。 これは複合体形成のために適切な条件下で、ヒト或いは動物どちらでもよいが、 正常の被験者から得られる体液或いは細胞抽出物と、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ １Ｂポリペプチドに対する抗体とを結合することにより達成され、当分野ではよ く知られている。標準的な複合体形成量は、ポジティブコントロールされた希釈 系とそれを比較することにより計量され、抗体の既知の量が精製ＰＡＮＣ１Ａ及 びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチドの既知の濃縮物と結合される。その後正常サンプル から得られた標準値はＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチドに関連する障 害或いは疾患により潜在的に影響を受けた被験者からのサンプルから得られた値 と比較される。標準値と被験値との偏差が疾患状態の存在を確定する。 薬物スクリーニング ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチド、その免疫原性フラグメント或い はオリゴペプチドは、種々の任意の薬物スクリーニング技術に おける治療用化合物をスクリーニングするために用いることができる。そのよう な試験において用いられるフラグメントは、溶液、固体支持体への付着、細胞表 面への付着、或いは細胞内への定着において制限はない。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡ ＮＣ１Ｂポリペプチドと試験される薬剤との間の活性、すなわち結合複合体の形 成の中止が測定される。 薬物スクリーニングのための別の方法は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリ ペプチドへの安定的な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニン グを提供し、１９８４年９月１３日公告の欧州特許出願第８４／０３５６４号（ Guysen）に詳細に記載されており、ここに参照して組み込んでいる。概要として は、多数の別々の小ぺプチド試験用化合物がプラスチックピン或いはいくつかの 他の表面のような、固体基質上に合成される。ポリペプチド試験化合物はＰＡＮ Ｃ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂフラグメントと反応し、洗浄される。結合ＰＡＮＣ１Ａ 及びＰＡＮＣ１Ｂはそれから当分野でよく知られた方法により検出される。また 精製ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、前述の薬物スクリーニング技術において 使用するために、プレート上に直接被着される。別法では非中和抗体がペプチド をキャプチャし、固形支持体上にペプチドを固定化するために用いるられる。 また本発明は、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図しており、その 中でＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを結合する中和抗体特性が特に、ＰＡＮＣ１ Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを結合するための試験化合物と競合する。このようにして、 抗体は１つ或いはそれ以上の抗原性決定基をＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂと分 ける任意のペプチドの存在を検出できる。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリヌクレオチドの使用 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリヌクレオチド、或いはその一部が診断並び にまた治療目的で用いられる。診断目的の場合、本発明のＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡ ＮＣ１Ｂは、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ活性が例えば、膵臓癌或いは乳癌と 関係する状態、障害或いは疾患における異常な遺伝子発現を検出し、かつ計量す るために用いられる。 本発明の範囲に含まれるものは、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮ Ａ及びＤＮＡ分子、並びにリボザイムであり、それらはＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮ Ｃ１Ｂの翻訳を抑制するために機能する。そのようなヌクレオチド配列は、膵臓 癌或いは乳癌が発生する危険性がある、或いは発生した個体の治療において用い られる。本発明の別の目的は、ポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイ ゼーション或いはＰＣＲプローブを提供することであり、ポリヌクレオチド配列 はゲノム配列を含み、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ或いは密接に関連する分子 をコード化する。そのプローブの特異性、すなわち非常に高い保存領域、保存領 域或いは非保存領域すなわちドメインのいずれから引出されるか、並びにハイブ リダイゼーション或いは増幅（高い、中間の或いは低い）の厳密さは、そのプロ ーブが自然に発生するＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ或いは関連する配列のみを 如何に同定するかを画定するであろう。関連する核酸配列を検出するためのプロ ーブはＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの保存領域、或いは非常に高い保存領域か ら選択され、そのようなプローブは変性プローブのプールにおいて用いられる。 同一の核酸配列を検出する場合、すなわち最大の特異性が所望される場合、核酸 プローブはＰＡＮＣ１Ａのヌクレオチド第２１６番目〜第２７４番目のような、 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの非保存ヌクレオチド領域、すなわち唯一の領域 から選択される。ここで用いるような用語「非保存ヌクレオチド領域」とは、Ｐ ＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに対して唯一の、しかも Ｈｘｓ７において発生しないヌクレオチド領域のことを指す。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリヌクレオチドの診断上の使用 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂコード化ポリヌクレオチド配列は、膵臓癌に関 連するＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ或いは他の遺伝子の異常発現に起因する疾 病の診断に対して用いられる。例えば、ポリヌクレオチド配列コード化ＰＡＮＣ １Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ発現における異常性を 検出するための生体組織検査或いは解剖からの組織のハイブリダイゼーション或 いはＰＣＲアッセイにおいて用いることができる。そのような定性的及び定量的 方法の形態は、サザンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット法 或いは他の膜用技術、ＰＣＲ技術、浸漬法、ピン或いはチップ技術を含む。すべ てのこれらの技術は、当分野ではよく知られており、実際に商用で入手可能な多 くの診断キットの基礎となっている。 そのような検査法は、特定の治療行為の有効性を評価するために調整され、動 物研究、臨床試験、或いは個々の患者の治療を監視する際に用いることができる 。疾患を診断するための基礎を与えるために、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ発 現に対する正常の、或いは標準的なプロフィールが確立されなければならない。 これは、正常な被験者、すなわち動物或いはヒトから得られる体液或いは細胞抽 出物を、ハイブリダイゼーション或いは増幅にための適切な条件下で、ＰＡＮＣ １Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ或いはその一部と結合することにより達成される。標準的 なハイブリダイゼーションは正常被験者に対して得られる値を、既知の精製ＰＡ ＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ量が用いられる同一の実験におけるポジティブコント ロール試験からの希釈系列と比較することにより計量することができる。正常な サンプルから得られた標準値は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰ ＡＮＣ１Ｂ発現に関連する障害或いは疾患により潜在的に影響を受けている被験 者からのサンプルから得られる値と比較される。標準値と被験者値との偏差が疾 患状態の存在を確定する。 もし疾患が確立されるなら、現存する治療用薬剤が投与され、治療プロファイ ル或いは数値が生成される。最終的に検査法は、その数値が正常、すなわち標準 パターンに進むか、或いは戻るかを評価するために規則的に繰り返される。治療 プロファイルは治療の有効性を示すために用いられ、数日間或いは数ヶ月の期間 に渡って継続される。米国特許第４，６８３，１９５、４，８００，１９５並び に４，９６５，１８８号に記載のあるようなＰＣＲは、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮ Ｃ１Ｂ配列に基づくオリゴヌクレオチドのための付加的な使用法を提供する。そ のようなオリゴマは一般的に化学的に合成されるが、酵素を用いて発生させるか 、或いは組換え源から生成されることもできる。一般にオリゴマは２つのヌクレ オチド配列、すなわち特異な遺伝子或いは状態を同定するための最適な条件下で 用いられる、センスオリエンテーションを有するヌクレオチド（５′→３′）及 びアンチセンスを有するヌクレオチド（３′←５′）からなる。同一の２つのオ リゴマ、オリゴマの入れ子状組、或いはオリゴマの変性プールでさえ、密接に関 連するＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ配列の検出、並びにまた計量するためによ り低い厳重な条件下であっても用いることができる。さらに特定の分子の発現を 計量するための方法は、放射性標識化（radiolabeling）（Melby PC等 1993 ＪI mmunol Methods 159:235-44）或いはバイオチニレイテイング（biotinylating） （Duplaa Ｃ 等 1993 Anal Biochem 229-36）ヌクレオチド、制御核酸の同時増 幅（coamplification）、並びに実験結果が書き込まれた標準的な曲線を含む。 複数のサンプルの計量は、ＥＬＩＳＡフォーマットにおける検査法を実行するこ とにより迅速に行うことができ、 対象のオリゴマが様々な希釈溶液中に現れ、分光光度分析或いは比色分析反応に より迅速に計量することができる。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリヌクレオチドの治療上の使用 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリヌクレオチド配列は膵臓癌或いは乳癌を含 む様々な状態の治療に対する基礎を与える。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂアンチセンス構造は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮ Ｃ１Ｂ或いはその免疫系の他の分子の過発現により特徴付けられる様々な異常条 件の治療に有用である。そのような疾患への個々の被験者に対するそのような配 列の供給及び発現が有効なら、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１ＢｍＲＮＡの転写を 減少、或いは抑制し、それによりそれらの発現に関する疾患状態を減少ずるであ ろう。 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルスから引 出される発現ベクタ、或いは細菌性プラスミドから引出される発現ベクタは、標 的細胞群への組換えＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ、センス或いはアンチセンス 分子の供給のために用いられる。当業者によく知られた方法は、ＰＡＮＣ１Ａ及 びＰＡＮＣ１Ｂを含む組換えベクタを構成するために用いることができる。例え ば Maniatis 等（上記）及び Ausubel 等（上記）により記載される技術を参照 されたい。別法では、組換えＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、リポソーム内の 標的細胞に供給することができる。 完全長ｃＤＮＡ配列、並びにまたその調節素子により、研究者は遺伝子機能の センス（Youssoufian Ｈ及びＨＦ Ｌodish 1993 Mol Cell Biol13:98-104）、或 いはアンチセンス（Eguchi 等（1991）Annu Rev Biochem60:631-652）調査のツ ールとしてＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを用いることができる。ゲノムＤＮＡ から得られるｃＤＮＡ或いは制御配列か ら設計されるオリゴヌクレオチドは発現を抑制するために in vivo 及びin vitr o で用いることができる。そのような技術は、現在当分野ではよく知られており 、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはその大きなフラグメン トが、コード化領域或いは制御領域に沿った様々な位置から設計されることがで きる。 さらにＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ発現は、高レベルのＰＡＮＣ１Ａ及びＰ ＡＮＣ１Ｂフラグメントを発現する発現ベクタを用いて、細胞或いは組織を形質 移入することにより調節される。そのような構成は、細胞を翻訳不可センス或い はアンチセンス配列で満たす。ＤＮＡ内への組込みの不在時であっても、そのよ うなベクタは、そのベクタのすべての複製が内因性のヌクレアーゼによりできな くなるまで、ＲＮＡ分子の転写を続けることができる。そのような一過性の発現 は、非複製ベクタを用いて１ケ月或いはそれ以上の間継続することもあり、適切 な複製素子がベクタ系の一部であるならいっそう長くなる。 他方では、適切な生殖細胞系、好適には受精体の安定的な形質転換が、ＰＡＮ Ｃ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂフラグメントを含むベクタを用いて、トランス発生性（ transgenic）有機体（米国特許第４，７３６，８６６号 １９９８年４月１２日 ）を生成し、内因性ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ遺伝子の活性を十分に弱める 、或いは全く除去するために十分な量のセンス或いはアンチセンス配列の複製を 生成する。しばしば、そのような遺伝子の分解は、腫瘍サイズが減少するような 振る舞いを観察することにより、確認される。 前述したように、遺伝子発現の修飾は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ遺伝子 、例えばプロモータ、エンハンサ或いはイントロンの制御領域に対するアンチセ ンス配列を設計することにより得られる。転写開始部位、例えばリーダ配列の＋ １０〜−１０領域の間から引出されるオリゴ ヌクレオチドが好適である。またアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子は、リボソ ームへの結合から転写産物を防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設 計される。同様に、抑制は、「三重らせん」塩基対合としても知られる、Ｈｏｇ ｅｂｏｏｍ塩基対合方法論を用いて達成することができる。三重らせん対合は二 重らせんの活性を弱め、ポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分子を結合するた めに十分に開放される。 リボザイムはＲＮＡの特異な切断を引き起こすことができる酵素的ＲＮＡ分子 である。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列 特定（sequence specific）ハイブリダイゼーションを含み、エンドヌクレアー ゼによる切断（endonucleolytic cleavage）により後続される。発明の範囲内に おいては、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ ＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼに よる切断を、特異的に及び効果的に引き起こすハンマーヘッド状（hammerhead m otif）リボザイム分子が設計される。 任意の潜在的なＲＮＡ標的内部の特異なリボザイム切断部位は、後続する配列 ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対する標的分子を走査 することにより最初に同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝 子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列は、 オリゴヌクレオチド配列を実施不可能にする２次構造特徴に対して評価される。 また候補標的の適切性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリ ゴヌクレオチドについてのハイブリダイゼーションへの接近性を試験することに より評価できる。 本発明のアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びリボザイムはどちらも、ＲＮ Ａ分子を合成するのための当分野で周知の方法により調製される。これらの技術 は、固相ホスソラミダイト（phosphoramidite）化学 合成のような化学的合成オリゴヌクレオチドに対する技術を含む。別法では、Ｒ ＮＡ分子はアンチセンスＲＮＡ分子をコード化するＤＮＡ配列の in vivo 及び in vitro 転写により発生する。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６の ような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する多種のベクタに組み込まれ る。別法では、構造的に或いは誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセ ンスｃＤＮＡ構成が、細胞株、細胞或いは組織内に導入される。 ＤＮＡ分子は細胞内安定性及び半減期を高めるために修飾される。実行可能な 修飾は、限定はしないが、その分子の５′並びにまた３′端部のフランキング配 列の付加、或いは分子のバックボーン内にホスホジエステラーゼ連鎖ではなく、 ホスホロチオナーテ（phosphorothioate）或いは２′−Ｏ−メチルの使用を含む 。 細胞或いは組織内にベクタを導入するための方法は、実施例の IV 項において 議論される方法を含む。さらに、これらの形質転換或いは形質移入方法のいくつ かは、米国特許第５，３９９，４９３及び５，４３７，９９４号に記載されるよ うな、ex vivo 治療法、患者から得られた基幹細胞内へのベクタの導入並びに自 家移植に対するクローンの増殖のいずれに対しても適切である。 さらにここで開示されるＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリヌクレオチド配列 は、限定はしないが、三重遺伝子コード及び特異な塩基対合相互作用のような特 性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供する 、まだ開発されていない分子生物学的技術において用いられる。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに関連するポリヌクレオチド配列の検出及び遺伝 子地図作成 またＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに対する核酸配列は、内因性の遺伝的配列 を地図化する場合に、前述のようなハイブリダイゼーションプローブを発生させ るために用いることができる。その配列は、よく知られる技術を用いて、特定の 染色体或いはその染色体の特定領域に対する遺伝子地図を作成することができる 。これらは、染色体の広がりに対するｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション （Verma 等（1988）HumanCromosomes:A Manual of Basic Technique，Pergamon Press， NewYork）、フローソート（flow-sorted）染色体調製法、或いはＹＡ Ｃｓ、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、細菌性Ｐ１構造或いは単染色体ｃＤＮＡ ライブラリのような人工染色体構造を含む。 染色体調整法のｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション及び確定された染色 体標識を用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地図を延長する 際に大変重要である。遺伝子地図の例は、Science（1995; 270: 410f 及び1994; 265:1981f）に見出すことができる。しばしば、特定のヒト染色体の数或いは腕 が知られていなくても、別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配置により、関連 する標識を明らかにすることができる。新しい配列は、染色体の腕、或いはその 一部への物理的地図作成により割当てることができる。これは位置クローニング 或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を調査する研究者に貴重な情報を 提供する。一度、毛細血管拡張性運動失調（ＡＴ）のような疾患或いは症候群が 、特定のゲノム領域、例えばＡＴ〜１１ｑ２２−２３（Gatti等（1988）Nature 336:577-580）への遺伝子連鎖により天然のまま局所化されれば、その領域に地 図化している任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節 遺伝子を表すことができる。本発明のヌクレオチド配列は、正常者、保菌者或い は感染した個体間の転座、逆型等による染色体位置の偏差を検出するために用い ることもできる。 薬品組成物 本発明の活性組成物は、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂポリペプチドの全部或 いは一部、インヒビタ或いは抗体を含む、単独の、或いは安定化化合物のような 少なくとも１つの他の薬剤と結合した、アンタゴニストからなり、限定はしない が、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水を含む、任意の無菌の生物互換 性製薬担体において投与される。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂヌクレオチド及びアミノ酸配列は、患者単独に 、或いは他の薬品或いはホルモンと結合して、或いは医薬品添加物或いは製薬的 に許容可能な担体と混合される薬品組成物において、投与される。本発明の１つ の実施例では、製薬的許容可能担体が製薬的に挿入される。 治療される状態、障害或いは疾患に依存して、これらの薬品組成物は全体的に 、或いは局所的に処方され、投与される。処方或いは投与に関する技術は、「Rem ington's Pharmaceutical Sciences」(Mack PublishingCo,Easton ＰＡ)の最新版 において見出すことができる。適切な投与経路は、経口投与、経膣投与或いは粘 膜投与、さらには筋肉投与、皮下投与、骨髄内投与、クモ膜下投与、脳室内投与 、静脈内投与、腹腔内投与或いは鼻腔内投与を含む非経口投与を含む。 注入する場合、本発明の薬品組成物は水溶液において、好適にはHanks's 溶液 、Ringer's 溶液或いは生理緩衝食塩水のような生理学的互換緩衝液において処 方される。組織或いは細胞投与の場合には、浸透されるべき特定の障壁に対して 適切な浸透剤が、処方において用いられる。そのような浸透剤は一般に当分野で は周知である。 薬品組成物は経口投与において適切な投与量において当分野でよく知られる製 薬的許容可能担体を用いて処方される。そのような担体により、 薬品組成物は、治療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤 、カプセル剤、液体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリ剤、懸濁剤或いは類似の形 態として処方される。 本発明において用いるために適切な薬品組成物は、活性処方組成物が有効量内 に含まれる組成物を含み、意図する目的を達成する。効果的な量の画定は、当業 者にはよく知られており、特に以下の開示内容を考慮すれば明らかになろう。 活性処方組成物に加えて、これらの薬品組成物は製薬的に用いられる製剤内の 活性化合物の処理を容易にする添加物及び補助剤を含む適切な製薬的許容可能担 体を含む。経口投与にために処方される製剤は錠剤、糖衣剤、カプセル剤或いは 溶剤の形態である。 本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化 処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、エントラップ（entrapping）処理或 いは凍結乾燥処理により製造される。 非経口投与に対する製薬的処方は、水溶状の活性化合物の水溶液を含む。さら に活性化合物の懸濁剤は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油 性の溶媒或いは媒介体は、胡麻油或いは、オレイン酸エチル、トリグリセリド或 いはリポソームのような脂肪酸エステルのような脂肪油を含む。水性の注入懸濁 剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデキスト ランのような懸濁剤の粘性を増加する物質が含まれる。さらにまた、懸濁剤は適 切な安定剤或いは薬剤を含み、それにより溶解度を増加し、非常に濃縮された溶 液の調製ができるようになる。 経口使用の場合の製薬調製は、所望の場合には錠剤或いは糖衣剤核を得るため に適切な補助剤を加えた後、活性化合物を固形医薬品添加物と結合し、付加的に 結果生じた混合物を砕き、顆粒状の混合物を加工処理 する。適切な医薬品添加物は、ラクトース、サクロース、マンニトール或いはソ ルビトールを含む、砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうもろこし、 小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシプロピ ルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセ ルロース、アラビック或いはトラガカントのようなガム質、並びにゼラチン或い はコラーゲンのようなタンパク質である。所望なら、架橋結合ポリビニルピロリ ドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いはその中の塩類のよ うな、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられる。 糖衣剤核部分は、濃縮された砂糖液のような適切な錠皮を与えられ、ガム質ア ラビック、タルク、ポリビニルピロリドン炭化ポルゲル剤、ポリエチレングリコ ール並びにまた二酸化チタン、ラッカ溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混合物 を含むこともある。同定するため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量を 特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられる。 油状で用いられる製薬製剤は、ゼラチンからなるプッシュ−フィットカプセル 及びゼラチンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或い はソルビトールのような錠皮を含む。プッシュ−フィットカプセルは、ラクトー ス或いはでんぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグ ネシウムのような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物 を含むことができる。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、脂肪油、液体パラ フィン、或いは安定剤があるなしにかかわらず液体ポリエチレングリコールのよ うな適切な液体に溶解或いは浮遊する。 製薬的許容可能担体内に処方された本発明の化合物からなる組成物は、調製さ れ、適切な容器内に置かれ、さらに指示された条件の治療に対す るラベルを付される。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂインヒビタの場合、ラベル 上に指示される条件は膵臓癌の治療を含む。 その調製組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸、 硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸から形成す ることができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニック溶 剤において、より可溶性を呈するようになる。他の場合には、好適な製剤は、１ ｍＭ−５０ｍＭのヒスチジン、０．１％−２％のショ糖、使用前に緩衝剤と結合 させたｐＨ範囲４．５−５．５にある２％−７％のマンニトールにおける凍結乾 燥粉末である。 本発明の方法において用いられる任意の化合物の場合、治療的に有効な投与量 は細胞培養アッセイから最初に見積もられる。それから好適には投与量は動物モ デルにおいて処方され、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂレベルを調整する所望の 循環濃度範囲を達成する。 治療的な有効投与量はＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの量、或いは腫瘍サイズ の縮小を意味する徴候を改善するインヒビタの量を表す。そのような化合物の毒 性及び治療有効性は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％に対する致死投与量）及 びＥＤ５０（個体群の５０％において治療的に効果のある投与量）を画定するた めの、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬手順により画定することが できる。毒性と治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／Ｅ Ｄ５０として表すことができる。治療指数が大きくならなように抑制する化合物 が好適である。これらの細胞培養アッセイ及び付加的な動物研究から得られるデ ータは、ヒトへの使用に対する投与量の範囲を調製する際に用いることができる 。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ５０を達 成する循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、用いられる投与形態 、患者の感受性並びに投与経路に依存するこの範囲 内で変化する。 厳密な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。 投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性部分を与え、かつ所定の効果を維持す るために調整される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の厳密さ、すなわち 年齢、体重並びに患者の性別、食事、投与の時間及び頻度、複合製剤、反応感受 性、並びに治療への抵抗性／反応を含む。長期活性化薬品組成物は３〜４日毎に 、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス率に依存して２週間 に１度、投与してもよい。 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇまで変化し、全投与量は約１ｇま でであり、投与経路に依存する。特定の投与量或いは供給の方法に関するガイダ ンスは、文献において見出すことができる。米国特許第４，６５７，７６０、５ ，２０６，３４４或いは５，２２５，２１２号を参照されたい。当業者は、ＰＡ ＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂに対しては、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂのインヒ ビタに対する処方とは異なる処方を用いるであろう。肺に対する投与は、腎臓或 いは胃に対する投与とは異なる方法にて供給する必要がある。 これらの例は図により与えるが、本発明を制限するものではない。 産業上の利用可能性 I ＤＮＡライブラリ構成 議論を進めるために、炎症性アデノイドｃＤＮＡライブラリが記載される。胎 盤、脊髄或いはｈＮＴ細胞株からのｃＤＮＡライブラリは、当業者に周知の方法 と同様の方法により調製される。 炎症性アデノイドライブラリは、アデノイド組織と、扁桃腺摘出中に子供から 手術により取り除かれた扁桃腺リンパ球組織との混合物から構 成された。アデノイド組織はカリフォルニア大学ロサンゼルス校から入手し、将 来使用するために凍結されていた。凍結組織は乳鉢及び乳棒において細かく砕か れ、グアニジンイソチオシアネート（Chirgwin JM 等（1979）Biochemistry 18: 5284）を含む緩衝液内で即座に溶解された。いくつかのフェノール−クロロフォ ルム抽出及びエタノール沈殿による分離が引き続き行われた。ポリＡ＋ｍＲＮＡ は、常磁性粒子と結合したビオチニレート化（biotinylated）オリゴｄ（Ｔ）及 びストレプタビジン（streptavidine）を用いて分離された（Poly(A) Tract Iso lationSystem; Promega社,Madison，WI）。 炎症性アデノイド組織からのポリＡｍＲＮＡは、ｃＤＮＡライブラリを構成す るために Stratabene 社により用いられた。ｃＤＮＡ合成は、オリゴｄ（Ｔ）並 びにまた無作為のヘキサマを用いて準備された。合成アダプタオリゴヌクレオチ ドは、ＵＮＩ−ＺＡＰ（登録商標）ベクタシステム（Stratabene 社）内への挿 入を可能するｃＤＮＡ端部上に結合される。これにより、高効率な一方向性（セ ンスオリエンテーション）λライブラリ構成及び、青／白色選択を用いるプラス ミド系の利便性がｃＤＮＡインサートを有するクローンを検出できるようにする 。 各ｃＤＮＡライブラリの品質は、ＤＮＡプローブ或いは抗体プローブのいづれ かを用いてスクリーニングされ、それからｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ファ ージミド（Stratabene 社）が生体細胞内に迅速に切り出された。そのファージ ミドにより、容易な挿入特性、配列、特定部位の突然変異誘発、一方向性遺伝子 欠失の作成並びに融合タンパク質の発現のためのプラスミド系の使用が可能にな る。各ライブラリ粒子からのファージ粒子は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主変形ＸＬ１−Ｂ ＬＵＥ（商標）（Stratabene 社）内に感染した。ＸＬ１−ＢＬＵＥの高い形質 転換効率は、ｃＤＮＡからの希有の、少ない比率のクローンを得る確率を拡大 した。 II ｃＤＮＡクローンの分離及び配列 プラスミドＤＮＡは、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Cat＃77468;Advanced Gene tic Technology 社，Gaithersbung MD）を用いて細胞から切り離され、精製され た。このキットは９６０精製のための試薬を有する９６ウエルブロック（well b lock）からなる。以下の変更点を除いて、推奨されるプロトコルを用いた。１） ９６ウエルは、２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４％のグリセロールを有 する無菌のＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Cat#22711，LIFE TECHNOLOGIES（登 録商標），Gaithersbung MD）の１ｍｌのみをそれぞれ充填された。２）その細 菌は、そのウエルが接種され、溶解緩衝剤の６０μｌを用いて分離された後、２ ４時間培養された。３）ブロックの中味が主要なフィルタプレートに加えられる 前に、２９００ｒｐｍのＢｅｃｋｍａｎ ＧＳ−６Ｒを５分間用いる遠心分離が 実施された。４）イソプロパノールをＴＲＩＳ緩衝剤に加える付加的な過程は通 常は実施しなかった。プロトコルの最終過程後、サンプルは、貯蔵のためにＢｅ ｃｋｍａｎ ９６−ウエルブロックに移された。 ｃＤＮＡは、４つのＰｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（PTC200 ; MJ Research 社，Watertown MA）及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７或いは３７３ＤＮＡ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ（Perkin Elm er 社）を組み合わせてＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ２２００（Hamil ton 社，Reno NV）を用いる、Sanger F及び AR Coulson（1975;Ｊ Mol Biol 94: 441f）の方法により配列決定され、リーディングフレームが画定された。 III ｃＤＮＡクローン及びその導出されたタンパク質の相同性検索 各ｃＤＮＡはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社により開発された検索 アルゴリズムを用いるＧｅｎｂａｎｋにおける配列と比較され、ＩＮＨＥＲＩＴ （登録商標）６７０ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ に組み込まれた。このアルゴリズムでは、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ（TRW 社，Los Angeles CA）が相同性領域を画定す るために用いられた。配列比較が如何に実行されるかを画定する３つのパラメー タは、ウインドサイズ、ウインドオフセット並びに誤差許容度である。これらの ３つのパラメータの組み合わせを用いるとき、ＤＮＡデータベースは、検索すべ き配列に相同の領域を含む配列に対して検索され、適切な配列が初期値を用いて 得られた。その後これらの相同性領域は、ドットマトリクス相同性プロットを用 いて調査され、相同性領域を偶然性一致領域から識別した。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔ ｅｒｍａｎ配列が相同性検索の結果を表示するために用いられた。 ＢＬＡＳＴは、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（Alts chul SF（1993）J Mol Evol 36:290-300;Altschul SF 等（1990）J Mol Biol 21 5:403-10）に対して有効であり、局所的な配列アライメントを検索するために用 いられた。ＢＬＡＳＴはヌクレオチド配列とアミノ酸配列の両方のアライメント を生成し、配列の類似性を画定する。アライメントの局所的な性質のために、Ｂ ＬＡＳＴは特に、厳密な一致を画定する、或いは相同性を同定する際に有用であ る。ＢＬＡＳＴはギャップを含まない一致に対して有用である。ＢＬＡＳＴアル ゴリズム出力の基本的なユニットはＨｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｐａｉｒ（ＨＳＰ）である。 ＨＳＰは任意の、しかし等しい長さの２つの配列フラグメントからな り、そのアライメントは局所的に最大であり、かつそのアライメントスコアは、 閾値、すなわち使用者により設定された遮断スコアを満たす、すなわち越える。 ＢＬＡＳＴアプローチは、検索すべき配列とデータベース配列との間のＨＳＰを 探索することであり、見出される任意の一致の統計的有意性を評価し、さらに使 用者選択の有意性を満足する一致のみを報告する。パラメータＥは、全データベ ース検索の環境内で、ＨＳＰ（或いはＨＳＰの組）偶然的発生の予想頻度の上限 と解釈される。任意のデータベース配列が一致し、それがＥを満足する場合には 、プログラム出力において報告される。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、重複する配列フラグメントを大きなヌクレ オチド内に組み込むことにより、配列アセンブリプロジェクトを作成し、管理す る、ＩＮＨＥＲＩＴ（登録商標）ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍのＡ ＢＩ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐａｒｔ（Applied Bios ystems 社）を用いて同定された。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、胎盤、脊 髄或いはｈＮＴ細胞株において見出されるヌクレオチド配列から組み込まれ、膵 臓腺癌から引出される細胞株内で示差的に発現することが見出されるヌクレオチ ド配列ＧI ５３３９４８（ヒトＸＳ７ｍＲＮＡ）にヌクレオチド相同性を有す ることがわかった。 IV 調節素子を回収するためのＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの発現 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの核酸配列は、ゲノムライブラリからの完全長 配列を得るように、オリゴヌクレオチドプライマを設計するために用いることが できる。あるプライマはアンチセンス方向（ＸＬＲ）において延長を開始するた めに合成され、他のプライマはセンス方向（ＸＬＦ）内に配列を延長するために 合成される。そのプライマにより、周 知のＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ配列は、対象の制御領域に対する新しい、未 知のＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂヌクレオチド配列を含むアンプリコンを発生 する「外側に」延長されるようになった。初期プライマは、Ｏｌｉｇｏ４．０（ Natlonal Biosciences 社、Plymouth MN）、或いは他の適切なプログラムを用い るｃＤＮＡから、長さが２２−３０ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含有 率を有し、かつ約６８−７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計する ことができる。結果的にヘアピン構造及びプライマープライマ二量化を生じる、 任意のヌクレオチドの延長は避けられた。 ヒトゲノムライブラリは、５′上流配列を延長し、増幅するために用いられる 。必要なら、プライマの第２の組が既知領域をさらに延長するために用いられる 。ＸＬ−ＰＣＲキット（Perkln Elmer 社）に対する構造に従って、酵素と反応 混合物とを完全に混合することにより、高い適合度を有する増幅が得られる。の 各プライマとキットの全ての他の組成物の推奨される濃縮物とからなる４０ｐｍ ｏｌを用いて開始するとき、ＰＣＲはＰｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃ ｌｅｒ（ＰＴＣ２００；MJ Reserch 社、Watertown MA）と以下のパラメータを 用いて実行される。 ステップ１ ９４℃、１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃、１分間 ステップ３ ６８℃、６分間 ステップ４ ９４℃、１５秒間 ステップ５ ６５℃、１分間 ステップ６ ６８℃、７分間 ステップ７ ステップ４−６をさらに１５サイクル繰返す ステップ８ ９４℃、１５秒間 ステップ９ ６５℃、１分間 ステップ１０ ６８℃、７：１５分間 ステップ１１ ステップ８−１０を１２サイクル繰返す ステップ１２ ７２℃、８分間 ステップ１３ ４℃（そのまま保持） 反応混合物の５−１０μｌの部分標本は、低濃度（約０．６−０．８％）アガ ロースミニゲルにおける電気泳動により解析され、反応物が配列を延長すること に成功したか否かを画定する。最も大きな生成物或いは帯が選択され、ゲルから 切り出された。さらに精製はＱＩＡＱｕｉｃｋ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ 社 ）のような商用のゲル抽出方法を用いることを含む。ＤＮＡ回収の後、クレノウ 酵素が、再結合及びクローニングを容易にするブラントエンドを作成する一本鎖 ヌクレオチド懸垂を切り取るために用いられる。 エタノール沈殿後、生成物は１３μｌの結合緩衝液内に再溶解され、１μｌＴ ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ が加えられ、その混合物は、２〜３時間室温で、或いは１６℃で一昼夜培養され る。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適切な溶媒内にある）は、３μ ｌの結合混合物を用いて形質転換され、８０μｌのＳＯＣ媒質内で培養される（ Sembrook Ｊ等、上記）。３７℃で１時間培養した後、２ｘＣａｒｂを含む、Ｌ ｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天上で培養される。翌日、いくつかのコロ ニが各プレートから無作為に選択され、適切、商用で入手可能な無菌の９６−ウ エル微量定量プレートの個々のウエル上に配置された１５０μｌの液状ＬＢ／２ ｘＣａｒｂ媒質上で培養される。さらに翌日、５μｌの各一昼夜培養物が非無菌 ９６ウエルプレート内に移され、水で１：１０に希釈した後、各５μｌのサンプ ルはＰＣＲアレイ内に移される。 ＰＣＲ増幅の場合、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの４ユニットを含む１８μｌ の濃縮されたＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタプライマ並びに延長反応物 に対して用いられる遺伝子特異プライマの１つ或いは両方が各ウエルに加えられ る。増幅は以下の条件を用いて実行される。 ステップ１ ９４℃、６０秒間 ステップ２ ９４℃、２０秒間 ステップ３ ５５℃、３０秒間 ステップ４ ７２℃、９０秒間 ステップ５ ステップ２−４をさらに２９サイクル繰り返す ステップ６ ７２℃、１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） ＰＣＲ反応物の部分標本は、ヌクレオチド重量標識と共にアガロースゲル上に 広げられる。ＰＣＲ生成物のサイズは元の部分的なｃＤＮＡと比較され、適切な クローンが選択され、プラスミド内に結合され、配列される。 Ｖ ハイブリダイゼーションプローブの標識付け ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２から導かれるハイブリダ イゼーションプローブは、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニ ングするために用いられる。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識付 けが特に記載されるが、大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順が 用いられる。オリゴヌクレオチドは、５０ｐｍｏｌの各オリゴマと、２５０ｍＣ ｉの[γ-³²Ｐ]アデノシン３リン酸（Amersham 社，Chicago ＩＬ）及びＴ４ポリ ヌクレオチドキナ−ゼ（DuPont ＮＥＮ（商標）、Boston ＭＡ）とを組み合わせ ることにより標識付けられる。標識付けられたオリゴヌクレオチドはＳｅｐｈａ ｄｅ ｘＧ−２５超精細レジンカラム（Pharmacia 社）を用いて精製される。計数毎分 １０⁷を含む各部分は、後続するエンドヌクレアーゼの１つを用いて消化される ヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜用ハイブリダイゼーション解析において用いられ る（ＡｓｅＩ，ＢｇＩＩＩ，ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ，Ｘｂａ１或いはＰｖｕＩＩ ；DuPont ＮＥＮ（商標））。 各消化物からのＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上に分割され、ナイロン膜 に移される（Nytran Plus,Schleicher＆Schuell,Durham ＮＨ）。ハイブリダイ ゼーションは４０℃で１６時間実行される。非特異シグナルを取り除くために、 ブロットは、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水＋０．５％ドデシル硫酸ナトリ ウムまで、段階的に厳密さが増す条件下で、室温にて順次洗浄される。ＸＯＭＡ ＴＡＲ（登録商標）フィルム（Kodak,Rochester ＮＹ）が、数時間Ｐｈｏｓｐｈ ｏｉｍａｇｅｒ ｃａｓｓｅｔｔｅ（Molecular Dynamics,Sunnyvale ＣＡ）に おいてブロットに晒された後、ハイブリダイゼーションパターンが視覚的に比較 される。 VI アンチセンス分子 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ配列或いはその任意の一部は内因性のＰＡＮＣ １Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの in vivo 及び in vitro 発現を抑制するために用いる ことができる。約２０塩基対からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が 特に記載されるが、大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用い ることができる。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂのコード化配列に基づくオリゴ ヌクレオチドが内因性ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの発現を抑制するために用 いられる。Ｏｌｉｇｏ４．０を用いるとき、相補的なオリゴヌクレオチドは、逆 ５′配列から設計することができ、上流非翻訳配列にプロモータが結合すること を防 ぐことにより転写を抑制するために、或いはリボソームがｍＲＮＡに結合するこ とを防ぐことによりＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ転写の翻訳を抑制するための いずれかに用いられる。 VII ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの発現 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクタ内にサブク ローニングすることにより、並びにベクタを宿主細胞内に形質移入するにより達 成される。この場合には、ｐＳｐｏｒｔ或いは代わりのｃＤＮＡクローニングベ クタ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratabene社）が、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ １ＢをＥ．ｃｏｌｉ内に発現するために用いられる。クローニング部位、ｐＢｌ ｕｅｓｃｒｉｐｔの上流は、β−ガラクトシダーゼに対するプロモータを含み、 アミノ基末端メチオニン及びβ−ガラクトシダーゼの７残基を含む配列により後 続される。直後に続くこれらの８つの残基は、転写のために有用なバクテリオフ ァージプロモータであり、多くの特異な制限部位を含むリンカである。ｉｇｉｆ 配列はＥｃｏＲＩ及びＸｈｏ１部位を用いるプラスミド内にクローニングされ、 そのプラスミドはＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ′（Stratabene社）を形質移入するた めに用いられる。標準的な方法を用いるＩＰＴＧを有する形質移入細菌性変形の 誘導は、β−ガラクトシダーゼの最初の７残基、約５〜１５のリンカの残基、並 びに完全長ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂからなる融合タンパク質を生成する。 シグナル配列は、後続する活性に対する検査法において直接用いることができる 細菌性の成長媒体内にＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの分泌を促す。 融合タンパク質としてＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの発現は、発現ベクタ内 にｃＤＮＡをサブクローニングすることにより達成され、発現ベクタはＴ７プロ モータからなり、Ｔ７プロモータには以下順次、開始 メチオニンコドン（ＡＴＧ）、６ヒスチジンコドン、（チオレドキシンをコード 化する）Ｅ．ｃｏｌｉのＴｒｘＡ遺伝子、エンテロキナーゼ切断部位及びヌクレ オチド配列コード化ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ或いはその変異体に対するコ ード化配列が後続する。発現ベクタ内のＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの発現は 、ＩＭＩＡＣ ｃｈｒｏｍｏｔｏｇｒａｐｈｙ（Porath、上記）における精製を 可能にする。 VIII ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ特異抗体の生成 ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（Maniatis 社、上記）を用いて 精製されるＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、標準的なプロトコルを用いてウサ ギを免疫することができるが、一般にはモノクローナルアプローチが用いられる 。ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂから翻訳されたアミノ酸配列は、ＤＮＡＳＴＡ Ｒソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ 社）を用いて解析することができ、高い免疫 抗原性の領域を画定することができ、対応するオリゴペプチドは、当業者には周 知の手段により、合成され、抗体を増すために用いられる。Ｃ末端付近の、或い は隣接する親水性領域内のエピトープのような、適切なエピトープを選択するた めの解析は、Ausubel ＦＭ等（上記）により記載される。 一般的に、オリゴペプチドは、ｆｍｏｃ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いるＡｐｐ ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｍｏｄｅｌ ４３１Ａを用いて合成され、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ：Ausubel FM 等、上記）を用いた反応 によりキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ，Sigma）に結合される、１ ５残基の長さである。ウサギは、完全なフロイントアジュバントにおけるオリゴ ペプチド−ＫＬＨ複合体を用いて免疫される。結果生じる抗血清は抗ペプチド活 性に対 して、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％ＢＳＡを用いてブロック化 し、ウサギ抗血清を用いて反応し、洗浄し、さらに放射性ヨウ素化されたヤギ抗 ウサギＩｇＧを用いて反応することにより評価される。 IX 特異抗体を用いるＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの精製 内因性或いは組換えＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂは、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡ ＮＣ１Ｂに対する特異な抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィにより精製す ることができる。免疫親和性カラムはＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを、ＣｎＢ ｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Pharmacia Biotech 社）のよう な活性化クロマトグラフレジンと共有結合することにより構成される。結合後、 そのレジンは製造上の使用説明書に従って、ブロック化され、洗浄される。 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを含む媒体は、免疫親和性カラム上を通過し、 そのカラムはＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを優先的に吸収できる条件下（例え ば洗浄剤存在下での高イオン強度緩衝剤）で洗浄される。そのカラムは、抗体／ ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ結合を粉砕する条件下で溶離され（例えばｐＨ２ −３の緩衝剤、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオト ロピックイオン）、ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂが集められる。 X ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂと相互作用する分子の同定 ＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ、或いはその生物活性フラグメントは、¹²⁵Ｉ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ ｒｅａｇｅｎｔを用いて標識される（Bolton,A E 及び Hunter,WM（1973）Biochem J 133:529）。９６ウエルプレートのウエル 内に先に配置された小さな候補分子は、標識されたＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１ Ｂを用いて培養され、洗浄され、標識さ れたＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂ複合体を有する任意のウエルが検定される。 異なる濃度のＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂを用いて得られるデータは、その数 、親和性並びに候補分子とＰＡＮＣ１Ａ及びＰＡＮＣ１Ｂの結合に対する値を計 算するために用いられる。 XI 完全長ＰＡＮＣ１Ａの配列決定 インサイトクローン番号４９６０７１が、ｈＮＴ−２細胞株から得られ、ＰＡ ＮＣ１Ａに対する完全長コード化配列を得るために用いられた。配列決定用テン プレートは、Ｐｒｏｍｅｇａ ＷＩＺＡＲＤ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｓｙｓｔｅｍ を用いて４９６０７１ヌクレオチド配列を含む宵液体培養から得られた。入れ子 状遺伝子欠失の組は、ＰｒｏｍｅｇａＥｒａｓｅ−ａ−ｂａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ を用いてクローン４９６０７１から調製され、配列決定用テンプレートとして用 いられた。 配列決定のための反応は、ＡｍｉｐｌｉＴａｑＦＳ，ＤＮＡポリメラーゼを有 するＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑ ｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて実行された。 反応は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにお いて解析された。個々の配列は、ＡＢＩ ＡｕｔｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ ｓｏｆ ｔｗａｒｅを用いて、アセンブルされ、エディットされた。ＰＡＮＣ１Ａの完全 コード化領域は第９図に示される。 XII ノーザン解析 インサイトクローン４９６０７１は、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍ ｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（Altschul SF（1993）J MolEvol 36:290-300; Altschul SF 等（1990）J Mol Blol 215:403-10）に 対して有効であるＢＬＡＳＴを用いて、ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）データベー ス内のすべての他の配列と比較された。 問い合わせ（query）配列としてクローン４９６０７１（５０３５塩基）の完 全長挿入に用いるＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）データベース内のＢＬＡＳＴ比較 の結果が、表１に示される。 インサイトクローン４９６０７１は従来の方法を用いてノーザン解析を実行す るために用いられる。 ＰＡＮＣ１Ａから引出されるＤＮＡプローブは、ノーザンブロット法に対する スクリーニングをするために用いられた。ＤＮＡプローブは４９６０７１プラス ミドのＥｃｏＲＩ消化により生成された。制限消化物は１％アガロースゲル上で 分割され、１．４ｋｂ制限フラグメントはゲルから摘出され、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ（Qiagen 社）上で精製された。１．４ｋｂフラグメントは、ク ローン４９６０７１の第９図の塩基１から１４０７まで延長し、５’非翻訳領域 及び最大のコード化配列から構成される。そのプローブは、共に Amersham 社か ら購入した「ｒｅｄｉ」ｖｕｅ［−³²Ｐ］ｄ−ＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ ）を有する「ｒｅｄｉ」ｐｒｉｍｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔを用いて無作為 に注入することにより精製された。組み込まれていない放射活性は Pharmacia 社から購入されるＮＩＣＫ ｃｏｌｕｍｎ（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０）におけ るカラムクロマトグラフィにより取り除かれた。 多数組織ノーザンブロット法ＭＴＮ−Ｉ及びＭＴＮ−ＩＩが Clontech社から 購入された。各ノーザンブロット法は、種々の組織からのレーン当たり約２ｕｇ のポリＡ＋を含む。ＲＮＡは、ナイロン膜ににじませ、ＵＶ照射により定着させ た、変性ホルムアルデヒド１．２％アガロースゲルにおいて電気泳動される。ｒ ａｐｉｄ−ｈｙｂハイブリダイゼーション緩衝剤は Amersham 社から購入された 。 ブロットは６５℃で１時間、プレハイブリダイゼーションされる。ハイブリダ イゼーションは０．５ｘ１０ＣＰＭ／ｍｌプローブを用いて、６５℃で１時間実 行された。ブロットは、１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ内で、室温で２ｘ１０分間 洗浄され、その後２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ内で、６５℃で各１０分間、２回 の厳重な洗浄が行われた。ブロット はＳａｒａｎ Ｗｒａｐ（登録商標）に包まれ、Amersham 社から購入された２ 枚の増感紙及びＨｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＭＰを用いて、−７０℃でオートラジオグ ラフされた（２０ｘＳＳＣ＝３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム ）。 プローブとしてインサイトクローン４９６０７１を用いるノーザンブロット法 が第１０図に示される。ノーザンブロット法に対して１．４ｋｂ Ｅｃｏｒｌハ イブリダイゼーションプローブを用いた結果は（ＭＴＮ Ｂｌｏｔｓ，Clontech Labs）、多数の転写産物が全１６の組織内に存在するということを示した。転 写産物のサイズは、２．４，３，４．４，９．５並びに１１ｋｂであった。主な 転写産物は２．４，４，４並びに９．５ｋｂであった。これらは、骨格筋、膵臓 、小腸、卵巣並びに精巣において最も豊富であった。転写産物の豊富さは組織間 で変化する。例えば、２．４ｋｂ転写産物は大部分の組織で最も豊富であった。 しかしながら、４．４ｋｂ帯は骨格筋においては２．４ｋｂ帯より豊富であった 。さらに９．５ｋｂ帯は他の検査された組織より膵臓においてより豊富であった 。 2.4kb 3kb 4.4kb 9.5kb 11kb 心臓 Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ 脳 Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ 胎盤 Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ 肺臓 Ｘ Ｘ Ｘ 肝臓 Ｘ Ｘ Ｘ 骨格筋 Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ 腎臓 Ｘ Ｘ Ｘ 膵臓 Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ 脾臓 Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ 胸腺 Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ 前立腺 Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ 精巣 Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ 卵巣 Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ 小腸 Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ 結腸 Ｘ Ｘ 白血球 Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ 上記明細書において述べたすべての発行物及び特許はここで参照して組み込ん でいる。本発明の記載した方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、本発 明の範囲及び精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特 に好適な実施例に関連して記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのよう な特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際には 、本発明を実施するために記載された方法の種々の変更例は、分子生物学或いは 関連する分野の当業者には明らかなように、以下の請求項の範囲内に含まれるも のである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/566 33/566 33/574 33/574 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＲ，ＣＡ ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ， ＪＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，Ｓ Ｇ (72)発明者 シールヘイマー、ジェフリー・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94022・ ロスアルトスヒルズ・ラクレスタドライブ 12555 (72)発明者 コールマン、ロジャー アメリカ合衆国カリフォルニア州94041・ マウンテンビュー・＃２・マリポーザ 260

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のポリヌクレオチド配列からなる精製ポリヌクレ オチド。 ２． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列からなる精製ポリヌクレ オチド。 ３． 請求項１のポリヌクレオチド或いはその一部と、相補的なポリヌクレオチ ドからなることを特徴とするアンチセンス分子。 ４． 請求項２のポリヌクレオチド或いはその一部と、相補的なポリヌタレオチ ドからなることを特徴とするアンチセンス分子。 ５． 請求項１のポリヌクレオチドからなる発現ベクタ。 ６． 請求項２のポリヌクレオチドからなる発現ベクタ。 ７． 請求項５の発現ベクタを用いて形質転換されることを特徴とする宿主細胞 。 ８． 請求項６の発現ベクタを用いて形質転換されることを特徴とする宿主細胞 。 ９． 第７図に記載するようなＰＡＮＣ１Ａのアミノ酸配列からなる精製ポリペ プチド。 １０．第７図に記載するようなＰＡＮＣ１Ｂのアミノ酸配列からなる精製ポリペ プチド。 １１．請求項１のポリヌクレオチドからなる診断用組成物。 １２．請求項２のポリヌクレオチドからなる診断用組成物。 １３．生体試料における請求項１のポリヌクレオチドを検出するための診断検査 法であって、 ａ）核酸ハイブリダイゼーション複合体を形成するために適切な条件下で、前 記生体試料と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ヌクレオチド配列或いはそのフラグメン トからなる第１のヌクレオチド配列とを結合する過程 と、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記複合体 の存在が、前記生体試料における請求項１のポリヌクレオチドからなる第２のヌ クレオチド配列の存在と相関をなす、該ハイブリダイゼーション複合体を検出す る過程と、 ｃ）前記試料における前記第２のヌクレオチド配列の量と基準値とを比較する ことにより、前記第２のヌクレオチド配列の量が基準値からいかに変化するかを 判定する過程であって、前記第２のヌクレオチド配列の異常レベルの存在が確実 に膵臓癌と相関をなす、該過程とを有することを特徴とする生体試料における請 求項１のポリヌクレオチドを検出するための診断検査法。 １４．生体試料における請求項１のポリヌクレオチドを検出するための診断検査 法であって、 ａ）核酸増幅のために適切な条件下で、前記生体試料と、ポリメラーゼ連鎖反 応プライマとを結合する過程であって、前記プライマがＳＥＱＩＤ ＮＯ：１の ヌクレオチド配列のフラグメントからなる、該過程と、 ｂ）増幅されたヌクレオチド配列を検出する過程と、 ｃ）前記生体試料における前記増幅されたヌクレオチド配列の量と基準値とを 比較することにより、前記ヌクレオチド配列の量が前記基準値からいかに変化す るかを判定する過程であって、前記ヌクレオチド配列の異常レベルの存在が確実 に膵臓癌と相関をなす、該過程とを有することを特徴とする生体試料における請 求項１のポリヌクレオチドを検出するための診断検査法。 １５．生体試料における請求項２のポリヌクレオチドを検出するための診断検査 法であって、 ａ）核酸ハイブリダイゼーション複合体を形成するために適切な条件 下で、前記生体試料と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド配列或いはその フラグメントからなる第１のヌクレオチド配列とを結合する過程と、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記複合体 の存在が前記生体試料における請求項２のポリヌクレオチドの第２のヌクレオチ ド配列の存在と相関をなす、該ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程と 、 ｃ）前記試料における前記第２のヌクレオチド配列の量と基準値とを比較する ことにより、前記第２のヌクレオチド配列の量が前記基準値からいかに変化する かを判定する過程であって、前記第２のヌクレオチド配列の異常レベルの存在が 確実に膵臓癌と相関をなす、該過程とを有することを特徴とする生体試料におけ る請求項２のポリヌクレオチドを検出するための診断検査法。 １６．生体試料における請求項２のポリヌクレオチドを検出するための診断検査 法であって、 ａ）核酸増幅のために適切な条件下で、前記生体試料と、ポリメラーゼ連鎖反 応プライマとを結合する過程であって、前記プライマがＳＥＱＩＤ ＮＯ：２の ヌクレオチド配列のフラグメントからなる、該過程と、 ｂ）増幅されたヌクレ オチド配列を検出する過程と、 ｃ）前記生体試料における前記増幅されたヌクレオチド配列の量と基準値とを 比較することにより、前記ヌクレオチド配列の量が前記基準値からいかに変化す るかを判定する過程であって、前記ヌクレオチド配列の異常レベルの存在が確実 に膵臓癌と相関をなす、該過程とを有することを特徴とする生体試料における請 求項２のポリヌタレオチドを検出するための診断検査法。 １７．第７図に記載するようなＰＡＮＣ１Ａに対してアミノ酸配列を有 するポリペプチドを生成するための方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現のために適切な条件下で、請求項７の宿主細胞を 培養する過程と、 ｂ）前記宿主細胞培養物から前記ポリペプチドを回収する過程とを有すること を特徴とするポリペプチド生成方法。 １８．第７図に記載するようなＰＡＮＣ１Ｂに対してアミノ酸配列を有するポリ ペプチドを生成するための方法であって、 ａ）前記ポリペプチドの発現のために適切な条件下で、請求項８の宿主細胞を 培養する過程と、 ｂ）前記宿主細胞培養物から前記ポリペプチドを回収する過程とを有すること を特徴とするポリペプチド生成方法。 １９．請求項９のポリペプチド或いはその一部を用いる特異な結合親和性を有す る複数の化合物をスクリーニングする方法であって、 複数の化合物を供給する過程と、 適切な条件下で結合できるだけの十分な時間内に、請求項９のポリペプチドと 複数の化合物のそれぞれとを結合する過程と、 請求項９の前記ポリペプチドと前記複数の化合物のそれぞれとの結合を検出す ることにより、請求項９の前記ポリペプチドと特異に結合する化合物を同定する 過程とを有することを特徴とするスクリーニング方法。 ２０．請求項１０のポリペプチド或いはその一部を用いる特異な結合親和性を有 する複数の化合物をスクリーニングする方法であって、 複数の化合物を供給する過程と、 適切な条件下で結合できるだけの十分な時間内に、請求項１０のポリペプチド と複数の化合物のそれぞれとを結合する過程と、 請求項１０の前記ポリペプチドと前記複数の化合物のそれぞれとの結合を検出 することにより、請求項９の前記ポリペプチドを特異に結合す る化合物を同定する過程とを有することを特徴とするスクリーニング方法。 ２１．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のポリヌクレオチド配列からなる精製ポリヌクレ オチド。